JP2002525053A

JP2002525053A - エクジソンレセプターおよびそれらの使用のための方法

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Publication number: JP2002525053A
Application number: JP2000570318A
Authority: JP
Inventors: マークシー．アルバーツェン，; キャサリンディー．ブルーク，; カールダブリュー．ガーナート，; ブラットレイアレンロス，
Original assignee: パイオニアハイ−ブレッドインターナショナル，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-09-10
Filing date: 1999-09-10
Publication date: 2002-08-13
Also published as: US7151168B2; US6504082B1; US20030088890A1; CA2336207A1; HUP0103993A3; EP1112360A1; AU5915999A; US20030110528A1; CA2336207C; HUP0103993A2; MXPA01002529A; AR021484A1; WO2000015791A1; US7205455B2; US7238859B2; US20030131381A1

Abstract

(57)【要約】本発明の分野は、新規なエクジソンレセプターまたはその誘導体によって発現が制御される誘導性遺伝子発現系である。この分野は、特に、新規なエクジソンレセプターに対する核酸およびポリペプチドの単離および特徴付けに関する。これらの核酸およびポリペプチドは、エクジソンまたは誘導体レセプターアゴニストで誘導性の新規な遺伝子発現系において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明の分野は、新規なエクジソンレセプターまたはその誘導体によって発現
が制御される誘導性遺伝子発現系である。この分野は、特に、新規なエクジソン
レセプターに対する核酸およびポリペプチドの単離および特徴付けに関する。こ
れらの核酸およびポリペプチドは、エクジソンまたは誘導体レセプターアゴニス
トで誘導性の新規な遺伝子発現系において有用である。

【０００２】（発明の背景）ステロイドホルモン２０−ヒドロキシエクジソン（β−エクジソンとしても既
知）は、多くの昆虫の発生の時期を制御する。エクジソンは、変態を生じる組織
の発達における同調的変化を誘発する。一般には、Ｋｏｌｌｍａｎ（編）、Ｅｃ
ｄｙｓｏｎｅ：ＦｒｏｍＣｈｅｍｉｓｔｒｙｔｏＭｏｄｅｏｆＡｃｔ
ｉｏｎ、ＴｈｉｅｍｅＭｅｄｉｃａｌＰｕｂ．、ＮＹ（１９８９）（これは
、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。一般的用語「エクジソン
」とは、２０−ヒドロキシエクジソンについての略語として頻繁に使用される。

【０００３】エクジソンレセプター（ＥｃＲ）ポリペプチドは、リガンド結合ドメイン、Ｄ
ＮＡ結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含む。このレセプターは、
２０−ヒドロキシエクジソンに結合し、そして核における標的遺伝子の遺伝子発
現をトランス活性化する。

【０００４】レセプターポリペプチドのリガンド結合ドメインは、標的遺伝子の５’調節領
域がホルモンに応答して活性化される手段を提供する。他の化学物質（例えば、
非ステロイド性エクジソンアゴニストＲＨ５８４９（Ｗｉｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４１：４６７〜４６９（１９８８））もまた、ＥｃＲのリガンド結合ドメイ
ンに対する化学的リガンドとして作用する。

【０００５】ＤＮＡ結合ドメインは、応答エレメント（標的遺伝子中の特異的ヌクレオチド
配列）に非共有結合的に結合するアミノ酸の配列を含む。応答エレメントは、ホ
ルモンにより活性化される標的遺伝子の５’調節領域内に位置する。

【０００６】トランス活性化ドメインは、ＴＡＴＡボックスでの予備的な開始およびアセン
ブリの間に、転写因子の作動に影響するサブドメインとして作用する、１以上の
アミノ酸配列を含む。このトランス活性化ドメインの効果は、転写開始事象の反
復が標的遺伝子からのより大きなレベルの遺伝子発現をもたらすことを可能にす
ることである。リガンドの結合は、レセプターポリペプチドにおける高次構造の
変化を引き起こし、そしてトランス活性化ドメインが標的遺伝子内のコード配列
の転写に影響し、標的ポリペプチドの産生を生じることを可能にする。

【０００７】ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいてＥｃＲには、３つのアイソフォームが存在し、
各々が独立した生物学的機能を有する。全てが、同じヘテロダイマーパートナー
であるＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ（ＵＳＰ）を共有する。ＵＳＰは、レチノイ
ン酸レセプターα（また、ＥｃＲとヘテロダイマーを形成し得る（Ｔｈｏｍａｓ
ら、Ｎａｔｕｒｅ３６２：４７１〜４７５（１９９３））に最も相同である。
各々のアイソフォームが独立してエクジソンと相互作用するが、ＵＳＰの添加は
、遺伝子のプロモーター内に見出されるエクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）
に対して結合するための複合体の親和性を大いに増強する。Ｕｌｔｒａｓｐｉｒ
ａｃｌｅは、単離およびクローニングされており、そしてそのリガンド結合ドメ
インが同定されている（Ｈｅｎｒｉｃｈら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ１８：４１４３〜４１４８（１９９０））。ＷＯ９４／０１５５
８を参照のこと。

【０００８】リガンドと結合することなく、ＥｃＲ／ＲＳＰヘテロ二重体は、ＥｃＲＥと弱
く相互作用し、転写を阻害する。ＥｃＲ／ＵＳＰ複合体によるエクジソンまたは
他のリガンドの結合は、転写を容易にするように機能する複合体における高次構
造の変化とともに、ＥｃＲＥに対するその親和性を増強する。エクジソンへテロ
マーレセプター複合体は、ＤＮＡを高親和性で結合し、そしてエクジソンリガン
ドの存在により促進される一過性の転写誘導性で、ＤＮＡ転写活性化の強力なプ
ロモーターとして作用する。

【０００９】遺伝子発現の開始および程度を制御することがしばしば所望される。特定の遺
伝子の発現を選択的に誘導する能力は、細胞だけではなくシステムおよび生物レ
ベルでも発生および機能の操作を可能にする。従って、エクジソンレセプター／
Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅは、遺伝子発現を調節する手段を提供する。これは
、遺伝子活性化を誘発するために外因的に適用され得る、化学物質を使用する調
節を提供する。

【００１０】米国特許第４，９８１，７８４号は、キメラレセプタータンパク質をコードす
る新規なレチノイン酸レセプターを議論している。このキメラは、グルココルチ
コイドレセプター、ミネラルコルチコイドレセプター、エストロゲン関連レセプ
ター、甲状腺レセプター、およびレチノイン酸レセプターの間の機能的ドメイン
を交換することによって構築される。

【００１１】米国特許第５，３１０，６６２号は、トランス活性化ドメインが位置またはコ
ピー数に関して改変されているホルモンレセプターおよびホルモン様レセプター
（このレセプターは、増大したトランス活性化特性を有する）を議論している。

【００１２】米国特許第４，８３３，０８０号は、遺伝子内の特異的配列を認識し、かつ転
写の活性化または抑制のいずれかをする原核生物ペプチドにより制御される真核
生物の遺伝子発現の調節に関する。

【００１３】米国特許第５，５５４，５１０号は、ヘテロダイマーを形成し、非対称ＤＮＡ
結合部位に結合し、そして遺伝子発現を抑制または増大する、異なるＤＮＡ結合
ドメインを有する異なるタンパク質の対を提供することによって遺伝子発現を調
節することに関する。

【００１４】米国特許第５，２１７，８６７号は、トランス活性化ドメインの位置またはコ
ピー数における数が増大したトランス活性化を提供するホルモンレセプターおよ
びホルモン様レセプターに関する。

【００１５】米国特許第５，５７１，６９６号は、レセプターのステロイド／甲状腺スーパ
ーファミリーのメンバー、これらのレセプターをコードするＤＮＡ、および宿主
細胞中でこれらを発現するための方法に関する。

【００１６】ＷＯ９０／１１２７３は、標的部位の特異性を決定する、ステロイド／甲状腺
ホルモンレセプターのＤＮＡ結合ドメイン組成、１つのレセプターの標的部位特
異性を別の標的部位特異性に変換するための方法に関する。

【００１７】米国特許第５，２９８，４２９号は、化合物がホルモンレセプターのアゴニス
トまたはアンタゴニストであるか否かを決定するバイオアッセイ（このアッセイ
は、レポーター遺伝子に作動可能に連結されているホルモン応答エレメントをコ
ードするＤＮＡ配列を含む）に関する。

【００１８】米国特許第５，０７１，７７３号は、ホルモンレセプターであると疑われるタ
ンパク質が転写活性化特性を有するか否かを決定し、そして化合物がレセプター
タンパク質に対する機能的リガンドか否かを評価するために有用なホルモンレセ
プターのバイオアッセイを議論している。

【００１９】ＷＯ９３／２１３３４は、化学的に誘導性の植物遺伝子発現カセットで形質転
換された植物細胞におけるこのカセットに関する。誘導性プロモーターは、標的
遺伝子に作動可能に連結されており、この誘導性プロモーターは、細胞中でもま
た発現される調節タンパク質によって活性化される。効果的な外因性誘導剤の存
在下では、アクチベータータンパク質は、標的遺伝子の発現を誘導する。

【００２０】ＷＯ９３／２３４３１は、変異ステロイドホルモンレセプター、および遺伝子
治療における分子スイッチとしてこれらを使用するための方法に関する。

【００２１】ＷＯ９４／０１５５８は、昆虫に由来するＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅレセプ
ターと相互作用して、マルチマー種を形成し得る、レセプターのステロイド／甲
状腺スーパーファミリーの種々のメンバーに関する。

【００２２】ＷＯ９２／１６５４６は、レセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリ
ーのいくつかのメンバーについて、リガンドに対する応答エレメントであるＤＮ
Ａセグメントに関する。機能的プロモーターおよび遺伝子との組み合わせで応答
エレメントは、レセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバー
に対するリガンドに応答性の遺伝子を含む組換えベクターを提供する。

【００２３】ＷＯ９３／１１２３５は、１つより多いレセプターのマルチマーを形成する、
レセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの種々のメンバーの相互作
用に関する。これは、この第１のレセプターが、第１のレセプターに対する同族
リガンドの存在におけるホルモン発現制御下で維持される遺伝子の転写をトラン
ス活性化する能力を調節する。

【００２４】米国特許第５，５３４，４１８号は、細胞において組換えタンパク質の産生を
制御するための方法に関する。このタンパク質をコードする遺伝子の転写は、リ
ガンドレセプター複合体により活性化される転写制御エレメントの制御下で維持
される。この複合体は、リガンド（ホルモンまたはホルモンのアナログ）がレセ
プター（これは、ホルモンレセプターまたは機能的アナログである）と複合体化
する場合に、形成される。

【００２５】ＷＯ９１／１３１６７は、昆虫ステロイドレセプターの特徴を有する昆虫ＤＮ
Ａ配列の単離に関する。

【００２６】ＷＯ９６／２７６７３は、エクジソンレセプターを含む組換え誘導性遺伝子発
現系を議論している。リガンド結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、または
ＤＮＡ結合ドメインのいずれかが組換えレセプターにおいて異種であるキメラレ
セプターが、作製される。この構築物は、植物細胞において標的遺伝子を活性化
するために使用される。

【００２７】米国特許第５，５１４，５７８号は、エクジソンレセプターをコードするポリ
ヌクレオチド配列および宿主細胞中でのそれらの発現を開示する。

【００２８】ＷＯ９６／３７６０９は、化学誘導剤に応答性の遺伝子スイッチとして作用し
て、遺伝子の外的制御を可能にし得る、エクジソンレセプタータンパク質に関す
る。

【００２９】ＷＯ９３／０３１０６２は、哺乳動物細胞中でエクジステロイドとエクジステ
ロイドレセプターポリペプチドとを接触させることによって遺伝子発現を誘導す
るための方法に関する。この細胞は、このレセプターに対するＤＮＡ結合配列を
含む。

【００３０】米国特許第５，８８０，３３３号は、核ホルモンのクラスＩＩステロイドおよ
び甲状腺ホルモンスーパーファミリーの発現を通して、植物中での遺伝子発現を
制御するための方法に関する。リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ま
たはトランス活性化ドメインのいずれかが組換えレセプター中で異種であるキメ
ラレセプターが、作製される。このキメラレセプターは、標的配列の発現を調節
するために使用される。

【００３１】米国特許第５，４３２，０６８号は、雄性稔性に必須の遺伝子の発現を調節す
るために誘導可能プロモーターを用いることにより、制御的に植物を雄性稔性に
する方法に関する。この遺伝子が「オフ」である場合、植物は不稔性である。し
かし、プロモーターが誘導される場合、その植物は稔性になる。特に、それによ
り植物におけるフラバノール（ｆｌａｖａｎｏｌ）産生に影響する遺伝子が、こ
の植物を条件的に雄性稔性にするように制御される方法に関する。関連米国特許
第５，４７８，３６９号は、植物において雄性稔性を媒介するヌクレオチド配列
およびアミノ産配列を開示する。

【００３２】米国特許第５，８２４，５２４号および第５，８５０，０１４号はまた、構成
的に不稔性である植物を提供することにより、植物稔性の制御に関する。ここで
稔性は、雄性稔性ＭＳ４５ＤＮＡ分子またはフラボノン産生に影響を与える遺
伝子を用いて誘導され得る。

【００３３】米国特許第５，８５９，３４１号は、小胞子形成の選択的誘導を介して、遺伝
性の、外部より制御可能な雄性稔性を提供するための方法に関する。

【００３４】いくつかのエクジソンレセプターが公知であるが、さらなるレセプターの（特
に植物における）単離および使用のための必要性が存在する。従って、本発明は
、新規なエクジソンレセプターに関する。本発明は、昆虫生理学の理解の助長に
対する影響を有し得るが、（特に植物における）遺伝子発現の制御におけるレセ
プターペプチドの潜在的な用途に、かなり関心がある。

【００３５】（発明の要旨）従って、本発明は、昆虫属Ｐｙｒｉｌｉｄａｅ由来の新規なタンパク質に関し
、このタンパク質は、エクジソンに応答性である。

【００３６】本発明は特に、Ｏｓｔｒｉｎｉａ種、特にＯｓｔｒｉｎｉａｎｕｂｉｌａｌ
ｉｓ由来のタンパク質に関する。

【００３７】本発明は、これらの種におけるエクジソンレセプターとして作用する新規タン
パク質を包含する。

【００３８】本発明は特に、配列番号２におけるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。

【００３９】本発明はまた、新規なエクジソンレセプターと結合してヘテロダイマーを形成
する、Ｐｙｒｉｌｉｄａｅ種由来のさらなる新規なタンパク質を包含する。この
タンパク質は、「Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ」タンパク質と称され得る。従っ
て、本発明は特に、配列番号３におけるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する
。

【００４０】これらタンパク質は、エクジソン、エクジソン誘導体、またはエクジソン模倣
体のような化学物質誘導剤に応答して標的遺伝子を活性化するために、単独で、
または組み合わせて有用である。

【００４１】本発明はまた、新規なエクジソンレセプター中のリガンド結合ドメイン、ＤＮ
Ａ結合ドメイン、またはトランス活性化ドメインの１つ以上が、キメラレセプタ
ータンパク質中に存在する他のドメインに関して異種である供給源から得られる
キメラレセプタータンパク質に関する。キメラレセプタータンパク質は、リガン
ドの選択および活性化されるべき標的配列の選択における柔軟性を提供し、そし
て細胞または生物における制御された遺伝子発現を可能にする。

【００４２】異種供給源の選択は、トランス活性化、リガンド結合、またはＤＮＡ結合につ
いての所望の特異性および有効性レベルに依存する。従って、キメラレセプター
分子は、以下の利点を付与する：（１）ネイティブドメインよりも強いトランス
アクチベータードメインを用いることによりトランス活性化を最大にし、そして
特定の宿主細胞と適合性であるトランスアクチベーターを用いることにより特異
的宿主細胞におけるトランス活性化を可能にする；（２）選択された化学的リガ
ンドによる誘導を、このリガンドの結合部位を別のリガンド結合部位の代わりに
置きかえることによって提供する；および（３）ネイティブなＤＮＡ結合部位を
異なる応答エレメント（すなわち、ＥｃＲＥ以外）を認識する部位と置きかえる
ことによる特異的な応答エレメントの使用。

【００４３】本発明はまた、これらのタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列
に関する。特に、本発明は、配列番号１（エクジソンレセプター）および配列番
号３（Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）に示すヌクレオチド配列に関する。

【００４４】本発明はまた、ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含する。

【００４５】本発明はまた、この発現ベクターを含む、および／またはこのヌクレオチド配
列を発現する細胞を包含する。

【００４６】本発明はまた、本明細書中に記載のタンパク質に結合するリガンドをスクリー
ニングするための方法を提供する。

【００４７】本発明の好ましい実施態様では、レセプターが発現され、そして標的遺伝子が
活性化される細胞は、植物細胞である。

【００４８】本発明はまた、植物稔性を調節するための方法を提供する。

【００４９】（発明の詳細な説明）本発明は、エクジソンに応答性の新規なタンパク質に関する。このタンパク質
は、Ｐｙｒｉｌｉｄａｅ属に由来し、そして特にＯｓｔｒｉｎｉａ種（特に、Ｏ
ｓｔｒｉｎｉａｎｕｂｉｌａｌｉｓ）に由来する。本発明の組成物は、新規な
エクジソンレセプター（ＥｃＲ）およびＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ（ＵＳＰ）
レセプターを包含する。これらのレセプターは両方とも、ステロイド／ホルモン
レセプタースーパーファミリーのメンバーに相同性を有し、そして化学物質誘導
剤に応答して標的遺伝子の転写の活性化に関与する。特に、本発明は、配列番号
２または４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離さ
れた核酸分子を提供する。本明細書中に記載の（例えば、配列番号１または３に
記載の）核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、なら
びにそれらのフラグメントおよび改変体がさらに提供される。

【００５０】本発明は、単離されたまたは実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物
を包含する。「単離された」もしくは「精製された」核酸分子もしくはタンパク
質またはそれらの生物学的に活性な部分は、他の細胞物質または培養培地（組換
え技術によって精製された場合）を実質的に含まず、または化学物質前駆体また
は他の化学物質（化学合成される場合）を実質的に含まない。好ましくは、「単
離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でその核酸に天然
に隣接した配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置した配列）（
好ましくは、タンパク質コード配列）を含まない。例えば、種々の実施態様では
、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で核酸分子
に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋ
ｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満を含み得る。細胞物質を実質的に含まな
いタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量による）未満の夾
雑するタンパク質を有するタンパク質の調製物を包含する。本発明のタンパク質
またはその生物学的に活性な部分が組換え生成される場合、好ましくは、培養培
地は、約３０％、２０、１０％、または５％（乾燥重量による）未満の化学物質
前駆体または目的のタンパク質でない化学物質を示す。

【００５１】しかし、実質的に純粋なタンパク質を含まない調製物もまた有用であり得る実
施態様が存在することが理解される。従って、より純粋でない調製物は、夾雑す
る物質がペプチドの特定の所望の使用を妨害しない限り、有用であり得る。

【００５２】開示されたヌクレオチド配列およびそれによりコードされたタンパク質のフラ
グメントおよび改変体もまた、本発明により包含される。「フラグメント」によ
って、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列の一部、従って、それによっ
てコードされるタンパク質もまた意図される。ヌクレオチド配列のフラグメント
は、ネイティブタンパク質の機能的な生物学的活性の１つ以上を保持するタンパ
ク質フラグメントをコードし得る。従って、ヌクレオチド配列のフラグメントは
、機能的リガンド結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、またはＤＮＡ結合ド
メインを保持し得る。

【００５３】本発明のＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセプターの生物学的
に活性な部分をコードする、Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセ
プターヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０
、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０の連続す
るアミノ酸、または本発明の全長レセプターに存在するアミノ酸の総数まで（例
えば、それぞれ配列番号２および４の５４６または４６０アミノ酸）をコードす
る。ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーションプローブとして有用であ
るＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセプターをコードするヌクレ
オチド配列のフラグメントは、一般に、Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエク
ジソンレセプターの生物学的に活性な部分をコードする必要はない。

【００５４】従って、Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセプターをコードす
るヌクレオチド配列のフラグメントは、レセプターの生物学的に活性な部分をコ
ードし得るか、またはそれは、以下に開示の方法を用いてハイブリダイゼーショ
ンプローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられ得るフラグメントであり得る
。Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセプターの生物学的に活性な
部分は、本発明のレセプターをコードするヌクレオチド配列の１つの部分を単離
し、そのレセプターのコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロで組換
え発現により）、そしてレセプターのコードされた部分の活性を評価することに
より調製され得る。Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセプターヌ
クレオチド配列のフラグメントである核酸分子は、少なくとも１６、２０、５０
、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、
５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，
１００、１，２００、１，３００、もしくは１，４００、１，５００、１，６０
０、１，７００、１，８００ヌクレオチド、または本明細書中に開示された全長
Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセプターヌクレオチド配列に存
在するヌクレオチドの数（例えば、それぞれ配列番号１または２の２，１２６お
よび１，８３７ヌクレオチド）までを含む。

【００５５】また、これらのフラグメントにおいて、とりわけ診断アッセイのために有用で
ある非機能的フラグメントが含まれる。従って、非機能的リガンド結合ドメイン
フラグメントは、機能的リガンド結合ドメインと競合する結合アンタゴニストと
しての使用を有し得る。このようなフラグメントは、例えば、リガンドを結合し
得るが、ＤＮＡ結合に必要な高次構造の変化を付与し得ない。同様に、非機能的
ＤＮＡ結合ドメインは、それがトランス活性化、および結果の遺伝子発現を妨害
し、一方、機能的ＤＮＡ結合ドメインによるＤＮＡ結合もまた妨害するように、
ＤＮＡに結合し得る。同様に、非機能的トランス活性化ドメインは、宿主細胞成
分によって誘導される転写を妨害し得る。

【００５６】あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の
フラグメントは、一般に、生物学的活性を保持するフラグメントタンパク質をコ
ードしない。従って、ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約２０ヌ
クレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、および本発明のタン
パク質をコードする全長ヌクレオチド配列までの範囲であり得る。

【００５７】「改変体」とは、実質的に類似の配列を意図する。ヌクレオチド配列のために
、保存的改変体は、遺伝暗号の縮重のために、本発明のＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃ
ｌｅまたはエクジソンレセプターポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードす
る配列を含む。これらのような天然に存在する対立遺伝子改変体は、周知の分子
生物学技術（例えば、以下に概説したようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）お
よびハイブリダイゼーション技術）の使用によって同定され得る。改変体ヌクレ
オチド配列はまた、合成由来のヌクレオチド配列（例えば、部位指向性変異誘発
を用いることによって生成されたが、本発明のエクジソンまたはＵｌｔｒａｓｐ
ｉｒａｃｌｅレセプターをなおコードする配列）を包含する。一般に、本発明の
ヌクレオチド配列改変体は、そのそれぞれのネイティブなヌクレオチド配列に対
して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、一般的には、８０％、好まし
くは、８５％、９０％、９５％、９８％までの配列同一性を有する。

【００５８】「改変体」タンパク質とは、ネイティブタンパク質のＮ末端および／またはＣ
末端への１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる短縮化）または付加；ネイティブ
タンパク質の１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいはネイティブ
タンパク質の１つ以上の部位のアミノ酸の置換によりネイティブタンパク質から
誘導されたタンパク質を意図する。このような改変体は、例えば、遺伝的多型ま
たは人為操作から生じ得る。

【００５９】本発明のタンパク質は、種々の方法（アミノ酸置換、欠失、短縮化、および挿
入を包含する）で変化され得る。このような操作のための方法は、一般に、当該
分野で公知である。例えば、Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセ
プタータンパク質のアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡにおける変異生成によって調
製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当該分野で
周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８
７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌｉ
ａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ）およびその
中で引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に
影響しない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）
ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
、Ｄ．Ｃ．、これは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに見出され
得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと交
換する置換）が好ましいとされ得る。

【００６０】従って、本発明の遺伝子およびヌクレオチド配列は、天然に存在する配列なら
びに変異体形態の両方を包含する。同様に、本発明のタンパク質は、天然に存在
するタンパク質ならびにその改変形態および変異形態の両方を包含する。このよ
うな改変体は、機能的リガンド結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、または
ＤＮＡ結合ドメインを保持しつづける。明らかに、改変体をコードするＤＮＡに
おいて作製される変異は、この配列をリーディングフレーム外とすることなく、
そして好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補領域を作出しない。ＥＰ
特許出願公開第７５，４４４号を参照のこと。

【００６１】本明細書中に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、および置換は、タンパ
ク質の特徴を大きな変化を生じることが期待されない。しかし、そうするよりも
前に置換、欠失、または挿入の正確な効果を推定することは困難である場合、当
業者は、この効果が慣用のスクリーニングアッセイにより評価されることを理解
する。すなわち、活性は、レセプターがリガンドに結合する、ＤＮＡと相互作用
する、または転写を活性化する能力によって評価され得る。

【００６２】改変体ヌクレオチド配列およびタンパク質はまた、ＤＮＡシャッフリングのよ
うな変異誘発および組換え手順に由来する配列およびタンパク質を包含する。こ
のような手順を用いて、１つ以上の異なるＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエ
クジソンレセプターコード配列は、所望の特性を有する新規なレセプターを作出
するように操作され得る。このように、組換えポリヌクレオチドのライブラリー
は、実質的な配列同一性を有し、かつインビトロまたはインビボで相同組換えさ
れ得る配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から生成される。例えば
、このアプローチを用いて、目的のドメインをコードする配列モチーフは、本発
明のエクジソンまたはＵｌｔｒａｓｐｉｒｉｃａｌレセプター遺伝子と他の公知
のステロイド／ホルモンレセプターまたは遺伝子アクチベータータンパク質との
間でシャッフリングされて、これにより、目的の改善された特性（例えば、酵素
の場合、Ｋｍの増大）を有するタンパク質をコードする新規な遺伝子を入手し得
る。このようなＤＮＡシャッフリングについてのストラテジーは、当該分野で公
知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４
）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）Ｎａ
ｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅら（１９９７）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇら（１９９７）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４５０４−４５０９；Ｃ
ｒａｍｅｒｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１：２８８−２９１；および米
国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照のこと。

【００６３】さらに、本発明により包含されるタンパク質改変体は、１つ以上のドメイン機
能を増強するかまたは減少するかのいずれかである変異を含む改変体を包含する
。例えば、リガンド結合ドメインにおいて、遺伝子発現が増大され得るように、
特定のリガンドへのドメインの感受性を増強する変異が、導入され得る。あるい
は、所望のリガンドと競合し得る、所望でないリガンドに対するドメインの感受
性を減少させる変異を導入することが所望され得る。同様に、変異は、これらの
ドメインの機能性を増大させるかまたは減少させ得るＤＮＡ結合ドメインおよび
トランス活性化ドメインに導入され得る。変異の導入に変わるものとして、機能
における増大は、これらのドメインのコピー数を増大させることにより提供され
る。従って、本発明はまた、ドメインの１つ以上が１コピーより多く提供される
タンパク質を包含する。

【００６４】本発明のヌクレオチド配列は、他の生物から対応する配列を単離するために使
用され得る。このようにして、ＰＣＲ，ハイブリダイゼーションなどのような方
法が、本明細書中に記載の配列に対するそれらの配列相同性に基づいてこのよう
な配列を同定するために使用され得る。本明細書中に記載のレセプター配列全体
に対する、またはそれらのフラグメントに対する、それらの配列同一性に基づい
て単離された配列は、本発明によって包含される。

【００６５】ＰＣＲアプローチにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、目的の任意の
生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列の増幅
のためにＰＣＲ反応における使用のために設計され得る。ＰＣＲプライマーを設
計する方法およびＰＣＲクローニングのための方法は、一般的に、当該分野で公
知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉ
ｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ）に開示される。また、Ｉｎｎｉｓら編、（１９９０）
ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ）、ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９５）ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇ
ｉｅｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）；およびＩｎｎｉ
ｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９９）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＭａｎｕａｌ
（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと。ＰＣＲの
公知の方法としては、プライマー対、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、単一
の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異
的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを用いる方法が挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【００６６】ハイブリダイゼーション技術において、公知のヌクレオチド配列の全てまたは
部分が、選択された生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまた
はｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡ
ライブラリー）中に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリ
ダイズするプローブとして使用される。このハイブリダイゼーションプローブは
、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、ま
たは他のオリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例えば、³²Ｐ）ま
たは任意の他の検出可能なマーカーで標識化され得る。従って、例えば、ハイブ
リダイゼーションのためのプローブは、本発明のレセプター配列に基づいて合成
オリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーシ
ョンおよびｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築のためのプロ
ーブの調製のための方法は、一般に、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒ
ｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｐｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ）に
おいて開示される。

【００６７】例えば、本明細書中に開示されたＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソ
ンレセプターの配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応するＵｌｔｒ
ａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセプター配列およびメッセンジャーＲＮ
Ａに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され得る。種々の条件下
で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、
Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅまたはエクジソンレセプター配列間で独特であり、
そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも
約２０ヌクレオチド長である配列を包含する。このようなプローブは、選択され
た生物から対応するエクジソンレセプターまたはＵｌｔｒａｓｐｉｒｉｃａｌ配
列をＰＣＲによって増幅するために使用され得る。この技術は、所望の生物から
さらなるコード配列を単離するために、または生物中のコード配列の存在を決定
するための診断アッセイとして使用され得る。ハイブリダイゼーション技術は、
プレート化したＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを
包含する（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこ
と。

【００６８】このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実
施され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対するよりも、検出可能に
より大きな程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標
的配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は
配列依存性であり、そして異なる環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよ
び／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対
して１００％相補的である標的配列が同定され得る（相同プロービング）。ある
いは、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出され得るように
、配列中にいくらかミスマッチとなることが可能になるように調整され得る（異
種プロービング）。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満であり
、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。

【００６９】代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５ＭＮａイオン未
満であり、代表的には約０．０１〜１．０ＭＮａイオン濃度（または他の塩）
（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０
〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプロー
ブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃であ
る条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミ
ド）の添加によって達成され得る。例示の低いストリンジェンシー条件は、３０
〜３５％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム
）の緩衝溶液を用いる３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×から２×
のＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム
）を用いる５０〜５５℃での洗浄を包含する。例示の中程度のストリンジェンシ
ー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１．０ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での
３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．５×から１×のＳＳＣを用いる
５５〜６０℃での洗浄を包含する。例示の高いストリンジェンシー条件は、５０
％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼ
ーション、および０．１×のＳＳＣを用いる６０〜６５℃での洗浄を包含する。

【００７０】特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定
的な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリッドについては、Ｔ_mは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔ_m＝８１．５℃＋１
６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／
Ｌから概算され得；ここでＭは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、Ｄ
ＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージ
であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセ
ンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔ_mは、
相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度
（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。Ｔ_mは、１％のミスマッチにつ
き約１℃低下する；従って、Ｔ_m、ハイブリダイゼーション、および／または洗
浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例え
ば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔ_mは、１０低下し得
る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで
の特定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔ_m）よりも約５℃低く選択さ
れる。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも１、２
、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；
中程度のストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも６、７、８、９、ま
たは１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いス
トリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも１１、１２、１３、１４、１５
、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。
この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴ_mを
使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／ま
たは洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望
されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）
よりも低いＴ_mを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を
増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガ
イドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙ−ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；お
よびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第２章（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒ
ｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖ
ｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと。

【００７１】従って、エクジソンレセプターまたはＵｌｔｒａｓｐｉｒｉｃａｌタンパク質
をコードする単離された配列、および本明細書中に開示されるエクジソンレセプ
ター配列またはＵｌｔｒａｓｐｉｒｉｃａｌ配列、あるいはそのフラグメントに
ハイブリダイズする単離された配列は、本発明に含まれる。このような配列は、
開示される配列と、少なくとも４０％〜５０％相同であり、約６０％〜７０％相
同であり、そしてさらに約８０％、８５％、９０％、９５％〜９８％以上相同で
ある。すなわち、配列の配列類似性は、少なくとも約４０％〜５０％、約６０％
〜７０％、およびさらに約８０％、８５％、９０％、９５％〜９８％の配列類似
性を共有する範囲にわたり得る。

【００７２】以下の用語は、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチドの間の配列の関係を記
載するために用いられ得る：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、
（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、および（ｅ）
「実質的同一性」。

【００７３】（ａ）本明細書中で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較の基準とし
て使用される規定された配列である。参照配列は、特定化された配列のサブセッ
トまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメン
ト、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子配列としてである。

【００７４】（ｂ）本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチ
ド配列の連続しかつ特定化されたセグメントについての参照を作製し、ここで比
較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメ
ントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付
加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは
、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり、そして必要に応じて、３０
、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列
におけるギャップの包含に起因する参照配列に対する高い類似性を避けるために
、ギャップペナルティーが代表的に導入され、そして一致する数から差し引かれ
ることを理解する。

【００７５】比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。
比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ
．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによって；Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性ア
ラインメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性探索方法によって；以下
を含むがこれらに限定されないアルゴリズムのコンピューター化された実行によ
って行われ得る：Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅ
ｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ
；ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ
，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５Ｓｃ
ｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡのＧＡ
Ｐ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；ＣＬＵＳ
ＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ７３：２３７−
２４４（１９８８）によって十分に記載される；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９）
ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇら（１９９２）
ＣｏｍｐｕｔａｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＢｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ８：１５５−６５、およびＰｅｒｓｏｎら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１；好ましいコンピューターアラインメン
トプログラムはまた、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム、
およびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０を参照のこと）を含む。アラインメントは
また、点検および手動のアラインメントによってしばしば行われる。配列アライ
ンメントは、上記のプログラムのデフォルトのパラメーターを使用して行われる
。

【００７６】（ｃ）本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列またはポリペプチド配列
の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定化された比較ウインド
ウにわたって最大の一致にアラインされた場合の同一である２つの配列中の残基
に対する参照を作製する。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使
用される場合、同一ではない残基位置は、保存性アミノ酸置換によってしばしば
異なり、ここでアミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性
）を有する他のアミノ酸残基で置換され、従って、分子の機能的特性を変化させ
ないことが理解される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パー
セントは、置換の保存的性質について訂正するように上方に調整され得る。この
ような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有
するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。代表的
には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存性置換を点
数付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従っ
て、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０
のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる
。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌ
ｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に
おいて実行されるように計算される。

【００７７】（ｄ）本明細書中で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比
較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列を比較することによっ
て決定された値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列
の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付
加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）
を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配
列に存在して一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位
置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１０
０をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。

【００７８】（ｅ）（ｉ）用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一性」は、ポリヌクレオ
チドが、標準的なパラメーターを使用して、記載されるアラインメントプログラ
ムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくと
も８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも
９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドンの縮
重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れることに
よって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同
一性を決定するために、これらの値が適切に調整され得ることを理解する。これ
らの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも６０％、
より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、および最も好ましくは少な
くとも９５％の配列同一性を意味する。

【００７９】ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の表示は、２つの分子が、ス
トリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするか否かである。一般的に、
ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の
配列に対する熱融点（Ｔ_m）よりも約５℃低く選択される。しかし、ストリンジ
ェントな条件は、約１℃〜約２０℃の範囲にある温度を含み、これは、本明細書
中で他に限定されるように、ストリンジェンシーの所望の程度に依存する。スト
リンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードす
るポリペプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。このこ
とは、例えば、核酸のコピーが、遺伝コードによって許容される最大のコドン縮
重を使用して作製される場合に、生じ得る。２つの核酸配列が実質的に同一であ
ることの１つの表示は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２
の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差免疫性である場合で
ある。

【００８０】（ｅ）（ｉｉ）ペプチドの文脈における用語「実質的同一性」は、ペプチドが
、特定化された比較ウィンドウにわたって、参照配列に対して、少なくとも７０
％の配列同一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少
なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことである。好ま
しくは、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行
われる。２つのポリペプチド配列が実質的に同一であることの表示は、１つのポ
リペプチドが、第２のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であ
ることである。従って、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異な
る場合に、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似
の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり
得るということ以外は、上記に示したような配列を共有する。

【００８１】タンパク質は、それを天然で発現する細胞から精製され得るか、それを発現す
るように改変された（すなわち、組換え）細胞から精製され得るか、または当該
分野で周知のタンパク質合成技術を使用して合成され得る。好ましい実施態様に
おいて、タンパク質は、組換えＤＮＡ法によって産生される。このような方法に
おいて、タンパク質をコードする核酸分子は、本明細書中により十分に記載され
るように発現ベクター中にクローニングされ、そして当該分野で公知の方法に従
って適切な宿主細胞において発現され得る。次いで、そのタンパク質は、当業者
に周知のタンパク質精製技術を用いて細胞から単離される。あるいは、タンパク
質またはフラグメントが、当業者に周知のペプチド合成方法を使用して合成され
得る。

【００８２】本発明はまた、キメラタンパク質を含み、ここでは異種タンパク質（本発明の
タンパク質とは実質的に相同ではないアミノ酸配列を有する）が、本発明のタン
パク質もしくはそのフラグメント、またはその改変体と融合タンパク質を形成す
る。これらのタンパク質は、作動可能に連結されていてもよく、または作動可能
に連結されていなくてもよい。作動可能な連結の例は、単一のタンパク質が翻訳
に際して産生されるようなインフレームの融合である。このような融合タンパク
質は、例えば、組換えタンパク質の精製を容易にする。別の実施態様において、
融合タンパク質は、特定の宿主細胞からのその分泌を容易にする、Ｎ末端の異種
シグナル配列を含み得る。タンパク質の発現および分泌は、異種シグナル配列の
使用によって増大され得る。

【００８３】本発明は、特に、本明細書中に記載されるタンパク質中の１つ以上のドメイン
が、異種機能を有する異種タンパク質と作動可能に連結されるタンパク質に関す
る。従って、リガンド結合ドメインは、他のリガンドについてのリガンド結合ド
メインで置換され得る。それによって、遺伝子発現の制御は、エクジソン以外の
リガンドに基づくが、核における遺伝子発現は、エクジソン応答エレメントに依
存する。あるいは、ネイティブなリガンド結合ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン
が、異種応答エレメントを認識する結合ドメインで置換される間にも維持され得
る。従って、遺伝子発現についての事象の配列がエクジソンまたは他の適切なリ
ガンドによって開始される一方、最終的な遺伝子発現は、異種ＤＮＡ結合配列に
対応する応答エレメントの存在に依存する。さらに、トランス活性化領域は、遺
伝子発現が所望される細胞型に依存して置換され得る。従って、特定の細胞型に
おける転写因子を補充するために、その細胞型と適合するトランス活性化領域は
、ネイティブなトランス活性化ドメインを置換し得る。

【００８４】リガンド結合ドメインは、核レセプターのステロイド／甲状腺ホルモンスーパ
ーファミリーのクラスＩＩレセプタータンパク質のメンバー（レチノイン酸レセ
プター、ビタミンＤレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターを含むがこれ
らに限定されない）から得られ得る。

【００８５】トランス活性化ドメインもまた、核レセプターのステロイド／甲状腺ホルモン
スーパーファミリーのクラスＩＩレセプタータンパク質のメンバー（レチノイン
酸レセプター、ビタミンＤレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターを含む
がこれらに限定されない）から得られ得る。あるいは、トランス活性化ドメイン
は、他の転写アクチベーター（単純ヘルペス由来のＶＰ１６、トウモロコシＣ１
、およびＧＡＬ４を含むがこれらに限定されない）から得られ得る。

【００８６】ＤＮＡ結合ドメインもまた、核レセプターのステロイド／甲状腺ホルモンスー
パーファミリー（レチノイン酸レセプター、ビタミンＤレセプター、および甲状
腺ホルモンレセプターを含むがこれらに限定されない）のクラスＩＩレセプター
タンパク質のメンバーから得られ得る。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、他の
転写アクチベーター（ＬｅｘＡおよびＧＡＬ４を含むがこれらに限定されない）
から得られ得る。

【００８７】本明細書中で使用される場合、用語「組換え」とは、ヌクレオチド配列のイン
ビトロ切断および再連結、ならびに、例えば、細胞の内在性配列への外因性配列
の組込みから、相同組換えによるものと同様に得られる、細胞中または生物中に
おける切断および連結をいう。

【００８８】核酸は、それを天然で発現する細胞（例えば、配列が増幅される細胞）から、
またはそれが外因的に導入された細胞（すなわち、組換え細胞）から精製され得
る。あるいは、核酸は、当該分野で周知の合成方法を用いて合成され得る。従っ
て、本明細書中に記載されるタンパク質をコードするヌクレオチドは、発現ベク
ターにクローニングされ得、増幅され得、そして適切な宿主細胞中で発現され得
る。

【００８９】本発明はまた、融合タンパク質を提供するヌクレオチド配列を含み、ここでは
異種タンパク質（本発明のタンパク質とは実質的に相同ではないアミノ酸配列を
有する）が、本発明のタンパク質と融合タンパク質を形成する。これらのヌクレ
オチド配列は、作動可能な連結のために提供されてもよく、または作動可能な連
結のために提供されなくてもよい。

【００９０】本発明は、特に、タンパク質中の１つ以上のドメインが異種機能を有する異種
ドメインと作動可能に連結されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関
する。従って、リガンド結合ドメインは、別のリガンドについてのリガンド結合
ドメインで保持され得る。あるいは、ネイティブなリガンド結合ドメインは、Ｄ
ＮＡ結合ドメインが、異種応答エレメントを認識する結合ドメインで置換される
間にも維持され得る。最終的には、トランス活性化領域もまた、所望されるトラ
ンス活性化領域によって置換され得る。

【００９１】本発明はさらに、レセプター発現ベクター（すなわち、エクジソンレセプター
、Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ、またはキメラ誘導体）に加えて、レセプター発
現ベクターから発現されるタンパク質についての標的として作用するヌクレオチ
ド配列を含む細胞をさらに含む。標的は、標的ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列（この発現は、リガンドの添加および結果としてのレセプタータンパ
ク質の活性化によって制御される）に作動可能に連結した調節領域を含む。この
調節領域は、コアプロモーター配列、転写の開始を可能にする配列、および結合
レセプターについての応答エレメントを含む。

【００９２】従って、任意の所望のコード配列の発現は、コード配列の転写を制御するプロ
モーターが、レセプターポリヌクレオチドのＤＮＡ結合ドメインに対して相補的
な応答エレメントを含むように設計される限りは、所望のように制御され得る。
発現のレベルは、トランス活性化因子の選択によって制御され得る。発現の誘導
は、リガンドの選択によって制御され得る。

【００９３】従って、本発明はさらに、本明細書中に記載されるタンパク質と相互作用する
化学リガンドを提供することによって、特異的遺伝子の発現および遺伝子産物の
産生を制御するための方法に関する。

【００９４】エクジソンレセプターまたはＵＳＰタンパク質、あるいはそれらの組み合わせ
（ヘテロダイマーとして）のいずれかが使用され得る。エクジソンレセプターが
単独で使用される実施態様において、所望のレベルの遺伝子活性化を達成するた
めに、１つ以上の変異が１つ以上のドメインにおいて作製され得る。

【００９５】この系は、宿主細胞を形質転換するために使用される２つ以上の発現カセット
からなり得る。第１の発現カセットは、ＥｃＲタンパク質および／またはＵＳＰ
タンパク質、あるいはそれらの等価物についての配列を含み得る。これらの遺伝
子の転写は、プロモーター（例えば、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモ
ーター、または組織選択的もしくは細胞周期選択的プロモーター）の制御下に配
置され得る。第２の発現カセットは、標的配列を含む。

【００９６】標的配列は、リガンド誘導性発現が所望される目的のタンパク質をコードする
。このような標的配列は、殺虫剤耐性または除草剤耐性、栄養因子、成長誘導剤
をコードする遺伝子、および稔性に必要とされる遺伝子を含み得るがこれらに限
定されない。このような標的配列は、そのプロモーター領域内に含まれるエクジ
ソンまたは他の適切な応答エレメントに続く。

【００９７】１つの実施態様において、形質転換された細胞中で発現されたＥｃＲ／ＵＳＰ
ヘテロダイマーは、標的配列の上流のエクジソン応答エレメントに優先的に結合
する。ヘテロダイマーについてのリガンドが宿主細胞に導入された場合、ＥｃＲ
／ＵＳＰ／リガンド複合体は、遺伝子発現を容易にするように作用する。ＥｃＲ
／ＵＳＰ認識のためのリガンド応答エレメントを含む特定の認識配列は当該分野
で周知であり、そして一般に使用される分子生物学技術を通して標的遺伝子のプ
ロモーター領域に有効に操作され得る。例えば、Ｃｒｉｓｐｉ，Ｓ．，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．２７５（４）：５６１−５７４（１９９８）；Ａｎｔｏｎｉｅｗ
ｓｋｉ，Ｃ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（６）：２９７７−２９８６（１
９９６）；Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．，ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．（９）：８７５−８８２（１９９４）；Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ，Ｃ．，Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４９（５）：５４５−５５６（１９９５年１２月
１５日）；Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ，Ｃ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（７
）４４６５−４４７４（１９９４）；Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ，Ｃ．，Ｉｎｓｅ
ｃｔＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１）：１０５−１１４（１９９３
）を参照のこと。

【００９８】従って、本発明の好ましい実施態様は、標的遺伝子のプロモーター中に操作さ
れるキメラ構築物（ｃｏｎｔｒｕｃｔ）中にＥｃＲまたはＵＳＰを単独で含む、
ＥｃＲ／ＵＳＰ複合体またはその改変された誘導体のいずれかによって認識され
る応答エレメントを含む。次いで、この構築物は、ＥｃＲおよび／またはＵＳＰ
核酸配列あるいはその誘導体を含む発現カセットを用いて宿主細胞を同時形質転
換するために使用され得る。ＥｃＲレセプターポリペプチドによって認識される
リガンドの存在下で、標的遺伝子は選択的に誘導される。この様式における誘導
は、リガンド濃度依存的であり得、遺伝子発現のより高いレベルを生じるリガン
ドの濃度が増加する。従って、リガンド応答性エレメントをペプチドコードセグ
メントに連結することによって、タンパク質産生がリガンドの投与によって調節
されるタンパク質発現系が開発され得る。

【００９９】別の実施態様において、ＥｃＲ単独またはそのキメラ誘導体の発現は、標的配
列の転写を調節する。この実施態様において、ＥｃＲまたはそのキメラ誘導体に
よって認識される応答エレメントは、標的配列の転写調節領域中に操作される。
リガンドの添加は、ＥｃＲの活性化および標的配列の発現を生じる。

【０１００】用語「核酸」とは、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲ
ＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに、ヌクレオチドアナログを使用して生成さ
れるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログをいう。この核酸分子は、一本鎖または二本
鎖であり得る。鎖は、コード鎖または非コード鎖を含み得る。

【０１０１】本明細書中に記載されるタンパク質または他の成分ポリペプチドは、単独で使
用されるか、または他のタンパク質もしくは遺伝子発現を容易にする因子と組み
合わせて使用され得る。エクジソン結合系の成分は、実質的に類似の効果を達成
するために関連するホルモン応答エレメントの他の成分と置換され得ることは、
当該分野において理解される。

【０１０２】本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、微生物および植物を含
む種々の宿主においてタンパク質を発現するために操作および使用され得る。本
発明のタンパク質配列およびＤＮＡ配列は、単独でまたは他のタンパク質と組み
合わせて使用され得ることが理解されている。

【０１０３】本発明のタンパク質は、目的の任意の宿主における発現のために発現カセット
において使用され得る。このような発現カセットは、目的のタンパク質をコード
する遺伝子に連結された転写開始領域を含む。調節領域の転写調節下にあるよう
に、目的の遺伝子の挿入のための複数の制限部位を有するこのような発現カセッ
トが提供され得る。この発現カセットは、使用される特定の宿主生物について適
切な選択マーカー遺伝子をさらに含み得る。

【０１０４】転写開始領域、プロモーターは、植物宿主に対してネイティブか、または類似
か、または外来性か、または異種であり得る。さらに、プロモーターは、天然の
配列であり得るか、あるいは合成配列であり得る。「外来性」によって、転写開
始領域は、転写開始領域が導入されないネイティブな植物においては見出されな
いことが意図される。本明細書中で使用されるように、キメラ遺伝子は、コード
配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に連結されるコード配列を含む
。

【０１０５】コード配列の発現を駆動し得る任意のプロモーターまたはプロモーターエレメ
ントが、使用され得る。例えば、構成的プロモーターとしては、例えば、Ｒｓｙ
ｎ７のコアプロモーター（同時係属米国特許出願第０８／６６１，６０１号）；
コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ
３１３：８１０−８１２）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら（１９９０）Ｐｌ
ａｎｔＣｅｌｌ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅ
ｎら（１９８９）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２および
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：
６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．
Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら（１９８４）Ｅ
ＭＢＯＪ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許出願第
０８／４０９，２９７号）などが挙げられる。他の構成的プロモーターとしては
、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；同第５，６０８，１４４号；同第
５，６０４，１２１号；同第５，５６９，５９７号;同第５，４６６，７８５号
；同第５，３９９，６８０号；同第５，２６８，４６３号；および同第５，６０
８，１４２号に記載のプロモーターが挙げられる。

【０１０６】あるいは、組織選択的プロモーターが、特定の植物組織内での増強されたＥｃ
ＲまたはＵＳＰの発現を標的化するために利用され得る。組織選択的プロモータ
ーとしては、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９７）ＰｌａｎｔＪ．１２（２）２５
５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａら（１９９７）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓ
ｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎＧｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９
７）ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａ
ｒｔら（１９９６）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１
３４１；ＶａｎＣａｍｐら（１９９６）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１２
（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉら（１９９６）Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９
４）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌ
ａｍ（１９９４）ＲｅｓｕｌｔｓＰｒｏｂｌ．ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒ．２０
：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏら（１９９３）ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ
．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａら（１９９３）Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０）２０）：９５８６−９５９０；
およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら（１９９３）ＰｌａｎｔＪ．４（３）
：４９５−５０５に記載のプロモーターが挙げられる。このようなプロモーター
は、必要に応じて、弱い発現のために改変され得る。

【０１０７】植物の生殖器官において発現を指向するプロモーターは、特に興味深い。この
ようなプロモーターとしては、例えば、葯選択的プロモーター、タペート選択的
プロモーター、雌蕊選択的プロモーターおよび胚珠選択的プロモーターが挙げら
れるが、これらに限定されない。葯選択的プロモーターの例としては、ａｎｔ３
２およびａｎｔ４３Ｄ（米国特許出願番号第０７／９０８，２４２号）、葯（タ
ペート）プロモーターＢ６（Ｈｕｆｆｍａｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１７Ｂ：要約＃Ｄ２０９）およびプロモーター５１２６（米国特許
第５，７９５，７５３号）が挙げられる。葯選択的プロモーターの他の例もまた
、米国特許第５，４７０，３５９号に見出され得る。雌蕊選択的プロモーターと
しては、例えば、改変Ｓ１４プロモーター（Ｄｚｅｌｋａｌｎｓら（１９９３）
ＰｌａｎｔＣｅｌｌ５：８５５）が挙げられる。

【０１０８】転写カセットは、５’−３’方向（転写の方向）に、植物中で機能的な、転写
開始領域、翻訳開始領域、目的のＤＮＡ配列、翻訳終結領域および転写終結領域
を含む。終結領域は、転写開始領域に対してネイティブであり得るか、目的のＤ
ＮＡに対してネイティブであり得るか、または他の供給源に由来し得る。簡便な
終結領域は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミドから入手可能であ
る（例えば、オクトピンシンターゼの終結領域およびノパリンシンターゼの終結
領域）。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６
２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ６４：６７１
−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．５：１４１−
１４９；Ｍｏｇｅｎｒａ（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１２６１−１
２７２；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）Ｇｅｎｅ９１：１５１−１５８；Ｂａｌ
ｌａｓら（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：７８９１−
７９０３；Ｊｏｓｈｉら（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
５：９６２７−９６３９もまた参照のこと。

【０１０９】同時形質転換された標的遺伝子の発現のための発現カセットは、その標的遺伝
子の発現を促進するに適切な位置での応答エレメント結合に特異的なプロモータ
ー領域を含む。従って、このような領域は、その遺伝子のクローニング部位の上
流の適切な距離に、かつ適切な方向で含まれる。さもなければ、標的遺伝子の発
現カセットは、先に議論した必要とされるエレメントの全てを含み得る。

【０１１０】本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、植
物の遺伝子操作において特に有用である。この様式において、本発明の遺伝子は
、目的の植物中での発現のための発現カセット内に配置される。このカセットは
、この目的の遺伝子に作動可能に連結された５’調節配列および３’調節配列を
含む。このカセットは、その生物体内へ同時形質転換されるべき少なくとも１つ
のさらなる遺伝子を、さらに含み得る。あるいは、目的の他の遺伝子は、他の発
現カセット上に提供され得る。適切な場合、この遺伝子は、さもなければ、この
形質転換された植物における発現の増加のために最適化され得る。つまり、この
遺伝子は、発現を改善するために植物に選択的なコドンを使用することによって
合成され得る。植物選択的遺伝子を合成するための方法が当該分野で利用可能で
ある。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号、同第５，４３６，３９１号、
およびＭｕｒｒａｙら（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｄｓＲｅｓ．１７：
４７７−４９８（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【０１１１】さらなる配列改変が、細胞性宿主において遺伝子発現を増強することが公知で
ある。これらとしては、偽ポリアデニル化シグナルコード配列、エキソン−イン
トロンスプライス部位シグナルコード配列、トランスポゾン様反復コード配列、
および遺伝子発現に有害であり得る他のこのように非常に特徴付けられた配列を
コードする配列の排除が挙げられる。この配列のＧ−Ｃ含量は、所定の細胞性宿
主細胞において発現される公知の遺伝子を参照して計算される、その所定の細胞
性宿主についての平均レベルに調整され得る。可能な場合、この配列は、推定ヘ
アピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するように改変される。

【０１１２】この発現カセットは、この発現カセット構築物中に５’リーダー配列をさらに
含み得る。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するように作用し得る。翻訳
リーダーは、当該分野で公知であり、これらには、以下のものが挙げられる；ピ
コルナウイルスリーダー（例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎ウイルス５’非
コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ，Ｏ．，Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．および
Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９８９）ＰＮＡＳＵＳＡ８６：６１２６−６１３０）；
ポチウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）リーダー（例えば、ＴＥＶリーダー（タバ
コエッチウイルス）（Ａｌｌｉｓｏｎら、（１９８６）））；ＭＤＭＶリーダー
（トウモロコシ萎縮（Ｄｕａｒｆ）モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１
５４：９−２０）、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）（
Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｇ．およびＰ．Ｓａｒｎｏｗ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，
３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍ
ＲＮＡ（ＡＭＶＲＮＡ４）由来の非翻訳リーダー（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．
およびＧｅｈｒｋｅ，Ｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：６２２−６２５
）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ，Ｄ．Ｒら（１
９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲＮＡ、２３７−２５６
頁）；およびトウモロコシ萎黄病斑（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅ）ウイ
ルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ，Ｓ．Ａ．ら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ８１：３８２−３８５）。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐ
ｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，８４：９６５−９６８もまた参照のこと。発
現を増強することが公知の他の方法もまた、利用され得る（例えば、イントロン
など）。

【０１１３】発現カセットの調製において、種々のＤＮＡフラグメントが、適切な方向に、
かつ適切な場合は、適切な読み枠でそのＤＮＡ配列を提供するように操作され得
る。この目的のために、アダプターまたはリンカーを使用して、このＤＮＡフラ
グメントを連結し得るか、または他の操作を含んで、簡便な制限部位、余分なＤ
ＮＡの除去、制限部位の除去などを提供し得る。この目的のために、インビトロ
変異誘発、プライマー修復、制限処理、アニーリング、切除、連結、ＰＣＲなど
を使用し得、ここで、挿入、欠失または置換（例えば、転位および転換）が含ま
れ得る。

【０１１４】本発明は、種々のリガンドを包含する。第１の非ステロイド性エクジステロイ
ドアゴニストである、ジベンゾイルヒドラジン（ＲＨ−５８４９［１，２−ジベ
ンゾイル，１−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジド］によって代表される）は、Ｒｏｈ
ａｍａｎｄＨａａｓから殺虫剤として市販されており、１９８８年にさかの
ぼって記載された。このシリーズの別の市販の化合物は、ＲＨ−５９９２［テブ
フェノジド（ｔｅｂｕｆｅｎｏｚｉｄｅ），３，５−ジメチル安息香酸１−１（
１，１−ジメチルエチル）−２（４−エチルベンゾイル）ヒドラジド］である。
これらの化合物は、ＭａｎｄｕｃａｓｅｘｔａおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ
ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの両方において２０−ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ
）を模倣する。これらの化合物は、非ステロイド性であるエクジステロイドアゴ
ニストを使用して昆虫を制御する能力を有するという利点を有する。このような
ジベンゾイルヒドラジンのさらなる例は、ＲｏｈａｍおよびＨａａｓに対する米
国特許第５，１１７，０５７号、およびＯｉｋａｗａら、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ
．４１：１３９−１４８（１９９４）において与えられる。しかし、本発明の遺
伝子スイッチの任意の誘導物質（ステロイド性または非ステロイド性であるか、
そして現在入手可能であるか、または入手可能になるかに関わらず）が、使用さ
れ得ることが理解される。好ましいリガンドは、メトキシフェノジドである。

【０１１５】

【化１】エクジソンのアナログ（例えば、ＭｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅＡ）もまた、本発
明に包含される。

【０１１６】本発明のヌクレオチド配列のペプチド産物もまた、他の潜在的なリガンドアナ
ログを解明するために使用され得る。コンビナトリアル合成方法によって作製さ
れる低分子の多様なライブラリーのスクリーニングは、結合親和性を有する化合
物を同定するために使用され得る。当業者は、リガンド結合のアゴニストおよび
アンタゴニストの両方についてスクリーニングするための高感度アッセイを開発
するために、提供されるこのペプチド配列を使用し得る。

【０１１７】ＥｃＲまたはＵＳＰの発現ならびに標的遺伝子発現のための発現カセットの構
築において、種々の一般に認知されるプラスミドが使用され得る。当業者は、コ
ンピテント細胞を、発現カセットで形質転換し得、このカセットが自律複製を促
進することか、またはこの宿主細胞染色体内に組み込むことを認識する。ＥｃＲ
、ＵＳＰおよび標的遺伝子は、単一のカセットまたは複数のカセットに含まれ得
る。さらに、ＥｃＲまたはＵＳＰを使用して、形質転換された宿主細胞において
複数の標的遺伝子の発現を調節し得ることが、本発明者らによって想定される。

【０１１８】本発明のＥｃＲまたはＵＳＰペプチドは、ステロイド／ホルモンレセプターフ
ァミリーの他のメンバーと組み合わせられ得る。例えば、Ｒｏｗｅ，Ａ．（１９
９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２）：２７５−２
７８；Ｇｌａｓｓ，Ｃ．（１９９６）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１５０（３
）：３４９−３５７；Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｐ（１９９６）ＦＡＳＥＢＪ．，１
０（９）：９４０−９５４；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．（１９９６）Ｃｅｌ
ｌ，８３（６）：８４１−８５０を参照のこと。ＤＮＡ結合核ホルモンレセプタ
ーのステロイド／甲状腺ホルモンレセプタースーパーファミリーのメンバーは、
種を越えて反応することで示されている。従って、トランスレチノイン酸、甲状
腺ホルモン、ビタミンＤまたはペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターでＥ
ｃＲに代える置換は、ＤＮＡ相互作用を促進し得る。このようなキメラタンパク
質は、このスーパーファミリーのメンバーの結合特性の重要な反映を提供する。
このような組み合わせは、さもなければネイティブまたは比較的相同なタンパク
質に受け入れられないかもしれない広範な系または種における、これらの分子の
適用可能性の範囲を広げるためにさらに使用され得る。従って、キメラ構築物は
、ネイティブ構築物が種特異的な制限のために機能的ではない系内に置換され得
る。ハイブリッド構築物は、ネイティブタンパク質と組み合わせて、さもなけれ
ば利用可能でない、所望または通常でない、特性をさらに示し得る。

【０１１９】本発明の別の実施態様において、本明細書中に記載のタンパク質に結合するリ
ガンドについてスクリーニングするための方法を提供する。従って、タンパク質
およびその関連フラグメント（例えば、リガンド結合ドメイン）の両方は、レセ
プターに結合し、従って遺伝子発現を誘導する化合物についてスクリーニングす
るために使用され得る。このアッセイは，細胞ベースのアッセイまたは無細胞の
アッセイであり得、これらは、リガンド結合ドメイン（可溶性または細胞に関連
するかのいずれかの）を候補化合物に曝露する工程、および複合体の形成を検出
する工程あるいはその活性化レセプターによって引き起こされる遺伝子発現に関
連する生物学的事象を検出する工程のいずれかを含む。

【０１２０】本発明の他の実施態様において、特に、その遺伝子の発現がもはや所望されな
い場合か、または遺伝子発現をより低いレベルに減少させることが所望される場
合に、遺伝子発現をネガティブに制御することが所望され得る。この実施態様に
おいて、発現は、目的の遺伝子に対して指向されるアンチセンス分子の使用によ
ってブロックされ得る。例えば、米国特許第５，７２８，５５８号および同第５
，７４１，６８４号を参照のこと。

【０１２１】本発明のさらなる実施態様において、抗体を使用して、細胞におけるレセプタ
ー発現を検出する。好ましい実施態様において、検出は、トランスジェニック植
物においてであり、そしてその植物の種々の部分における発現を評価することに
関する。タンパク質の検出は、組織切片のインサイチュハイブリダイゼーション
によってインサイチュであり得るが、大量のタンパク質精製、および大量調製物
のウェスタンブロットまたは免疫学的アッセイによる引き続く分析によって分析
もまたされ得る。あるいは、遺伝子発現は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのレベ
ルを評価するために相補的ポリヌクレオチドを使用する任意の分野の当業者に周
知の技術によって、核酸レベルで発現され得る。例えば、目的の核酸に相補的な
ＰＣＲプライマーが、発現のレベルを同定するために使用され得る。

【０１２２】目的の植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロ
コシ（Ｚｅａｍａｙｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ、Ｂｒａ
ｓｓｉｃａｒａｐａｓｐｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａ
ｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅｃ
ｅｒｅａｌｅ）、トウモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈ
ｕｍｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）、
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍ
ａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌ
ａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａ
ｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍ
ｏｅａｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａ
）、コーヒー（Ｃｏｆｅａｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆ
ｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓｃｏｍｏｓｕｓ）、カンキツ類の木（
Ｃｉｔｒｕｓｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａｃａｃａｏ）、茶（
Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ種）、アボカト（Ｐ
ｅｒｓｅａａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓｃａｓｉｃａ）、
バンジロウ（Ｐｓｉｄｉｕｍｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒ
ａｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａｅｕｒｏｐａｅａ）、カラスムギ、
オオムギ、野菜、花卉、および針葉樹。好ましい植物としては、トウモロコシ、
ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラナ属、コムギ、オオムギ、ライムギ、アル
ファルファ、イネおよびモロコシ属が挙げられる。しかし、本発明は、宿主細胞
が、キメラレセプターが他の細胞型の細胞（例えば、昆虫および真菌のような無
脊椎動物細胞、ならびに鳥類および哺乳類のような動物細胞）由来の異種ドメイ
ン以外のエクジソンリガンド結合ドメインを含む植物細胞以外である実施態様を
包含することが理解される。

【０１２３】本発明の組成物は、好ましくは植物を形質転換するために使用される。この様
式において、遺伝的に改変された植物、植物細胞、植物組織、種子などが、入手
され得る。「形質転換された」によって、細胞のゲノム内へのＤＮＡの安定な導
入が意図される。形質転換プロトコルおよび植物内へヌクレオチド配列を導入す
るためのプロトコルは、形質転換について標的化される植物または植物細胞の型
（すなわち、単子葉または双子葉）に依存して変化し得る。植物細胞内へのヌク
レオチド配列の導入および引き続くその植物ゲノム内への挿入の適切な方法とし
ては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇ
ｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：５６
０２−５６０６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎ
ｄら、米国特許第５，５６３，０５５号）、直接遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓ
ｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：２７１７−２７２２）、および銃式（ｂ
ａｌｌｉｓｔｉｃ）粒子加速（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４
５，０５０号；Ｔｏｍｅｓｒａ，米国特許第５，８７９，９１８号；Ｔｏｍｅｓ
ら、米国特許第５，８８６，２４４号；Ｂｉｄｎｅｙら、米国特許第５，９３２
，７８２号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「ＤｉｒｅｃｔＤＮＡＴｒａｎｓｆ
ｅｒｉｎｔｏＩｎｔａｃｔＰｌａｎｔＣｅｌｌｓｖｉａＭｉｃｒｏ
ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅＢｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，Ｔｉ
ｓｓｕｅ，ａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ：ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＭ
ｅｔｈｏｄｓ、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；およびＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６）が挙げられる。また、以下も参照のこ
と：Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：
４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）ＰａｒｔｉｃｕｌａｔｅＳｃ
ｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃ
ｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６
７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：９２３−９２６（ダイズ）；ＦｉｎｅｒおよびＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１
）ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（
ダイズ）；Ｓｉｎｇｈら（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６
：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ
）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：５５９−５６
３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓ、米国特許第５，２４０，８５５号；Ｂｕｉｓ
ｉｎｇら、米国特許第５，３２２，７８３号および同第５，３２４，６４６号；
Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「ＤｉｒｅｃｔＤＮＡＴｒａｎｓｆｅｒｉｎｔ
ｏＩｎｔａｃｔＰｌａｎｔＣｅｌｌｓｖｉａＭｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃ
ｔｉｌｅＢｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａ
ｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ：ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＭｅｔｈｏｄｓ
、Ｇａｍｂｏｒｇ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（トウ
モロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）ＰｌｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：
４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ
Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７
６３−７６４；Ｂｏｗｅｎら、米国特許第５，７３６，３６９号（穀類）；Ｂｙ
ｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；ＤｅＷｅｔら（１９８５）Ｔｈｅ
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＯｖｕｌｅＴ
ｉｓｓｕｅｓ、Ｃｈａｐｍａｎｎら編（Ｌｏｎｇｍａｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ）１
９７−２０９頁（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌ
ｌＲｅｐｏｒｔｓ９：４１５−４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒら（１９９２
）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー（ｗ
ｈｉｓｋｅｒ）媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１
９９３）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１２：２５０−２５５ならび
にＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＦｏｒｄ（１９９５）ＡｎｎａｌｓｏｆＢｏｔａ
ｎｙ７５：４０７−４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒ
ｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：７４５−７５０（トウモロコシ（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介する））（これら全ては
、本明細書中で参考として援用される）。

【０１２４】形質転換された細胞は、従来の方法に従って、植物に成長させ得る。例えば、
ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ５
：８１−８４を参照のこと。次いで、これらの植物を増殖させ得、そして同じ形
質転換株または異なる株のいずれかで受粉させ得、そして所望の表現型特性を有
する生じたハイブリッドを同定し得る。２以上の世代を成長させて、その表現型
特性が安定に維持および遺伝されることを確認し得、種子を回収して、所望の表
現型特性または他の特性が達成されていることを確認し得る。

【０１２５】この系は、植物発達サイクルにおける特定の時点で、特定のタンパク質の発現
を選択的に誘導するために有用であることが、本発明者らによって想定される。
特定の穀物の栄養価を増強する標的遺伝子（単数または複数）が導入され得る。
この成分は、収穫直前に誘導され得るか、低用量のリガンドを成長および発達の
間を通して投与して、特定の産物の貯蔵を作製し得る。この系はまた、殺虫特性
または除草剤耐性を選択的に誘導するために使用され得る。除草剤耐性の場合、
そのリガンドを除草剤の適用前にスプレーすることによって植物に導入して、他
の所望でない競合者を排除し得ることが、本発明者らによって想定される。本発
明者らは、環境因子に対する植物耐性の増強における、この系の使用をさらに想
定する。タンパク質を、過酷な天候条件に応答して選択的に誘導し、寒冷、乾燥
または土壌過飽和のような条件に対する植物の耐性を一過的に増強し得る。

【０１２６】当業者に公知の組織選択的プロモーターの使用は、特定の組織型または細胞型
に対する誘導性を制限し得ることが想定される。本発明者らは、ＥｃＲおよび／
またはＵＳＰ、あるいはこれらのキメラ誘導体の発現の、組織選択的プロモータ
ーでの調節を想定する。この組み合わせは、特定の組織においてのみ、または特
定の発達段階でのみ、標的配列の転写を活性化する。従って、この系を使用して
、植物の種子または生殖構造物において、その生物体の他の領域においてほとん
どまたは全く発現を伴わずに、発現を選択的に誘導し得る。従って、発現産物は
、ヒト消費の対象であり得る領域において、またはその領域とは別に、区画化さ
れ得る。

【０１２７】本発明者らの特定の目的の実施態様は、発生中の植物における稔性または生殖
系を変化させることにおける特許請求の範囲に記載の発明の使用である。本発明
者らは、生殖を促進する、植物の組織における遺伝子の発現を、促進または抑制
するエクジソン誘導性発現系の使用を想定する。当業者は、所定の植物の稔性ま
たは生殖の様式を調節するために、選択的に誘導または発現され得る特定の遺伝
子が公知であることを認識する。例えば、米国特許第５，４３２，０６８号は、
遺伝子が「オフ」の場合に植物が不稔性であるが；プロモーターが誘導される場
合に、その植物が稔性となるような、雄性稔性にとって重要な遺伝子の発現を調
整する誘導性プロモーターを使用することにより、植物を制御可能に雄性稔性と
するための方法を教示する。従って、本発明の１つの実施態様は、そのような方
法を使用する、植物における雄性稔性を調節するためのエクジソム（ｅｃｄｙｓ
ｏｍｅ）誘導性発現系の使用である。

【０１２８】さらに、生殖プロセスを無効にするために、生存可能な接合体の形成が妨げら
れ得る。このことは、種々の手段（例えば、生存可能な配偶子の形成にとって重
要なプロセスの任意の破壊または改変を含む）を介して、達成され得る。雄性不
稔性は、花粉形成の欠乏または効果的な受粉をし得ない花粉の生成のいずれかを
もたらす欠損より生じ得る。雌性不稔性は、花粉の発芽、成長または受粉に必要
な組織の破壊より生じ得る。このことは、例えば、機能的な、胚嚢、子房、雌蕊
、柱頭または伝達路（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇｔｒａｃｔ）の産生をしない
ことから生じ得る。さらに、生殖の代替的様式は、子孫が減数分裂または正常の
二重受精を行ったことのない雌性植物相成分を無性的に使用して産生される、ア
ポミクシスである。

【０１２９】受精プロセスの破壊に有用である、目的のタンパク質をコードする標的配列と
しては、例えば、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）（Ｍ
ｏｆｆａｔｔら、（１９８８）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８６：１１５０〜
１１５４、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のリボ
ヌクレアーゼ（Ｍａｒｉａｎｉら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４７：７３７
〜７４１）、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ由来のインドール酢酸リ
ジンシンセターゼ（Ｒｏｍａｎｏら、（１９９１）ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ５：４３８〜４４６）、Ｅｒｗｉｎｉａｃｈｒｙｓａｎｔ
ｈｅｍｉＥＣ１６由来のペクチン酸塩リアーゼｐｅｌＥ（Ｋｅｅｎら、（１９
８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６８：５９５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｉｓｒａｅｌｉｅｎｓｉｓ由来のＣｙｔＡ毒素（
ＭｃＬｅａｎら、（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６９：１０１
７〜１０２３）ｃｍｓ−Ｔトウモロコシミトコンドリアゲノム由来のＴ−ｕｒｆ
１３（Ｂｒａｕｎら、（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１５３）、μフ
ァージのｇｉｎリコンビナーゼ（Ｍａｅｓｅｒら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０〜１７６）、およびジフテリア毒素Ａ鎖（Ｇｒｅ
ｅｎｆｉｅｌｅｄら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８
０：６８５３）が挙げられる。

【０１３０】本発明者らは、受精プロセスを破壊する目的のタンパク質をコードする標的配
列で植物の形質転換を想定する。ＥｃＲおよび／またはＵＳＰあるいはそれらの
誘導体の発現を制御するための、葯および雌蕊選択的プロモーターの使用は、稔
性に必要な組織における標的配列の発現を保証する。従って、標的配列は、他の
植物組織に対して有害ではない。

【０１３１】例えば、トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物細胞を形質転
換して、複数のＤＮＡ構築物を含ませ得る。第１のＤＮＡ構築物は、エクジソン
レセプターまたはそのキメラ誘導体をコードする。このＤＮＡ構築物は、葯特異
的または選択的特異的プロモーター、器官特異的転写アクチベーター、ＤＮＡ結
合ドメイン、およびＥｃＲリガンド結合ドメインを含む。第２のＤＮＡ構築物は
、標的配列に作動可能に連結された構成的プロモーターと作動可能に連結された
適切な転写応答エレメントを含む。エクジソンを用いるトランスジェニック植物
の処理は、標的配列の発現をもたらし、そして植物を不稔性とする。

【０１３２】別の実施態様において、第３のＤＮＡ構築物が、植物中に導入され、そしてＵ
ＳＰコード配列またはそのキメラ誘導体に作動可能に連結された組織選択的プロ
モーターを含む。この実施態様において、エクジソン処理の後、標的配列をコー
ドするＤＮＡ構築物の発現がＵＳＰ／ＥｃＲヘテロ二量体によって調節される。

【０１３３】以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定の目的ではない。

【０１３４】（実施例）（実施例１：エクジソンレセプターおよびＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅの単離
）ライブラリー構築のために、ヨーロッパアワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎｃ
ｏｒｎｂｏｒｅｒ）であるＯｓｔｒｉｎｉａｎｕｂｉｌａｌｉｓより総ＲＮ
Ａを単離した。アワノメイガの幼生（例えば、第２期、第３期、および第４期の
混合物（等重量））を、液体窒素中で粉砕し、ホモジナイズし、そして総ＲＮＡ
を、標準的な手順によって抽出し得る。ポリＡＲＮＡを、ＰｒｏｍｅｇａＣ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＰｏｌｙＡＴａｃｔ
システムを用いて、総ＲＮＡから単離した。ｃＤＮＡ合成を実行し、そして一方
向性ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ
）からのＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓｃＤＮＡ合成キットに従って、構築した。ｃ
ＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、サイズ分画し、そしてベクター中に連結するた
めに、制限フラグメントに適切に消化した。ＥｃＲ遺伝子およびＵＳＰ遺伝子の
ためのプローブを、ｃＤＮＡから単離した。ｃＤＮＡおよび縮重プライマーを、
ＰＣＲ混合液中で、合わせた。増幅後、顕著なバンドをサブクローニングおよび
配列決定し、そして得られたフラグメントを使用して、アワノメイガライブラリ
ーからのＥｃＲおよびＵＳＰのためのプローブとし得る。ＥｃＲを増幅するため
に使用したプライマーは、

【０１３５】

【化２】であった。ＵＳＰについて、以下のプライマーを使用した。

【０１３６】

【化３】サブクローニングしたｃＤＮＡを、配列決定し、公開された配列に対応する適切
な配列同一性を有する配列を同定した。これらのフラグメントを使用して、Ｏｓ
ｔｒｉｎｉａｎｕｂｉｌａｌｉｓ由来のｃＤＮＡをプローブし、そして全長コ
ード配列を得た。コード配列を、発現カセット中に連結し、そして配列決定した
。

【０１３７】（実施例２：一過性発現アッセイを使用する、エクジソンおよびＵＳＰレセプ
ターによるレポーター配列のトランス活性化）プロモーター誘導性発現に対するエクジソンおよびＵＳＰの効果を試験するた
めに、トウモロコシ胚由来の細胞懸濁培養物を使用する、一過性トランス活性化
アッセイを開発した（米国特許第５，８８６，２４４号もまた参照のこと）。Ｐ
ＨＰ１１５４５と称するレポータープラスミドを、ｐＳＰ７２ベクター中に構築
し、そして８つのＬｅｘＡオペレーター、ＣａＭＶ５９構成的プロモーターの最
少フラグメント、Ωリーダー配列、Ａｄｈイントロン１、ホタルルシフェラーゼ
のコード配列、およびＰｉｎＩＩターミネーター配列を含んだ。

【０１３８】エフェクタータンパク質をコードする２つのＤＮＡ構築物を生成した。ＰＨＰ
１０９５６と称するキメラエクジソンレセプター構築物を生成した。ＰＨＰ１０
９５６は、ｐＵＣベクター中にクローニングされた、ノパリンシンターゼ（ＮＯ
Ｓ）プロモーター、Ωリーダー配列、Ａｄｈ１イントロン、ポテトプロテアーゼ
インヒビターＩＩ（ＰｉｎＩＩ）終結配列を含む。トウモロコシＣ１トランス活
性化ドメイン、ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメイン、およびエクジソンレセプターの
リガンド結合ドメインとの間の融合物をコードするフラグメントを、イントロン
の下流にクローニングした。

【０１３９】ＵＳＰコード配列を含有するＤＮＡ構築物を生成して、ＰＨＰ１０９６７と命
名した。ＰＨＰ１０９６７は、ｐＵＣベクターにクローニングされた、Ｎｏｓプ
ロモーター、Ωリーダー配列、Ａｄｈ１イントロン、およびＰｉｎＩＩ終結配列
を含む。ＵＳＰコード領域をコードする核酸配列を、イントロンの下流に挿入し
た。

【０１４０】これらの構築物を、Ｕｎｇｅｒら（１９９３）ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ
５：８３１〜８４１により記載された微小発射体（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔ
ａｉｌｅ）ボンバードメントにより胚形成懸濁細胞中に導入した。エフェクター
配列をコードするプラスミドＤＮＡおよびレポーター配列をコードするプラスミ
ドＤＮＡを、１．０μｍタングステン微小発射体５０μｍ（１５ｍｇ／ｍｌ）と
混合した。このエフェクター配列をコードするプラスミドおよびレポーター配列
をコードするプラスミドの濃度を図１に示す。ＤＮＡを、５０μｌの２．５Ｍ
ＣａＣｌ₂および２０μｌの０．１Ｍスペルミジンの添加により沈殿させた。微
小発射体および沈殿したＤＮＡを遠心分離してペレットにし、そしてその上清を
取り除いた。このペレットを、２５０μｌの無水エタノールの存在下での超音波
処理により洗浄し、遠心分離し、そしてエタノールを除いた。６０μｌの新しい
無水エタノールを添加し、そしてこの混合物を超音波処理して、このペレットを
分散させた。この微小発射体−ＤＮＡ混合物の１０μｌアリコートを、各マクロ
キャリア上に配置し、そしてヘリウム駆動微小発射体銃であるＰＤＳ−１０００
（１１００ｐｓｉ破壊ディスク装置圧）を使用して、トウモロコシ懸濁細胞へと
ボンバードメントした。胚形成懸濁培養物の維持および一過性発現アッセイを、
以前にＵｎｇｅｒら（１９９３）ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ５：８３１〜
８４１および米国特許第５，８８６，２４４号により記載されたように実施した
。

【０１４１】

【表１】この胚形成懸濁細胞へのレポータープラスミドおよびエフェクタープラスミド
の同時ボンバードメントの後、ルシフェラーゼレポーター構築物のトランス活性
化をアッセイした。一過性に形質転換されたカルス組織を、水または培地、およ
びリガンドまたはエタノールキャリアに浸漬した濾紙上でインキュベートした。
この一過性アッセイのために、５０ｍｇのカルス組織を、リガンド（１０μＭ
ＲＨ５９９２）またはエタノールキャリアコントロールの存在下でインキュベー
トした。このルシフェラーゼアッセイは、以前に記載されたように（Ｕｎｇｅｒ
ら（１９９３）ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ５：８３１〜８４１）、２６℃
での１６〜１８時間のインキュベーション後に実施した。

【０１４２】ルシフェラーゼ発現を平均光単位で測定し、そしてその結果を表２にまとめる
。ＵＳＰレセプター（プラスミドＰＨＰ１０９６７）およびＣ１：：ＬｅｘＡ：
：エクジソン融合タンパク質（プラスミドＰＨＰ１０９５６）の発現は、ＲＨ５
９９２リガンドの存在下で、ＬｅｘＡ応答性ルシフェラーゼレポーター（ＰＨＰ
１１５４５）を５３倍にトランス活性化した（表２）。

【０１４３】ＵＳＰレポーターは、このルシフェラーゼレポーターのトランス活性化に必要
でなかった。Ｃ１：：ＬｅｘＡ：：エクジソン融合タンパク質（プラスミド１０
９５６）のみの発現が、ＲＨ５９９２リガンドの存在下で、このＬｅｘＡ応答性
ルシフェラーゼレポーター遺伝子のトランス活性化を生じた（表２）。

【０１４４】

【表２】（実施例３）（キメラエクジソンレセプターによるレポーター配列のトランス活性化）プロモーター駆動性発現に対するこのエクジソンレセプターの効果をさらに試
験するために、安定なトランス活性化アッセイを、キメラエクジソンレセプター
を使用して実施した。エフェクターＤＮＡ配列およぼレポーターＤＮＡ配列の両
方の発現のためのＤＮＡ構築物を、作製した。

【０１４５】レポータープラスミド（名称ＰＨＰ１６５４）を、ｐＳＰ７２ベクター中に構
築した。このプラスミドは、５つのＧＡＬ４応答性エレメント、最小ＣａＭＶ−
５９構成的プロモーター、ωリーダー配列、Ａｄｈイントロン１、ホタルルシフ
ェラーゼのコード配列、およびＰｉｎＩＩターミネーター配列を含んだ。

【０１４６】キメラエクジソンレセプタータンパク質をコードする２つのＤＮＡ構築物を作
製した。このキメラエクジソンレセプター構築物（名称ＰＨＰ１０５１２）は、
ｐＵＣベクター中にクローニングされたノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモー
ター、ωリーダー配列、Ａｄｈ１イントロン、３５５プロモーター、ＰＡＴ遺伝
子およびポテトプロテアーゼインヒビターＩＩ（ＰｉｎＩＩ）終結配列を含む。
トウモロコシＣ１トランス活性化ドメイン、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインとエ
クジソンレセプターのリガンド結合ドメインとの間の融合物をコードするフラグ
メントを、このイントロンの下流にクローニングした。

【０１４７】プラスミド（名称ＰＨＰ１０５１３）はまた、ｐＵＣベクタ−中にクローニン
グされたノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター、ωリーダー配列、Ａｄｈ
１イントロン、３５５プロモーター、ＰＡＴ遺伝子、およびポテトプロテアーゼ
インヒビターＩＩ（ＰｉｎＩＩ）終結配列を含む。しかし、このイントロンのす
ぐ下流にキメラレセプターをコードするフラグメントは、ＶＰ１６活性化ドメイ
ン、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインとエクジソンレセプターのリガンド結合ドメ
インとの間の融合物を含む。

【０１４８】Ｈｉ−ＩＩ遺伝子型由来の約１．５〜２．０ｍｍの長さの未熟胚（Ａｒｍｓｔ
ｒｏｎｇおよびＰｈｉｌｉｐｓ（１９８８）ＣｒｏｐＳｉ．２８：３６３〜３
６９）を、ＰＨＰ１６５４レポータープラスミド、およびＰＨＰ１０５１３また
はＰＨＰ１０５１２のいずれかを用いてボンバードメントした。上記のように、
選択マーカー遺伝子であるＰＡＴを、ＰＨＰ１０５０５１３およびＰＨＰ１０５
１２上に含ませた。このＰＡＴ遺伝子は、除草剤ビアロホス（ｂｉａｌｏｐｈｏ
ｓ）に対する耐性を付与する（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ７
０：２５〜３７）。

【０１４９】胚を、Ｔｏｍｅｓら（１９９４）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ、Ｔｉｓｓｕｅ、ａｎ
ｄＯｒｇａｎｃｕｌｔｕｒｅ、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＭｅｔｈｏｄｓ
１９７〜２１３に記載されるプロトコルを使用してボンバードメントした。詳細
には、Ｈｉ−ＩＩ未熟胚をボンバードメントし、そしてＳｏｎｇｓｔａｄら、１
９９３ＡｇｒｏｎｏｍｙＡｂｓｔｒａｃｔｓ１８３により記載されるよう
に選択培地上で培養した。トランスジェニックカルスからの植物再生を、Ａｒｍ
ｓｔｒｏｎｇおよびＰｈｉｌｉｐｓ（１９８８）ＣｒｏｐＳｃｉ２８：３６
３〜３６９のプロトコルに従って実施したが、ただし、ビアラホス（３ｍｇ／ｍ
ｌ）を、この再生培地の各々に添加した。植物を、温室中で確立した。

【０１５０】キメラエクジソンによりルシフェラーゼレポーター配列のトランス活性化を、
標準的プロトコルを使用してアッセイした。各個別のＴ₀植物からの４枚の葉の
パンチ（ｐｕｎｃｈ）を、Ｈ₂Ｏ（ｗ／ＥｔＯＨキャリア）かまたはＨ₂Ｏ中の１
０μＭＲＨ５９９２に浸した濾紙上に配置した。サンプルを１６時間インキュ
ベートし、そしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。個々の植物由来の
アッセイされた２００μｌ総抽出物のうちの２０μｌの、ネガティブコントロー
ル（すなわち、Ｈ₂Ｏに浸した葉のパンチ）およびＲＨ５９９２誘導サンプルの
両方からの結果を、光単位で示す。この結果を、表３に示す。

【０１５１】

【表３】安定なトランス活性化アッセイの結果は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、エ
クジソンレセプターのリガンド結合ドメイン、およびトウモロコシＣ１由来のト
ランス活性化ドメインかまたはＶＰ１６由来のトランス活性化ドメインのいずれ
かを含むキメラエクジソンレセプターの発現が、エクジソンレセプターリガンド
の存在下で適切な標的配列の転写を活性化し得ることを示す。

【０１５２】本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許出願は、本出願が属する分
野の当業者のレベルを示す。すべての刊行物および特許出願は、あたかも各個々
の刊行物または特許出願が詳細かつ個別に、参考として援用されると示されたか
のような程度に、本明細書中で参考として援用される。

【０１５３】上記の本発明は、理解の簡明さの目的のために、例示および実施例によってい
くらか詳細に記載されたが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の
範囲内で実施され得ることが、明らかである。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１０月２０日（１９９９．１０．２０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９８】従って、本発明の好ましい実施態様は、標的遺伝子のプロモーター中に操作さ
れるキメラ構築物中にＥｃＲまたはＵＳＰを単独で含む、ＥｃＲ／ＵＳＰ複合体
またはその改変された誘導体のいずれかによって認識される応答エレメントを含
む。次いで、この構築物は、ＥｃＲおよび／またはＵＳＰ核酸配列あるいはその
誘導体を含む発現カセットを用いて宿主細胞を同時形質転換するために使用され
得る。ＥｃＲレセプターポリペプチドによって認識されるリガンドの存在下で、
標的遺伝子は選択的に誘導される。この様式における誘導は、リガンド濃度依存
的であり得、遺伝子発現のより高いレベルを生じるリガンドの濃度が増加する。
従って、リガンド応答性エレメントをペプチドコードセグメントに連結すること
によって、タンパク質産生がリガンドの投与によって調節されるタンパク質発現
系が開発され得る。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１２７】本発明者らの特定の目的の実施態様は、発生中の植物における稔性または生殖
系を変化させることにおける特許請求の範囲に記載の発明の使用である。本発明
者らは、生殖を促進する、植物の組織における遺伝子の発現を、促進または抑制
するエクジソン誘導性発現系の使用を想定する。当業者は、所定の植物の稔性ま
たは生殖の様式を調節するために、選択的に誘導または発現され得る特定の遺伝
子が公知であることを認識する。例えば、米国特許第５，４３２，０６８号は、
遺伝子が「オフ」の場合に植物が不稔性であるが；プロモーターが誘導される場
合に、その植物が稔性となるような、雄性稔性にとって重要な遺伝子の発現を調
整する誘導性プロモーターを使用することにより、植物を制御可能に雄性稔性と
するための方法を教示する。従って、本発明の１つの実施態様は、そのような方
法を使用する、植物における雄性稔性を調節するためのエクジソン誘導性発現系
の使用である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１３１】例えば、トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物細胞を形質転
換して、複数のＤＮＡ構築物を含ませ得る。第１のＤＮＡ構築物は、エクジソン
レセプターまたはそのキメラ誘導体をコードする。このＤＮＡ構築物は、葯また
は雌蕊選択的プロモーター、器官特異的転写アクチベーター、ＤＮＡ結合ドメイ
ン、およびＥｃＲリガンド結合ドメインを含む。第２のＤＮＡ構築物は、標的配
列に作動可能に連結された構成的プロモーターと作動可能に連結された適切な転
写応答エレメントを含む。エクジソンを用いるトランスジェニック植物の処理は
、標的配列の発現をもたらし、そして植物を不稔性とする。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１４６】キメラエクジソンレセプタータンパク質をコードする２つのＤＮＡ構築物を作
製した。このキメラエクジソンレセプター構築物（名称ＰＨＰ１０５１２）は、
ｐＵＣベクター中にクローニングされたノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモー
ター、ωリーダー配列、Ａｄｈ１イントロン、３５Ｓプロモーター、ＰＡＴ遺伝
子およびポテトプロテアーゼインヒビターＩＩ（ＰｉｎＩＩ）終結配列を含む。
トウモロコシＣ１トランス活性化ドメイン、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインとエ
クジソンレセプターのリガンド結合ドメインとの間の融合物をコードするフラグ
メントを、このイントロンの下流にクローニングした。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１４７】プラスミド（名称ＰＨＰ１０５１３）はまた、ｐＵＣベクタ−中にクローニン
グされたノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター、ωリーダー配列、Ａｄｈ
１イントロン、３５Ｓプロモーター、ＰＡＴ遺伝子、およびポテトプロテアーゼ
インヒビターＩＩ（ＰｉｎＩＩ）終結配列を含む。しかし、このイントロンのす
ぐ下流にキメラレセプターをコードするフラグメントは、ＶＰ１６活性化ドメイ
ン、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインとエクジソンレセプターのリガンド結合ドメ
インとの間の融合物を含む。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１４８】Ｈｉ−ＩＩ遺伝子型由来の約１．５〜２．０ｍｍの長さの未熟胚（Ａｒｍｓｔ
ｒｏｎｇおよびＰｈｉｌｉｐｓ（１９８８）ＣｒｏｐＳｉ．２８：３６３〜３
６９）を、ＰＨＰ１６５４レポータープラスミド、およびＰＨＰ１０５１３また
はＰＨＰ１０５１２のいずれかを用いてボンバードメントした。上記のように、
選択マーカー遺伝子であるＰＡＴを、ＰＨＰ１０５１３およびＰＨＰ１０５１２
上に含ませた。このＰＡＴ遺伝子は、除草剤ビアロホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）
に対する耐性を付与する（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ７０：
２５〜３７）。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年４月２日（２００２．４．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項４】前記第１のプロモーターが、葯選択的プロモーター、タペー
ト選択的プロモーター、胚珠選択的プロモーター、および雌蕊選択的プロモータ
ーからなる群より選択される組織選択的プロモーターである、請求項３に記載の
方法。

【請求項５】前記リガンドが非ステロイド性エクジステロイドアゴニスト
、２０−ヒドロキシエクジソンおよびそれらのアナログからなる群より選択され
る、請求項３に記載の方法。

【請求項６】目的の前記ヌクレオチド配列の発現が植物の稔性を破壊する
、請求項３に記載の方法。

【請求項７】目的の前記ヌクレオチド配列の発現が、さもなくば不稔性の
植物において稔性を誘導する、請求項３に記載の方法。

【請求項８】目的の前記ヌクレオチド配列の発現が変更した生殖様式を誘
導する、請求項３に記載の方法。

【請求項９】請求項３に記載の方法であって、第３のヌクレオチド配列に
作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第３の発現カセットを該植物のゲノム中に安定に組み込む工程であって、該第３のヌクレオチド配列が、以下：ａ）配列番号３に示される配列を含むヌクレオチド配列または配列番号３に記載のヌクレオチド２２４〜１６０３を含む配列；ならびに、ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列、からなる群より選択される、工程、をさらに包含する、方法。

【請求項１０】ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを
含む発現ベクターであって、該ヌクレオチド配列が、以下：ａ）配列番号１に示される配列を含むヌクレオチド配列または配列番号１に記載のヌクレオチド３６８〜２００５を含む配列を含むヌクレオチド配列；ならびに、ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列、からなる群より選択される、発現ベクター。

【請求項１１】キメラレセプターをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターであって、ここで、該キメラレ
セプターが、活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメイ
ンを含み、ここで、該ドメインの少なくとも１つが、エクジソンレセプタードメインであり、そして配列番号１に示されるヌクレオチド配列または配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、発現ベクター。

【請求項１３】ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを
含む発現ベクターであって、該ヌクレオチド配列が、以下：ａ）配列番号３に示される配列を含むヌクレオチド配列または配列番号３に記載のヌクレオチド２２４〜１６０３を含むヌクレオチド配列；ならびに、ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列、からなる群より選択される、発現ベクター。

【請求項１５】請求項１４に記載の植物および植物の一部であって、該植
物および該植物の一部が、該植物のゲノム中に安定に組み込まれている第２の発
現カセットをさらに含み、該第２の発現カセットが、目的のヌクレオチド配列に
作動可能に連結されている転写調節領域を含み、該転写調節領域がリガンド−レ
セプター複合体によって活性化される、植物および植物の一部。

【請求項１７】請求項１４に記載の植物の、形質転換された種子。

【請求項１８】請求項１５に記載の植物の、形質転換された種子。

【請求項１９】請求項１６に記載の植物の、形質転換された種子。

【請求項２１】請求項２０に記載の植物細胞であって、該植物細胞が、該植物のゲノム中に安定に組み込まれている第２の発現カセットをさらに含み、該
第２の発現カセットが、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている転
写調節領域を含み、該転写調節領域がリガンド−レセプター複合体によって活性
化される、植物細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ブルーク，キャサリンディー．アメリカ合衆国アイオワ 50131，ジョンストン，グレイウッドサークル 6017 (72)発明者ガーナート，カールダブリュー．アメリカ合衆国アイオワ 50021，アンクニー，エヌ．イー．インズブラックドライブ 401 (72)発明者ロス，ブラットレイアレンアメリカ合衆国アイオワ 50322，アーバンデール，ヒッコリーレーン 7425 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA06 CA17 CA19 CB01 CD03 CD07 CD09 CD14 CG01 4B024 AA03 AA08 AA20 BA63 BA80 CA04 CA07 CA09 CA20 DA01 EA04 FA02 FA10 GA11 GA17 GA27 HA12 HA20 4B064 AG01 AG20 CA11 CA19 CC01 CC24 CD30 DA11 4B065 AA89X AA90Y AB01 AC14 BA02 BA25 BC50 BD50 CA24 CA53 4H045 AA10 AA20 BA10 CA51 DA50 EA05 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｐｙｒｉｌｉｄａｅ種由来の昆虫タンパク質をコードする単
離された核酸配列であって、そのヌクレオチド配列が、以下：ａ）エクジソンレセプターまたはＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅをコードする配
列を含むヌクレオチド配列；ｂ）配列番号１または配列番号３に示される配列を含むヌクレオチド配列：ｃ）配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；ｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、またはｃ）の配列にハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列、からなる群より選択される、単離された核酸配列。
【請求項２】Ｐｙｒｉｌｉｄａｅ種由来の単離されたポリペプチドであっ
て、該ポリペプチドが、以下：ａ）エクジソンレセプターまたはＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅを含むポリペプ
チド配列；ｂ）配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
；ｃ）配列番号１または配列番号３に示される配列を含むヌクレオチド配列によ
ってコードされるポリペプチド；ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号３に示される配
列を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコード
されるポリペプチド、からなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項３】植物中で目的のタンパク質の遺伝子発現を選択的に誘導する
方法であって、該方法が、以下の工程：ａ）発現カセットを該植物のゲノム中に安定に組み込む工程であって、該発現
カセットが、エクジソンレセプターをコードするヌクレオチド配列に作動可能に
連結されているプロモーターを含み、該エクジソンレセプターをコードする該ヌ
クレオチド配列が、以下：ｉ）エクジソンレセプターをコードする配列を含むＰｙｒｉｌｉｄａｅ種由来
のヌクレオチド配列；ｉｉ）配列番号１に示される配列を含むヌクレオチド配列；ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列；ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）、ｉｉ）、またはｉｉｉ）の配列に
ハイブリダイズするヌクレオチド配列、からなる群より選択される、工程、ｂ）第２の発現カセットを該植物のゲノム中にさらに安定に組み込む工程であ
って、該発現カセットが目的の該タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている転写調節領域を含み、そして該転写調節領域がリガンド
−レセプター複合体によって活性化される、工程；ｃ）該レセプターと複合体化するリガンドと、該植物とを接触させる工程であ
って、該レセプター−リガンド複合体が該転写調節領域と相互作用し、かつ目的
の該タンパク質の遺伝子発現を誘導する、工程、を包含する、方法。
【請求項４】前記プロモーターが構成的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記プロモーターが組織選択的である、請求項３に記載の方
法。
【請求項６】前記組織選択的プロモーターが、葯選択的プロモーター、タ
ペート選択的プロモーター、胚珠選択的プロモーター、および雌蕊選択的プロモ
ーターからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】前記リガンドが非ステロイド性エクジステロイドアゴニスト
、２０−ヒドロキシエクジソンまたはそれらのアナログを含む群より選択される
、請求項３に記載の方法。
【請求項８】目的の前記タンパク質の発現が植物の稔性を破壊する、請求
項３に記載の方法。
【請求項９】目的の前記タンパク質の発現が、さもなくば不稔性の植物に
おいて稔性を誘導する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】目的の前記タンパク質の発現が変更した生殖様式を誘導す
る、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】前記変更した生殖様式がアポミクシスである、請求項１０
に記載の方法。
【請求項１２】前記エクジソンレセプターがキメラレセプターであり、該
キメラレセプターが活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合
ドメインを含み、該ドメインの少なくとも１つが該エクジソンレセプターに由来
する、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】前記活性化ドメインまたは前記ＤＮＡ結合ドメインが転写
アクチベータータンパク質に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】前記転写アクチベータータンパク質が、ＶＰ１６、トウモ
ロコシＣ１、またはＧＡＬ４を含む群より選択される、請求項１０に記載の方法
。
【請求項１５】請求項１２に記載の方法であって、前記活性化ドメイン、
前記ＤＮＡ結合ドメインまたは前記リガンド結合ドメインが、核レセプターのス
テロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーのメンバーに由来する、方法。
【請求項１６】請求項１５に記載の方法であって、前記核レセプターのス
テロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーのメンバーが、レチノイン酸レセ
プター、ビタミンＤレセプター、または甲状腺ホルモンレセプターを含む群より
選択される、方法。
【請求項１７】請求項３に記載の方法であって、前記発現カセットがＵｌ
ｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された
プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、そしてＵｌｔｒａｓ
ｐｉｒａｃｌｅをコードする該ヌクレオチド配列が、以下：ａ）配列番号３に示される配列を含むヌクレオチド配列；ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列；ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）の配列にハイブリダイズす
るヌクレオチド配列、からなる群より選択される、方法。
【請求項１８】請求項１７に記載の方法であって、Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａ
ｃｌｅレセプターがキメラレセプターであり、該キメラレセプターが活性化ドメ
イン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含み、該ドメインの
少なくとも１つが該Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅレセプター由来である、方法。
【請求項１９】前記エクジソンレセプターおよびＵｌｔｒａｓｐｉｒａｃ
ｌｅをコードするヌクレオチド配列が、別々の発現カセットに含まれる、請求項
１７に記載の方法。
【請求項２０】前記植物が双子葉植物である、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】前記植物が単子葉植物である、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】前記単子葉植物がトウモロコシである、請求項１８に記載
の方法。
【請求項２３】エクジソンレセプターをコードするヌクレオチド配列に作
動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターであって、該エクジソンレ
セプターをコードするヌクレオチド配列が、以下：ａ）エクジソンレセプターをコードする配列を含むＰｙｒｉｌｉｄａｅ種由来
のヌクレオチド配列；ｂ）配列番号１に示される配列を含むヌクレオチド配列；ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列；ｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、またはｃ）の配列にハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列、からなる群より選択される、発現ベクター。
【請求項２４】請求項２０に記載の発現ベクターであって、前記エクジソ
ンレセプターがキメラレセプターであり、該キメラレセプターが活性化ドメイン
、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含み、該ドメインの少な
くとも１つが該エクジソンレセプター由来である、発現ベクター。
【請求項２５】Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅをコードするヌクレオチド配
列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターであって、そしてＵ
ｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅをコードする該ヌクレオチド配列が、以下：ａ）配列番号３に示される配列を含むヌクレオチド配列；ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列；ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）の配列にハイブリダイズす
るヌクレオチド配列、からなる群より選択される、発現ベクター。
【請求項２６】植物であって、請求項２３に記載の発現ベクターが、その
ゲノム中に安定に組み込まれている、植物。
【請求項２７】請求項２６に記載の植物であって、該植物がそのゲノム中
に安定に組み込まれている第２の発現カセットをさらに含み、該第２の発現カセ
ットが、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている転写調節領域を含み、該転写調節領域がリガンド−レセプター複合体によ
って活性化される、植物。
【請求項２８】前記植物がそのゲノム中に安定に組み込まれた、請求項２
５に記載の発現ベクターをさらに含む、請求項２７に記載の植物。
【請求項２９】請求項２６に記載の植物の、種子。
【請求項３０】請求項２７に記載の植物の、種子。
【請求項３１】請求項２８に記載の植物の、種子。
【請求項３２】植物細胞であって、請求項２３に記載の発現ベクターが、
そのゲノム中に安定に組み込まれている、植物細胞。
【請求項３３】請求項３２に記載の植物細胞であって、該植物細胞がその
ゲノム中に安定に組み込まれている第２の発現カセットをさらに含み、該第２の
発現カセットが、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に
連結されている転写調節領域を含み、該転写調節領域がリガンド−レセプター複
合体によって活性化される、植物細胞。
【請求項３４】前記植物細胞が、そのゲノム中に安定に組み込まれている
、請求項２５に記載の発現ベクターをさらに含む、請求項３３に記載の植物細胞
。