CN102014626B - 甾族配体及其在基因开关调控中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于基于核受体的诱导型基因表达系统的甾族配体，本发明还涉及在系统中调节目标基因表达的方法，所述系统包含一个或多个核受体复合物以及一个或多个甾族配体。其他方面包括配体组合物包括治疗组合物的。

Description

甾族配体及其在基因开关调控中的应用
发明领域
本发明涉及类固醇化学和基因受控表达的领域。更具体地，本发明涉及天然和突变的核受体的甾族配体，以及他们在基于核受体的诱导型基因表达系统中的应用。本发明还涉及采用这些配体和对应的基因开关在宿主细胞内调控目标基因表达的方法。本发明还涉及含有一个或多个甾族配体的组合物和治疗组合物。
发明背景
本发明引用的所有专利、专利申请和出版物在此整体完全引用作为参考。
精确控制基因表达是研究、操纵和控制发育和其他生理过程的有价值的工具。基因表达涉及大量特异性的蛋白-蛋白相互作用。DNA转录成RNA涉及在控制基因转录的启动子附近的转录激活因子。通常，转录激活因子与一个蛋白质结合，这个蛋白质具有与基因启动子区域的位点相结合的DNA结合结构域。为了产生基因表达，带有DNA结合结构域和转录激活结构域的蛋白必须被带到基因启动子区域的正确位置。
一种转基因方法采用细胞类型特异性启动子来驱动转基因的表达。带有转基因的DNA构建物首先整合到了宿主基因组中，当被转录激活因子触发时，在给定细胞类型中发生转基因的表达
另一种方法是通过诱导型启动子。例子包括PR-1a启动子，原核阻遏子/操纵子系统，免疫抑制亲免素系统，以及较高等的真核转录激活系统例如类固醇激素受体系统。
基于由热休克、干扰素、重金属诱导的启动子的基因调控系统已有描述(Wurn等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5414-5418；Arnheiter等，1990Cell62：51-61；Filmus等，1992NucleicAcidsResearch20：27550-27560)。然而，因为他们对于非靶基因的表达的影响，这些系统是有漏洞且有局限的。
原核阻遏子/操纵子系统采用细菌阻遏子蛋白和其所结合的独特操纵子DNA序列。来自细菌大肠杆菌的四环素(“Tet”)和半乳糖(“Lac”)阻遏子/操纵子系统已经用于植物和动物中控制基因的表达。在Tet系统中，四环素结合到TetR阻遏子蛋白，导致构象改变，从操纵子上释放出阻遏子蛋白，从而使得转录发生。在Lac系统中，对半乳糖或是合成的类似物例如异丙基β-D-硫代半乳糖苷的存在产生应答，使得lac操纵子被活化。在植物和动物中使用这样的系统，受限于配体(四环素和半乳糖)的化学不稳定性、它们的毒性、它们的天然存在，或是诱导或抑制需要相对较高的水平。
免疫抑制分子例如FK506、雷帕霉素和环孢素A可以结合到亲免素FKBP12、亲环素等上。利用这一信息，已经设计了一种将任何两个蛋白带到一起的整体策略，可以简单地通过将FK506放到两个蛋白中的每一个上，或是通过将FK506放在一个蛋白上并且将环孢素A放到另一个上。然后，可以使用FK506合成的同源二聚体(FK1012)或是FK506-环孢素融合产生的化合物(FKCsA)，诱导这些分子的二聚化(Spencer等，1993，Science262：1019-24；Belshaw等，1996ProcNatlAcadSciUSA93：4604-7)。使用融合到FKBP12的Gal4DNA结合结构域、以及融合到亲环素的VP16激活剂结构域、以及FKCsA化合物，表现为二聚化并且激活在带有Gal4结合位点的启动子的控制下的报告基因。这个系统包括可具有害副作用的免疫抑制剂，限制了在哺乳动物基因开关中的应用。
转录激活系统例如类固醇激素受体系统也已经使用。类固醇激素受体是核受体超家族的成员并且存在于脊椎动物和非脊椎动物细胞中。
昆虫的生长、蜕皮和发育受到蜕皮甾醇激素(蜕皮激素)和保幼激素的调控(Dhadialla等，1998.Annu.Rev.Entomol.43：545-569)。昆虫内蜕皮甾醇的分子靶标包括蜕皮甾醇受体(EcR)和超气门蛋白(USP)。EcR是核类固醇受体超家族的一个成员，该超家族的特征在于标志性的DNA和配体结合结构域以及一个激活结构域(Koelle等1991，Cell，67：59-77)。EcR受体对多个甾族化合物例如松甾酮A和米乐甾酮A、以及非甾族化合物包括市售的虫酰肼和甲氧虫酰肼产生应答(参见PCT/EP96/00686和US5,530,028)。
昆虫蜕皮甾醇受体(EcR)与超气门蛋白(USP，哺乳动物RXR的昆虫同源物)发生异源二聚化，结合蜕皮甾醇，结合蜕皮甾醇受体DNA反应元件，并且激活蜕皮甾醇应答基因的转录。EcR/USP/配体复合物在昆虫发育和繁殖过程中发挥重要作用。EcR是类固醇激素受体超家族的一员并且有5个调控结构域，A/B(反式激活)、C(DNA结合，异源二聚化)、D(铰链、异源二聚化)、E(配体结合，异源二聚化和反式激活)和F(反式激活)结构域。当融合到其他蛋白上时，这些结构域中的某些，例如A/B、C和E，保留了它们的功能。
严格调控的诱导型基因表达系统或“基因开关”可用于各种应用，例如基因治疗、蛋白在细胞中的大规模产生、基于细胞的高通量筛选测试，功能基因组，以及在转基因植物和动物中特性的调控。
一种基于EcR的基因开关采用黑腹果蝇EcR(DmEcR)和家鼠RXR(MmRXR)，并且表明在类固醇、松甾酮A存在下这些受体反式激活哺乳动物细胞系和转基因小鼠中的报告基因(ChristophersonK.S，MarkM.R，BajaJ.V，GodowskiP.J.1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：6314-6318；NoD，YaoT.P，EvansR.M，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：3346-3351)。Later，Suhr等1998，Proc.Natl.Acad.Sci.95：7999-8004表明当缺乏外源异二聚体伴侣时，虫酰肼通过家蚕EcR(BmEcR)反式激活哺乳动物细胞中的报告基因。
PCT/US97/05330(WO97/38117)和PCT/US99/08381(WO99/58155)公开了调控外源基因表达的方法，其中在配体存在下且可选地在能作为沉默伴侣的受体存在下，包含外源基因和蜕皮甾醇反应元件的DNA构建物被一个蜕皮甾醇受体激活。蜕皮甾醇受体从黑腹果蝇中分离出来的。通常，这样的系统需要存在沉默伴侣，例如类视黄醇X受体(RXR)，以提供最佳激活。在哺乳动物细胞中，昆虫蜕皮甾醇受体(EcR)与类视黄醇X受体(RXR)异源二聚化，并且以配体依赖的方式调控靶基因的表达。PCT/US98/14215(WO99/02683)公开了从家蚕蚕蛾分离的蜕皮甾醇受体在哺乳动物系统中发挥作用，而不需要外源二聚体伴侣。
US6,265,173B1公开了各种类固醇/甲状腺超家族受体的各种成员能与黑腹果蝇USP或其带有至少一个USP二聚化结构域的片段相结合，用于一个基因表达系统。US5,880,333公开了一个应用于植物中的黑腹果蝇EcR和USP异二聚体系统，其中反式激活结构域和DNA结合结构域是位于两个不同的杂合蛋白上的。这些基于USP的系统在动物细胞中是组成型的，所以不能有效调控目标基因的表达。
在每一种情况下，反式激活结构域和DNA结合结构域(可以为如PCT/US98/14215中的天然EcR或是如PCT/US97/05330中的修饰的EcR)整合到单个分子中，并且其他异二聚体伴侣，USP或RXR，以它们的天然状态使用。
上述基于EcR的基因调控系统的缺点包括在缺乏配体时有可观的背景活力，并且这些系统不能植物和动物都适用(参见US5,880,333)。
所以，本领域需要改良基于EcR的系统，在植物和动物中精确调控内源或外源目标基因的表达。这样改良的系统可用于下列应用，例如基因治疗、大规模生产蛋白和抗体、基于细胞的高通量筛选测试、功能基因组以及在转基因动物中特性的调控。对于某些应用例如基因治疗，希望能有一个诱导型的基因表达系统，对非甾族配体应答良好且对如内源类固醇等类固醇不敏感。因此，简单的、复杂的和依赖于配体的改良系统可用于调控生物系统，所述配体相对便宜、容易获得且对宿主毒性低。
已经显示一种基于核受体的诱导型基因表达系统，其中通过把反式激活和DNA结合结构域放在两个不同的蛋白上将它们相互分开，使得缺乏配体时的背景活力大大降低，并且在存在配体时活力要显著高于背景(PCT/US01/09050)。与申请PCT/US97/05330和PCT/US98/14215中公开的系统相比，这个双杂交系统是一个显著改进的诱导型基因表达调控系统。这个双杂交系统利用了一对相互作用蛋白将转录激活结构域带到了一个相对于DNA结合结构域更有利的位置，使得当DNA结合结构域结合到基因的DNA结合位点上时，反式激活结构域更有效地活化启动子(参见如US5,283,173)。简要地说，双杂交基因表达系统包含两个基因表达盒，第一组件编码一个融合到核受体多肽上的DNA结合结构域，并且第二组件编码一个融合到不同核受体多肽上的反式激活结构域。在存在配体时，第一多肽和第二多肽相互作用，有效地将DNA结合结构域和反式激活结构域联系起来。因为DNA结合和反式激活结构域位于两个不同的分子上，在缺乏配体时的背景活力大大降低。
此外，双杂交系统避免了一些由于在未修饰的RXR用作开关伴侣时通常发生RXR过表达导致的副作用。在双杂交系统的一个实施例中，去除了EcR或RXR的天然DNA结合和反式激活结构域。结果，这些杂合分子与细胞内存在的其它类固醇激素相互作用降低，导致副作用降低。
申请人拥有的其他基因开关系统包括下列文献所述的那些系统，每篇文献都在此引用作为参考：US7，091，038；WO2004078924；EP1266015；US20010044151；US20020110861；US20020119521；US20040033600；US20040197861；US20040235097；US20060020146；US20040049437；US20040096942；US20050228016；US20050266457；US20060100416；WO2001/70816；WO2002/29075；WO2002/066612；WO2002/066613；WO2002/066614；WO2002/066615；WO2005/108617；US6，258，603；US20050209283；US20050228016；US20060020146；EP0965644；US7，304，162；US7，304，161。
附图简述
图1显示了制备蜕皮甾醇的O-烷基醚的保护/去保护方案。在醚化反应(E)前，通过转化为对应的20，22-苯基硼酸盐(25a)、2，3-丙酮化合物(25b)和2，3，14，22-二丙酮化合物(25c)类似物，选择性地保护20E(25)的2，3-和/或20，22-二醇。保护/去保护条件：(a)苯基硼酸(PBA)，无水DMF，室温1小时。(b)H2O2∶THF9∶1(v/v)，pH＝7，室温2.5小时。(c)1.2，2-二甲氧基丙烷(DMP)，无水丙酮，熔化的p-TsOH，室温3小时；2.H2O2/THF9∶1(v/v)，pH＝7，室温2.5小时。(d)0.1MHC1aq∶1，4-二氧杂环乙烷1∶1，室温2.5小时。(e)DMP，无水丙酮，熔化的p-TsOH，室温6小时。(f)AcOH70％，1，4-二氧杂环乙烷，回流8小时。从PoA(26)合成PoA2，3-丙酮化合物(26a)在相似反应条件下进行。
图2显示了蜕皮甾醇醚类似物(1-23)和参照化合物(24-30)的结构、名称和编码。
图3显示了用黑腹果蝇BII生物测试(BII)和采用野生型(WT)EcR或EcR的E274V/V390I/Y410E突变体的云杉卷叶蛾基于EcR的基因开关测试，来测定O-烷基化的蜕皮甾醇(1-23)和参照化合物(24-30)的效力和功效。aRMFI＝相对最大诱导倍数(相对于二酰基肼)；b3T3细胞系；平均背景～1；参照FI(1微摩)＝806(WT-CfEcR)，1012(E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR)。
图4A-4D显示了在基于E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR、野生型埃及斑蚊EcR、黑腹果蝇EcR、以及小鼠3T3成纤维细胞中的VgEcR/RXR系统的基因开关测试中，PoA22-甲基醚、PoA和MuA的比较剂量应答曲线。报告基因为虫荧光素酶；相对于DMSO标准品的诱导倍数在左轴上作图，且绝对相对光单位(RLU)在右轴上作图。计算对于每个配体和开关系统的EC50值，并且在图上显示。
图5显示了3D-QSAR模型的统计学摘要(CoMFA/CoMSIA作用场、留一法交叉验证分析和常规PLS分析)。缩写：最小σ＝列筛选(千卡/摩尔)，SPRESS＝标准预测误差，r2＝常规(非验证)匹配相关系数，S＝估计标准误差，q2＝留一法交叉验证相关系数，PSA＝极性表面积。
图6显示了醚功能基团对在BII生物测试中测得的蜕皮甾醇活力的贡献。活力差异用化合物对之间在存在或不存在表示为-OR的取代基时的差异Δ-logEC50表示。
图7显示了对于一套O-烷基类固醇，计算的辛醇-水分配系数，血脑屏障渗透，Caco-2细胞渗透，人血清白蛋白(HAS)结合以及水溶性。1实验logD值：20-羟基蜕皮甾酮，0.01；松甾酮A，1.95；二酰基肼30，3.4。2实验值：20-羟基蜕皮甾酮，6.7mg/mL；松甾酮A，0.18mg/mL；米乐甾酮A，＞2.9mg/mL；二酰基肼30，6.2μg/mL。
图8显示了用基于埃及斑蚊(Aa)和黑腹果蝇(Dm)EcR的基因开关测试所测得的所选的O-烷基化蜕皮甾醇和参照化合物的效力和功效。aRMFI＝相对最大诱导倍数(相对于二酰基肼30)。
图9显示了带有羟基变化的类固醇。
图10显示了带有侧链变化的类固醇。
图11显示了带有氧化状态、羟基化程度、环系统和侧链切断等变化的类固醇。
图12显示了蚕(家蚕(Bombyxmori)，BmEcR)、烟草天蛾(烟草天蛾(Manducasexta)，MsEcR)、云杉蚜虫(云杉卷叶蛾(Choristoneurafumiferana)，CfEcR和E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR)、果蝇(黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)，DmEcR)、黄热病蚊(埃及斑蚊(Aedesaegypti)，AaEcR)、硬蜱(美洲花蜱(Amblyommaamericanum)，AmaEcR)、银叶粉虱(银叶粉虱(Bemisiaargentifolii)，BaEcR)、叶蝉(黑尾叶蝉(Nephotettixcincticeps)，NcEcR)以及黄粉虫(黄粉虫(Tenebriomolitor)，TmEcR)的EcR配体结合结构域的序列比对。在序列比对上方标出了螺旋区域。用星号标出了相同的残基；冒号标出了保守的残基。用实心圆圈标出的(保守的)或实心三角形标出的(不保守的)残基位于结合了松甾酮A的HvEcR的(只有重原子)内。用空心圆圈标出的残基位于结合了松甾酮A的HvEcR的(只有重原子)内。E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR用加下划线的黑体字标出。
图13显示了在小鼠NIH3T3细胞中的一个采用GAL4-EcR(DEF区域)，VP16-RXR-USP嵌合体和虫荧光素酶报告基因的双杂交系统中，测得的类固醇对鳞翅目EcR的基因开关EC50值。FI＝诱导倍数；RMFI，相对于RSL1最大值的最大诱导倍数；“～”，通过目视观察评估的EC50。EcR来源：BmEcR，蚕；MsEcR，烟草天蛾；CfEcR，云杉蚜虫；E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR。
图14显示了在小鼠NIH3T3细胞中的一个采用GAL4-EcR(DEF区域)，VP16-RXR-USP嵌合体和虫荧光素酶报告基因的双杂交系统中，测得的类固醇对非鳞翅目EcR的基因开关EC50值。包括了BII细胞转化EC50值用作比较。FI，诱导倍数；RMFI，相对最大诱导倍数；“～”，通过目视观察评估的EC50。EcR来源：BII，果蝇，DmEcR，果蝇；AaEcR，黄热病蚊；AmaEcR，硬蜱；BaEcR，银叶粉虱；NcEcR，叶蝉；TmEcR，黄粉虫。
图15显示了在小鼠NIH3T3细胞中的一个采用GAL4-EcR(DEF区域)，VP16-RXR-USP嵌合体和虫荧光素酶报告基因的双杂交系统中，测得的类固醇对鳞翅目EcR的基因开关EC50值。FI＝诱导倍数；RMFI，相对于RSL1最大值的最大诱导倍数；“～”，通过目视观察评估的EC50。EcR来源：BmEcR，蚕；MsEcR，烟草天蛾；CfEcR，云杉蚜虫；E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR。
图16显示了在小鼠NIH3T3细胞中的一个采用GAL4-EcR(DEF区域)，VP16-RXR-USP嵌合体，或VgEcR/RxR系统和虫荧光素酶报告基因的双杂交系统中，测得的类固醇对非鳞翅目EcR的基因开关EC50值。包括了BII细胞转化EC50值用作比较。FI，诱导倍数；RMFI，相对最大诱导倍数；“～”，通过目视观察评估的EC50。EcR来源：BII，果蝇，DmEcR，果蝇；AaEcR，黄热病蚊；AmaEcR，硬蜱；BaEcR，银叶粉虱；NcEcR，叶蝉；TmEcR，黄粉虫。
图17显示了所选类固醇的效力水平与EcR的关系，按照系统发生顺序排列。鳞翅目EcR显示在左边，非鳞翅目在右边。每条水平线代表一个不同的配体。交叉表示效力反转，即两个配体和在交叉的两侧的EcR正交。点状线表示杯苋甾酮/E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR//四翅滨藜甾酮/BaEcR和杯苋甾酮/E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR//小龙骨素B/AaEcR正交。
图18A和18B显示了杯苋甾酮(实心圆圈)和四翅滨藜甾酮(空心圆圈)与(a)E274V/V390I/Y410E突变的EcR和(b)BaEcR的剂量应答。诱导倍数(测试剂量RLU对背景RLU的比率)在左纵轴上标出。近似RLU测量在右轴上标出。较高剂量的一些点被省略。
图19A和19B显示了杯苋甾酮(实心圆圈)和小龙骨素B(空心三角)与(a)E274V/V390I/Y410E突变的EcR和(b)AaEcR的剂量应答。诱导倍数(测试剂量RLU对背景RLU的比率)在左纵轴上标出。近似RLU测量在右轴上标出。较高剂量的一些点被省略。
图20显示了E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR对BaEcR的类固醇效力(-log(EC50)/-log(EC50))的图谱。
发明概述
随着基于受体的基因调控系统的改进，对于比现有配体活性更高的配体的需求增加。本发明公开了能够调节转基因表达的新型甾族配体，参见SilviaLapenna专题论述，英国。
本发明涉及与基因开关一起使用的甾族配体，所述基因开关例如基于核受体的诱导型基因表达调控系统，以及用这些配体与基因开关在宿主细胞内调控目标基因表达的方法。
本发明的一个实施方式涉及使用带有本发明配体的基因表达调控系统在宿主细胞内调控基因表达的方法。本发明的一个方面提供了一种在宿主细胞内调控目标基因表达的方法，包括下列步骤：a)向宿主细胞导入一个如本发明所述的基因表达调控系统；b)向宿主细胞导入一个基因表达序列组合，该序列组合包含i)一个反应元件，包含一个结合来自基因表达调控系统的第一杂合多肽的DNA结合结构域的结构域；ii)一个启动子，被基因表达调控系统的第二杂合多肽的反式激活结构域所活化；和iii)一个表达有待调控的目标基因；以及c)向宿主细胞导入一个配体，从而一旦配体导入到宿主细胞中，调控目标基因的表达。
本发明的另一个方面包括用于独立控制多个目标基因表达的正交基因开关。本发明的正交基因开关包括那些基于核受体的基因开关，例如类固醇受体，其包括蜕皮甾酮受体。此外，正交的基因开关包括基于野生型序列或突变序列或其组合的独立开关。
本发明的另一个方面包括基因开关，其包含H组核受体配体结合结构域，蜕皮甾酮受体配体结合结构域，蜕皮甾酮受体配体结合结构域，云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的取代突变体，云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的V390I/Y410E突变体或云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的E274V/V390I/Y410E突变体。
本发明的另一个方面是一种包含至少一个基因开关和至少一个活化配体的重组基因开关系统，其中活化配体是本发明所公开的一种或多种化合物或非甾族化合物、或二酰基肼、酰胺酮或二唑啉。
本发明的另一个方面是一种包含多个基因开关的系统，其中多个基因开关是由同一个载体多核苷酸上存在的一个或多个核酸编码的。
本发明的另一个方面是一种重组基因开关系统，其中每个独立可操作的基因开关控制一个不同的目标基因，其中目标基因为治疗性目标基因、细胞因子和/或毒素。
本发明的另一个方面是一种通过给予有效量的本发明公开的化合物激活重组基因开关的方法，其中重组基因开关系统对所述化合物产生应答。
本发明的另一个方面涉及带有一个或多个甾族配体的组合物和治疗组合物。本发明的其他方面包括包含甾族和/或非甾族结构的基因开关配体的组合物。这样的组合物包括治疗性混合物。
发明详述
本发明的一个实施方式提供了与基于类固醇受体的诱导型基因表达系统联合使用的配体，来调控宿主细胞内目标基因的表达。在一个实施方式中，本发明提供了一种基因开关系统，该系统的背景基因表达水平降低且对低于微摩浓度的甾族配体产生应答，本发明克服了现存诱导型表达系统的局限性，并且提供了一种控制基因表达的有效方法。
当需要控制基因表达水平时，本发明可用于下列应用，例如基因治疗、大规模表达蛋白和抗体、基于细胞的高通量筛选测试、功能基因组、蛋白质组、代谢组、以及在转基因生物中特性的调控。本发明的一个优点是可以调整基因的表达以符合用户的需求。
本发明涉及下列化学式的化合物：
或
其中R1、R2、R3和R4为
a)H，(C1-C6)烷基；(C1-C6)卤烷基；(C1-C6)氰基烷基；(C1-C6)羟烷基；(C1-4)烷氧基(C1-C6)烷基；(C2-C6)烯基，任选被卤素、氰基、羟基、或(C1-C4)烷基取代；(C2-C6)炔基，任选被卤素、氰基、羟基、或(C1-C4)烷基取代；C3-C5环烷基，任选被卤素、氰基、羟基、或(C1-C4)烷基取代；环氧乙基，任选被卤素、氰基、或(C1-C4)烷基取代；或是
b)未取代的或取代的苄基，其中取代基独立为1-5个H、卤素、硝基、氰基、羟基、(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基；以及
R5为H；OH；F；Cl；或(C1-C6)烷氧基。
在一个实施方式中，当R1、R2、R3和R4为H时，则R5不为H或羟基。
在一个实施方式中，R1、R2、R3和R4中至少一个不为H。在另一个实施方式中，R1、R2、R3和R4中至少两个不为H。在另一个实施方式中，R1、R2、R3和R4中至少3个不为H。在另一个实施方式中，R1、R2、R3和R4中每一个都不为H。
在一个实施方式中，
当R1、R2、R3和R4为H时，则R5不为甲氧基，
当R1、R2、R3和R4为异丙基时，则R5不为羟基，以及
当R1、R2和R3为H且R5为羟基时，则R4不为甲基或乙基。
在特定实施方式中，R1、R2、R3和R4为
a)H，(C1-C6)烷基；(C1-C6)卤烷基；(C1-C6)氰基烷基；(C1-C6)羟烷基；(C1-4)烷氧基(C1-C6)烷基；(C2-C6)烯基；(C2-C6)炔基；环氧乙基，任选被卤素、氰基、或(C1-C4)烷基取代；或是
b)未取代的或取代的苄基，其中取代基独立为1-5个H、卤素、氰基或(C1-C6)烷基；以及
R5为H、OH、F、Cl或(C1-C6)烷氧基。
在其他特定实施方式中，R1、R2、R3和R4为H、(C1-C6)烷基；(C2-C6)烯基；(C2-C6)炔基；2’-乙基环氧乙基，或苄基；并且
R5为H；OH或F。
在特定实施方式中，
当R1、R2、R3和R4为异丙基时，则R5不为羟基；
当R5为H、羟基、甲氧基或氟时，则R1、R2、R3和R4中至少一个不为H；
当R1、R2、R3和R4中只有一个为甲基且R5为H或羟基时，则R1、R2、R3和R4中剩下的不为H；
当R4以及R1、R2和R3中的一个为甲基时，则R5既不为H也不为羟基；
当R1、R2、R3和R4都为甲基时，则R5不是羟基；且
当R1、R2和R3都是H且R5为羟基时，则R4不为乙基、正丙基、正丁基、烯丙基或苄基。
本发明的实施方式也涉及调控目标基因表达的方法，该方法包括接触一个核受体复合物，包含：
a)一个DNA结合结构域
b)一个配体结合结构域
c)一个反式激活结构域；和
d)一个配体；
以及一个DNA构建物，包含
一个目标基因，以及
一个反应元件
其中目标基因是在反应元件的控制之下的；并且
在配体存在下，DNA结合结构域结合到反应元件上，导致激活或抑制目标基因。
在一个实施方式中，配体是下列化学式的化合物：
或
其中R1、R2、R3、R4和R5具有上面所述的含义。
本发明的特定实施方式包括使用下列甾族基因开关配体：20-羟基蜕皮甾酮-2-甲基醚；20-羟基蜕皮甾酮-3-甲基醚；20-羟基蜕皮甾酮-14-甲基醚；20-羟基蜕皮甾酮-2，22-二甲基醚；20-羟基蜕皮甾酮-3，22-二甲基醚；20-羟基蜕皮甾酮-14，22-二甲基醚；20-羟基蜕皮甾酮-22，25-二甲基醚；20-羟基蜕皮甾酮-2，3，14，22-四甲基醚；20-羟基蜕皮甾酮-22-正丙基醚；20-羟基蜕皮甾酮-22-正丁基醚；20-羟基蜕皮甾酮-22-烯丙基醚；20-羟基蜕皮甾酮-22-苄基醚；20-羟基蜕皮甾酮；22-(28R，S)-2’-乙基环氧乙基醚，松甾酮A-2-甲基醚，松甾酮A-14-甲基醚，松甾酮A-22-甲基醚，松甾酮A-2，22-二甲基醚，松甾酮A-3，22-二甲基醚，松甾酮A-14，22-二甲基醚，海南陆均松甾酮-22-甲基醚。
本发明的其他实施方式包括使用下列甾族基因开关配体：25，26-双脱氢松甾酮A，(异旌节花甾酮C(Δ25(26)))，斯达甾酮(shidasterone)(旌节花甾酮(stachysterone)D)，旌节花甾酮C，22-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮(紫杉甾酮)，松甾酮A，多孔菌甾酮B，22-脱氢-20-羟基蜕皮甾酮，二甲基呋喃基蜕皮甾酮，(22R)-20-(2，2′-二甲基呋喃基)蜕皮甾酮，22脱氧蜕皮甾酮，25-脱氧蜕皮甾酮，22-脱氢蜕皮甾酮，蜕皮甾酮，22-表-蜕皮甾酮，24甲基蜕皮甾酮(20-去氧罗汉松甾酮A)，蜕皮甾酮-22-琥珀酸酯，25-脱氧蜕皮甾酮-22-β-D-吡喃葡萄糖苷，蜕皮甾酮-22-豆蔻酸酯，22-脱氢-20-异蜕皮甾酮，20-异蜕皮甾酮，20-异-22-表蜕皮甾酮，2-脱氧蜕皮甾酮，斯莱诺糖苷E(2-脱氧蜕皮甾酮3β葡萄糖苷；布蓝糖苷A(blechnosideA))，2-脱氧蜕皮甾酮-22-乙酸酯，2-脱氧蜕皮甾酮-3，22-二乙酸酯，2-脱氧蜕皮甾酮-22-β-D-吡喃葡萄糖苷，2-脱氧蜕皮甾酮-25-β-D-吡喃葡萄糖苷，2脱氧-21-羟基蜕皮甾酮，3-表-22-异-蜕皮甾酮，3-脱氢-2-脱氧蜕皮甾酮(三羟基胆甾烯二酮)，3-脱氢蜕皮甾酮，3-脱氢-2-脱氧蜕皮甾酮-22-乙酸酯，蜕皮甾酮-6-羧甲基肟，蜕皮甾酮-2，3-丙酮化合物，14-表-20-羟基蜕皮甾酮-2，3-丙酮化合物，20羟基蜕皮甾酮-2，3-丙酮化合物，20-羟基蜕皮甾酮-20，22-丙酮化合物，14-表-20-羟基蜕皮甾酮-2，3，20，22-二丙酮化合物，帕西甾酮-20，22-对羟基苄亚甲基缩醛，松甾酮，(20R)-二氢松甾酮，(20S)二氢松甾酮，松甾酮-20-丹磺酰肼，(20S)-二氢松甾酮-2，3，20-三苯甲酸酯，(20R)-二氢松甾酮-2，3，20-三苯甲酸酯，(20R)二氢松甾酮-2，3-丙酮化合物，(20S)二氢松甾酮-2，3-丙酮化合物，(5α-H)-二氢红苋甾酮，2，14，22，25-四脱氧-5α-蜕皮甾酮，5α-酮二醇，贝克甾醇(bombycosterol)，2α，3α，22S，25-四羟基-5α-胆甾烷-6-酮，(5α-H)-2-脱氧-21-羟基蜕皮甾酮，栗甾酮，24-表-栗甾酮，(5α-H)-2-脱氧整合甾酮A，(5α-H)-22-脱氧整合甾酮A，(5α-H)-20-羟基蜕皮甾酮，24，25-二脱氢海南陆均松甾酮，25，26-二脱氢海南陆均松甾酮，5-脱氧醛固酮(海南陆均松甾酮)，(14α-H)-14-脱氧-25-羟基海南陆均松甾酮，25-羟基海南陆均松甾酮，红苋甾酮，(5β-H)-二氢红苋甾酮，二氢红苋甾酮-17β-乙酸酯，斯地甾酮(sidisterone)，20-羟基蜕皮甾酮-2，3，22-三乙酸酯，14-脱氧(14β-H)-20-羟基蜕皮甾酮，14-表-20-羟基蜕皮甾酮，9α，20-二羟基蜕皮甾酮，马来甾酮(malacosterone)，2-脱氧脱皮甾酮，B-3-β-D-吡喃葡萄糖苷，筋骨草内酯，其兰酮B(cheilanthoneB)，2β，3β，6α-三羟基-5β-胆甾烷，2β，3β，6β-三羟基-5β-胆甾烷，14-脱氢斯达甾酮，旌节花甾酮B，2β，3β，9α，20R，22R，25-六羟基-5β-胆甾-7，14-二烯-6-酮，卡拉达甾酮，(14β-H)-14-脱氧-25-羟基海南陆均松甾酮，4-脱氢-20-羟基蜕皮甾酮，14-甲基-12-烯-斯达甾酮，14-甲基-12-烯-15，20-二羟基蜕皮甾酮，足甾酮B，2β，3β，20R，22R-四羟基-25-氟-5β-胆甾-8，14-二烯-6-酮(25-氟足甾酮B)，卡隆甾酮(calonysterone)，14-脱氧-14，18-环-20-羟基蜕皮甾酮，9α，14α-环氧-20-羟基蜕皮甾酮，9β，14β-环氧-20-羟基蜕皮甾酮，9α，14α-环氧-20-羟基蜕皮甾酮2，3，20，22-二丙酮化合物，28-高油菜素内酯，异高油菜素内酯。
本发明的一个方面包括使用如本发明所述的甾族分子与基因开关联用来控制目标基因的表达。一个如本发明所述的能控制目标基因表达的基因开关可包含至少一个蜕皮甾酮受体的片段。任选地，一种如本发明所述的能够控制目标基因表达的基因开关可包含另一个结合类固醇分子的核受体的至少一个片段。
当Rx基团是指定的时，其中x用数字1-4表示，且相同的Rx基团也指定了烷基链长度例如“(C1-C3)”，应了解指定的链长度只是指当Rx为烷基的情况，并且不涉及当Rx可不为烷基的情况，例如为H或芳基。
术语“烷基”包括支链和直链烷基。典型的烷基包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、异辛基、壬基和癸基。
术语“卤代”指氟代、氯代、溴代或碘代。
术语“卤代烷基”指被一个或多个卤素基团取代的烷基，例如氯代甲基，2-溴乙基，3-碘丙基、三氟甲基和全氟丙基。
术语“环烷基”指环状的脂肪族环结构，任选被烷基、羟基或卤素取代，例如环丙基、甲基环丙基、环丁基、2-羟基环戊基、环已基和4-氯环己基。
术语“羟基烷基”指被一个或多个羟基取代的烷基，例如羟基甲基和2，3-二羟基丁基。
术语“烷基磺酰基”指被烷基取代的磺酰基，例如甲磺酰基和正丙基磺酰基。
术语“烯基”指直链或支链的烯化不饱和碳氢基团，带有一个或多个烯键，例如乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丙烯基和2-戊烯基。
术语“卤代烯基”指被一个或多个卤素基团取代的烯基。
术语“炔基”是指直链或支链的不饱和碳氢基团，带有1个或2个炔键，例如乙炔基和丙炔基。
术语“烷基羰基”指烷基酮基功能基团，例如乙酰基、正丁酰基等等。
术语“杂环基”或“杂环”指未取代的或取代的、饱和的、部分饱和的或不饱和的五元或六元环，带有1、2或3个杂原子，例如一个或两个杂原子，独立地选自下组：氧、氮和硫。杂环基的例子包括例如吡啶基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、吡咯基、吲哚基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、四氢吡喃基、吗啉基、哌嗪基，二氧杂环戊烷基和二氧杂环已烷基。
术语“烷氧基”包括连有末端氧原子的支链和直链烷基。典型的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。
术语“卤代烷氧基”指被一个或多个卤素基团取代的烷氧基，例如氯代甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和全氟异丁氧基。
术语“烷氧基烷基”指被烷氧基取代的烷基，例如异丙氧甲基。
术语“非甾族化合物”或“非甾族配体”指不来源于1，2-环戊烯多氢烯菲骨架的化合物：
其激活一个基因开关。参见例如1970年纽约普莱南出版公司出版的Akhrem，A.A和Yu.A.Titov.的《总类固醇合成》。(Akhrem，A.A.andYu.A.Titov.TotalSteroidSythesis.NewYork：PlenumPress，1970.)
术语“二酰基肼”指一种带有N’-取代的-N，N’-二酰基肼内核的化合物。这样的化合物公开在如美国专利第4,985,461号、第5,225,443号、第5,354,762号、第5,117,057号、第6,013,836号、第5,424,333号、第5,344,958号、第5,530,028号、第5,482,962号、第7,456,315号和第7,304,161号以及WO2008/153801中。在一个实施方式中，术语“二酰基肼”指具有下列化学式的化合物：
其中R1为烷基，且Ar1和Ar2独立地为带有1-3个选自下组的取代基的苯基，所述取代基包括卤素、烷基和烷氧基。在一个实施方式中，R1为支链的C4-C8烷基，例如-C(CH3)3、-C(CH3)C(CH3)3、-C(CH2CH3)C(CH3)3或-C(CH2CH2CH3)C(CH3)3。在一个实施方式中，苯取代基独立地为C1-C4烷基或烷氧基，例如Ar1为2-乙基-3-甲氧基苯基并且Ar2为3，5-二甲基苯基。本实施方式的代表性的二酰基肼公开在如U.S.7,456,315和WO2008/153801中。
术语“酰胺酮”指具有下列化学式的化合物：
如公开在U.S.7,365,093中。
术语二唑啉”指具有下列化学式的化合物：
如公开在U.S.7,304,162中。
术语“运载体”包括本领域已知的任何标准载体。在一个实施方式中，运载体为药学上可接受的运载体。术语“药学上可接受的运载体”包括任何标准的药学运载体、缓冲剂和赋形剂，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂(例如油/水或水/油乳剂)，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。合适的药学运载体和它们的制剂在1995年宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司出版的《雷明顿药物科学》第19版(Remington′sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCo，Easton，PA，19thed.1995)中有述。优选的药学运载体取决于活性药剂的预期给药方式。
“硅胶层析”指一种纯化方法，其中目标化学物质作为浓缩样品加到垂直柱的顶部，该柱由装在玻璃、塑料或金属圆柱中的硅胶或化学修饰的硅胶构成，并且用溶剂或溶剂混合物从这样的柱上洗脱。
“快速层析”是指在空气、氩气或氮气压力下进行的硅胶层析，通常压力在10-50psi的范围内。
“梯度层析”指化学物质采用逐步变化组成的溶剂混合物从柱上洗脱的硅胶层析。
本发明使用的术语具有它们在本领域使用的平常意义。
术语“分离的”在本发明中用于表明生物材料(核酸或蛋白)已经从其原始环境(其天然存在的环境)中分离出来了。例如，一个以天然状态存在于植物或动物中的多核苷酸不是分离的，然而从它天然存在的相邻核酸中分离出来的相同多核苷酸被认为是“分离的”。术语“纯化的”不需要材料以绝对纯、不带有其它化合物的形式存在。它是一个相对的定义。
多核苷酸在从初始材料或天然材料纯化了至少1个数量级后，例如2或3或4或5个数量级，处于“纯化”状态，。
“核酸”或“核酸分子”或“多核苷酸”是包含共价连接称为核苷酸的亚基的多聚物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)和多聚脱氧核糖核酸(DNA)，两者都可为单链或双链。DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成的DNA和半合成的DNA。DNA可为线性的、环状的或超螺旋的。核酸可指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)，或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷)的磷酸酯多聚形式，或其任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酸酯，为单链形式或双链螺旋。可能有双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。该术语包括限制性片段、质粒和染色体。DNA或RNA序列描述可以根据正常惯例，按照沿着非转录DNA链(即具有与mRNA同源序列的链)从5’到3’的方向给出序列。“重组DNA分子”是已经经过分子生物学操作的DNA分子。
术语“核酸片段”应理解为相对于对照核酸序列长度缩短的核苷酸序列，并且包含一个与对照核酸相同核苷酸序列的共有部分。当合适时，这样的本发明的核酸片段可包含在较大的多核苷酸中。片段的长度可以为本发明的核酸的至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000或1500个连续核苷酸。
如本发明所用，“分离的核酸片段”为单链或双链的RNA或DNA多聚物，可选地带有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA多聚物形式的分离的核酸片段可由一个或多个cDNA、基因组DNA或合成的DNA片段组成。
“基因”指编码一个多肽或编码一个生物活性RNA分子的核苷酸集合。术语“基因”包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”也指表达特定蛋白或多肽的核酸片段，包括编码序列前(5’非编码序列)和编码序列后(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”指如天然发现的带有其自身调控序列的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含天然不会一起出现的调控序列和/或编码序列。因此，嵌合基因可包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或是调控序列和编码序列来自同一来源但以与天然情况不同的方式排列。嵌合基因可包含来自不同来源的编码序列和/或来自不同来源的调控序列。“内源基因”指在生物体基因组上其天然位置上的天然基因。“外源”基因或“异源”基因指正常不会出现在宿主生物体中的基因，但是通过基因转移导入到宿主生物体中。“转基因”是已经通过转化方式导入基因组中的基因。
“异源”DNA指天然不在细胞中、或不在细胞中的染色体位点上的DNA。在一个实施方式中，异源DNA包括细胞的外来基因。
术语“基因组”包括染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。
核酸分子是与另一个核酸分子“可杂交”的，例如cDNA、基因组DNA或RNA，当在温度和溶液离子强度合适的条件下核酸分子的单链形式可以退火连接到其它核酸分子上(参见Sambrook等，1989见下文)。杂交和洗涤条件是众所周知的并且列举在1989年冷泉港的冷泉港实验室出版社出版的Sambrook，J，Fritsch，E.F和Maniatis，T.的《分子克隆实验指南》第二版(Sambrook，J，Fritsch，E.F.andManiatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual，SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor(1989))中，尤其是其中的第11章和表11.1(整体引入本发明作为参考)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严谨度”。
可以调节严谨条件来筛选适度相似的片段，例如来自关系远的生物体的同源序列；到高度相似的片段，例如来自相近生物体的复制功能酶的基因。为了初步筛选同源核酸，可以采用对应于Tm55℃的低严谨度的杂交条件，如5xSSC、0.1％SDS、0.25％牛奶且没有甲酰胺；或是30％甲酰胺、5xSSC、0.5％SDS。对应于较高Tm的适度严谨杂交条件为例如40％甲酰胺，和5x或6xSCC。对应于最高Tm的高严谨杂交条件，例如50％甲酰胺，5x或6xSCC。
杂交需要2个核酸包含互补序列，尽管依赖于杂交的严谨度，碱基之间可能错配。术语“互补”用于描述能相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明也包括分离的核苷酸片段，该片段与本发明所公开或所用的完整序列以及他们基本相似的核酸序列互补。在本发明的一个特定实施方式中，采用杂交条件来检测多核苷酸，该杂交条件包含一个Tm55℃的杂交步骤，并且使用如上所述的条件。在一个实施例中，Tm为60℃。在另一个实施方式中，Tm为63℃。在另一个实施方式中，Tm为65℃。
杂交后的洗涤也决定了严谨条件。一套条件采用了一系列的洗涤，从室温下用6XSSC，0.5％SDS洗涤15min开始，然后重复用2XSSC，0.5％SDS在45℃洗30min，并且然后重复两次用0.2XSSC，0.5％SDS在50℃洗30min。另一套严谨条件采用较高的温度，洗涤与上述条件相同，除了最后两次用0.2XSSC，0.5％SDS洗涤30min的温度提高到60℃。另一套高度严谨的条件采用最后两次洗涤为在65℃用0.1XSSC，0.1％SDS洗涤。杂交需要两个核酸包含互补序列，尽管依赖于杂交的严谨度，碱基之间可能有错配。
核酸杂交的合适严谨度取决于核酸的长度和互补程度，变量是本领域所熟知的。两个核苷酸序列之间的相似度或同源性越高，带有那些序列的核酸的杂合体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按照下列顺序降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于大于100个核苷酸长度的杂交，已经有了计算Tm的方程式(参见Sambrook等，见上，9.50-0.51)。对于较短核酸即寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更为重要，并且寡核苷酸的长度决定了它的特异性(参见Sambrook等，见上11.7-11.8)。
在本发明的一个特定实施方式中，采用下列杂交条件检测多核苷酸，杂交条件包含一个杂交步骤，盐浓度少于500mM且至少为37℃；以及一个洗涤步骤，用2XSSPE且至少为63℃。在一个实施方式中，杂交条件包含杂交和洗涤步骤都在至少200mM盐且63℃进行。
在一个实施方式中，可杂交的核酸的长度为至少约10个核苷酸。一个可杂交的核酸的最小长度的例子为至少约15个核苷酸；另一个长度为至少约20个核苷酸；且又一个长度为至少30个核苷酸。此外，熟练技术人员会意识到，根据如探针长度等因素，可以按需要调节温度和洗涤溶液盐浓度。
术语“探针”指能与互补的单链靶核酸碱基配对形成双链分子的单链核酸分子。
如本发明所用，术语“寡核苷酸”指一种能与基因组DNA分子、cDNA分子、质粒DNA或mRNA分子杂交的核酸分子。寡核苷酸可以加上标签，如32P-核苷酸或是共价连接了如生物素等标签的核苷酸。加了标签的寡核苷酸可用作探针来检测核酸的存在。寡核苷酸(两者中的一个或两个可带有标签)可用作PCR引物，用于克隆全长核酸或核酸片段，或是检测核酸的存在。寡核苷酸也可用于与DNA分子形成三螺旋。通常，寡核苷酸是合成制备的，例如用核酸合成仪。因此，寡核苷酸可用非天然存在的磷酸二酯类似键来制备，例如硫酯键。
“引物”是在合适条件下与靶核酸序列杂交以产生双链核酸区域作为DNA合成起始点的寡核苷酸。这样的引物可用于聚合酶链式反应。
“聚合酶链式反应”简称PCR，表示一种用酶扩增特定核酸序列的体外方法。PCR涉及一系列重复的温度循环，每个循环包含三个阶段：模板核酸变性以分离靶分子链，将单链PCR寡核苷酸引物退火结合到模板核酸上，并且用DNA聚合酶延伸退火的引物。PCR提供了一种检测靶分子存在的方法，并且在定量或半定量条件下，确定在起始核酸池中那个靶分子的相对量。
“逆转录聚合酶链式反应”简称RT-PCR，表示一种体外方法，用酶从RNA分子产生靶cDNA分子，接着如上所述在靶cDNA分子内酶扩增特定的核酸序列或序列。RT-PCR也提供了一种检测靶分子存在的方法，并且在定量或半定量条件下，确定在起始核酸池中那个靶分子的相对量。
DNA“编码序列”是当置于合适调控序列的控制下时，体内或体外在细胞内转录和/或翻译成多肽的双链DNA序列。“调控序列”指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、当中或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子，翻译前导序列，内含子，多聚腺苷酸化识别序列，RNA加工位点，效应因子结合位点和茎环结构。编码序列的边界由一个在5’(氨基)端的起始密码子和一个在3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于，原核序列，siRNA，微小RNA，shRNA或其他生物活性RNA，来自mRNA的cDNA，基因组DNA序列，以及甚至合成的DNA序列。如果编码序列是用于在真核细胞中目标蛋白的表达，多聚腺苷化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
如本发明所用，术语“头对头”指两个多核苷酸序列相互之间的方向。当一个多核苷酸编码链的5’端接近另一个多核苷酸编码链的5’端时，两个多核苷酸位于“头对头”的方向，从而每个多核苷酸的转录方向从另一个多核苷酸的5’端向外进行。术语“头对头”可以缩写为(5′)-到-(5′)，并也可用符号(←)或(3′←5′53′)表示。
如本发明所用，术语“尾对尾”描述了两个多核苷酸序列相互之间的方向。当一个多核苷酸编码链的3’端接近另一个多核苷酸编码链的3’端时，两个多核苷酸位于“尾对尾”的方向，从而每个多核苷酸的转录方向朝着另一个多核苷酸进行。术语“尾对尾”可以缩写为(3′)-到-(3′)，并也可用符号(.←)或(5′.3′3←5′)表示。
如本发明所用，术语“头对尾”描述了两个多核苷酸序列相互之间的方向。当一个多核苷酸编码链的5’端接近另一个多核苷酸编码链的3’端时，两个多核苷酸位于“头对尾”的方向，从而每个多核苷酸的转录方向与另一个多核苷酸相同的方向进行。术语“头对尾”可以缩写为(5′)-到-(3′)，并也可用符号(.)或(5′.3′53′)表示。
术语“下游”指一个核苷酸序列位于对照核苷酸序列的3’。特别是，下游核苷酸序列通常涉及转录起始位点后的序列。例如，一个基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
术语“上游”指一个核苷酸序列位于对照核苷酸序列的5’。特别是，上游核苷酸序列通常涉及位于编码序列或转录起始位点的5’侧的序列。例如，多数启动子位于转录起始位点的上游。
术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指切割双链DNA中特定核苷酸序列的酶。
“同源重组”指一个外源DNA序列插入到另一个DNA分子中，例如一个载体插入到染色体中。例如，载体攻击特定的染色体位点进行同源重组。对于特异性的同源重组，载体包含于染色体的序列同源的足够长的区域，允许互补结合和载体结合到染色体上。同源的序列越长，且序列相似度越高，可以提高同源重组的效率。
本领域已知的几个方法可用于增殖本发明所述的多核苷酸。一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，可以增殖并且成批制备重组表达载体。如本发明所述，可用的表达载体包括但不限于下列载体或它们的衍生物：人或动物病毒例如牛痘病毒或腺病毒；昆虫病毒例如杆状病毒；酵母载体；细菌噬菌体载体(例如λ)以及质粒和粘粒DNA载体，仅举几例。
“载体”是用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞的任何工具。载体可为一个可以连接到另一个DNA片段上的复制子，从而实现连接片段的复制。“复制子”是能在体内作为自主DNA复制单位的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，即能够在它自己控制下进行复制。术语“载体”包括用于在体外、经体外到体内或体内将核酸导入细胞的病毒或非病毒工具。本领域已知的大量载体可用于操作核酸，整合反应元件和启动子到基因中等。可能的载体包括，例如质粒或修饰的病毒包括如细菌噬菌体例如λ衍生物，或是质粒例如pBR322或pUC质粒衍生物，或是Bluescript载体。例如，向合适的载体中插入对应于反应元件或启动子的DNA片段可通过连接合适的DNA片段到所选择的带有互补粘性末端的载体上来实现。任选地，DNA分子的末端可为酶修饰的或任意位点，可通过连接核苷酸序列(接头)到DNA末端来产生。这样的载体可以工程化改造成带有选择性标记物基因，该标记物基因用于筛选标记物整合到细胞基因组中的细胞。这样的标记物可以识别和/或筛选整合并且表达了标记物编码的蛋白的细胞。
病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经用于向细胞以及活动物对象的各种基因传递应用。可使用的病毒载体包括但不限于，逆转录病毒，腺相关病毒，痘，杆状病毒，牛痘，单纯疱疹，EB病毒，腺病毒，双粒病毒和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒，脂质体，带电脂质(细胞转染剂)，DNA-蛋白质复合物，生物聚合物。除了核酸，载体也可能包括一个或多个调控区域，和/或用于筛选、检测和监测核酸转移效果的选择性标记物(转移到哪个组织，表达持续时间等)。
术语“质粒”指一个染色体外的元件，通常带有一个不是细胞中央代谢一部分的基因，并且通常为环状双链DNA分子的形式。这种元件可为自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线形、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA，可来自任何来源，其中大量核苷酸序列已经连接或重组到一个独特构建物中，该构建物能将启动子片段和选定基因产物的DNA序列以及合适的3’非翻译序列导入到细胞中。
“克隆载体”为一个“复制子”，其为单位长度的如DNA等核酸，能后续复制并且包含一个复制起点，例如质粒、噬菌体或粘粒，可以连接另一个核酸片段，从而发生连接片段的复制。克隆载体也能在一种细胞类型中复制并在另一种细胞中表达(“穿梭质粒”)。
载体导入到预期的宿主细胞中可采用本领域已知的方法，例如转染、电转、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体(溶酶体融合)，使用基因枪，或是DNA载体运送装置(参见例如Wu等，1992，J.Biol.Chem.267：963-967；Wu和Wu，1988，J.Biol.Chem.263：14621-14624；和1990年3月5日递交的Hartmut等的加拿大专利申请第2,012,311号)。
本发明的多核苷酸也可在体内用脂质体导入。旨在克服脂质体介导的转染所遇到的困难和危险的合成的阳离子脂质，可用于制备体内转染编码标记物基因的脂质体(Felgner等，1987，PNAS84：7413；Mackey等，1988.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8027-8031；和Ulmer等，1993，Science259：1745-1748)。可用于核酸转移的脂质化合物和组合物在WO95/18863、WO96/17823和US5,459,127中有描述。脂质也可化学连接到用于定向的其它分子上(Mackey等，1988，见上)。靶向的肽可以化学连接到脂质体上，例如激素或神经递质、以及蛋白例如抗体，或非肽分子。
其它分子也可用于促进体内核酸的转染，例如阳离子寡肽(例如WO95/21931)，来源于DNA结合蛋白的肽(如WO96/25508)，或阳离子聚合物(如WO95/21931)。
也可将载体在体内作为裸露的DNA质粒导入(参见US5,693,622、5,589,466和5,580,859)。也可使用受体介导的DNA传递方法(Curiel等，1992，Hum.GeneTher.3：147-154；以及Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。
术语“转染”指细胞摄入RNA或DNA。当这样的RNA或DNA已经转入到细胞中时，细胞已经被RNA或DNA“转染”。当转染的RNA或DNA引起表型改变时，细胞已经被RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA可被整合(共价连接)到染色体DNA上，修饰细胞的基因组。
“转化”指核酸片段转移到宿主生物的基因组上，导致遗传上稳定的继承。带有转化核酸片段的宿主生物体称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体。
“基因区域”指一个包含一个编码多肽的基因的核酸分子或核苷酸序列的区域。
此外，包含本发明的多核苷酸的重组载体可包括在细胞宿主中的一个或多个复制起始位点用于扩增或表达标记物或选择性标记物。
术语“选择性标记物”表示一个识别因子，通常为抗生素或化学抗性基因，可通过基于标记物基因效果进行筛选，即对抗生素的抗性、对除草剂的抗性、比色标记物、酶、荧光标记物等等，其中效果用于追踪目标核酸的传承和/或识别已经继承了目标核酸的细胞或生物体。本领域已知并且已采用的选择性标记基因的例子包括：提供对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素，双丙氨磷除草剂、磺胺药物等等的抗性的基因；以及用作表型标记物的基因，即花青素调控基因，异戊烯转移酶基因等等。
术语“报告基因”表示编码能根据报告基因的效果来进行识别的识别因子的核酸，其中效果用于追踪目标核酸的继承，以识别已经继承了目标核酸的细胞或生物体，和/或测量基因表达诱导或转录。本领域已知和已使用的报告基因包括：虫荧光素酶(Luc)，红色荧光蛋白(RFP)，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，绿色荧光蛋白(GFP)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(LacZ)，β-葡萄糖醛酸酶(GUS)等等。选择性标记基因也可被认为是报告基因。
“启动子”指能控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。通常但不是永远，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可来源于天然基因或是由来自自然界中不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成DNA片段。本领域的技术人员应理解，不同的启动子可引导一个基因在不同组织或细胞类型中的表达，或是在发育的不同阶段的表达，或是对于不同环境或生理条件产生应答。使得基因在多数时间在多数细胞类型中表达的启动子，一般称为“组成型启动子”。使得基因在特定细胞类型中表达的启动子，一般称为“细胞特异性启动子”或是“组织特异性启动子”。使得基因在发育或细胞分化的特定阶段表达的启动子，一般称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。诱导和导致基因在用一种诱导该启动子的药剂、生物分子、化学品、配体、光等等接触或处理后表达的启动子，一般称为“诱导型启动子”或“调控型启动子”。还意识到，因为在多数情况下，调控序列的实际边界还没有完全确定，不同长度的DNA片段可以有相似的启动子活力。
“启动子序列”为一种能在细胞中结合RNA聚合酶并且起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区域。为了定义本发明，启动子序列在它的3’末端以转录起始位点为界，并且延伸到上游(5’方向)以包含起始高于背景的可检测水平的转录需要的最小数量的碱基或元件。在启动子序列中，可发现转录起始位点(例如通过核酸酶S1图谱来定义)，以及负责与RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域(一致序列)。
当RNA聚合酶把编码序列转录成mRNA时，编码序列在细胞中“受控于”或“可操作地连接了”转录和翻译调控序列，然后被反式RNA剪接(如果编码序列包含内含子)和翻译成由编码序列编码的蛋白。
“转录和翻译控制序列”为DNA调控序列，例如启动子、增强子、终止子等等，供编码序列在宿主细胞中的表达。在真核细胞中，多聚腺苷化信号为控制序列。
术语“反应元件”表示一个或多个顺式作用DNA元件，其通过与DNA结合结构域的相互作用使启动子产生应答。反应元件可为(完美或不完美的)回文序列，或是由可变数量核苷酸分隔开来的序列基序或半位点构成。半位点可为相似的或相同的，并且排列成正向或反向的重复，或是作为单个半位点或是相邻半位点的一前一后的多聚体。根据反应元件所导入的细胞或生物体的特性，反应元件可包含一个从不同生物体分离的最小启动子。DNA结合结构域结合到反应元件的DNA序列上，起始或抑制了在该反应元件控制下的下游基因的转录。用作天然蜕皮甾醇受体的反应元件的DNA序列的例子包括RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQIDNO：28)(参见CherbasL等，(1991)，GenesDev.5，120-131)；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可为一个或多个间隔子核苷酸(SEQIDNO：29)(参见D′AvinoPP.等，(1995)，Mol.Cell.Endocrinol，113，1-9)；以及GGGTTGAATGAATTT(SEQIDNO：30)(参见AntoniewskiC.等，(1994).Mol.CellBiol.14，4465-4474)。
术语“可操作地连接”指在单个核酸片段上连接核酸序列，使得一个片段的功能被另一个所影响。例如，当它能影响那个编码序列的表达(即编码序列在启动子的控制下转录)时，启动子可操作的连接到一个编码序列上。编码序列可以正义或反义的方向可操作的连接到调控序列上。
如本发明所用，术语“表达”指来自核酸或多核苷酸的正义(mRNA)或反义RNA的转录且稳定聚集。表达也可指mRNA翻译成蛋白或多肽。
术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”指可以在特定的限制性位点或通过同源重组插入到核酸或多核苷酸中的DNA片段。DNA片段包含一个编码目标多肽的多核苷酸，并且对盒和限制性位点进行设计，以确保在转录和翻译的合适编码框插入盒。“转化盒”指包含编码目标多肽的多核苷酸并且除了多核苷酸外还有促进特定宿主细胞转化的盒。本发明的盒，表达盒，基因表达盒也可包含使得编码目标多肽的多核苷酸在宿主细胞中表达上升的元件。这些元件可包括但不限于，启动子、最小启动子、增强子、反应元件、终止子序列、多聚腺苷化序列等等。
出于本发明的目的，术语“基因开关”指一个基于核受体的系统，包括但不限于基于EcR的系统，当存在一种或多种配体时，调控至少一个目标基因的表达，其中目标基因可操作的连接到预先确定的反应元件和启动子上。基因开关可包含形成同源二聚体的多肽或形成异二聚体的多肽。
术语“调控”表示诱导、降低或抑制核酸或基因的表达，导致分别诱导、降低或抑制蛋白或多肽的产生。
本发明的质粒或载体还可包含至少一个适用于驱动基因在宿主细胞中表达的启动子。术语“表达载体”表示能在转化进入宿主后使插入核酸序列表达的载体、质粒或运载体。克隆的基因，即插入的核酸序列，通常置于控制元件的控制之下，例如启动子、最小启动子、增强子等等。起始控制区域或启动子，用于驱动核酸在预期宿主细胞中的表达，是大量的且为本领域的技术人员所熟悉的。事实上，任何能驱动这些基因表达的启动子适用于本发明，包括但不限于，病毒启动子，细菌启动子，动物启动子，哺乳动物启动子，合成启动子，组成型启动子，组织特异性启动子，发育特异性启动子，诱导型启动子，光调控启动子；CYC1，HIS3，GAL1，GAL4，GAL10，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI，碱性磷酸酶启动子(用于在酿酒酵母中表达)；AOX1启动子(用于在毕赤酵母中表达)；β-内酰胺酶，lac，ara，tet，trp，lPL，lPR，T7，tac和trc启动子(用于在大肠杆菌中表达)；光调控启动子，种子特异性启动子，花粉特异性启动子，卵巢特异性启动子，疾病发生或疾病相关的启动子，花椰菜花叶病毒35S启动子，CMV35S最小启动子，木薯脉花叶病毒(CsVMV)启动子，叶绿素a/b结合蛋白启动子，核酮糖1，5二磷酸羧化酶启动子，芽特异性启动子，根特异性启动子，几丁质酶启动子，压力诱导型启动子，水稻东格鲁杆状病毒启动子，植物超级启动子，马铃薯亮氨酸氨基肽酶启动子，硝酸还原酶启动子，甘露氨酸合成酶启动子，胭脂碱合成酶启动子，泛素启动子，玉米醇溶蛋白启动子，花青素启动子(用于在植物细胞中表达)；本领域已知的动物和哺乳动物启动子包括但不限于，SV40早期(SV40e)启动子区域，包含在劳斯肉瘤病毒(RSV)的3′长末端重复序列(LTR)中的启动子，腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期启动子(MLP)基因的启动子，巨细胞病毒(CMV)早期启动子，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子，杆状病毒IE1启动子，延伸因子1α(EF1)启动子，磷酸甘油酯激酶(PGK)启动子，泛素(Ubc)启动子，白蛋白启动子，小鼠金属硫蛋白-L启动子和转录控制区域的调控序列，普遍存在的启动子(HPRT，波形蛋白，α-肌动蛋白，微管蛋白等等)；中间纤维的启动子(结蛋白、神经纤维、角蛋白、GFAP等等)，治疗性基因的启动子(MDR，CFTR的或因子VIII的启动子等等)，疾病发生或疾病相关的启动子，以及表现出组织特异性且已用转基因动物的启动子，如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，在肝中有活性的白蛋白基因、载脂蛋白AI和载脂蛋白AII的控制区，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区，在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区，在骨髓细胞有活性的β-珠蛋白基因控制区，在脑的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区，以及在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区，丙酮酸激酶启动子，绒毛启动子，脂肪酸结合肠蛋白的启动子，平滑肌细胞α肌动蛋白启动子等等。此外，这些表达序列可以加入增强子或调控序列等等进行修饰。
可用于本发明的实施方式的增强子包括但不限于：SV40增强子，巨细胞病毒(CMV)增强子，延伸因子1(EF1)增强子，酵母增强子，病毒基因增强子，等等。
终止控制区，即终止子和多聚腺苷酸化序列，也可来源于宿主天然就有的各种基因。可选地，终止序列可以是不需要的。在本发明的一个实施方式中，终止控制序列可包含或来源于一个合成的序列，合成的多聚腺苷酸化信号，SV40晚期多聚腺苷酸化信号，SV40多聚腺苷酸化信号，牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号，病毒终止子序列，等等。
术语“3’非编码序列”或“3’非翻译区(UTR)”指位于编码序列下游的DNA序列，并可包含多聚腺苷酸化[poly(A)]识别序列，以及编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多聚腺苷酸化信号通常具有能影响多聚腺苷酸尾加到mRNA前体的3’末端。
“调控区”表示调控第二核酸序列表达的核酸序列。调控区可包括天然负责表达特殊核酸(同源区)的序列，或可包括负责表达不同蛋白或甚至合成蛋白的不同起始序列(异源区)。特别是，序列可为以特异性或非特异性方式、以诱导型或非诱导型方式激活或抑制基因转录的原核、真核或病毒基因序列或是衍生序列。调控区包括复制起始位点，RNA剪接位点，启动子，增强子，转录终止序列，引导多肽进入靶细胞分泌通路的信号序列。
来自“异源”的调控区为天然与所表达的核酸不相关的调控区域。异源调控区包括来自不同物种的调控区，来自不同基因的调控区，杂合调控序列，以及天然不存在的但由本领语的普通技术人员设计的调控序列。
“RNA转录本”指来自RNA聚合酶催化的DNA序列转录的产物。当RNA转录本是DNA序列的完美互补副本时，它称为初级转录本，或它可为来自初级转录本转录后加工的RNA序列，且称为成熟的RNA。“信使RNA(mRNA)”指不带有内含子并且可被细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”指与mRNA互补且来源于mRNA的双链DNA。“正义”RNA指包括mRNA并且可被细胞翻译成蛋白的转录本。“反义RNA”指与目标初级转录本或mRNA的全部或部分互补并且抑制目标基因表达的RNA转录本。反义RNA的互补性可为与特定基因转录本的任何部分，即在5’非编码序列，3’非编码序列或编码序列。“功能RNA”或“生物活性RNA”指反义RNA，核酶RNA，或不翻译但对细胞过程有影响的其他RNA。
“多肽”为一种由共价连接的氨基酸残基构成的多聚化合物。
根据侧链R，氨基酸可以分成7组：(1)脂肪族侧链，(2)带有羟基(OH)的侧链，(3)带有硫原子的侧链，(4)带有酸性或酰胺基团的侧链，(5)带有碱性基团的侧链，(6)带有芳香环的侧链，及(7)脯氨酸，一种侧链与氨基熔化的亚胺酸。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用。
“分离的多肽”或“分离的蛋白”为基本不含有在天然状态下与其相结合的化合物(例如其他蛋白或多肽、核酸、碳水化合物、脂类)的多肽或蛋白。“分离的”并不意味着排除与其他化合物的人工或合成的混合物，或是存在不影响生物活性的杂质，并且可存在例如因为不完全纯化、加入稳定剂，或是加入到药学可接受的制剂中。
“取代突变体多肽”或“取代突变体”理解为表示一个包含至少一个野生型或天然存在的氨基酸被一个相对于野生型或天然存在的多肽不同的氨基酸取代的突变体多肽。取代突变体多肽可包含仅一个野生型或天然存在的氨基酸取代并且可称为“点突变体”或“单点突变体”多肽。任选地，取代突变体多肽可包含两个或更多个野生型或天然存在的氨基酸被相对于野生型或天然存在的多肽不同的两个或多个氨基酸取代的突变体多肽。根据本发明，带有一个取代突变的H组核受体配体结合结构域多肽包含至少一个野生型的或天然存在的氨基酸被一个与野生型或天然存在的H组核受体配体结合结构域多肽不同的氨基酸取代。
当取代突变体多肽包含一个有2个或多个野生型或天然存在的氨基酸的取代时，该取代可包含等量的野生型或天然存在的氨基酸从取代中缺失，即两个野生型或天然存在的氨基酸被两个非野生性或非天然存在的氨基酸置换掉；或是非等量的野生型或天然存在的氨基酸从取代中被缺失，即两个野生型氨基酸被一个非野生型氨基酸置换掉(取代+缺失突变)；或是两个野生型氨基酸被三个非野生型氨基酸置换掉(取代+插入突变)。
取代突变体可用缩写命名系统来描述，表示在对照多肽中被置换的氨基酸残基和序号，以及新的取代的氨基酸残基。例如，一个多肽的第20个氨基酸残基被取代的取代突变体，可以缩写为“x20z”，其中“x”为待置换的氨基酸，“20”为多肽内氨基酸残基的位置或序号，且“z”为新的取代的氨基酸。所以，取代突变体可互换地缩写为“E20A”或“Glu20Ala”，表示该突变体在多肽的20号位点包含一个丙氨酸残基(本领域通常缩写为“A”或“Ala”)替换了谷氨酸
(本领域通常缩写为“E”或“Glu”)。
取代突变可以用本领域已知的任何突变技术来制备，包括但不限于，体外定点突变(Hutchinson，C.等，1978，J.Biol.Chem.253：6551；Zoller和Smith，1984，DNA3：479-488；Oliphant等，1986，Gene44：177；Hutchinson等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：710)，使用接头(法玛西亚公司，Pharmacia)，限制性内切酶消化/片段缺失和取代，PCR-介导的/寡核苷酸定向突变等等。基于PCR的技术可用于定点突变(参见1989年斯托克顿出版社出版的H.Erlich编的《PCR技术：DNA扩增的原理和应用》第6章第61-70页的Higuchi的“使用PCR工程化改造DNA”(Higuchi，1989，″UsingPCRtoEngineerDNA″，inPCRTechnology：PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification，H.Erlich，ed，StocktonPress，Chapter6，pp.61-70))。
如本发明所述的“多肽片段”理解为表示氨基酸序列比对照多肽更短的多肽，并且包含与这些对照多肽的完整部分相同的氨基酸序列。在适当的时候，这样的片段可作为一部分包括在一个较大的多肽中。如本发明所述的多肽的这样的片段长度可为至少2，3，4，5，6，8，10，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，25，26，30，35，40，45，50，100，200，240或300个氨基酸。
多肽或蛋白的“变体”可为任何类似物、片段、衍生物或突变体，其来源于多肽或蛋白并且保留了多肽或蛋白的至少一种生物特性。多肽或蛋白的不同变体可以是天然存在的。这些变体可为等位变体，其特征在于，编码这个蛋白的结构基因的核苷酸序列差异，或可包含差异剪接或翻译后修饰。熟练的技术人员可以生产带有单个或多个氨基酸取代、缺失、插入或置换的变体。这些变体可包括，尤其是，(a)一个或多个氨基酸残基被取代为保守或非保守氨基酸的变体；(b)多肽或蛋白中加入一个或多个氨基酸残基的变体；(c)一个或多个氨基酸包含一个取代基团的变体；以及(d)多肽或蛋白融合到另一个多肽如血清白蛋白上的变体。用于获得这些变体的技术，包括遗传技术(抑制、缺失、突变等)、化学技术和酶技术，是具有本领域普通技术的人已知的。
“异源蛋白”指细胞中不天然产生的蛋白。
“成熟蛋白”指经过翻译后加工的多肽，即初级翻译产物中存在的任何前肽或原肽已经被去除的多肽。“前体”蛋白指mRNA翻译的初级产物，即还存在前肽和原肽。前肽和原肽可为但不限于细胞内定位信号。
术语“同源性”指在两个多核苷酸或多肽分子间相同性的百分比。从一个半分子到另一个半分子序列间的对应性，可由本领域已知的技术来确定。例如，同源性可以通过直接比较两个多肽分子之间的序列信息来确定，通过匹配序列信息并且采用已有的计算机程序。任选地，同源可以通过可在同源区域之间形成稳定的双链的条件下进行多核苷酸杂交、然后用单链特异性的核酸酶进行消化并且测定消化所得片段的大小来确定。
如本发明所用，所有语法形式和拼写变化的术语“同源的”，指带有“共同的进化起源”的蛋白之间的相互关系，包括来自超家族(如免疫球蛋白超家族)的蛋白以及来自不同物种的同源蛋白(如肌球蛋白轻链等)(Reeck等，1987，Cell50：667)。这种蛋白(及其编码基因)具有序列同源性，表现为他们序列高度相似。然而，在同样的使用和直接应用中，当用副词例如“高度”修饰时，术语“同源的”可指序列相似并且没有共同的进化起源。
因此，各种语法形式的术语“序列相似性”，指核酸或蛋白的氨基酸序列之间的同一性或对应性程度，可共有或可不共有相同的进化起点(参见Reeck等，1987，Cell50：667)。
在一个特定实施方式中，当有至少约50％(例如，至少约75％、90％或95％)的核苷酸与DNA序列在确定的长度上匹配时，两个DNA序列为“基本同源”或“基本相似”。基本同源的序列可以通过用序列数据库中已有的软件比较序列，或用在如为该特定系统确定的严谨条件下的Southern杂交来进行识别。确定合适的杂交条件包含在本领域的技术中。参见如Sambrook等，1989，见上。
如本发明所用，“基本相似”指核酸序列片段，其中一个或多个核苷酸碱基的变化导致一个或多个氨基酸取代，但是不影响DNA序列编码的蛋白的功能特性。“基本相似”也指核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的变化不影响核酸片段通过反义或共抑制技术来介导基因表达改变的能力。“基本相似”也指修饰本发明的核酸片段，例如缺失或插入基本不影响所得转录本的功能特性的一个或多个核苷酸碱基。所以，应该理解，本发明包括比特定的序列例子更多。每个所提议的修饰在本领域的常规技术内，例如确定所编码的产物保持的生物活力。
而且，熟练的技术人员意识到，本领域包括的基本相似的序列也可通过它们在严谨条件下(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃，并且用2XSSC，0.1％SDS洗涤，然后用0.1XSSC，0.1％SDS)与本发明列举的序列相杂交的能力来确定。本发明的基本相似的核酸片段为DNA序列与本发明报道的核酸片段的DNA序列有至少70％相同的那些核酸片段。本发明的基本相似的核酸片段包括DNA序列与本发明报道的核酸片段的DNA序列有至少80％相同的那些核酸片段。其他基本相似的核酸片段包括与本发明报道的核酸片段的DNA序列至少90％相同。其他基本相似的核酸片段包括与本发明报道的核酸片段的DNA序列有至少95％相同的那些核酸片段。
当超过约40％的氨基酸为相同的、或超过60％的氨基酸为相似的(功能相同)时，两个氨基酸序列为“基本同源”或“基本相似”。在一个实施方式中，相似或同源的序列是由如GCG(遗传学计算机集团，GCG套装第7版的程序使用说明，麦迪逊，威斯康辛州(GeneticsComputerGroup，ProgramManualfortheGCGPackage，Version7，Madison，Wisconsin))累进程序进行比较来确定。
如本发明所用，术语“对应于”指相似或同源序列，确切的位点可以与测定相似性或同源性的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列比对可包括间隔。因此，术语“对应于”指序列相似性，且不是指氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”包括足够的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列来推定识别那个多肽或基因，通过本领域熟练技术人员的手动序列评估，或是通过用例如BLAST(基本局部比对搜索工具；Altschul，S.F.等，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；也参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等算法进行计算机自动化序列比较和识别。一般来说，为了推定识别一个多肽或核苷酸序列是与已知蛋白或基因同源的，10个或更多个连续氨基酸或是30个或更多个核苷酸是必需的。此外，根据核苷酸序列，带有20-30个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖的基因识别方法(例如Southern杂交)和分离方法(例如细菌菌落或细菌噬菌体菌斑原位杂交)。此外，为了获得包含引物的特定核酸片段，12-15个碱基的短寡核苷酸可用作PCR中的扩增引物。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含足够的序列，用于特异性识别和/或分离带有该序列的核酸片段。
如本领域已知，术语“相同百分比”为两个或多个多肽序列或两个或多个核苷酸序列之间的关系，通过比较序列来确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，情况可为通过这些序列的严谨度匹配来确定。“同一性”和“相似度”可以用已知方法来计算，包括但不限于在下列文献中描述的那些：1988年纽约牛津大学出版社出版的Leski，A.M.编的《计算分子生物学》(ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M，ed.)OxfordUniversityPress，NewYork(1988))；1993年纽约学术出版社出版的Smith，D.W.编的《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects(Smith，D.W，ed.)AcademicPress，NewYork(1993))；1994年新泽西哈门那出版社出版的Griffin，A.M.和Griffin，H.G编的《序列数据的计算机分析》第一部(ComputerAnalysisofSequenceData，PartI(Griffin，A.M，andGriffin，H.G，eds.)HumanaPress，NewJersey(1994))；1987年学术出版社出版的vonHeinje，G.编的《分子生物学中的序列分析》(SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G，ed.)AcademicPress(1987))；以及1991年纽约的斯托克顿出版社出版的Gribskov，M.和Devereux，J.编的《序列分析引物》(SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.andDevereux，J，eds.)StocktonPress，NewYork(1991))。确定同一性的方法设计为给出所测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法编写在公开的计算机程序中。序列比对和计算同一性百分比可以用LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序(DNASTAR公司，麦迪逊，威斯康辛州)进行。序列的多重比对可以采用默认参数(缺口罚分＝10，缺口长度罚分＝10)，用Clustal方法比对(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)进行。可以选择采用Clustal方法进行成对比对的默认参数：KTUPLE1，缺口罚分＝3，窗口＝5以及保存的对角线＝5。
术语“序列分析软件”指用于核苷酸或氨基酸序列分析的任何计算机算法或软件。“序列分析软件”可以是市场上有售的或是独立开发的。典型的序列分析软件包括但不限于GCG程序组件(威斯康辛套件9.0版，遗传计算集团(GCG，麦迪逊，威斯康辛州)(GCGsuiteofprograms(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI))，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)，以及DNASTAR(DNASTAR公司.1228S.帕克大街，麦迪逊，威斯康辛州153715，美国)(DNASTAR，Inc.1228S.ParkSt，Madison，WI53715USA)。但本申请的情境下应该理解，当序列软件用于分析时，分析的结果基于程序引用的“默认值”，除非特别指明。如本发明所用，“默认值”表示当软件初次启动时最初装载在软件中的任何值或参数集。
“合成的基因”可以采用本领域技术人员已知的方法从化学合成的寡核苷酸构件开始进行组装。连接和退火这些构件以产生基因片段，然后进行酶组装，构建完整的基因。“化学合成的”，如涉及DNA序列，表示组成核苷酸在体外组装。DNA手工化学合成可以采用已经建立完善的方法来完成，或是自动化化学合成可以采用多种市售仪器之一来进行。因此，为了根据核苷酸序列优化来反映宿主细胞的密码子偏好，可以对基因进行改造以获得最优化的基因表达。熟练技术人员希望如果倾向于使用那些宿主所偏好的密码子，可以成功的表达基因。当有序列信息时，可以基于来源于宿主细胞的基因的调查来确定优选密码子。
如本发明所用，两个或多个独立可操作的基因调控系统被称为是正交的，当：a)每个给定系统通过他们各自的配体在所选浓度下调控，导致那个系统中目标基因的表达程度产生可检测的变化；以及b)与在细胞、组织或生物体中同时操作的所有其他系统的表达变化相比，变化是具有统计学显著差异的，无论实际调控是同时或依次发生的。例如，每个独立可操作的基因调节系统的调控产生基因表达的变化比细胞、组织或生物体内所有其他可操作的系统高至少2倍、5倍、10倍、100倍或500倍。完全正交的基因开关系统能够通过各自的配体，独立调控每一个开关组分。在系统中的一个开关目标基因表达程度可检测的变化，不影响在细胞、组织或生物体中其他可操作系统的目标基因表达的可检测的变化。本发明可用于检索正交的配体和正交的基于受体的基因表达系统。
术语“调控”表示给定配体/受体复合物诱导或抑制基因或目标基因表达的能力。
术语“外源基因”表示对于对象是外来的基因，即通过转化方法导入对象的基因，内源突变基因的未突变版本或是内源未突变基因的突变版本。内源基因可为以DNA或RNA形式导入到对象中的天然或合成基因和治疗性基因，RNA可以通过例如逆转录酶的DNA中间体来发挥作用。这样的基因可以导入到靶细胞中，直接导入到对象中，或者是通过把转化的细胞转入对象中间接导入。术语“治疗性基因”表示对于表达这种基因的宿主细胞具有有益作用的基因。治疗性基因可为编码毒素或对于杀伤细胞有贡献的其他产物的基因。例如，这样的目标基因可用于癌症治疗。
术语“受体复合物”通常指包含核受体组分的蛋白复合物，包括蜕皮甾酮受体(EcR)和/或超气门(USP)蛋白(参见Yao，等(1993)Nature366，476-479；Yao等，(1992)Cell71，63-72)。功能受体复合物也可包括其他蛋白例如亲免素。类固醇受体家族蛋白的成员，已知为转录因子(例如DHR38、β-FTZ-1或其他昆虫同源物)，也可为EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖性的伴侣。受体复合物也可为蜕皮甾酮受体蛋白和超气门蛋白、视黄酸-X-受体(“RXR”)蛋白的脊椎动物同源物的异二聚体。受体复合物也包括EcR-EcR同源二聚体或USP-USP同源二聚体或RXR-RXR同源二聚体。
受体复合物可以通过一个活性类固醇或非甾族配体结合到复合物的一个蛋白上来活化，所述复合物中的蛋白包括EcR但不排除复合物的其他蛋白。
核受体复合物包括类固醇受体超家族成员的蛋白，其中成员的特征在于存在氨基末端的由绞链区分隔的反式激活结构域、DNA结合结构域(“DBD”)、以及配体结合结构域(“LBD”)。家族的一些成员也可在LBD的羧基端一侧具有另一个反式激活结构域。DBD的特征在于存在2个半胱氨酸锌指蛋白，中间间隔了2个氨基酸基序P-Box和D-Box，其提供反应元件的特异性。这些结构域可为天然的、修饰的、或异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。
构成目标基因、反应元件和受体复合物的DNA序列可以整合到原始细菌，原核细胞例如大肠杆菌、枯草杆菌或其他肠细菌，或是真核细胞例如植物或动物细胞。这些细胞可为单细胞或多细胞生物的形式。目标基因、反应元件和受体复合物的核苷酸序列也可作为RNA分子整合，例如以功能病毒RNA如烟草花叶病毒的形式。脊椎动物细胞是有优势的，因为他们天然缺乏对本发明的配体应答的分子。作为结果，他们对本发明的配体不敏感。所以，细胞可以生长并且表达所需的产物，基本不受到配体本身的存在的影响。
术语“对象”指完整的植物或动物，或是来自植物或动物的细胞。也可以预期，当对象为真菌或酵母时，配体同样可以良好工作。当对象为完整的动物时，动物包括脊椎动物或哺乳动物。
当与可以结合到连接到目标基因反应元件上的受体复合物一起使用时，本发明的配体可以提供对目标基因表达的外部暂时调控。不同组分相互结合的顺序并不重要，即配体结合到受体复合物和受体复合物结合到反应元件的顺序。通常，目标基因表达的调控是对受体复合物结合到特定控制或调控DNA元件上产生应答。与类固醇受体家族的其他成员一样，蜕皮甾酮受体蛋白带有至少三个结构域，一个反式激活结构域，一个DNA结合结构域和一个配体结合结构域。与类固醇受体家族亚集一样，这个受体也包含负责异源二聚化的定义不甚明确的区域。配体可结合到同源二聚体复合物(如EcR-EcR或USP-USP)。一个或多个受体结构域可以产生不同的嵌合基因开关。通常，三个结构域中的一个或多个可以从不同于其他结构与来源的一个来源选择，使得嵌合受体是在所选宿主细胞或生物体中优化了反式激活活力，与配体的补体结合，以及识别特定的反应元件。此外，反应元件本身可以被修饰或是被其他DNA结合蛋白结构域的反应元件取代，例如来自酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski，等.(1988)Nature，335，563-564)或来自大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent和Ptashne(1985)，Cell，43，729-736)。嵌合系统的另一个优势在于，它们允许根据希望的最终结果，选择驱动目标基因的启动子。这样的双重控制在基因治疗领域尤其重要，特别是当产生细胞毒性蛋白时，因为可以控制表达的时间以及发生表达的细胞。序列是在合适的条件下可以特异性起始转录的位点。当可操作的连接到一个合适的启动子上的内源或外源的目标基因导入到对象细胞中，基因的表达受控于本发明的配体的存在。启动子可以被组成型或诱导型的调控，或者可为组织特异性(也就是说，只在特殊类型的细胞中表达)或生物体的某些发育阶段特异性的。
本发明的另一个方面是一种在对象中调控一个或多个目标基因表达的方法，包括给予对象有效量的配体，所述配体包含本发明的化合物，并且其中对象的细胞包含：
a)一个受体复合物，包含：
一个DNA结合结构域；
一个配体结合结构域；和
一个反式激活结构域；以及
b)一个DNA构建物，包含：
一个目标基因；
一个反应元件；
其中目标基因是在反应元件的控制下的；并且在存在配体时，DNA结合结构域结合到反应元件上，导致目标基因的激活或抑制。
本发明的一个相关方面是一种在转基因对象内调节内源或异源基因表达的方法，包括在对象细胞中将本发明的配体与蜕皮甾醇受体接触，其中细胞包含蜕皮甾醇受体的DNA结合序列，并且其中蜕皮甾醇受体-配体-DNA结合序列复合物的形成诱导基因的表达。
与控制细胞产生多肽的时间的优势一样，本发明的这个方面提供了另一个优势，在这种多肽的聚集会损伤细胞的那些情况下，多肽的表达可以限制在短时期内。当外源基因是治疗性基因时，这样的控制尤为重要。治疗性基因可以受召集产生控制所需功能的多肽。它们也可用于产生损伤性或甚至致死性蛋白，例如能使癌症细胞死亡的蛋白。
编码各种多肽的多种基因组和cDNA核酸序列是本领域所熟知的。可与本发明的配体一起使用的外源遗传物质或其他目标基因，包括编码生物活性目标蛋白的基因，例如分泌型蛋白；酶，包括能将底物从有毒物质代谢为无毒物质、或是从无活性物质代谢为活性物质的酶；调控蛋白；细胞表面受体；及其他。可用的基因也包括编码下列物质的基因：凝血因子；激素例如肽激素，胰岛素，甲状旁腺激素，促黄体激素释放因子，α和β精子抑素以及人生长激素；编码下列蛋白的基因，例如酶，缺乏时会导致反常状态的发生；编码的细胞因子或淋巴因子的基因，例如干扰素，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，集落刺激因子-1，肿瘤坏死因子和促红细胞生成素；编码抑制剂物质的基因，例如α1-抗胰蛋白酶；编码起药物作用的物质的基因，例如白喉和霍乱毒素；及其他。可用的基因也包括可用于癌症治疗以及治疗遗传疾病的基因。本领域技术人员能够获得几乎所有已知基因的核酸序列信息，并可以直接从公共资源库、发表该序列的研究所获得核酸分子，或采用常规方法来制备该分子。
为了用于基因治疗，本发明所述的配体可在药学可接受的运载体中摄取，例如溶液、悬浮液、片剂、药膏、酏剂以及注射组合物。药物制剂可包含重量百分比从0.01％到99％的配体。制剂可为单剂量形式或是多剂量形式。在任何特定药物制剂中的配体的量取决于有效剂量，即激发或抑制所需的基因表达所需要的剂量。
药物制剂的合适给药途径包括口服、直肠、局部(包括皮肤、口腔和舌下)、阴道、肠道外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)给药，以及通过鼻胃管给药。本领域的技术人员应理解，优选的给药途径取决于所治疗的病症，并且可随着如接受者的病情而发生变化。
本发明所述的配体也可与其他药学活性化合物联合给药。本领域的技术人员会理解，可以选择与本发明所述配体联合使用的药学活性化合物，以避免在接受者上发生不良反应或是在化合物之间发生不希望的相互作用。可与配体联合使用的其他药学活性化合物的例子包括，例如艾滋病化疗剂，氨基酸衍生物，镇痛药，麻醉剂，肛肠产品，解酸剂和抗胀气药，抗生素，抗凝血剂，解毒剂，抗纤维蛋白溶解剂，抗组胺药，抗炎剂，抗肿瘤剂，抗寄生虫剂，抗原虫剂，退烧药，防腐剂，抗痉挛和抗胆碱能药，抗病毒药，食欲抑制剂，关节炎药物，生物反应调节剂，骨代谢调节剂，肠道泻药，心血管药物，中枢神经系统兴奋剂，脑代谢促进剂，去耳垢剂，胆碱酯酶抑制剂，感冒和咳嗽制剂，集落刺激因子，避孕药，细胞保护剂，牙科制剂，除臭剂，皮肤科药物，解毒剂，糖尿病药物，诊断剂，腹泻药物，多巴胺受体激动剂，电解质，酶和助消化剂，麦角制剂，生育剂，膳食纤维，抗真菌剂，溢乳抑制剂，胃酸分泌抑制剂，胃肠促动力剂，促性腺激素抑制剂，头发生长促进剂，补血药，血液流变学剂，止血剂，组胺H2受体拮抗剂，激素，高血糖剂，降血脂药，免疫抑制剂，轻泻剂，抗麻风病药，白细胞分离辅助药物，肺表面活性剂，偏头痛药，黏液溶解剂，肌肉松弛剂拮抗剂，肌肉松弛剂，麻醉拮抗剂，鼻腔喷雾剂，呕吐药物，核苷类似物，营养补充剂，骨质疏松症药，催产药，副交感神经阻断药，拟副交感神经药，帕金森氏症药物，青霉素佐剂，磷脂，血小板抑制剂，卟啉症药，前列腺素类似物，前列腺素，质子泵抑制剂，瘙痒症药物，精神药物，喹诺酮类药物，呼吸促进剂，唾液促进剂，盐替代品，硬化症药物，皮肤创伤药剂，戒烟辅助药物，磺胺药，阻滞交感神经药，溶解血栓剂，抽动秽语综合征药物，震颤药物，肺结核药剂，促尿酸排泄剂，尿路药物，子宫收缩剂，子宫松弛剂，阴道药剂，眩晕剂，维生素D类似物，维生素和医学成像造影剂。在某些情况下，配体可以用作药物治疗的辅助药物，例如，“关闭”一个能产生代谢某种特定药物的酶的基因。
对于农业应用，除了如上所述的应用，本发明的配体也可用于控制杀虫蛋白的表达，例如苏云金杆菌(Bt)毒素。这样的表达可为组织或植物特异性的。此外，特别是当也需要控制植物病虫害时，一种或多种农药可以与本发明所述的配体结合使用，从而提供额外的优势和效力，包括与该农药的单独使用相比减少总使用次数。当使用与农药的混合物时，根据待处理的作物、虫害和/或杂草，在组合物中每个组分的相对比例取决于每种农药的相对功效和所需的使用费用。本领域技术人员将认识到，农药的混合物可以提供诸如一些优势，例如比单独使用一种农药更为广谱。可与如本发明所述的配体组合成为组合物的农药的例子，包括杀真菌剂，除草剂，杀虫剂，杀螨剂和杀菌剂。
本发明所述配体可通过常用的方法作为水性喷雾施用到植物树叶上，例如传统的高滴度液压喷雾、低滴度喷雾、气喷净法和空中喷洒。
本发明的宿主细胞和非人生物体
用于调控本发明的基因表达系统的配体可用于调控宿主细胞内的基因表达。转基因宿主细胞中的表达可用于表达各种目标基因。本发明提供了用于在原核和真核宿主细胞中调控基因表达的配体。宿主细胞内的表达用于表达各种目标多肽，包括但不限于，植物中产生的抗原如疫苗；酶，包括像α-淀粉酶，肌醇六磷酸酶，葡聚糖酶和木聚糖酶的酶，提供对昆虫、线虫、真菌、细菌、病毒和非生物压力的抗性的基因，抗原，保健食品，药品，维生素，用于修饰氨基酸成分的基因，除草剂抗性，耐寒、耐旱和耐热性，工业产品，油脂，蛋白，碳水化合物，抗氧化剂，雄性不育植物，花，燃料，其他的输出型性状，治疗性多肽，通路的中间体；基于细胞的测试，功能基因组测试，生物治疗性蛋白质生产，蛋白质组测试及其他。
宿主细胞可为细菌细胞，真菌细胞，线虫细胞，昆虫细胞，鱼类细胞，植物细胞，鸟类细胞，动物细胞，哺乳动物细胞或人体细胞。在又一个实施方式中，本发明涉及用于调控宿主细胞中的基因表达的配体，其中该方法包括在允许编码带有取代突变的核受体配体结合结构域的多肽表达的条件下，在培养基中培养如上所述的宿主细胞，并且从培养物中分离带有取代突变的核受体配体结合结构域。
在一个特定实施方式中，分离的宿主细胞是原核宿主细胞或真核宿主细胞。在另一个特定实施方式中，分离的宿主细胞是无脊椎动物宿主细胞或脊椎动物宿主细胞。这样的宿主细胞可以选自：细菌细胞，真菌细胞，酵母细胞，线虫细胞，昆虫细胞，鱼类细胞，植物细胞，鸟类细胞，动物细胞和哺乳动物细胞。更具体地说，宿主细胞是酵母细胞，线虫细胞，昆虫细胞，植物细胞，斑马鱼细胞，鸡细胞，仓鼠细胞，小鼠细胞，大鼠细胞，兔细胞，猫细胞，狗细胞，牛细胞，山羊细胞，奶牛细胞，猪细胞，马细胞，绵羊细胞，猿细胞，猴细胞，黑猩猩细胞或人体细胞。宿主细胞的例子包括但不限于，真菌或酵母种类，如曲霉属，木霉属，酿酒酵母属，毕赤酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属；或细菌种类，如集胞藻属，聚球藻属，沙门氏菌属，芽孢杆菌属，不动杆菌属，红球菌属，链霉菌属，埃希氏菌属，假单胞菌属，甲基单胞菌属，甲O-烷化菌属，产碱杆菌属，集胞藻属，项圈藻属，硫杆菌属，甲烷杆菌属和克雷伯菌属；动物；以及哺乳动物宿主细胞。
在一个特定实施方式中，宿主细胞为线虫细胞(Caenorhabditiselegans)。
在另一个特定实施方式中，宿主细胞是选自下组的哺乳动物细胞：包括仓鼠细胞，小鼠细胞，大鼠细胞，兔细胞，猫细胞，狗细胞，牛细胞，山羊细胞，奶牛细胞，猪细胞，马细胞，绵羊细胞，猴细胞，黑猩猩细胞和人类细胞。
宿主细胞转化是本领域所熟知的，可以通过多种方法实现，包括但不限于电转，病毒感染，质粒/载体转染，非病毒载体介导的转染，农杆菌介导的转化，基因枪法等等。表达所需基因产物涉及在合适的条件下培养转化的宿主细胞，以及诱导所转化基因的表达。原核和真核细胞的培养条件和基因表达方法是本领域中所熟知的。可以收获细胞并且根据基因产物特异性的方法来分离基因产物。
此外，可以选择宿主细胞，所述宿主细胞调控插入的多核苷酸表达，或是以所需的特定方式修饰和加工多肽产物。不同宿主细胞具有特征性的且特异性的机制用于蛋白翻译以及翻译后加工和修饰。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保对表达的外源蛋白进行所需的修饰和加工。例如，在细菌系统中表达可用于生产非糖基化核心蛋白产物。在酵母中表达能产生糖基化产物。在真核细胞中表达可以增加异源蛋白的“天然”糖基化和折叠的可能性。此外，在哺乳动物细胞中表达可以提供一个用于重组、或构成多肽活性的工具。此外，不同的载体/宿主表达系统的可能影响加工反应达到不同的程度，例如蛋白质水解切割。本发明还涉及到包含本发明的分离的宿主细胞的非人生物体。
在一个特定实施方式中，非人生物体为原核生物体或真核生物体。在另一个特定实施方式中，非人生物体为非脊椎动物生物体或脊椎动物生物体。在一个特定实施方式中，非人生物体为非人哺乳动物。
例如，非人生物体选自下组，包括细菌，真菌，酵母，线虫，昆虫，鱼类，植物，鸟，动物和哺乳动物。更具体地说，非人类生物体是酵母，线虫，昆虫，植物，斑马鱼，鸡，仓鼠，小鼠，大鼠，兔子，猫，狗，牛，山羊，奶牛，猪，马，绵羊，猿，猴，或黑猩猩。在另一个特定实施方式中，非人类生物体是家鼠(Musmusculus)。
本发明的基因表达调控系统
本发明涉及一组可用于基于核受体的诱导型基因表达系统的配体。特别是，本发明涉及能够反式激活基因表达调控系统的配体，所述基因表达调控系统包含至少一个能在宿主细胞中表达的基因表达盒，包含编码带有核受体配体结合结构域的多肽的多核苷酸，例如H组核受体。H组核受体配体结合是来源于类固醇受体，蜕皮甾醇受体，突变蜕皮甾酮受体，遍在受体，孤儿受体1，NER-1，类固醇激素和受体1，类视黄醇X受体作用蛋白-15，肝X受体β，类固醇激素受体样蛋白，肝X受体，肝X受体α，法尼醇X受体，受体作用蛋白14，金合欢醇受体。在一个实施方式中，H组核受体配体结合结构域是来自蜕皮甾醇受体。
在一个特定实施方式中，基因表达调控系统包含一个包含编码多肽的多核苷酸的基因表达盒，所述多肽包含一个反式激活结构域，一个识别与所需调控表达的基因相关的反应元件的DNA结合结构域，以及一个带有取代突变的H组核受体配体结合结构域。基因表达调控系统还可包含一个第二基因表达盒，包含i)一个反应元件，被第一基因表达盒所编码多肽的DNA结合结构域识别；ii)一个启动子，被第一基因表达盒所编码多肽的反式激活结构域所活化；以及iii)一个表达有待调控的目标基因。
在另一个特定实施方式中，基因表达调控系统包含一个基因表达盒，该盒包含a)一个编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含一个反式激活结构域，一个识别与表达有待调控的基因相关的反应元件的DNA结合结构域，以及一个带有取代突变的H组核受体配体结合结构域；以及b)一个选自下组的第二核受体配体结合结构域，包括脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域，非脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域，超气门蛋白配体结合结构域，以及包含两个多肽片段的嵌合配体结合结构域，其中第一多肽片段来自脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、非脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、或超气门蛋白配体结合结构域，且第二多肽片段来自不同的脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、非脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域或超气门蛋白配体结合结构域。基因表达调控系统还可包含一个第二基因表达盒，该盒包含包含i)一个反应元件，被第一基因表达盒所编码多肽的DNA结合结构域识别；ii)一个启动子，被第一基因表达盒所编码多肽的反式激活结构域所活化；以及iii)一个表达有待调控的目标基因。
在另一个特定实施方式中，基因表达调控系统包含一个第一基因表达盒和一个第二基因表达盒，所述第一基因表达盒包含一个编码第一多肽的多核苷酸，所述第一多肽包含一个识别与表达有待调控的基因相关的反应元件的DNA结合结构域和一个核受体配体结合结构域，所述第二基因表达盒包含一个编码第二多肽的多核苷酸，所述第二多肽包含一个反式激活结构域和一个核受体配体结合结构域，其中一个核受体配体结合结构域为带有取代突变的H组核受体配体结合结构域。在一个实施方式中，第一多肽基本不带有反式激活结构域且第二多肽基本不带有DNA结合结构域。出于本发明的目的，“基本不带有”表示所讨论的蛋白不包含所讨论的结构域的足以提供激活或结合活力的序列。基因表达调控系统可还包含一个第三基因表达盒，该组件包含i)一个反应元件，被第一基因表达序列元件的第一多肽的DNA结合结构域所识别；ii)一个启动子，被第二基因表达盒的第二多肽的反式激活结构域所活化；以及iii)一个表达有待调控的目标基因。
当只有一个核受体配体结合结构域为带有取代突变的H组配体结合结构域时，另一个核受体配体结合结构域可以来自与带有取代突变的H组配体结合结构域形成二聚体的任何其他核受体。例如，当带有取代突变的H组核受体配体结合结构域为带有取代突变的蜕皮甾醇受体配体结合结构域时，其他核受体配体结合结构域(“伴侣”)可来自类固醇受体，蜕皮甾醇受体，哺乳动物类视黄醇X受体(RXR)，非脊椎动物RXR，超气门蛋白，或嵌合核受体，所述嵌合核受体其带有至少两个不同核受体配体结合结构域多肽片段，选自脊椎动物RXR、非脊椎动物RXR和USP(参见PCT/US01/09050、PCT/US02/05235和PCT/US02/05706)。“伴侣”核受体配体结合结构域还可包含截短突变、缺失突变、取代突变、或其他修饰、或上述突变的组合。
在一个实施方式中，脊椎动物RXR配体结合结构域为来自人、小鼠、大鼠、鸡、猪、青蛙、斑马鱼(Daniorerio)、海鞘或水母(Tripedaliacysophora)RXR。
例如，非脊椎动物RXR配体结合结构域是来自蝗虫(飞蝗，Locustamigratoria)超气门多肽(“LmUSP”)，硬蜱(美洲花蜱，Amblyommaamericanum)RXR类似物1(“AmaRXR1”)，硬蜱(美洲花蜱，Amblyommaamericanum)RXR类似物2(“AmaRXR2”)，招潮蟹(Celucapugilator)RXR类似物(“CpRXR”)，甲虫(黄粉虫，Tenebriomolitor)RXR类似物(“TmRXR”)，蜜蜂(Apismellifera)RXR类似物(“AmRXR”)，蚜虫(桃蚜，Myzuspersicae)RXR类似物(“MpRXR”)，或是非双翅目/非鳞翅目RXR类似物。
嵌合RXR配体结合结构域可包含至少两个多肽片段，选自脊椎动物类RXR多肽片段，非脊椎动物类RXR多肽片段，以及非双翅目/非鳞翅目非脊椎动物类RXR类似物多肽片段。用于本发明的嵌合RXR配体结合结构域可包含至少2个不同物种的RXR多肽片段，或当物种相同时，两个或多个多肽片段可来自物种RXR多肽片段的两个或多个不同的异构体。
在一个实施方式中，嵌合RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物类RXR多肽片段和一个非脊椎动物类RXR多肽片段。
在另一个实施方式中，嵌合RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物类RXR多肽片段和一个非双翅目/非鳞翅目非脊椎动物类RXR类似物多肽片段。
在一个特定实施方式中，目标基因对于宿主细胞为内源基因。在另一个特定实施方式中，目标基因对于宿主细胞为外源基因。
在一个特定实施例中，配体与H组核受体的配体结合结构域及其核受体配体结合结构域伴侣的结合，使得基因表达或被抑制。在一个特定实施方式中，一个或多个受体结构域差异产生杂合(嵌合)基因开关。通常，DBD、LBD和反式激活结构域等三个结构域中的一个或多个可选自不同于其他结构域来源的一个来源，使得杂合基因和所得的杂合蛋白在所选宿主细胞或生物体中优化了反式激活活性、与配体补偿性结合和识别特定的反应元件。此外，反应元件本身可以被修饰或被其他DNA结合蛋白结构域所取代，例如来自酵母的GAL-4蛋白和来自大肠杆菌的LexA蛋白，或是合成反应元件，所述合成反应元件对与蛋白的靶向性相互作用特异性，所述蛋白是为该特异性相互作用而设计、修饰和筛选的，以容纳杂合受体(参见例如Kim，等.(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，94：3616-3620)。双杂交系统的另一个优点在于，它允许根据所需最终效果来选择用于驱动基因表达的启动子。这样的双重控制在基因治疗领域尤为重要，尤其是当产生细胞毒性蛋白时，因为表达的时间以及发生表达的细胞都是可以控制的。当可操作的连接到一个合适的启动子上的基因导入到对象细胞中时，外源基因的表达受到本发明的系统的控制。启动子可以被组成型或诱导型调控，或可为组织特异性(也就是说只在特殊类型的细胞中表达)或是对于生物体的某些发育阶段特异性。
蜕皮甾醇受体是核受体超家族的一个成员，并且被分入亚家族1，H组(本发明中称为“H组核受体”)。每一个组的成员在E(配体结合)结构域共享40-60％的氨基酸相同性(Laudet等，“核受体亚家族的统一命名系统”(AUnifiedNomenclatureSystemfortheNuclearReceptorSubfamily)，1999；Cell97：161-163)。核受体亚家族1(H组)的其他成员包括：遍在受体(UR)，孤儿受体1(OR-1)，类固醇激素核受体1(NER-1)，类视黄醇X受体相互作用蛋白-15(RIP-15)，肝X受体β(LXRβ)，类固醇激素受体样蛋白(RLD-1)，肝X受体(LXR)，肝X受体α(LXRα)，法尼醇X受体(FXR)，受体相互作用蛋白14(RIP-14)，和金合欢醇受体(HRR-1)。
特别是，本发明描述了可用于包含带有取代突变的H组核受体配体结合结构域的基因表达调控系统的新型配体。该基因表达系统可为基于“单开关”基因表达系统，其中反式激活结构域和DNA结合结构域位于一个所编码的多肽上。任选地，基因表达调控系统可为基于“双开关”或“双杂交”的基因表达调控系统，其中反式激活结构域，DNA结合结构域位于两个不同的所编码的多肽上。
本发明的基于蜕皮甾醇受体的基因表达调控系统可为异二聚体或同源二聚体。功能性EcR复合物通常指核受体家族的两个成员的异二聚体蛋白复合物，蜕皮甾醇受体蛋白和超气门蛋白或是脊椎动物的USP类似物，类视黄醇X受体蛋白。然而，复合物也可为同源二聚体。类固醇受体家族蛋白的其他成员，称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1)，也可为EcR、USP和/或RXR的配体依赖性或非依赖性伴侣。
蜕皮甾醇受体复合物通常包括核受体超家族成员的蛋白，其中所有成员的特征一般在于存在一个氨基末端反式激活结构域，一个DNA结合结构域(“DBD”)和一个与DBD通过铰链区分隔开来的配体结合结构域(“LBD”)。如本发明所用，术语“DNA结合结构域”包含一个DNA结合蛋白的最小多肽序列直到一个DNA结合蛋白的全长序列，只要DNA结合结构域发挥与反应元件结合的功能。核受体超家族的成员的特征还在于存在四个或五个结构域：A/B、C、D、E，以及在一些成员中为F(参见US4,981,784和Evans，Science240：889-895(1988))。“A/B”结构域对应于反式激活结构域，“C”对应于DNA结合结构域，“D”对应于铰链区，且“E”对应于配体结合结构域。家族的一些成员也带有另一个在LBD的羧基末端的反式激活结构域，对应于“F”。
DBD的特征在于存在两个半胱氨酸锌指，两者之间带有两个氨基酸基序，P-box和D-box，其提供对蜕皮甾醇反应元件的特异性。这些结构域可为天然的、修饰的、或是异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。EcR受体，如类固醇受体家族的一个子集，也具有不很明确的区域负责异源二聚化。因为核受体的结构域天然是模块化的，LBD、DBD和反式激活结构域是可以互换的。
本发明调控基因表达的方法
本发明提供了一种在宿主细胞中调控目标基因表达的方法，包括下列步骤：a)将本发明所述的基因表达调控系统导入到宿主细胞中；且b)将一个配体导入到宿主细胞中，其中目标基因是基因表达盒的一个组分，所述盒包含i)一个反应元件，包含一个被基因表达系统的DNA结合结构域识别的结构域；ii)一个启动子，其被基因表达系统的反式激活结构域激活；以及iii)一个表达有待调控的目标基因，从而一旦配体导入到宿主细胞中，目标基因的表达被调控。
本发明还提供了一种在宿主细胞中调控基因表达的方法，包括下列步骤：a)将本发明所述的基因表达调控系统导入到宿主细胞中；b)将一个如本发明所述的基因表达盒导入到宿主细胞中，其中基因表达盒包含i)一个反应元件，包含一个被基因表达系统的DNA结合结构域识别的结构域；ii)一个启动子，其被基因表达系统的反式激活结构域激活；以及iii)一个表达有待调控的目标基因；并且c)将一个配体导入到宿主细胞中，从而一旦配体导入到宿主细胞中，目标基因的表达被调控。
采用本发明公开的方法在宿主细胞内调控表达的目标基因可为内源基因或外源基因。所需基因或蛋白的核酸或氨基酸序列信息可位于多个公共数据库之一中，例如GENBANK、EMBL、Swiss-Prot和PIR，或在很多杂志中。然后，这些信息可用于构建所需构建物，用于将目标基因插入到用于本发明所述方法的基因表达盒中。
目标基因的例子包括但不限于：植物中产生的抗原如疫苗；酶例如α-淀粉酶，肌醇六磷酸酶，葡聚糖酶和木聚糖酶，提供对昆虫、线虫、真菌、细菌、病毒和非生物压力的抗性的基因，保健食品，药品，维生素，用于修饰氨基酸成分的基因，除草剂抗性，耐寒、耐旱和耐热性，工业产品，油脂，蛋白，碳水化合物，抗氧化剂，雄性不育植物，花，燃料，其他的输出型性状，编码治疗性预期多肽或是产物可用于治疗病症、疾病、紊乱、功能障碍、遗传缺陷的基因，例如单克隆抗体，酶，蛋白酶，细胞因子，干扰素，胰岛素，促红细胞生成素，毒素，凝血因子，其他血液因子或组分，用于基因治疗的病毒载体，用作疫苗的病毒，药物开发的靶标，功能基因组，以及蛋白组学分析和应用，及其他。
检测基因表达/转录
一种可用于本发明方法的检测为检测细胞内转录状态，包括RNA的同一性和丰度，例如mRNA类。这样的检测通常是通过以几种现有基因表达技术中的任一种来测定cDNA的丰度来实现的。
核酸阵列技术是一种可用于确定mRNA差异表达的技术。这种技术包括，例如寡核苷酸芯片和DNA微阵列。这些技术基于对应于不同基因或cDNA的DNA片段或寡核苷酸，其固定化在固体支持物上并且与探针杂交，所述探针是从细胞、组织或全生物体提取的总mRNA池制备的并且转化为cDNA。寡核苷酸芯片是用光刻技术在基质上合成的寡核苷酸阵列。DNA微阵列是DNA样品的阵列，通常为自动化机械打印到载玻片上的PCR产物。每个基因用全长或部分长度的靶DNA序列来分析。
另一种可用于本发明方法的检测为通过用本领域已知的方法来检测细胞中存在的组成蛋白的丰度，从而确定细胞的翻译状态。
当需要识别与各种生理功能相关的基因时，可以采用检测发生了某些功能变化的测试，所述功能例如细胞生长，细胞凋亡，衰老，分化，粘附，结合到一个特定分子上，结合到另一个细胞上，细胞组织，器官发生，细胞内转运，促进转运，能源转换，代谢，肌肉发育，神经发育，和/或造血。
此外，选择性标记物或报告基因表达可用于检测采用本发明的基因表达调控。
检测基因表达产物的其他方法是本领域所熟知的，包括Southern杂交(DNA检测)、点或插槽印迹(DNA，RNA)、Northern杂交(RNA)、RT-PCR(RNA)、Western印迹(多肽检测)和ELISA(多肽)分析。标记的蛋白质可用于检测与其杂交的特定的核酸序列。
在某些情况下，需要扩增核酸序列的量。这可能是通过使用多种合适方法中的一个或多个来实施，包括，例如，聚合酶链式反应(“PCR”)，连接酶链式反应(“LCR”)，链置换扩增(“SDA”)，基于转录的扩增等等。PCR是按照已知技术进行的，其中例如在一个热稳定DNA聚合酶存在下，在杂交条件下用一对寡核苷酸引物处理核酸样品。
一般方法
本发明所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且描述在1989年纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社出版的Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T的《分子克隆实验指南》(Sambrook，J，Fritsch，E.F.andManiatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)(Maniatis))以及1984年纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社出版的T.J.Silhavy、M.L.Bennan和L.W.Enquist的《基因融合实验》(T.J.Silhavy，M.L.Bennan，andL.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.(1984))以及1987年格林出版社和威立国际科学出版社出版的Ausubel，F.M等的《分子生物学现有技术》(Ausubel，F.M.etal，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987))中。
适用于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域所熟知的。适用于下列实施例的技术可在下列文献中找到，1994年华盛顿特区的美国微生物学会出版的《普通细菌学方法手册》(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood，NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips编)(ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood，NoelR.KriegandG.BriggsPhillips，eds.)，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC.(1994)))或是1989年马萨诸塞州桑德兰的斯诺联合公司出版的ThomasD.Brock的《生物技术：工业微生物学教材》第二版(ThomasD.BrockinBiotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，SecondEdition，SinauerAssociates，Inc，Sunderland，MA(1989))。所有用于宿主细胞生长和维持的试剂、限制性酶和材料来自奥德里奇化学公司(AldrichChemicals)(密尔沃基，威斯康辛州)、DIFCO实验室(底特律，密歇根州)、GIBCO/BRL(盖塞斯堡，马里兰州)或西格玛化学公司(SigmaChemicalCompany)(圣路易斯，密苏里州)，除非特别指明。
基因序列的操作可以采用可从遗传计算机集团公司获得的程序套件来完成(威斯康辛套装9.0版，遗传计算机集团(GCG)，麦迪逊，威斯康辛州)(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)。
缩写的含义如下所述：“h”表示小时，“min”表示分钟，“sec”表示秒，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔/升，“mM”表示毫摩尔/升，“M”表示摩尔/升，“mol”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“A”表示腺嘌呤或腺苷，“T”表示胸腺嘧啶或胸苷，“G”表示鸟嘌呤或鸟苷，“C”表示胞嘧啶或胞苷，“xg”表示时间权重，“nt”表示核苷酸，“aa”表示氨基酸，“bp”表示碱基对，“kb”表示千碱基对，“k”表示千，“μ”表示微，“℃”表示摄氏度，“C”在化学方程式中表示摄氏度，“THF”表示四氢呋喃，“DME”表示乙二醇二甲醚，“DMF”表示二甲基甲酰胺，“NMR”表示核磁共振，“psi”表示磅/平方英寸，“TLC”表示薄层层析，“approx.”表示接近，“cal.”表示计算的，“cm”表示厘米，“EC50”表示呈现50％应答的有效浓度，“eq”表示当量，“g”表示克，“i.d.”表示内径，“[M]”表示分子量，“μmol”表示微摩尔，“N”表示正常浓度，“nm”表示纳米，“NMR”表示核磁共振光谱，“nOe”表示核极化效应，“NP”表示正常相，“ppm”表示百万分之，“Rf”表示保留系数，“RP”表示反相，“r.t.”表示室温，“R.t.”表示保留时间，“UV”表示紫外，“v/v”或“v/v/v”表示体积/体积比，“w/v”表示重量/体积比，以及“λ”表示波长。
化合物制剂
化学品和试剂
氧化银(Ag2O)，甲基碘(CH3I)，碘乙烷(CH3CH2I)，1-碘丙烷(CH3CH2CH2I)，1-碘丁烷(CH3CH2CH2CH2I)，烯丙基溴(CH2＝CHCH2Br)，苄基溴(C6H5CH2Br)，1-溴-2-丁酮(CH3CH2COCH2Br)，无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，2，2-二甲氧基丙烷(DMP)，苯硼酸(PBA)，单氢化对甲基苯磺酸(p-TsOH)，四氢呋喃(THF)，1，4-二氧杂环乙烷，三氟甲磺酸甲酯(CF3SO2OCH3)，2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶(C14H23N)和对茴香醛购自奥德里奇公司(Aldrich)。Celite购自BDH。Minisart滤器购自塞多利斯公司(Sartorius)。过氧化氢(H2O2)100倍体积，硫酸(H2SO4)，盐酸(HCl)，乙酸(AcOH)，氢氧化钠(NaOH)，丙酮，乙酸乙酯(AcOEt)和HPLC-级甲醇(MeOH)，乙醇(EtOH)，氯仿(CHCl3)和二氯甲烷(CH2Cl2)购自飞世尔科技公司(FisherScientific)。甲醇-d4购自格斯科学仪器有限公司(GossScientificInstrumentsLtd)。20-羟基蜕皮甾酮(20E)是由俄罗斯瑟克特夫卡尔的俄罗斯科学院生物学研究所的V.Volodin博士(Syktyvkar，Russia)提供的。松甾酮A(PoA)由皮埃尔和玛丽居里大学(UniversitéPierreetMarieCurie)的RenéLafont博士提供。无水丙酮是蒸馏后溶剂储存在分子筛中获得的。
一般反应条件
无水反应条件是通过在真空下火焰干燥舒伦克反应管并且在导入试剂前引入氮气或氩气保护气氛，使用无水溶剂和套管传输液，并且冷冻干燥用作起始材料的类固醇。涉及Ag2O的反应通过将舒伦克管包在铝箔中避光。反应用薄层色谱(TLC)和/或高效液相色谱法(HPLC)监测。TLC是用默克HPTLC铝薄层20×20cm硅胶60F254(MerckHPTLCaluminumsheets20×20cmsilicagel60F254)进行的。板在紫外光下观察，然后浸入5％对茴香醛/5％H2SO4的乙醇溶液中并且加热。化合物的流动性用Rf值表示(Rf＝化合物移动的距离/溶剂前沿移动的距离)。用HPLC进行反应监测需要在固定的时间间隔从反应罐中取出等体积的反应混合物，样品用甲醇淬灭，离心并且用Minisart0.20μm的过滤器过滤上清液。在滤液减压浓缩，用30％甲醇∶水(v/v)配制，注入到一个带DAD的分析型C18-HPLC(柱的详细介绍见下)上运行25min的线性梯度的30％到100％甲醇∶水，接着在等强度100％甲醇下10min，流速为1mL/min和在λ＝242和λ＝300nm处都进行监测，以根据所显示的特征性的保留时间(Rt)，以及通过全紫外光谱的特定峰的观察，来识别不同的产物。
分离，纯化和定量
WatersVac35ccC18-10g萃取柱用于对粗反应混合物进行预纯化。样品作为5％甲醇水溶液的形式加样，然后用溶液强度逐步提高的梯度进行洗涤(通常30％、80％和100％甲醇水溶液)来选择性洗脱目标化合物。可以通过RP-或NP-HPLC来进行分离或纯化，其中在242nm监测流出液看是否有类固醇发色团出现，可用吉尔森170二极管阵列检测仪(DAD)(Gilson170DiodeArrayDetector)或是吉尔森单波长全色素/115UV检测仪(GilsonsinglewavelengthHolochrome/115UVdetector)。分析型HPLC用C18柱(PhenomenexSpherecloneODS2，5μm，150×4.60mm或PhenomenexProdigyODS2，5μm，250×4.60mm)或C6柱(PhenomenexSphereclone，5μm，150×4.60毫米)或是二醇柱(JonesApexIIDiol，5μm，150×4.60mm或GRACEApexIIDiol，5μm，150×4.60mm)或硅胶柱(ZorbaxSil，5μm，250×4.60mm)进行，所有都采用1mL/min的流速。半制备型HPLC是采用C18柱(PhenomenexSpherecloneODS2，5μm，250×10mm)或硅胶柱(ZorbaxSil，5μm，250×9.40mm)，或二醇柱(GRACEApexII，5μm，150×8.00mm)来进行，所有都采用2mL/min的流速。制备型HPLC是用C18柱(PhenomenexSpherecloneODS2，5μm，250×21.20mm)在5mL/min的流速下进行的。定量是采用岛津公司UV-2401PC进行紫外分光光度测定含有14α-羟基-7-烯-6-酮半分子(242nm的消光系数：12400Lmol-1cm-1)和海南陆均松甾酮样共轭系统(299nm消光系数：14190Lmol-1cm-1)的化合物。根据朗伯比耳方程式(Lambert-Beerequation)计算浓度。
光谱技术和生物测试
核磁共振(NMR)光谱记录采用Bruker公司Avance/DRX400核磁共振谱仪在质子频率400MHz和碳频率100MHz下进行，或是用Bruker公司ACF300核磁共振谱仪在质子频率300MHz和碳频率75MHz下进行。样品溶解在氘化甲醇中，以四甲基硅烷作为内参。化学位移用百万分之(ppm)来表示。高分辨率质谱采用化学电离模式(CIMS)或正离子快速原子轰击质谱(FABMS)模式来进行。CIMS用配有直接进样探头的MicromassGCT质谱仪或是配有直接进样探头的JeolMS700质谱仪来记录，两种情况下都用甲烷作为反应气体和甲醇作为溶剂。FABMS记录在JeolMS700质谱仪上，采用氙气作为反应气体和“妙方”(1，4-二硫代-L-苏丁醇和1，4-二硫赤藓糖醇的4∶1混合物)作为基质，或是VGQuattro质谱仪，采用甘油基质和甲醇作为溶剂。
制备20E2，3-丙酮化合物
20E(197.7mg，411.9μmol)和PBA(58.6mg，480μmol)溶解在无水DMF(4.5mL)中，并且混合物在无水条件下室温搅拌1小时。然后加入熔化的p-TsOH(39.3mg，0.5eq，在氮气氛中本生灯逐渐加热直到达到熔融状态从单水p-TsOH中去除结晶水来制备的)和DMP(2.3mL)的无水丙酮溶液(4.6mL)，混合物搅拌3小时。然后减压去除丙酮和DMP，混合物用AcOEt(20mL)稀释，用盐水洗涤(3×10mL)，并且在减压下去除有机溶剂。向残余物中加入15mL的THF/H2O29∶1v/v(H2O2100倍体积，用0.1NNaOH预先中和)，并且混合物在室温下搅拌2.5小时维持中性pH(pH自然降低，导致20E2，3-丙酮化合物重新转换成20E)。用旋转蒸发去除THF，并且混合物用25％MeOH/H2O溶液重悬，并且冷却到0℃。通过棉絮过滤悬浮液收集沉淀，并且用MeOH溶解回收残余物，然后旋转蒸发产生纯的20E2，3-丙酮化合物(138.5mg，产率＝65％).
制备20E22-甲基醚
Ag2O(207.0mg，10eq)和CH3I(90μL，15eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(48.0mg，92.3μmol)的1.3mL无水DMF溶液中，并且混合物在室温无水条件下搅拌。反应2.5小时后，混合物进行如下操作：加入AcOEt(25mL)，且混合物用Celite垫片过滤，垫片用AcOEt(150mL)洗涤并且旋转蒸发溶剂。然后粗反应混合物用C18 进行预纯化，且产物用半制备型C18-HPLC系统配合等强度的70％MeOH/H2O进行纯化，其产生了24.1mg(49％)22-甲基醚20E2，3-丙酮化合物(R.t.＝23min)。去除2，3-异亚丙基如下操作：水性HCl(0.1M，1.0mL)逐滴加入到产物的1，4-二氧杂环乙烷溶液(1.0mL)中，且混合物在室温下搅拌。反应2.5小时后，混合物用5％1，4-二氧杂环乙烷/H2O溶液稀释，并用C18 预纯化。然后所需产物用半制备型C18-HPLC(58％MeOH/H2O)纯化，其产生22毫克(48％)20E22-甲基醚(R.t.＝17min)。全面定性采用400MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS来获得(计算[M+H]+495.3322.实测[M+H]+＝495.3348)。
制备20E2-甲基醚和20E3-甲基醚
Ag2O(116.0mg，10eq)加入到新鲜制备的20E20，22-苯基硼酸盐(30mg，53μmol)的DMF溶液(2mL)中。在反应过程中分四次加入CH3I(258μL，44.7eq)，并且混合物在室温无水条件下搅拌。反应4小时后，再次加入Ag2O(10eq)，且混合物继续搅拌总共7.5小时。反应的进行和去除苯基硼酸盐如20E2，3-丙酮化合物制备中所述。假定的产物用半制备型C18-HPLC系统配合等强度的50％MeOH/H2O纯化，其中20min后洗脱了20E3-甲基醚(6mg，25％)且23min后洗脱了20E2-甲基醚(13mg，50％)。全面定性采用400MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS来获得(20E2-甲基醚：计算[M+H]+＝495.3322，实测[M+H]+＝495.3337。20E3-甲基醚：计算[M+H]+495.3322，实测[M+H]+＝495.3344)。
制备20E-2，3；20，22-二丙酮化合物
20E(236mg；492μmol)在无水条件下溶解在无水丙酮(10mL)中。也加入无水DMF(0.5mL)帮助溶解。将熔化的p-TsOH(51mg，0.2eq；如上所述制备)和DMP(0.2mL)转入反应罐中，并且混合物在室温氮气流下搅拌6小时。然后在减压下部分去除溶剂，剩余的溶液加入到AcOEt(100mL)中并且用H2O(50mL)洗涤，然后用饱和的NaCl溶液洗涤(3×50mL)。有机相用TLC(CHCl3/MeOH；15∶1，v/v；Rf20E2，3，20，22-二丙酮化合物＝0.35；Rf20E20，22-单丙酮化合物＝0.13)和分析型C18-HPLC进行分析，得到混合的20E2，3，20，22-二丙酮化合物(R.t.＝23.2)和20E20，22-单丙酮化合物(R.t.＝19.5min)。两种产物的分离采用硅胶(Merck，Kieselgel60)开放柱(2.5i.d.×25cm)层析进行，用CH2Cl2/MeOH(17∶1，v/v)洗脱79.7mg(29％)前一个化合物，且用CH2Cl2/MeOH(13∶1，v/v)洗脱142.4mg(52％)后一个化合物。用NMR和CIMS分析进行定性，并发现数据符合文献值(ecdybase.org.)。
制备20E14甲基醚
Ag2O(324.4mg，20eq)和CH3I(260μL，60eq)加入到2，3，20，22-二丙酮化合物(39.3mg，70.2μmol)溶液中，并且混合物在60℃无水条件下搅拌。3小时后，反应混合物如在20E22-甲基醚中所述进行操作。去除丙酮化合物基团操作如下：将粗反应混合物溶解在1，4-二氧杂环乙烷(1mL)中，加入70％水性AcOH(10mL)并且在80℃回流8小时，关闭热源并且让混合物继续搅拌过夜。反应混合物用H2O(50mL；用1-丁醇预饱和)稀释，并用1-丁醇洗涤(4×50mL；用H2O预饱和)。混合的有机相在减压下蒸发，残余物用C18-HPLC(50％MeOH/H2O)纯化，其产生4.5mg(13％)20E14-甲基醚(R.t.＝21min)。全面定性用400MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS来获得(计算[M+H]+＝495.3322.实测[M+H]+＝495.3317)。
制备20E25-甲基醚和20E22，25-二甲基醚
二叔丁基-4-甲基-嘧啶(88.8mg，6eq)和三氟甲磺酸甲酯(47μL，6eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(37.5mg，72.1μmol)的无水CH2Cl2溶液(3mL)中，混合物在室温无水条件下搅拌。55小时后，在真空下去除三氟甲磺酸甲酯，并且残余物用HCl(0.1M)∶1，4-二氧杂环乙烷1∶1(v/v)处理进行中和并且去除2，3-丙酮化合物基团。所需产物的纯化采用制备型C18-HPLC系统配合等强度的60％MeOH/H2O进行，其可以收集11.15mg(31％)20E25-甲基醚(R.t.＝20.1min)和5.63mg(15％)20E22，25-二甲基醚(R.t.＝42.0min)。两种化合物的定性采用300MHzNMR分析(表3a-3e)和FAB-MS获得(20E25-甲基醚：计算[M+H]+＝495.6690；实测[M+H]+495.4。20E22，25-二甲基醚：计算[M+H]+＝509.6960；实测[M+H]+＝509.4)。
制备20E22-乙基醚
Ag2O(534mg，40eq)和CH3CH2I(92μL，20eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(30mg，57.7μmol)的无水DMF溶液(2mL)中，并且反应在无水条件下室温搅拌。28小时后，如在20E22-甲基醚中所述，操作反应并且去除2，3-丙酮化合物基团。假定产物的纯化采用半制备型C18-HPLC配合等强度的70％MeOH/H2O进行，其在R.t.＝12min洗脱，然后用半制备型硅胶柱配合等强度的CH2Cl2/异丙醇/H2O(125/30/2，v/v/v)，其在R.t.＝19.6min洗脱，并且产生5.5mg(19％)20E22-乙基醚。全面定性采用400MHzNMR分析(表3a-3e)和
CIMS获得(计算[M+H]+＝509.3478.实测[M+H]+＝509.3503)。
制备20E22-正丙基醚
Ag2O(208mg，10eq)和CH3(CH2)2I(187μL，20eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(50mg，96.1μmol)的无水DMF溶液(2mL)中，并且反应在室温无水条件下搅拌。8小时后，再次加入CH3CH2CH2I(20eq)。24小时后，如在20E22-甲基醚中所述，操作反应并且去除2，3-丙酮化合物基团。假定产物的纯化采用半制备型C18-HPLC配合等强度的70％MeOH/H2O进行，其在R.t.＝18min洗脱，并且产生11.6mg(23％)20E22-正丙基醚，全面定性采用400MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS获得(计算[M+H]+＝523.3635；实测[M+H]+＝523.3613)。
制备20E22-正丁基醚
Ag2O(649.7mg，40eq)和CH3(CH2)3I(239μL，30eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(36.4mg，70.1μmol)的无水DMF溶液(3mL)中，并且反应在室温无水条件下搅拌。8小时后再次加入CH3CH2CH2I(20eq)。45小时后，如在20E22-甲基醚中所述，操作反应并且去除2，3-丙酮化合物基团。纯化假定的产物制备型C18-HPLC配合采用等强度的75％MeOH/H2O进行，其在R.t.＝33min洗脱，并且产生11.1mg(30％)20E22-正丁基醚。全面定性采用300MHzNMR分析(表3a-3e)和FAB-MS获得(计算[M+H]+＝537.7500，实测[M+H]+＝537.7)。
制备20E22-(28R，S)-2′-乙基环氧乙基醚
Ag2O(790.0mg，40eq)和CH3CH2COCH2Br(391μL，45eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(44.3mg，85.2μmol)的无水DMF溶液(4mL)中，且反应在室温无水条件下搅拌。72小时后，如在20E22-甲基醚中所述，操作反应且去除2，3-丙酮化合物基团。纯化假定的化合物用制备型的C18-HPLC进行，首先使用等强度的75％MeOH/H2O系统，其在R.t.＝21min洗脱，并且接着用等强度的70％MeOH/H2O系统，其在R.t.＝30min洗脱，并且产生5.0mg(11％)20E22-(28R，S)-2′-乙基环氧乙基醚。全面定性采用300MHzNMR分析(表3a-3e)和FAB-MS获得(计算[M+H]+＝571.7330；实测[M+H]+＝551.3)。
制备20E22-烯丙基醚
Ag2O(137.7mg，10eq)和CH2＝CHCH2Br(75μL，15eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(30.9mg，59.4μmol)的无水DMF溶液(2mL)中，并且反应在室温无水条件下搅拌，并且用TLC(CHCl3/MeOH；10∶1，v/v；Rf20E2，3-丙酮化合物＝0.16；Rf22烯丙基20E2，3-丙酮化合物＝0.33)监测。在26小时后，如在20E22-甲基醚中所述，操作反应并且去除2，3-丙酮化合物基团。纯化假定的产物采用制备型C18-HPLC配合等强度的70％MeOH/H2O系统进行，其在R.t.＝26min洗脱，并且产生11.6mg(38％)20E22-烯丙基醚。全面定性采用300MHzNMR分析(表3a-3e)和FAB-MS获得(计算[M+H]+＝521.7070，实测[M+H]+＝521.4)。
制备20E22-苄基醚
Ag2O(139.5mg，10eq)和C6H5CH2Br(107μL，15eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(31.3mg，60.2μmol)的无水DMF溶液(2mL)中，且反应在室温无水条件下搅拌，并且用TLC(CHCl3/MeOH；10∶1，v/v；Rf22-苄基20E2，3-丙酮化合物＝0.36)监测。72小时后，如20E22-甲基醚中所述，操作反应并且去除2，3-丙酮化合物基团。纯化假定的产物用制备型C18-HPLC系统配合等强度的70％MeOH/H2O系统进行，其在R.t.＝48min洗脱，并且产生3.0mg(9％)20E22-苄基醚。全面定性采用400MHzNMR分析(表3a-3e)和FAB-MS获得(计算[M+H]+＝571.7670；实测[M+H]+＝571.2)。
制备20E2，22-二甲基醚和20E3，22-二甲基醚
Ag2O(538mg，10eq)和CH3I(210μL，15eq)加入到20E(108mg，225μmol)的无水DMF溶液中(3mL)，反应在室温无水条件下搅拌。1.5小时后，再加入10eq的Ag2O和15eq的CH3I，在5小时后，如20E22甲基醚中所述，操作混合物。纯化假定的产物采用半制备型的C18-HPLC配合等强度的60％MeOH/H2O进行，其中20E3，22-二甲基醚在21分钟后洗脱(28.4mg，25％)且20E2，22-二甲基醚在24分钟后洗脱(45.8mg，40％)。全面定性采用400MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS获得(20E2，22-二甲基醚：计算[M+H]+509.3478.实测[M+H]+＝509.3481。20E3，22-二甲基醚：计算[M+H]+＝509.3478.实测[M+H]+＝509.3486)。
制备20E14，22-二甲基醚
Ag2O(84.7mg，10eq)和CH3I(48μL，20eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(19.0mg，36.5μmol)的无水DMF溶液(1.5mL)中，反应在室温无水条件下搅拌。反应21小时后，以10小时间隔再次加入Ag2O(3×10eq)和CH3I(3×20eq)。51小时后，如20E22-甲基醚中所述，操作反应并且去除2，3-丙酮化合物基团。纯化首先采用半制备型C18-HPLC配合等强度60％MeOH/H2O进行，其中收集了1.9mg的主峰R.t.＝18min，接着用半制备型硅胶柱配合等强度CH2Cl2/异丙醇/H2O(160∶30∶1.5，v/v/v)，其中20E14，22-二甲基醚在16.3分钟洗脱并产生1.0mg(6％)。全面定性采用400MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS获得(计算[M+H]+＝509.3478.实测[M+H]+＝509.3441)。
制备20E2，3，14，22-四甲基醚
Ag2O(1.745g，23eq)和CH3I(1.175mL，60eq)加入到20E(155mg，324μmol)的无水DMF溶液(4.0mL)中，并且反应在室温无水条件下搅拌。12小时后，再次加入19eq的Ag2O和60eq的CH3I，然后反应20小时后再加入60eqCH3I。总共36小时后，如20E22甲基醚中所述，操作反应。纯化采用半制备型C18-HPLC配合等强度的70％MeOH/H2O进行，其中20E2，3，14，22-四甲基醚在19分钟后洗脱且产生51mg(30％)。定性采用400MHzNMR(表3a-3e)和CIMS进行(计算[M+H]+＝537.3791.实测[M+H]+＝537.3823)。一个nOe实验确认了在C-14的立体化学如同在20E中(在H-9辐照使得14-OMe信号提高2.2％)。
制备PoA22-甲基醚和PoA14，22-二甲基醚
Ag2O(960.0mg，40eq)和CH3I(129μL，20eq)加入到PoA2，3-丙酮化合物(52.2mg，135.5μmol)的无水DMF溶液(3.5mL)中，且反应在室温无水条件下搅拌。23小时后，如在20E22-甲基醚中所述，操作反应并且去除2，3-丙酮化合物。纯化假定的产物采用半定量C18-HPLC配合等强度的65％MeOH/H2O作用45min，可以收集3.0mg(6％)PoA22-甲基醚(R.t.＝42min)，接着多次注入5mLMeOH，可以洗脱双甲基化合物，其然后用制备型C18-HPLC配合等强度的75％MeOH/H2O(3.8mg，8％)进行纯化。全面定性采用300MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS获得(PoA22-甲基醚：计算[M+H]+＝479.3373；实测[M+H]+＝479.3369。PoA14，22-二甲基醚：计算[M+H]+493.3529；实测[M+H]+＝493.3526)。
制备海南陆均松甾酮22-甲基醚
海南陆均松甾酮22-甲基醚是作为PoA2，3-丙酮化合物(61.0mg，121.0μmol)与Ag2O(278.0mg，10eq)和CH3I(121μL，15eq)在无水DMF(1.7mL)中甲基化反应46小时的副产物获得的。海南陆均松甾酮样共轭系统(λ最大＝299nm)采用HPLC配合DAD监测在λ＝300纳米进行检测。产物纯化采用制备型C18-HPLC配合等强度的75％MeOH/H2O(R.t.＝24.7min)，接着采用半制备型C18-HPLC配合等强度的65％MeOH/H2O(R.t.＝26.9min)，其产生1.7mg海南陆均松甾酮22-甲基醚(3％)。全面定性采用300MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS获得(海南陆均松甾酮22-甲基醚：计算[M+H]+＝477.3216；实测[M+H]+＝477.3224)。
制备PoA2-甲基醚，PoA14-甲基醚，PoA2，22-二甲基醚和PoA3，22-二甲基醚
Ag2O(590.0mg，10eq)和CH3I(238μL，15eq)加入到PoA(118.1mg，254.6μmol)的无水DMF溶液中(3.3mL)，且反应在室温无水条件下搅拌。18小时后终止反应以获取PoA2，22-甲基醚，或者在46小时后终止反应获得所有其他产物。在所有情况下，如20E22-甲基醚中所述操作反应。纯化假定的产物采用制备型C18-HPLC配合等强度的75％MeOH/H2O进行，可以收集6％PoA2-甲基醚(R.t.＝20.2min)、2％PoA14-甲基醚(R.t.＝24.7min)、16.0％PoA2，22-甲基醚(R.t.＝39.7min)和7％PoA3，22-甲基醚(R.t.＝32.9min)。全面定性采用300MHzNMR分析(表3a-3e)和CIMS获得(PoA2-甲基醚：计算[M+H]+＝479.3373；实测[M+H]+＝479.3388。PoA14-甲基醚：计算[M+H]+＝479.3373；实测[M+H]+＝479.3363。PoA3，22-二甲基醚：计算[M+H]+＝493.3529；实测[M+H]+＝493.3528。PoA2，22-二甲基醚：计算[M+H]+＝493.3529；实测[M+H]+＝493.3525)。
在不同HPLC溶剂系统中20E的各种醚衍生物的HPLC保留时间显示在表1和2中。来自每种合成化合物的NMR数据总结在表3a-3e中。
表1.20E烷基醚衍生物的RP-和NP-HPLC保留时间a
a保留时间用分钟表示
方法A：C18-RP-HPLC(150×4.6mm，5mm颗粒大小，梯度为25分钟内从30％到100％甲醇/水，流速＝1mL/min，λ＝242nm)
方法B：C6-RP-HPLC(150×4.6mm，5mm颗粒大小，梯度为25分钟内从30％到100％甲醇/水，流速＝1mL/min，λ＝242nm)
方法C：二醇NP-HPLC(150×4.6mm，5mm颗粒大小，梯度为20分钟内从2％到10％甲醇/二氯甲烷，流速＝1mL/min，λ＝242nm)
方法D：二醇NP-HPLC(150×4.6mm，5mm颗粒大小，梯度为20分钟内从4％到10％甲醇/二氯甲烷，流速＝1mL/min，λ＝242nm)
表2.POA烷基醚衍生物的RP-和NP-HPLC保留时间A
a保留时间用min表示
方法A：C18-RP-HPLC(150×4.6mm，5mm颗粒大小，梯度为25分钟内从0％到100％甲醇/水，流速＝1mL/min，λ＝242nm和300nm)
方法B：C6-RP-HPLC(150×4.6mm，5mm颗粒大小，梯度为25分钟内从30％到100％甲醇/水，流速＝1mL/min，λ＝242nm和300nm)
方法C：ApexIIdiolNP-HPLC(150×4.6mm，5mm颗粒大小，等强度2％甲醇的二氯甲烷溶液，流速＝1mL/min，λ＝242nm和300nm)
表3c.20E的22-烷基衍生物的NMR数据
样品溶解在甲醇-d4中，化学位移用百万分之(ppm)表示
u.s.s.：低于溶剂信号
a：1H-NMR在400MHz收集，13C-NMR在100MHz收集.
b：1H-NMR在300MHz收集，13C-NMR在75MHz收集
*：用于和20E文献值比较(www.ecdybase.org)
BII生物测试
所有合成的和纯化的化合物在BII生物测试中进行检测，以评估它们对蜕皮甾醇受体的亲和力。类固醇应答体外生物测试采用果蝇BII细胞系。已知该测试基本没有代谢和运输不明确。它是基于来自果蝇的l(2)mbn肿瘤性血细胞系，该细胞系表达蜕皮甾醇受体复合物并且对蜕皮甾醇给予特征性应答，用浊度计进行检测。在正常情况下，细胞进行有丝分裂，形成小细胞。与类固醇受体激动剂接触后，细胞变大并且进行吞噬作用，表现为细胞密集成团；然后吸光度降低。拮抗剂阻止这种反应，导致细胞密度增加；相对于20E处理的对照，吸光度将增加。为了进行这一生物测试，将待测化合物加入到96孔微孔板的孔中(NalgeNunc公司，海福特，英国)，以几个从10-3M到10-10M的浓度加入20μL等分试样，浓度为5×10-8M的20μL的20E等分试样加入到孔中，测试拮抗活力。板在25℃培养6-7天。然后用酶标仪(Anthoshtll，安图斯实验科技公司，萨尔茨堡，奥地利(Anthoshtll，AnthosLabtec，Salzburg，Austria))进行定量检测，其中在405nm处测定吸光度。测试结果见表4。
表4.BII生物测试结果
制备基因表达盒
本实施例描述了基因表达盒的构建，该盒包含一个用于基于核受体的诱导型基因表达系统的H组核受体多核苷酸和多肽。申请人构建了一种基于云杉蚜虫((云杉卷叶蛾)ECR(CFECR)的基因表达盒。该制备的报告基因构建物包含一个ECR的配体结合结构域或是人RXR-JMUSP或小鼠RXR的嵌合体；以及一个GAL4DNA结合结构域(DBD)或一个VP16反式激活结构域(AD)。报告基因构建物包括报告基因虫荧光素酶可操作的连接到合成的启动子构建物上，所述构建物包含与GAL4DBD结合的GAL4反应元件。
3.1-GAL4CfEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：来自云杉蚜虫(云杉卷叶蛾)EcR(“CfEcR-DEF”；SEQIDNO：1)的野生型D、E和F结构域，融合到一个GAL4DNA结合结构域(“Gal4DNABD”或“Gal4DBD”；SEQIDNO：2)上，并且置于一个CMV启动子(SEQIDNO：3)的控制下。人RXR的EF结构域(“HsRXRβ-EF”；SEQIDNO：4的1-465核苷酸)的1-8号螺旋和飞蝗的超气门蛋白的EF结构域(“LmUSP-EF”；SEQIDNO：5的403-630核苷酸)的9-12号螺旋融合到来自VP16的反式激活结构域(“VP16AD”；SEQIDNO：6)上，并且置于一个SV40e启动子(SEQIDNO：7)的控制之下。五个一致的GAL4反应元件结合位点(“5XGAL4RE”；包括5个拷贝的包含SEQIDNO：8的GAL4RE)融合到一个合成的TATA最小启动子(SEQIDNO：9)上，并且置于虫荧光素酶报告基因(SEQIDNO：10)的上游。
3.2-GAL4/突变的CfEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：该构建物以与上述开关3.1相同的方法制备，除了将野生型的CfEcR-DEF用一个突变的CfEcR-DEF替换掉，所述突变的CfEcR-DEF包含一个带有选自表5的取代突变的配体结合结构域。
3.3-GAL4/AaEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：该构建物以与上述开关3.1相同的方法制备，除了将野生型的CfEcR-DEF用蚊子(埃及斑蚊)EcR(“AaECR-DEF”；SEQIDNO：11)的野生型DEF结构域替换掉。
3.4-GAL4/AmaEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：该构建物以与上述开关3.1相同的方法制备，除了将野生型的CfEcR-DEF用硬蜱(美洲花蜱)EcR(“AmaEcR-DEF”；SEQIDNO：12)的野生型DEF结构域替换掉。
3.5-GAL4/BaEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：该构建物以与上述开关3.1相同的方法制备，除了将野生型的CfEcR-DEF用粉虱(银叶粉虱)EcR(“BaEcR-DEF”；SEQIDNO：13)的野生型DEF结构域替换掉。
3.6-GAL4/DmEcR-DEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：该构建物以与上述开关3.1相同的方法制备，除了将野生型的CfEcR-DEF用果蝇(黑腹果蝇)EcR(“DmEcR-DEF”；SEQIDNO：14)的野生型DEF结构域替换掉。
3.7-GAL4/MsEcR-CDEF/VP16-βRXREF-LmUSPEF：该构建物以与上述开关3.1相同的方法制备，除了将野生型的CfEcR-DEF用烟草天蛾(Manducasexta)EcR(“MsEcR-DEF”；SEQIDNO：15)的野生型DEF结构域替换掉。
3.8-GAL4/NcEcR-DEF/VP16-βRXREF：该构建物以与上述开关3.1相同的方法制备，除了将野生型的CfEcR-DEF用叶蝉(黑尾叶蝉)EcR(“NcEcR-DEF”；SEQIDNO：16)的野生型DEF结构域替换掉，且RXREF-LmUSPEF用小鼠RXR(SEQIDNO：18)替换掉。
3.9-GAL4/TmEcR-DEF/VP16-βRXREF：该构建物以与上述开关3.1相同的方法制备，除了将野生型的CfEcR-DEF用黄粉虫(Tenebriomolitor)EcR(“TmEcR-DEF”；SEQIDNO：17)的野生型DEF结构域替换掉，且RXREF-LmUSPEF用小鼠RXR(SEQIDNO：18)替换掉。
表5云杉卷叶蛾的蜕皮甾酮受体(“CfEcR”)的配体结合结构域(LBD)的取代
突变
为了改变EcR配体结合，EcR配体结合结构域中基于分子模拟分析预测为对配体结合重要的残基在来自不同类型生物体的EcR中突变掉。表5表明在CfEcR(鳞翅目EcR)的配体结合结构域中的残基被突变掉，并且检测其对类固醇和非类固醇结合的改变。
表5中列出的每一种氨基酸取代突变是通过RCR介导的定点突变构建在EcRcDNA中的。CfEcR的氨基酸V96突变成苏氨酸，CfEcR的氨基酸V107突变成异亮氨酸，CfEcR的氨基酸N119突变成苯丙氨酸以及CfEcR的氨基酸Y127突变成谷氨酸。也可以制造CfEcR的点突变：一个包含V96T和N119F取代(V96T+N119F)，且第二个包含V107I和Y127E取代(V107I+Y127E)[REH3]。
PCR定点突变是采用Quikchange定点突变试剂盒(斯图特基因公司(Stratagene，LaJolla，CA))进行的，使用的反应条件和循环参数如下。PCR定点突变采用1x反应缓冲液(由厂商提供)、50ng双链DNA模板，125ng正向引物(FP)，125ng反向互补引物(RCP)和1μL的dNTP混合物(由厂商提供)，最终反应体积为50μL。用于产生每个EcR突变体的正向引物和反向互补引物见表6。所用循环参数包括，一个循环95℃变性30秒，接着16个循环的95℃变性30秒、55℃退火1分钟并且68℃延伸分钟。
表6用于构建取代突变CfEcR配体结合结构域的PCR引物
突变体 引物(SEQ ID NO：) 引物核苷酸序列(5′到3′)
N119n 随机FP(SEQ ID NO：20) gcgtacactcgcgacnnntaccgcaaggctggcatgg
N119n 随机RCP(SEQ ID NO：21) ccatgccagccttgcggtannngtcgcgagtgtacgc
V96T FP(SEQ ID NO：22) ggtaatgatgctccgaaccgcgcgacgatacg
V96T RCP(SEQ ID NO：23) cgtatcgtcgcgcggttcggagcatcattacc
V107I FP(SEQ ID NO：24) gcggcctcagacagtattctgttcgcgaac
V107I RP(SEQ ID NO：25) gttcgcgaacagaatactgtctgaggccgc
Y127E FP(SEQ ID NO：26) caaggctggcatggccgaggtcatcgagg
Y127E RP(SEQ ID NO：27) cctcgatgacctcggccatgccagccttg
然后，如上述实施例3.2所述，每个所得编码突变EcR配体结合结构域的PCR核酸产物融合到一个GAL4DNA结合结构域上。然后通过在本发明的各种配体存在下将他们和VP16-异二聚体伴侣一起转染到NIH3T3细胞中，测试GAL4/突变EcR受体构建物的活力。
生物学测试
为了确定是否本发明的任何化合物可以作为哺乳动物反式激活测试中报告基因活力的诱导因子，在转染了pFRLUC报告基因和如实施例3中所述基因表达盒3.1到3.9的NIH3T3细胞中，测试这些化合物。转染的细胞在0.01-33μM浓度的化合物存在下生长。加入配体后48小时，收获细胞并且用双荧光素酶测试试剂盒(普洛梅格公司，Promega)进行测试。显示总相对光单位(RLU)。采用标准的细胞培养和维持方法。
甾族配体20-羟基蜕皮甾酮(20E)和松甾酮A购自西格玛化学公司(Sigma)和英杰公司(Invitrogen)。所有配体溶解在DMSO中。
DNA如下所述转入到小鼠NIH3T3细胞(ATCC)中。采用了标准的细胞培养和维持方法。收获细胞并且以每孔2500个细胞、50μL含有10％胎牛血清(FBS)的生长培养基接入96孔板中。24小时后，用35μL含有二甲亚砜(DMSO；对照)或从0.01-33μM的8个剂量的配体的DMSO溶液的无血清生长培养基处理细胞。然后用SuperfectTM(凯杰公司，Qiagen)转染试剂转染细胞。对于每个孔，0.625μLSuperfectTM与14.2μL无血清生长培养基混合。向转染试剂混合物中加入0.16μg报告基因构建物和0.04μg每种受体构建物。转染混合物的成分用旋涡震荡器混合，然后在室温放置30min。在孵育结束后，向细胞中加入15μL转染混合物。细胞维持在37℃和5％CO2且5％血清的条件下48小时。
报告基因测试在处理后48小时采用普洛梅格(promega)公司的Bright-GloTM荧光素酶测试系统根据厂商的说明来检测虫荧光素酶活力。相对最大诱导倍数(RelMaxFI)确定为在任何浓度观察到的所测配体的最大诱导倍数，相对于在任何浓度观察到的松甾酮A(PoA)和20-羟基蜕皮甾酮(20E)的最大诱导倍数。EC50值是用三参数逻辑模型从剂量应答数据中计算出来的。测试结果显示在表7中。
实施例1
公开了半合成的基因开关的类固醇调控因子。代表性的蜕皮甾醇20-羟基蜕皮甾酮(20E)和松甾酮A(PoA)是在2-，3-，14-，22-和25-位点单甲基化和多甲基化，或是在22位点单烷基化。半合成的类固醇在天然昆虫系统(果蝇BII细胞)和哺乳动物系统中工程化基因开关系统中进行测试，采用黑腹果蝇、云杉卷叶蛾和埃及斑蚊EcR和/或其变体。在22位点甲基化的20E和PoA，保持或提高了基因开关效力。烷基化类固醇的SAR表明22-OH是一个氢键受体，25-OH可能是一个氢键供体，且2-OH和3-OH相互之间和与EcR为供体和/或受体。大体上，用膜相互作用(MI)-QSAR方法计算的ADME性质显示出所希望的趋势，溶解度更低，渗透性更高，和更好的穿透血脑屏障且不过度调控logP或血浆蛋白的结合。烷基化显示了用于基因治疗的基因开关技术的改良的甾族激活因子。
配体诱导型基因表达系统，例如基于EcR的系统，非常适合用于基因治疗应用。因为可以控制蛋白的表达水平，将基因开关整合到基因治疗方案中能够更有效的治疗癌症、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、运动神经元疾病、肌肉萎缩症、囊肿性纤维化、神经性疼痛、风湿性关节炎和普遍的再生医疗。此外，基因开关可以用于诊断，生物制药，以及领域中的其他应用，例如基于细胞的测试和动物模型用于开发药物测试，以及生产生物治疗剂和生物材料。昆虫蜕皮甾醇调控的基因开关是难以被人内源类固醇调控的，并且表现出非常低的基础转基因表达，诱导性高且剂量应答范围广。
个别的和几个类固醇羟基被甲基化或烷基化。因此，23个新的半合成类固醇被合成、纯化和结构分配。选择烷基化的位点，使得与EcR的相互作用最大化。在细胞基因开关系统中测试所得的类固醇。其他的有利性质包括可能提高膜通透性和对代谢的抗性。新类固醇的MI-QSARADME计算与他们的非烷基化相似物进行比较。用多维QSAR研究这些类固醇的CoMFA/CoMSIA模拟，结合约在天然果蝇BII细胞系统中测试150个原先已知的类固醇。新的半合成类固醇可用作基因开关激活因子用于临床基因治疗。
合成——材料和方法。PoA由皮埃尔和玛丽居里大学(UniversitéPierreetMarieCurie)的RenéLafont提供。20-羟基蜕皮甾酮(20E)是由俄罗斯瑟克特夫卡尔(Syktyvkar，Russia)的俄罗斯科学院生物学研究所的V.Volodin博士提供。对于溶解度和logD测定，PoA购自Axxora/Alexis公司，而20E和米乐甾酮A从西格玛奥德里奇有限公司(Sigma-Aldrich)获得。其他试剂和溶剂购自飞世尔科技公司(FisherScientific)和西格玛奥德里奇；用于NMR分析的氘化溶剂购自英国格斯科学仪器公司(GossScientificInstrumentsLtd)(GreatBaddow，U.K.)。无水丙酮和CH2Cl2在使用前蒸馏。用于HPLC的水是去离子的，纯度达到17ohms。所有其他HPLC溶剂在使用前除气，通过抽气过滤通过0.45μm(用于水性溶液)或0.5μm(用于有机溶液)WatersMillipore过滤器。无水反应条件的实现是通过在真空下火焰干燥舒伦克反应管并且在导入试剂前引入氮气或氩气保护气氛。使用套管传输液体。在使用前，类固醇冷冻干燥。通过用铝膜包裹使氧化银反应避光。
反应用HPLC结合Glison170系统(AnachemLimited，Luton，U.K.)二极管阵列检测仪(DAD)进行监测，采用SpherecloneODS2柱(5μm，150×4.60mm；Phenomenex，Macclesfield，U.K.)，接受线性梯度从30％到100％的甲醇水溶液超过25分钟，接着是10分钟的等强度100％甲醇，流速为1mL/min。层析在242nm和300nm波长(λ)进行监测。在固定的时间间隔取出等体积的反应混合物，样品用甲醇淬灭，离心并且用Minisart0.20mm的过滤器(塞多利斯公司，埃普索姆，英国(Sartorius，Epsom，U.K.)过滤上清液。减压浓缩滤出液，用30％甲醇∶水(v/v)配制成溶解所需的最小体积，并且注入。
分离粗反应混合物中独立的类固醇醚是通过开发合适的HPLC系统实施的，其涉及一种或多种下述方法。(A)半制备型C18-HPLC(PhenomenexSpherecloneODS2；250×10mm，5μm)流速2mL/min；(B)制备型C18-HPLC(PhenomenexSpherecloneODS2；250×21.20mm，5μm流速＝5mL/min)；(C1/C2)半制备型硅胶柱(KinesisZorbaxSil；250×9.4mm，5μm，流速＝2mL/min)，用等强度CH2Cl2∶2-PrOH∶H2O160∶30∶1.5(C1)或125∶30∶2.0(C2)，v/v/v洗脱。
化合物的纯度是HPLC验证的，使用两种不同的反相柱(PhenomenexSpherecloneC18和C6，5μm，150×4.60mm)和一个正相柱(Kinesis-GRACEApexIIDiol，5μm，150×4.60mm)，且对于除了22(λ最大＝299nm)以外的所有化合物用在λ＝242nm总峰区域的％表示，对化合物22采用λ＝300nm。
产物定量是采用ShimadzuUV-2401PC(岛津公司，米尔顿凯恩斯，英国(ShimadzuGB，MiltonKeynes，U.K.))进行紫外分光光度测定含有14α-羟基-7-烯-6-酮半分子(λ最大＝242nm，摩尔消光系数[ε]＝12,400Lmol-1m-1)或14-羟基-7，9(11)-二烯-6-酮半分子(λ最大＝299nm，ε＝14,190Lmol-1cm-1)的化合物。根据朗伯比耳方程式(Lambert-Beerequation)计算浓度。
一维(1H和13C)和二维(1H-1HCOSY，1H-1HNOESY，1H-13CHMQC和1H-13CHMBC)NMR频谱记录在自动化的BrukerACF-300频谱仪或是BrukerAVANCEDRX-400频谱仪上。样品溶解在甲醇-d4中，包含四甲基硅烷(TMS)作为内参。13C频谱用49.00ppm的甲醇七重峰的中间信号进行校正。1H和13C的化学位移(δ)用百万分之(ppm)表示。耦合常数(J)和一半高度时的宽度(w1/2)值用赫兹(Hz)表示。
高分辨率质谱是以化学电离模式(CIMS)或是正离子快原子轰击模式(FABMS)来进行的。用配有直接进样探头的MicromassGCT质谱仪或是配有直接进样探头的JeolMS700质谱仪来记录，两种情况下都用甲烷作为反应气体和甲醇作为溶剂。源温度为200℃且探头温度为500-650℃。FABMS也记录在Jeol700质谱仪上，采用氙气作为反应气体，源温度为30℃且以“妙方”(1，4-二硫代-L-苏丁醇和1，4-二硫赤藓糖醇的4∶1混合物)作为基质。
合成在2-OH、3-OH、14-OH和/或22-OH带有O-烷基醚功能基团的类固醇。在醚化之前，通过转化为对应的20.22-苯基硼酸盐、2，3-丙酮化合物或2，3，20，22-二丙酮化合物类似物(图1)，选择性地保护起始蜕皮甾酮上的2，3-和/或20，22-二醇基团。合成类固醇醚1和2的步骤遵循示例性的实施例。
合成20-羟基蜕皮甾酮2-甲基醚和20-羟基蜕皮甾酮3-甲基醚。Ag2O(116.0mg，10eq)加入到新鲜配置的20E20，22-苯基硼酸盐(25a；30mg，53μmol)的DMF溶液(2mL)中，在室温无水条件下搅拌。在反应过程中分四次加入CH3I(258μL，44.7eq)，并且在4小时后再次加入Ag2O(10eq)。用HPLC-DAD监测反应。7.5小时后加入乙酸乙酯(25毫升)并且混合物用Celite(BDH化学有限公司，普尔，英国.)垫片过滤通过多孔性4的烧结玻璃过滤漏斗(Weiss-Gallenkamp公司，英国)过滤。然后加入乙酸乙酯(150mL)洗涤过滤器并且真空蒸发溶剂。粗反应产物采用Sep-Vac35ccC18-10g萃取柱(Waters公司，艾斯特里，英国)固相萃取进行预纯化。然后去除苯基硼酸基团，通过用THF和H2O2的9∶1(v/v)混合物(100倍体积，预先用NaOH0.1N中和)溶解产物，并且在室温和中性pH下搅拌2.5小时，接着用水稀释、蒸发THF并且固相萃取。粗反应产物纯化采用半制备型C18-HPLC(PhenomenexSpherecloneODS2，250×10mm，5μm，流速＝2mL/min，在242nm)配合等强度的1∶1CH3OH/H2O，其中在20分钟后洗脱2(6mg，25％；纯度＞99％)且在23分钟后洗脱1(13mg，50％；纯度＞99％)。
合成在25-OH带有O-烷基醚功能基团的类固醇：20-羟基蜕皮甾酮25甲基醚和22，25-二甲基醚。DTBMP(88.8mg，6eq)和三氟甲磺酸甲酯(47μL，6eq)加入到20E2，3-丙酮化合物(25b；37.5mg，72.1μmol)的无水CH2Cl2溶液(3mL)中。混合物在室温无水条件下搅拌。55小时后，在真空条件下去除三氟甲磺酸甲酯，并且用0.1MHCl和1，4-二氧杂环乙烷的1∶1(v/v)混合物处理残余物。纯化甲基化类固醇采用制备型的C18-HPLC(PhenomenexSpherecloneODS2，250×21.20mm，5μm，流速＝5mL/min)，使用等强度的60％CH3OH/H2O，产量：11.15mg(31％；纯度＞99％)10和5.63mg(15％；纯度＞99％)14。
基因开关测试-果蝇BII细胞形态。采用果蝇BII细胞生物测试来测试EcR配体的活力。测试以四个复孔进行。简单地说，制备每种测试化合物在甲醇中的储液(10-3M到10-10M)。每个稀释液的等分试样(20μL)转入到微孔板的孔中并且蒸发掉溶剂。约2×105细胞/毫升培养基的细胞悬液(200μL)加入到每个孔中，并且加盖的板在湿润环境下25℃培养7天。细胞应答作为类固醇浓度的函数在405nm用浊度剂检测。
细胞基因开关测试-工程化EcR：USP/RXR系统。细胞基因开关测试是通过将下列构建物转染到小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)中来进行的。来自(a)云杉卷叶蛾EcR(CfEcR-DEF)、(b)E结构域中带有E274V/V390I/Y410E突变的云杉卷叶蛾EcR、(c)埃及斑蚊EcR(AaEcR-DEF)、以及(d)黑腹果蝇EcR(DmEcR-DEF)的野生型D、E和F结构域融合到GAL4-DBD上并且置于CMV启动子的控制下。来自人RXR和飞蝗RXR的嵌合RXR融合到VP16-AD上并且置于SV40e启动子的控制下。诱导型虫荧光素酶报告基因质粒pFRLuc，(斯图特基因克隆系统，佐拉，加利福尼亚州，美国(StratageneCloningSystems，LaJolla，CA，USA))包含5个拷贝的GAL4反应元件和一个合成的最小启动子。VgEcR/RXR基因开关系统，采用了一个杂合EcR，带有一个VP16激活结构域和一个识别不对称EcR和糖皮质激素受体反应元件的三残基突变的DBD，购自英杰公司(卡尔斯贝，加利福尼亚州，美国)，并且以类似的方式应用，通过将带有虫荧光素酶报告基因的载体瞬转NIH3T3细胞。
NIH3T3细胞在37℃和5％CO2下在添加了10％牛血清的DMEM培养基中培养，都购自弗吉尼亚州马纳萨斯市的敏达科(Mediatech)公司。细胞以2500细胞/孔的密度铺在96孔板中，每孔50μL生长培养基。下一天细胞首先用35μL含有二甲亚砜(DMSO；对照)或配体的DMSO溶液的无血清生长培养基处理。然后每孔细胞用含有0.04μgEcR构建物、0.04μgRXR构建物和0.16μg虫荧光素酶报告基因构建物的15μL无血清培养基转染，使用SuperfectTM转染试剂(凯杰公司，Qiagen，瓦伦西亚，加州，美国)根据厂商的说明进行。在0.01-33μM的8个剂量测试配体，并且对照和处理孔中DMSO的终浓度都为0.33％。处理和转染培养48小时后，用Bright-GloTM虫荧光素酶测试系统(普洛梅格公司，麦迪逊，威斯康辛州，美国)根据厂商说明测试细胞的虫荧光素酶活力。
3D-QSAR训练集和测试集。用一个蜕皮甾醇文库和相关的BII活力值来产生或验证一个3D-QSAR模型。分析中包含了15种O-烷基化类固醇(1-7，9-15and18)，而其他化合物是从植物中分离的、购买的、或是其他研究人员好心提供的。所有用于活力测试的化合物的纯度要求设定为至少97％。测试的类固醇醚纯度为至少98％。对于QSAR文库中的结构和活性数据都检查其准确性。
20种类固醇从3D-QSAR训练集中分出来产生一个独立的测试集，用于模型的外部验证。测试集的选择采用四维QSAR-MS方法进行，其根据四维指纹分子相似度矩阵来计算化学相似度分值。
分子模拟和3D-QSAR分析。分子模拟，比较分子场分析比较分子场分析(CoMFA)和比较分子相似性指数分析法(CoMSIA)采用SYBYL7.0进行。PoA结合到烟芽夜蛾(Hv)EcR上的报道的晶体结构(PDB编码＝1R1K)用作分子模板，用于通过构象选择QSAR分子集。需要任意构象决断的分子独立叠印到与HvEcR形成复合物的PoA上，并且查询类固醇骨架上的取代基，进行手工调节使得配体结合口袋的立体接收度最大化。所得的化合物三维模型采用标准Tripos力场和Gasteiger-Hückel电荷使得能量最小化，将17-碳类固醇核心排成一行并且放在SYBYL坐标格的中心。采用半经验性MNDO方法(ESP匹配)通过MOPAC界面计算SYBYL，来分配部分原子电荷。
对于CoMFA，计算Tripos标准立体场和静电场、以及指示剂立体场、静电场和氢键场；对于CoMSIA，获取立体、静电、疏水、氢键供体和氢键受体的相似性指数，采用SYBYL默认参数，间隔的网格和sp3C+1探头。采用偏最小二乘(PLS)或样品-距离偏最小二乘(SAMPLS)分析和留一(LOO)交叉验证，寻找CoMFA/CoMSIA场描述符和化合物的BII活力之间的关系。0.5千卡/摩尔的最小西格玛值(列筛选)用于提高信噪比。所得模型的统计学意义用LOO交叉验证系数q2，和预测标准差SPRESS.来共同判定。最终模型是非交叉验证的传统PLS分析产生的，所述PLS分析来源于从最初的类固醇池中去掉7个化合物后(训练集＝140化合物)后采用对应LOO交叉验证分析的最佳组分数量。模型验证涉及测试集的BII活力预测值并且与观察到的值进行比较。
ADME性质。类固醇O-烷基醚类似物的辛烷-水分配系数(MlogP)是通过对前面计算的非醚类固醇的MlogP值进行缩放来确定的。通过建立的膜相互作用QSAR(MI-QSAR)模型，来确定Caco-2细胞穿透系数和血-脑屏障分配系数。MI-QSAR分析包括，在用于开发QSAR模型的描述符池中，明确来源于模拟每种溶解物(小分子有机化合物)转运的性质和特征，所述溶解物包含穿过由磷脂构成的模型膜结构的训练集，在这个例子中为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)分子。采用3D-FEFF-QSAR分析，评估类固醇与人血清白蛋白(HSA)的结合。这一方法计算类固醇配体结合到HSA上的自由能ΔG，采用成比例的QSAR模型作为打分函数。Ka值从ΔG＝RTln(Ka)获得。Ka＝(1/Kb)，其中Kb为分子对HSA的结合亲和力，假设结合是专门针对HSA发生的，形成二元复合物，并且存在与配体浓度相比过量的HSA([HSA]＝0.6mM)。类固醇O-烷基化类似物的水溶性用AMSOL方法和软件确定。
理化检测LogD由吸附系统公司(AbsorptionSystems，Inc)检测。在1.5mL摇瓶系统中，松甾酮A和20E在等体积的pH7.4缓冲液和水饱和辛烷中为100μM，复孔进行检测，采用睾酮作为标准品。每个摇瓶在室温振荡60分钟，然后室温下放置1小时。制备系列稀释的有机层和水层，并且用普通LC/MS/MS方法配合最小4点校正曲线来确定每个稀释度的测试化合物浓度。水溶性由Robertson-Microlit公司检测。PoA、20E、米乐甾酮A和二酰基肼的饱和水溶液样品是溶解在HPLC级的水中的，在25℃搅拌1、5和10天，然后用0.45μm过滤器过滤以获取澄清的溶液。对于每种物质，分别在249、248、239nm和219nm检测紫外吸光度，如果需要时进行稀释。吸光度与对照标准品在相同吸光度最大值的吸光度，甲醇中相同的类固醇的1-2％溶液，因为溶剂效应允许有直到10nM的最大值位移。
合成合成了23种类固醇O-烷基醚(图2)，包括含量最丰富的昆虫蜕皮激素20E(25)的衍生物；最有效的天然蜕皮甾醇之一PoA(26)的衍生物；和一种带有与众不同的核心结构的中等强度的激动剂海南陆均松甾酮(27)的衍生物。20E的衍生物为在2-、3-、14-、22-或25-OH位点的5种单甲基醚(1-4，10)，在22-OH和2-、3-、14-和25-OH之一的位点的4种二甲基醚(11-14)，以及一种四甲基醚(15)。PoA衍生物包括在2-，14-或22-OH位点的单氧甲基醚(16-18)，以及带有一个双醚功能基团的3种类似物(19-21)。除了甲基醚之外，制备了几种20E22-O-醚类似物，包括带有直到四碳链的O-正烷基(5，6和8)，以及烯丙基(7)、苄基(8)和2′-乙基环氧乙基(23)醚基团的类似物。在个别羟基位点选择性的导入甲基可以通过图1中所示的保护/去保护策略来获得，其涉及将2，3-顺-和/或20，22-二醇基团转化为丙酮化合物或苯基硼酸盐基团。可以通过从未保护的蜕皮甾醇开始的单罐反应方法来同时制备单甲基化或多甲基化的类似物(16，17，19，20)。这种方法在反应次数上有优势，但是需要仔细地进行HPLC-驱动的反应监测，并且导致多甲基化对单甲基化类似物的比率较高。在涉及Ag2O和CH3I的甲基化反应中，蜕皮甾醇羟基的反应活性顺序为22-OH＞2-OH＞3-OH＞＞14-OH。当用Ag2O/CH3I没有观察到20E的第三顺位25-OH的甲基化时，通过提高反应温度(直到60℃)或是试剂的量，可以将14-OH转化为CH3O-基团。然而，Ag2O大大过量或是延长接触时间，会导致产物降解，例如脱水和/或发色团改变。作为一个适当的例子，在室温下，延长PoA与Ag2O/CH3I的接触时间(46小时)后，观察到形成了带有改变的发色团(7，9(11)-二烯-6-酮基团)、DaH22-甲基醚(22)的甲基化PoA衍生物。假设的反应机制可涉及通过Ag2O去除两个11-H原子之一，接着共轭双键对迁移。在寻找适用于如蜕皮甾醇等化学敏感性分子的替代O-甲基化方法中，我们发现6个等价物，每种在三氟甲烷磺酸甲酯和DTBMP中25℃和无水条件下，平稳且选择性的促进20E2，3-丙酮化合物(25b)的25-OH甲基化，反应活性顺序为25-OH＞22-OH＞＞14-OH。这一方法代表了一种新开发的用于多羟基化类固醇的O-甲基化的方法。在我们所有的实验中，20-OH位点仍然难以被甲基化。
NMR.制备O-烷基蜕皮甾醇1-23相对于其亲本化合物(20E，PoA或DaH)的1H和13C光谱分配，并且在1H-1HCOSY，1H-13CHMQC和1H-13CHMBC谱中检测J耦合连接。在2-，3-和/或22-位点的第二醚取代基的1H信号显示了一个在约0.4ppm的特征性高场位移，并且与13C信号相关，所述13C信号相对于亲本蜕皮甾醇在约10ppm发生低场位移。带有14α-OCH3基团的类固醇容易从他们的1H-NMR图谱上识别，其中9α-H信号表现出一个约0.3ppm的高场位移(δH＝2.76-2.78ppm)，且它们的13C-NMR图谱，其中14-C信号表现出一个约6ppm的低场位移(δC＝90.95-90.98ppm)。在NOESY实验中通过9α-H信号的照射确认14-甲氧基的α-立体化学，导致14-OCH3信号增强3％(2.97ppm)且2α-H信号增强13％(3.53-3.81ppm)。20E25-甲基醚类似物显示出25-C信号(76.16ppm)相对于20E的一个约5ppm的低场位移，26-C和27-C信号(25.52and25.27ppm)的一个约4ppm的高场位移。在蜕皮甾醇甲基醚类似物的1H-NMR图谱中，来自2β-OCH3，3β-OCH3，14α-OCH3，22-OCH3和25-OCH3的单峰分别出现在3.39，3.40，2.97，3.50和3.19ppm。在20E22-乙基醚、丙基醚和丁基醚类似物的1H-NMR图谱，连接到22-OR基的α碳上的两个质子表现为非对映异构信号，δH从3.51到3.75ppm。在23的1H-NMR图谱中，对应于63.54ppm的13C信号，在3.49ppm和3.39ppm的两个双峰(2J＝12Hz)被分配到22-乙基环氧乙基的成对环氧乙基质子；23的O-C-O基团的第四13C信号落在了110.25ppm。
果蝇BII细胞测试(图3)。黑腹果蝇BII细胞天然表达天然的EcR-USP复合物并且对EcR激动剂和拮抗剂作出特异性和定量反应。O-烷基类固醇1-23在BII生物测试中表现出激动剂效力，浓度范围从100μM到1nM，取决于分子中醚取代基的数量和位置。尤其是，20E的2-，3-，14-和25-羟基的甲基化使得功效降低，但是20E22-甲基醚(4)保留了20E的效力。22-乙基醚类似物(5)要比甲基的效力略低，而随着丙基、烯丙基和丁基等(6，7，8)烷基基团更大，活性差异上升。然而，22-O-苄基取代基(9)不会使20E的效力下降很多。PoA在任何位点的O-烷基化降低了其在BII生物测试中的功效。
工程化EcR/RXR：USP基因开关。在瞬转了诱导型系统的组分的小鼠细胞系中检测O-烷基类固醇驱动基因表达的能力。主要使用两种基因开关：一个基于野生型的云杉蚜虫(Cf)EcR(wt-CfEcR-DEF)和另一个基于该受体的E274V/V390I/Y410E突变体(突变的-CfEcR-DEF)。配合一些类固醇，对相同基因开关模式的黄热病蚊(Aa)和果蝇(Dm)EcR进行相似的实验。人RXRβ和来自飞蝗的昆虫USP融合到VP16-AD上，并且用作EcR的伴侣蛋白。
评估类固醇的效力(EC50)和功效。后者，RMFI，计算为相对于非甾族二酰基肼EcR激动剂(30)在其最佳测试浓度在相同测试条件下的最大诱导倍数，测试配体的最大诱导倍数。测试和参照配体的诱导倍数定义为配体诱导的基因表达和DMSO对照诱导的基因表达的倍率。
在野生型-CfEcR基因开关中，PoA(26)在所测类固醇中表现出最高诱导活力(EC50＝0.19μM，RMFI＝～0.18)，而米乐甾酮A和小龙骨素B效力较低(分别为EC50＝7.4μM和～12)且20E是没有活性的(EC50＞33μM)。在任何位点O-烷基化后，PoA的效力下降，虽然PoA22-甲基醚(18)和海南陆均松甾酮22-甲基醚(22)提供了比PoA本身(RMFI＝～0.2)更高的诱导倍数(分别为RMFI＝～0.6和～0.3)。一个特殊的20EO-烷基化类似物，20E22-乙基醚(5)，在约5μM的浓度诱导报告基因表达达到最大诱导倍数的77％。
在E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR基因开关中，PoA和PoA22-甲基醚是表现最佳的类固醇(图4)：PoA的EC50值为0.1μM，PoA22-甲基醚的EC50值0.7μM，且RMFI值分别为0.52和0.58。在这个开关中，米乐甾酮A相对较弱，EC50为1μM；而小龙骨素B为～7μM。20E是一个非常弱的激动剂(EC50＝20μM)。然而在22-乙基化后，20E的效力显著提高，EC50(5为0.76μM；20E为～20μM)和RMFI(5为1.1；20E为0.12)都提高。尽管程度较低，20E22-正丙基(6)、22-丁基(8)，22-苄基(9)和25-甲基(10)醚也提高了他们亲本化合物的性能，而20E22-烯丙基醚(7)的活力与20E相同。因此，在野生型和E274V/V390I/Y410E突变体形式的CfEcR基因开关中，PoA22-甲基醚是最强的O-烷基醚且20E22-乙基醚是排名第二。
一些O-烷基化类固醇还在同样通用形式的基因开关中测试，除了E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR和VgEcR/RXR之外，野生型AaEcR或野生型DmEcR取代了CfEcR。在基于AaEcR-和DmEcR-的测试中，PoA22-甲基醚的效力要比米乐甾酮A强，并且要比PoA更强一些(分别为EC50＝0.38nM和66nM)。就效力而言，AaEcR系统要比CfEcR对PoA22-甲基醚和测试的标准品PoA(1.1nM)和米乐甾酮A(9nM)都更为敏感，但是就功效而言灵敏度较低(例如，PoA：在1μM的FI＝166[AaEcR]对在1μM～900[CfEcR])。这种差异大部分是简单地归因于AaEcR系统在“关闭”状态的背景水平较高(FI＝7.6[AaEcR]对0.7[CfEcR])，而不是报告基因的绝对表达较低(RLUs＝～1046[AaEcR]对540[CfEcR])。相对于AaEcR开关，DmECR开关就背景转录而言更类似于CfEcR开关，且在功效上应答更低。在3T3细胞中，前面开发的VgEcR/RXR开关形式被PoA和米乐甾酮A所诱导，分别为EC50＝0.641和0..851μM，，且被PoA22-甲基醚诱导的EC50＝0.553μM。比较中，基于AaEcR-和DmEcR的基因开关在低(AaEcR)和中等(DmEcR)纳摩尔浓度就对这些配体产生应答，表明效力显著提高。
最终3D-QSAR模型。选择不同的分子场组合，包括CoMFA立体场和静电场，CoMSIAH-键供体，H-键受体和疏水场，以及极性表面区域(PSA)，以最好的代表蜕皮甾醇文库。所得的3D-QSAR模型的统计学总结在图15中。
基因治疗中的类固醇和EcR基因开关。EcR基因开关已经证明用于细胞和组织培养，以及动物模型中。效力最高的配体主要由两种化学型代表：合成的二酰基肼和天然的通常是植物来源的类固醇。两组中的代表都已经成功用于模型研究中的EcR基因开关中。从生物可利用性角度来看，二酰基肼具有II型ADME性状(溶解度低，logP高，渗透性高)且几乎没有容易代谢的位点，而蜕皮甾醇溶解度更高，logP较低且有很多容易代谢或偶联的羟基。
合成合成了23种20E、PoA和DaH的O-烷基蜕皮甾醇类似物。获得了20E和PoA的所有单甲基醚，除了(a)PoA的3-甲基醚，只能与22-甲基化一起获得，和(b)20-甲基醚，因为已经证明20-羟基没有反应活性。普通的合成依赖于分别对2，3-和20，22-二醇基团的完善的缩酮和硼酸盐二醇保护策略。合成20E22-甲基醚(4)和22-乙基醚(5)并且分离20E25-甲基醚(多足甾酮，10来自蕨类铁扇公主PolypodiumaureumL.)在本研究之前已经有描述，但是过去的研究中没有将其用于基因开关测试。
细胞基因开关测试为了测试醚1-23的基因开关效力，使用了两种基因开关模式，并且用几个配体简单研究了一下第三个模式。第一个是天然果蝇BII细胞系。BII细胞系来源于肿瘤性血细胞突变体(l[2]mbn)的血细胞。BII细胞中加入类固醇作为一个诱导吞噬作用的信号，并且细胞从小细胞层发展成带有清晰区域的较大细胞团。这个应答可以用浊度来定量。
第二种基因开关模式是工程化的异二聚体对。它采用了EcR配体结合结构域连接到细菌GAL-4DNA结合结构域上，其一旦接触配体，与一个连接到病毒VP16激活结构域的杂合的蝗虫-人RXR相结合。这个复合物随后结合到虫荧光素酶报告基因上游的GAL-4反应元件上，虫荧光素酶报告基因的表达提供了一个荧光读数。整个开关系统是在小鼠3T3细胞中瞬时表达的。使用了这个开关的EcR-LBD变体，其中LBD序列来源于云杉卷叶蛾(云杉蚜虫，CfEcR)，埃及斑蚊(蚊子，AaEcR)和黑腹果蝇(果蝇，DmEcR)(图8)。此外，测试了过去发现能提高整体EcR配体灵敏度的CfEcR突变变体(E274V/V390I/Y410E)。在每种情况下，测试系统的所有其它成分保持一致，除了在不同3T3细胞系克隆中测试了几种类固醇。
用于几种化合物的第三基因开关模式是过去用于小鼠体内研究的来源于DmEcR的VgEcR/RXR系统。
类固醇的QSAR定量——22-O-烷基蜕皮甾醇保留或提高了他们亲本化合物的诱导活力。根据在给定位点是否存在一个或多个甲基帽，对类固醇进行配对，并且计算果蝇BII测试中的效力差异(图6)。带有跨2-，3-，14-，22-和25-位点的单个醚取代的20E和PoA醚衍生物(1-10，16-18，22-23)可以直接得出效力差异和特定OH-基团加帽之间的关系。平均起来，每个羟基位点的甲基化导致效力降低，根据下列EC50log单位的抑制顺序排序：14-OH(2.12)、2-OH(1.67)、25-OH(1.09)、3-OH(1.06)和22-OH(0.35)。然而，明显地，9个类固醇中有5个的22-甲基化，包括20E本身(4，-logEC50＝8.20)，使得效力适度提高。多重甲基化通常提高了它的效果。
工程化的基因开关系统在效力和SAR细节上都表现出了一些差异应答。在野生型CfEcR上测试的类固醇中，只有20E22-乙氧基醚5表现出了效力比20E明显提高(EC50＝485μM，RMFI＝0.77)，在这个测试中20E是一个基本没有活性的类固醇。在E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR基因开关测试中，5又构成了一个相当大的改善(EC50＝0.76μM，RMFI＝1.10)相对于亲本20E(EC50＝～20μM，RMFI＝0.12)。其它22-醚，例如正丙基醚和苄基醚，也会造成改善。出乎意料地，米乐甾酮A和小龙骨素B都在CfEcR模式的基因开关中要比在BII测试中更弱。
对于野生型CfEcR，一旦羟基甲基化，PoA就失去了效力和功效。然而对于CfEcR的E274V/V390I/Y410E突变体，高效的PoA(EC50＝0.10μM，RMFI＝0.52)的效力丢失要小得多，并且一旦22-甲基化后还事实上获得了功效(18，EC50＝0.70μM，RMFI＝0.58)，从而获得了所需的效力、代谢和渗透特性。这一趋势在小鼠3T3细胞中的相同双杂交系统中的AaEcR和DmEcR延续了下来。配合AaEcR，在1.10nM18(EC50＝0.38nM)要比PoA效力更高；配合DmECR，它在～66nM是等效的。然而，在基于果蝇的VgEcR/RXR系统中，18与PoA和米乐甾酮A效力相等或者可能效力更高(EC50＝533nM/RMFI＝1.5对分别为EC50＝641nM/RMFI＝1.5和EC50＝851nM/RMFI＝1.3)，从而可被视为是本系统的最佳配体。简而言之，PoA可以在22-位点甲基化，产生缺少一个羟基但是保留了活力的结构。此外，由于甲氧基化结构的理化性质应该更好，它在治疗应用中可能要比PoA本身更有潜力。我们显示22-O-烷基(甲基，乙基，丙基)和22-O-苄基类固醇保留了或提高了他们亲本化合物的诱导活力。
ADME。蜕皮甾醇醚具有一个良好的ADME特征。对于示例性的类固醇醚和参照复合物，计算几个ADME性状-水溶性、LogP(MlogP)、血-脑屏障(BBB)穿透、Caco-2细胞渗透性和人血清白蛋白(HSA)结合(图7)。
溶解度。计算的PoA和20E水溶性与实验获得的值相一致(分别为0.18mg/mL和6.7mg/mL)。通常，溶解度随着羟基数量而提高(如米乐甾酮A＞20E＞PoA)；相应地，羟基加帽通常使溶解度降低。值得注意的例外是20E22-烷基醚。例如，类固醇5(20E22-O-乙氧基醚)和7(20E22-O-烯丙基醚)的溶解度要略高于它们带有游离的20，22-二醇的亲本化合物。一个解释是，与22-烷基类似物相比，20E的20，22-二醇的分子内氢键造成助溶性分子内氢键的减少，其只参与20-OH供体/22-OH受体的作用，并且受到与溶剂氢键的更多的热动力学限制。以相似的方式，22-OH/25-OH分子内氢键效果也可是显著的。在20E的O-22甲基化打乱了22-OH供体/25-OH受体作用中的分子内氢键，从而导致了20E22-甲氧基醚对20E的水溶性抑制要比PoA22-甲氧基醚对PoA更小，PoA缺乏25-OH，所以不能形成这样的分子内氢键。对于二酰基肼30，计算水溶性(3.6mg/mL)和观测水溶性(6.2μg/mL)之间相差～3个数量级。实验上，二酰基肼是容易结晶的材料。可能这种溶解度矛盾揭示了一个MI-QSAR模型没有说明的物理行为。
MlogP值.像水溶性一样，MlogP值与烷基化趋势相同。同样，22-烷基化是一个例外；出于与影响水溶性趋势相同的分子内键合的原因，这个位点的烷基化能够实际上降低MlogP。MlogP高估了实验值：20ElogD实验＝0.01(logP计算＝1.25)；PoAlogD实验＝1.95(logP计算＝2.19)。
血-脑屏障分隔.分子穿过BBB能力的度量是BBB分隔系数的对数(logBB)，其等于log(C脑/C血)，其中C脑是化合物在脑中的浓度且C血是化合物在血液中的浓度。根据已经发表的BBB分隔实验数据，log(BB)值＞0.3表明化合物容易进入到脑中，而log(BB)值＜-1表明分析很难进入脑中。我们的ADME估计表明20E、PoA和米乐甾酮A适度分布进入脑中(-0.89＜log(BB)＜-0.35)。在另一方面，O-烷基醚类固醇表现出穿过BBB的能力提高，尤其是PoA2-甲基醚(16：log(BB)＝0.16)和PoA22-甲基醚(18：log(BB)＝0.23)。对于潜在的中央神经系统(CNS)治疗剂，希望log(BB)为正值。同样，20EO-烷基醚类似物的计算log(BB)值要比20E高。
渗透性一些类固醇的Caco-2渗透系数(PCaco-2)采用已建立的Caco-2细胞渗透QSAR模型来确定。如图7中所示，从米乐甾酮A到20E到PoA，PCaco-2值逐渐增加，同时分子亲脂性(MlogP值)增加且水溶性降低。与亲本分子PoA(19×10-6厘米/秒)相比，PoAO-烷基醚衍生物16，18和20表现出相等或是更高的PCaco-2值(从20×10-6到29×10-6厘米/秒)；与亲本化合物20E(16.3×10-6厘米/秒)相比，20EO-烷基醚衍生物4，5，7，10和14也等效的或更容易渗透Caco-2细胞(14-24×10-6厘米/秒)。这些结果表明蜕皮甾醇的氧-醚衍生物的口服生物可利用性提高。
检测蜕皮甾醇的理化和吸收性质A)CacoII渗透性测试：汇合的单层Caco-2细胞(n＝2)，在孔中养到21-28天，在顶侧和底侧都加入测试类固醇，pH7.4±0.2。在120分钟从每侧取样来确定顶侧-底侧(A-B)和底侧-顶侧(B-A)的渗透性。采用普通LC/MS/MS方法配合最小四点校正曲线来检测测试化合物的浓度。特征为(PappA→B)＜1.0×10-6厘米/秒的物质被认为渗透性低。超过这个值则渗透性高。如果流出＞3.0且(PappB→A)＞1.0X10-6厘米/秒，认为物质发生了明显的流出；B)血浆蛋白结合测试：透析孔(n＝2)，每个透析孔一侧带有pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，孔的另一侧带有混合性别的人血浆，加入测试类固醇。在37℃，约24小时后，对每个孔的血浆侧和缓冲液侧进行取样，并且用LC/MS/MS分析。这些实验由吸收系统有限公司(AbsorptionSystems，Inc)进行，并且结果见表8。
表8
血浆蛋白结合HSA结合亲和力是药物发现和开发中考虑的一个重要药代动力学性质。HSA结合允许了循环系统中疏水分子的溶解。化合物与血清白蛋白的结合强度是决定化合物分布到目标组织以及他的生物利用度的主要因素之一。如图7所示，蜕皮甾醇表现出相似的HSA结合亲和力，从2.1×10-4到3.8×10-4(Ka值)。集合中HSA结合最低的化合物为20E22-乙基醚(5)，其在集合的醚中也是MlogP值最低的且计算的水溶性最高的。HSA结合最强的化合物是PoA3，22-二甲基醚(20)，其也是集合的醚中MlogP值最高的且处在蜕皮甾醇的计算水溶性较低的范围内。因此，蜕皮甾醇的HSA结合和化合物的疏水性以及水溶性之间普遍相关。
代谢和排泄。在人类中估计20E的半衰期为9小时。在小鼠、大鼠和人中已知的代谢物包括脱羟基、B-环还原、C-3的差向异构和20，22-二醇切割的产物。从第一原则，以及前面烷基化加帽提高了代谢稳定性的例子，蜕皮甾醇烷基化醚应该比对应的非醚更容易从脱羟基、氧化切割和共轭反应中复原；必须首先进行O-脱烷基步骤。
OH加帽是改善蜕皮甾醇的理化性质尤其是代谢的一种有效方式。通过烷基化可以实现一种综合平衡：为了提高有缺陷的性质(代谢不稳定、清除)，调控过量的性质(即水溶性和亲水性)。这不需要牺牲效力就实现了。
半合成的蜕皮甾醇作为药物。类固醇，包括蜕皮甾醇代表了除了二酰基肼之外的基因开关配体，其为可用于基于EcR的开关系统的另一种化学型。
本发明公开的烷基化策略调控了影响生物可利用度和药物递送参数的ADME性质。22-O-烷基化代表了一种修饰。这样的烷基化提供了改良型甾族激动剂用于开关活化的基因治疗。通过对特定的蜕皮甾醇羟基的甲基化，我们建立了改良的蜕皮甾醇的药理学相关的理化性质，而保持或提高了对于所选EcR的效力。
在2，3，14，20和22位点加入羟基提高了效力，而在25位点的羟基化降低了效力。然而，一些离群的配体/EcR组合物，例如杯苋甾酮激活E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR和四翅滨藜甾酮激活银叶粉虱BaEcR，表现出相对效力反转并且显示出正交基因开关的方向设计。这两种配体/受体对之间的效力反转可以用E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR中类固醇-尾接触残基V411和M502对应于BaEcR中的两个苏氨酸来解释。一般而言，鳞翅目和非鳞翅目可以通过CfEcR-V411的V到T/N/S的变化相互区分开来。在杯苋甾酮作用的CfEcR的E274V/V390I/Y410E突变体以及小龙骨素B激活埃及斑蚊(Aa)EcR中也观察到了另一种效力反转。
实施例2
在一个普通双杂交基因开关模式中，我们测试了一套42个类固醇对一组代表9种节肢动物物种的10个EcR的活力；来自BII测试和VGECR/RXR基因开关的数据在文中进行说明。趋势和不寻常的效力反转也列在表格中。比对EcR序列，标出来自已有晶体结构(LBD来自鳞翅目夜蛾[Hv]、半翅目烟粉虱[Bt]和甲虫赤拟谷盗[Tc])的接触残基，并且标出了配体上取代基变化和受体上残基模式之间的功效相关性。SAR离群值揭示了一个配体数据集中的配体。识别效力反转用于构建正交的基因开关。
我们鉴定了新的纳摩级和亚纳摩级的类固醇/EcR组合物。我们也描述了在几个稀有类固醇上的更为广泛的EcR筛选数据。评估在双杂交基因开关模式中EcR序列的应答能力，基础活性和动态范围。两个不希望的类固醇/EcR正交性也被识别了并就EcRLBD序列进行了评估。
材料和方法
分离、纯化和合成类固醇半合成的类固醇20E2-甲基醚；20E3-甲基醚，20E22-甲基醚，20E2，22-二甲基醚，20E3，33-二甲基醚，20E2，3，14，22-四甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮22-O-吡洛羧酸酯，以及土克甾酮-11α丙酸酯，土克甾酮-11α己酸酯，土克甾酮-11α癸酸酯是从20E或土克甾酮制备的。剩余的类固醇是从植物材料提取的，除了松甾酮A，它也是从20-羟基蜕皮甾酮合成的。米乐甾酮A购自AG科学有限公司(AGScientificInc)(圣迭戈，加利福尼亚州)。下列化合物是由其他研究人员好心提供的：2-脱氧蜕皮甾酮，蜕皮甾酮，2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和杯苋甾酮(RenéLafont教授)；紫杉甾酮，小龙骨素B，筋骨草甾酮C，(25S)-牛膝甾酮，(25R)-牛膝甾酮，罗汉松甾酮A，罗汉松甾酮C，鹿根甾酮，整合甾酮A(JurajHarmatha博士)；20-羟基蜕皮甾酮(VladimirVolodin博士)，土克甾酮(ZyadillaSaatov教授)和四翅滨藜甾酮(ApichartSuksamrarn教授)。用于合成/纯化的试剂和溶剂购自飞世尔科技公司(FisherScientific)和西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。用于HPLC的水是去离子的，纯度为17W。
独立类固醇的纯化采用HPLC进行，其中涉及下列方法中的一种或多种：(a)半制备型C18-HPLC(PhenomenexSpherecloneODS2；250×10mm，5μm，流速＝2mL/min)和(b)制备型C18-HPLC(PhenomenexSpherecloneODS2；250×21.20mm，5μm，流速＝5mL/min)，用合适的CH3OH/H2O混合物等强度洗脱；(c)半制备型硅胶柱(KinesisZorbaxSil；250×9.4mm，5μm，流速＝2mL/min)，用CH2Cl2∶2-PrOH∶H2O160∶30∶1.5或125∶30∶2.0(v/v/v)等强度洗脱。
所有的样品用RP-HPLC和/或NP(diol)-HPLC纯化到至少98％。在Gilson170系统(Anachem有限公司，卢顿，英国)上，用HPLC结合二极管阵列检测仪来验证化合物的纯度，采用两种不同的反相柱(PhenomenexSpherecloneC18和C6，5μm，150×4.60mm；菲罗门公司，马克菲尔德，英国(Phenomenex，Macclesfield，U.K.))，接受线性梯度从30％到100％的甲醇水溶液超过25分钟，接着是10分钟的等强度100％甲醇，和一个正相柱(Kinesis-GRACEApexIIDiol，5μm，150×4.60mm)，接受线性梯度从2％到10％，或4％到10％的CH3OH的CH2Cl2溶液，都采用流速1mL/min且波长(λ)为242nm和300nm.
产物定量是采用ShimadzuUV-2401Pc检测紫外光谱来进行，测定含有14α-羟基-7-烯-6-酮半分子(λ最大＝242nm，摩尔消光系数(ε)＝12,400Lmol-1cm-1)或14α-羟基-7，9(11)-二烯-6-酮半分子(λ最大＝299nm，摩尔消光系数(ε)＝14,190Lmol-1cm-1)。根据朗伯比耳方程式(Lambert-Beerequation)计算浓度。
细胞基因开关测试-果蝇BII细胞形态果蝇BII细胞系生物测试用于检测潜在的EcR配体的活力。测试以四个复孔进行。制备每种测试化合物的甲醇储液(10-3M到10-10M)。每个稀释度的等分试样(20μL)转入到微孔板的孔中，并且蒸发掉溶剂。孔中加入约2×105细胞/毫升培养基的细胞悬液200μL，并且加盖的板子在湿润环境下25℃培养7天。细胞应答作为类固醇浓度的函数在405nm用浊度剂检测。
细胞基因开关测试-工程化EcR：USP/RXR系统。细胞基因开关测试是通过将下列构建物转染到小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)中来进行的。表9中的EcR的D、E和F结构域融合到GAL4-DBD上并且置于CMV启动子的控制下。引物和克隆步骤如上所述。来自人RXR和飞蝗RXR的嵌合RXR融合到VP16-AD上并且置于SV40e启动子的控制下。诱导型虫荧光素酶报告基因质粒pFRLuc，(斯图特基因克隆系统，佐拉，加州，美国)包含5个拷贝的GAL4反应元件和一个合成的最小启动子。VgEcR/RXR基因开关系统，采用了一个杂合EcR，带有一个VP16激活结构域和一个识别不对称EcR和糖皮质激素受体反应元件的三残基突变的DBD，购自英杰公司(卡尔斯贝，加州，美国)，并且通过瞬转NIH3T3细胞以类似的方式应用。
NIH3T3细胞(这些NIH3T3细胞来自与实施例1中的NIH3T3细胞不同的一个克隆群)在37℃和5％CO2下在添加了10％牛血清的DMEM培养基中培养，都购自弗吉尼亚州马纳萨斯市的敏达科(Mediatech)公司。细胞以2500细胞/孔的密度铺在96孔板中，每孔50μL生长培养基。下一天细胞首先用35μL含有二甲亚砜(DMSO；对照)或配体的DMSO溶液的无血清生长培养基处理。然后每孔细胞用含有0.04μgEcR构建物、0.04μgRXR构建物和0.16μg虫荧光素酶报告基因构建物的15μL无血清培养基转染，使用SuperfectTM转染试剂(凯杰公司，Qiagen，Valencia，CA，USA)根据厂商的说明进行。在0.01-33μM的8个剂量测试配体，并且对照和处理孔中DMSO的终浓度都为0.33％。处理和转染培养48小时后，用Bright-GloTM虫荧光素酶测试系统(普洛梅格公司，麦迪逊，威斯康辛州，美国)根据厂商说明测试细胞的虫荧光素酶活力
蛋白序列从Pubmed获得。当只有核苷酸序列时(Ba和Nc)，用EBITranseq程序(http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/)进行翻译。序列比对和系统发生评估采用ClustalW2(availableontheworldwidewebatebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)获得。当有超过一种EcR变体存在时，用ClustalW进行初步比对来显示残基变化位于LBD之外。
用SYBYL7.1和7.3进行分子模拟。杯苋甾酮/E274V/V390I/Y410E突变的-CfEcR//四翅滨藜甾酮/BaEcR比较：在Sybyl7.1中比对结合了PoA的HvEcR(PDB:1R1K)和结合了PoA的BtEcR(LBD与BaEcR相同，PDB:1Z5X)的同源性，根据C-α原子的比对，给出加权RMS距离＝1.22。识别在重原子半径中的残基。CfEcRV390和Y410分别突变为I和E。不考虑所有其它残基，结合在E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR上的杯苋甾酮，以及结合在BaEcR上的四翅滨藜甾酮，每个晶体结构都是从PoA手工修饰的，可选地有侧链最小化(Tripos力场和Gasteiger-Hückel电荷)，但是没有打乱类固醇的环结构，目的在于使得受体匹配最大化。对于24S-四翅滨藜甾酮，BaEcR的M301C-C-S-C转矩移动180°，以避免与四翅滨藜甾酮的吡咯羰基的空间位阻，合理的调整考虑到a)M301在H7上且点外部朝向H11，b)这一移动没有产生其他冲突，以及c)在BYI06830:HvEcR晶体结构(PBD:1R20)发现了甲硫氨酸位移的先例。对于24R-四翅滨藜甾酮，BaEcR的M301C-C-S-C转矩移动10°，以避免与四翅滨藜甾酮的吡咯羰基的空间位阻。同样，类固醇C23-24键的转矩也调整10°，以达到一个更好的吡咯环位置。总之，接触残基或类固醇侧链只需要很少的且细微的调整，将杯苋甾酮和四翅滨藜甾酮容纳在他们的应答受体中。然后比较AaEcR和BtEcR对应的结合口袋残基的同一性和姿态。杯苋甾酮/E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR//小龙骨素B/AaEcR比较：杯苋甾酮使用如上所述。在PoA:BtEcR复合物中小龙骨素B是从PoA修饰得来的。与正交配体识别相关的AaEcR残基是采用下面的方法识别的。识别PoA:BtEcR晶体结构(PDB1Z5X)中的结合口袋残基，并且将BtEcR序列与AaEcR比对。在这些结合口袋残基中，有5个在两个受体之间有差异：Bt-H200/Aa-Q353，Bt-T287/Aa-N441，Bt-M389/Aa-Q545，Bt-T393/Aa-M549和Bt-V404/Aa-L560。因为这五个中每一个都与E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR中他们的比对配对物相同，可以排除这五个残基对正交有贡献。这两个受体之间相同的且姿态相似的其他残基也被排除掉了。BYI06830/四翅滨藜甾酮重叠：结合PoA(PDB1R1K)和BYI06830(PDB1R20)的HvEcR进行同源性比对。用如上所述获得的.四翅滨藜甾酮替换掉PoA。产生下述三维模型(数据未显示)：A.叠印结合在VY-CfEcR(绿色)上的杯苋甾酮(碳原子用青色，氧原子用红色)和结合在BaEcR(橙色)的24S-四翅滨藜甾酮(碳原子用黄色，氧原子用红色，氮原子用蓝色，氢原子用白色)。VY-CfEcR残基来源于PoA-结合的HvEcR晶体结构(PDB编码：1R1K)，除了HvEcR-V395其突变为VY-CfEcR-I390，以及HvEcR-Y415其突变为VY-CfEcR-E410。在配体的(重原子距离)中只有一个残基并且两种EcR之间的构象非常重要或是同一性有差异。蓝色标签指VY-CfEcR残基且棕色标签指BaEcR残基。图像是对前景上的螺旋H3和H4的部分的β层的视图。四翅滨藜甾酮用静电势表面着色表示。所选的24S-四翅滨藜甾酮和BaEcR残基(T337，T426)之间的氢键用红色虚线表示。杯苋甾酮没有参与类似的H-键相互作用。B.叠印结合在VY-CfEcR(绿色)上的杯苋甾酮(青色)以及结合在AaEcR(橙色)上的小龙骨素B(黄色)。小龙骨素B用静电势表面着色表示。C.叠印类似于PoA:HvEcR晶体结构结合在HvEcR上的24-S-四翅滨藜甾酮(黄色)和如HvEcR晶体结构中所见的二酰基肼BYI06830(青色)。
结果
42个类固醇的筛选集列在了图9、10和11中。最大的类固醇子集在2-，3-，5-，11-，14-，20-，22-和25-位点的羟基化状态和2-，3-，14-，和22-位点的甲基化上有差异(图9)。类固醇的第二子集包含选择侧链修饰，包括稀释、烷基化和链-环融合(图10)。第三且最后一个子集包含不常见结构变化的类固醇和一个油菜素内酯(异-高油菜素内酯)(图11)。
基因开关系统是从10个不同EcR中(图12)的每一个构建的，并且采用双杂交形式：GAL4-DBD融合到EcR上游且VP16激活结构域融合到一个RXR-USP嵌合体的上游，分别采用pM和pVP16质粒将基因开关系统瞬转到小鼠NIH3T3细胞中。采用虫荧光素酶作为报告基因，用pFRLUC载体转入。从43个类固醇集获得剂量应答曲线。得到EC50值并且显示在图13(鳞翅目)和图14(非鳞翅目)中。第二类固醇基因开关EC50数据集，主要包含来自六个类固醇醚的子集的数据但也包含来自基本集中的几个天然类固醇的数据，也在3T3细胞系中的相同基因开关系统中记录。这些数据也包括使用VgEcR/RXR系统的测试结果，显示在图15和图16中
用三种方式测定功效。第一种方法为直接从光度计记录相对光单位(RLU)。第二种方法为测试配体浓度的RLU对背景RLU的比率，即诱导倍数(FI)。第三种方法为在任何浓度观察到的给定配体的最大FI对二酰基肼N-(2-乙基-3-甲氧基苄基)-N′-(3，5-二甲苯酰)-N′-叔丁基肼观察到的最大FI的比率。这些值输入到图13-16中作为RMFI(相对最大诱导倍数)。作为每个开关系统的基础表达的指标，背景RLU列在了每张表的最后一行。
PoA/NcEcR的组合显示出EC50＝0.3nM(RMFI＝1)。此外，PoA活化BmEcR显示出EC50＝0.11μM，RMFI＝0.98，二酰基肼参照FI＝1776，背景FI＝3。以及PoA活化E274V/V390I/Y410E突变的-CfEcR显示出EC50＝0.11μM，RMFI＝0.52，二酰基肼参照FI＝4393，背景FI＝2。然而，20E事实上没有表现出对CfEcR的应答。
类固醇功效/受体应答的概述在图17的叠加测线图中给出，它描述了所选类固醇对按系统发生排序的每种EcR类型的-log(EC50)。交叉表示交叉表明交叉对侧的两个配体-受体对之间的效力反转。例如，杯苋甾酮/E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR和四翅滨藜甾酮/BaEcR；以及杯苋甾酮/E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR和小龙骨素B/AaEcR。这两个系统的剂量应答曲线显示在图18和图19中。E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR/BaEcR对的-log(EC50)对-log(EC50)图显示在图20中。
所收集的筛选集代表了结构和化学差异，包括羟基化数量和位点的差异，饱和的线性C8侧链，顺-A/B-环连接和7-烯-6-酮发色团。植物类固醇四翅滨藜甾酮带有连接到C24的吡咯2-羧基。这个化合物对于果蝇BII细胞系有很高的生物学活力(EC50＝5.3×10-10M)。在这个生物测试中，所有测试的类固醇都表现出一些活力，EC50跨了约6个数量级(图14)。
一系列20E和PoA的甲基醚针对多个受体进行筛选(图15和16)。
PoA和20E都对非鳞翅目受体要比对鳞翅目更为有效。由于Y410E突变，鳞翅目E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR也具有一个蜕皮甾醇尾的修饰区域。这个突变以及V390I突变，使得E274V/V390I/Y410E突变-CfEcR更喜欢鳞翅目EcR。
PoA、米乐甾酮A、旌节花甾酮C和异旌节花甾酮C是相对于所测EcR集的活性类固醇(图13和14)。其都带有疏水性的尾。而杯苋甾酮有些选择性的针对鳞翅目EcR，四翅滨藜甾酮选择性的针对非鳞翅目。同样的，筋骨草甾酮C的活力在非鳞翅目物种中更高.除了对于BaEcR，四翅滨藜甾酮通常RMFI值较弱(AaEcR和AmaEcR)或没有。
六个半合成的类固醇醚配合所选的天然蜕皮甾醇在替代3T3成纤维细胞中进行测试(图15和16)。一般而言，可以有下列观察结果：E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR和20E3-氧-甲基醚，保留了甚至获得了功效。其它醚失去了功效，例如MsEcR和20E3-甲基醚，20E22-甲基醚和20E3，22-氧-二甲基醚。
类固醇效力和功效可以在工程化的EcR中与二酰基肼(N-(2-乙基-3-甲氧基苯基)-N′-(3，5-二甲苯酰)-N′-叔丁基肼)相当。例如，对个位数nM的AaEcR激活剂，PoA和二酰基肼都效力很高。然而，PoA对Nc、Aa和AmaEcR(0.3-2nM)最为有效，而二酰基肼对鳞翅目受体(3-20nM)更为有效。松甾酮对所有测试的EcR在低于μmol级有效，但二酰基肼对BaEcR(6uM)在μmol级有效。除了对AmaEcR、BaEcR，和TmEcR，二酰基肼要比PoA更为有效一些。在所研究的受体中，根据整体诱导倍数和背景，E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR和其他鳞翅目EcR作为基因开关系统是最为优化的，而AmaEcR和TmEc比较不优化。
多配体/受体相互作用。E274V/V390I/Y410E突变-CfEcR//BaEcR对是适度相关的(R2＝0.6，图4)。对应于-log(EC50)的叠加测线图(图17)，并且考虑相对功效(RMFI)，显示了杯苋甾酮(E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR＞BaEcR)以及四翅滨藜甾酮(BaEcR＞E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR)之间的效力反转。剂量应答曲线(图18)显示了正交性
杯苋甾酮/E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR//小龙骨素B/AaEcR二联体发生效力反转(图17)。E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR//AaEcR对也是适度相关的(R2＝0.6)。检测剂量应答曲线(图19)表明其EC50区间要比杯苋甾酮/E274V/V390I/Y410E突变的CfEcR//四翅滨藜甾酮/BaEcR系统窄。
基因开关应用配体诱导型基因表达系统可用于功能基因组、药物开发、生物治疗性蛋白生产、转基因植物和动物中特征性表达，系统和合成生物学、细胞工程和基因治疗。
至少2个类固醇配体已经显示出了可行性：PoA和米乐甾酮A。在非天然、非甾族化合物中，已经证明了酰胺酮和四氢喹啉化学型的效力。在二酰基肼家族配体中，一些配体可在亚纳摩尔级的浓度激活基于工程化EcR的开关。相反的，类固醇带有游离的羟基并且是易被代谢的。这些羟基中的几个可以被重新制成更为ADME合适的药效成分。
生物药物需要多重开关。在癌症中，同时控制几个有害基因的功能在疾病抑制中很重要。为了切合实际，多重开关必须是强力的并且在工程化参数允许的范围内尽可能简单。在基于EcR的开关中，已经报道了类固醇/二酰基肼和THQ/二酰基肼二倍体的基本组成(Kumar等.PNAS200299：14710-15；Kumar等.JBiolChem2004279：27211-18)。本发明公开的杯苋甾酮/四翅滨藜甾酮和杯苋甾酮/小龙骨素B系统代表了基于类固醇的正交基因开关。
本发明不限于本发明所述的特定实施方式的范围中。事实上，除了本发明所述之外，根据前面的描述和附图，本发明的各种修改对于本领域的熟练技术人员来说是显而易见的。这些修改也应落入所附权利要求的范围内。

Claims (17)

1.一种包含多个独立可操作重组基因开关的组合物，其特征在于，每个独立可操作重组基因开关包含：
一个包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一重组盒，所述第一多肽包含：
一个DNA结合结构域，识别与表达有待调控的目标基因操作性连接的反应元件；
一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域，一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的V390I/Y410E突变体，或是一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的E274V/V390I/Y410E突变体；
一个第二重组盒，包含：
一个能结合到所述DNA结合结构域上的反应元件；
一个由反式激活结构域活化的启动子；以及
一个目标基因；
其中，组合物包含多个配体，其中至少一个配体为：
20-羟基蜕皮甾酮-2-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-3-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-14-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-2,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-3,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-14,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22,25-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-2,3,14,22-四甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-正丙基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-正丁基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-烯丙基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-苄基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-(28R,S)-2’-乙基环氧乙基醚，松甾酮A-2-甲基醚，松甾酮A-14-甲基醚，松甾酮A-22-甲基醚，松甾酮A-2,22-二甲基醚，松甾酮A-3,22-二甲基醚，松甾酮A-14,22-二甲基醚，海南陆均松甾酮-22-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-25-甲基醚，或20-羟基蜕皮甾酮-22-乙基醚。
2.一种包含多个独立可操作重组基因开关的组合物，每个基因开关由一个不同的配体控制，其特征在于，每个独立可操作基因开关包含：
A)一个或多个基因表达盒，包含
一个编码第一多肽的第一多核苷酸，包含：
一个反式激活结构域；
一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域，一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的V390I/Y410E突变体，或是一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的E274V/V390I/Y410E突变体；
一个编码第二多肽的第二多核苷酸，包含：
一个DNA结合结构域，识别与表达有待调控的目标基因操作性连接的反应元件；
一个核受体配体结合结构域；
一个第三多核苷酸，包含：
一个能结合到所述DNA结合结构域上的反应元件；
一个操作性连接到反应元件上的启动子；以及
一个目标基因；
B)一个配体，其中配体为：
20-羟基蜕皮甾酮-2-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-3-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-14-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-2,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-3,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-14,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22,25-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-2,3,14,22-四甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-正丙基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-正丁基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-烯丙基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-苄基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-(28R,S)-2’-乙基环氧乙基醚，松甾酮A-2-甲基醚，松甾酮A-14-甲基醚，松甾酮A-22-甲基醚，松甾酮A-2,22-二甲基醚，松甾酮A-3,22-二甲基醚，松甾酮A-14,22-二甲基醚，海南陆均松甾酮-22-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-25-甲基醚，或20-羟基蜕皮甾酮-22-乙基醚。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含至少两个基因开关。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，每个基因开关是由同一个载体多核苷酸上存在的一个或多个核酸编码的。
5.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，每个基因开关形成一个异二聚体受体复合物。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，每个基因开关的所述异二聚体受体复合物具有一个共同的组分。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述共同组分包含RXR配体结合结构域或RXR/USP嵌合式配体结合结构域。
8.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，每个独立可操作基因开关控制一个不同的目标基因。
9.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，一个目标基因能杀伤细胞。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述能杀伤细胞的目标基因为毒素。
11.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，一个目标基因为治疗性目标基因。
12.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，一个目标基因为细胞因子。
13.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，一个或多个核受体配体结合结构域为H组核受体配体结合结构域。
14.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，一个或多个核受体配体结合结构域为USP配体结合结构域，RXR配体结合结构域，RXR同源配体结合结构域，或是RXR配体结合结构域的嵌合体。
15.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，一个或多个核受体配体结合结构域为H组核受体配体结合结构域；并且其中一个或多个核受体配体结合结构域为USP配体结合结构域，RXR配体结合结构域、RXR同源配体结合结构域，或是RXR配体结合结构域的嵌合体。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，H组核受体配体结合结构域来自蜕皮甾酮受体、突变的蜕皮甾酮受体、鳞翅目蜕皮甾酮受体、突变的鳞翅目蜕皮甾酮受体，云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体、云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体的V390I/Y410E突变体，云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体的E274V/V390I/Y410E突变体。
17.一种在分离的宿主细胞内调控目标基因表达的方法，其特征在于，分离的宿主细胞包括：
一个包含一个编码第一多肽的第一多核苷酸的第一重组盒，包含：
一个反式激活结构域；
一个H组核受体配体结合结构域；
一个包含一个编码第二多肽的第二多核苷酸的第二重组盒，包含：
一个DNA结合结构域，识别与表达有待调控的目标基因操作性连接到反应元件；
一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域，一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的V390I/Y410E突变体，或一个云杉卷叶蛾蜕皮甾酮受体配体结合结构域的E274V/V390I/Y410E突变体；
一个第三重组盒，包含：
一个能结合到所述DNA结合结构域上的反应元件；
一个操作性连接到反应元件上的启动子；以及
一个目标基因；
所述方法包含将所述分离的宿主细胞接触20-羟基蜕皮甾酮-2-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-3-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-14-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-2,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-3,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-14,22-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22,25-二甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-2,3,14,22-四甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-正丙基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-正丁基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-烯丙基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-苄基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-(28R,S)-2’-乙基环氧乙基醚，松甾酮A-2-甲基醚，松甾酮A-14-甲基醚，松甾酮A-22-甲基醚，松甾酮A-2,22-二甲基醚，松甾酮A-3,22-二甲基醚，松甾酮A-14,22-二甲基醚，海南陆均松甾酮-22-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-22-甲基醚，20-羟基蜕皮甾酮-25-甲基醚，或20-羟基蜕皮甾酮-22-乙基醚。
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