JPH07126298A - Ｇ蛋白活性抑制型受容体およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 １０１アミノ酸からなるモルモットのＧ蛋白
活性抑制型オピオイドκ受容体、およびその受容体をコ
ードするＤＮＡ。 【効果】 本発明のＧ蛋白活性抑制型オピオイドκ受容
体は、神経伝達物質の遊離調節に深く関わっていると考
えられ、そのため、今後の脳機能改善（賦活）剤や鎮痛
剤の研究開発のための知見を得る上で、重要な役割を果
たすことが期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、受容体およびその受容
体蛋白をコードするＤＮＡに関する。より詳細に述べる
と、本発明はＧ蛋白活性抑制型受容体、およびその受容
体蛋白をコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【発明の目的】生体内には、情報伝達のために多くの種
類の受容体が存在する。細胞膜上に存在する受容体は、
別の細胞からの情報を受け取り、自己の細胞内へ伝達す
る役割を果たすが、そのメディエーターとなる最も重要
な情報変換蛋白がＧＴＰ結合蛋白（Ｇ蛋白）である。

【０００３】これまでに見出されてきた受容体は、すべ
てこのＧ蛋白の活性を増強することにより、情報を細胞
内に伝達すると考えられているが、本発明者らは数多く
のＧ蛋白を介する情報伝達の解析を行なった結果、Ｇ蛋
白活性を抑制する受容体の存在を見出し、本発明を完成
した。

【０００４】本発明のＧ蛋白活性抑制型受容体の具体例
としては、後に挙げるモルモット小脳細胞膜上のオピオ
イドκ受容体があるが、ラット線条体などの細胞膜での
Ｌ−ＤＯＰＡ受容体においても同様の反応が認められて
おりオピオイドκ受容体のみならず、他にも同様にＧ蛋
白活性を抑制する受容体が存在することが示唆される。
Ｌ−ＤＯＰＡは、従来神経伝達物質の一つであるドーパ
ミンの前駆物質であるとされてきたが、最近この物質自
身が一つの神経伝達物質としての性質を有することが明
らかとなった。

【０００５】本発明者らは、今回初めて、これらの受容
体を含む細胞膜標品においてそれぞれの作働薬（アゴニ
スト）を用いた刺激により、Ｇ蛋白活性は従来のものと
は逆に、抑制されるという現象を見出したものである。

【０００６】生体内には、情報伝達のために多くの種類
の受容体が存在する。その中で、哺乳動物では２０種以
上あるといわれるオピオイドペプチドは、鎮痛、鎮咳の
作用の他、脳内の情報伝達に深く関わっていると考えら
れている。

【０００７】オピオイドペプチドが結合するオピオイド
受容体には、３種のサブタイプが存在し、μ、δ、κ受
容体として分類されている。これらの受容体のうち、μ
受容体は、鎮痛、呼吸抑制、多幸感等に関与し、δ受容
体は、ストレス抑制等に関与し、κ受容体は、骨髄レベ
ルでの鎮痛、神経伝達物質の遊離抑制の役割を持つとさ
れている。

【０００８】しかしながら、これらの異なる受容体を介
した薬理作用は、それぞれが異なるメカニズムによるも
のなのか、共通のメカニズムによるのかは、解明がまだ
なされておらず、これらの研究のためには、個々の受容
体を純粋に精製することが必要とされる。しかしなが
ら、生体内の受容体を抽出した場合には、どうしても完
全に精製しきれないとか、得られる量が少ないといった
問題点があった。

【０００９】一方、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス
技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを
迅速に行なうことができるようになった。また、特定の
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡから、適当な宿主を用いて相当する
蛋白を発現させることもできるようになっている。

【００１０】本発明者らは、これらの方法を用いて新規
な受容体を見出すことにした。すなわち、モルモット小
脳細胞からｍＲＮＡを単離し、これを出発材料としてｃ
ＤＮＡを得、スクリーニングすることにより、その中の
Ｇ蛋白活性を抑制するオピオイドκ受容体をコードする
ＤＮＡを見出し、その塩基配列を決定し、アミノ酸配列
を推定し、本発明を完成した。

【００１１】従来より、オピオイドκ受容体としては、
カリフォルニアＤＮＡＸ研究所、スタンフォード大学に
おいて見出されたヒト胎盤由来κ受容体（Proc. Natl.
Acad. Sci., 89, 4124, (1992)参照）やシカゴ大学にお
いて見出されたマウス脳κ受容体（Proc. Natl. Acad.
Sci., 90, 6736, (1993)参照）が、知られている。しか
しながら、今回見出されたものは、そのアミノ酸の数お
よび細胞膜貫通性（７回）において、これらとまったく
異なったものであった。

【００１２】また、本発明におけるＧ蛋白活性抑制型オ
ピオイドκ受容体は、卵母細胞で発現試験後、オピオイ
ドκ受容体作働剤によるＧ蛋白活性抑制に基づく電位応
答および選択的拮抗剤による遮断効果が検証されてい
る。

【００１３】オピオイド受容体も含め、Ｇ蛋白活性を増
強する受容体は数多く知られているが、Ｇ蛋白活性を抑
制する受容体は、本発明によって初めて見出されたもの
である。

【００１４】

【発明の構成】本発明の主題は、Ｇ蛋白活性抑制型受容
体およびそれをコードするＤＮＡに関する。すなわち、
（１） Ｇ蛋白活性抑制型受容体、（２） Ｇ蛋白活性
抑制型受容体をコードするＤＮＡ、（３） 配列番号１
で示されるアミノ酸配列を含むＧ蛋白活性抑制型オピオ
イドκ受容体、（４） 配列番号１で示されるアミノ酸
配列を含むＧ蛋白活性抑制型オピオイドκ受容体をコー
ドするＤＮＡ、（５） 配列番号２で示される塩基配列
を有するｃＤＮＡ、および（６） 配列番号３で示され
る塩基配列を有するｃＤＮＡ、に関するものである。

【００１５】本発明のＧ蛋白活性抑制型オピオイドκ受
容体としては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有
するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、前
記した成熟蛋白部分のみ、あるいは成熟蛋白中、生物活
性の発現に必須な部分だけから成るポリペプチド）、そ
の一部が他のアミノ酸に置換されたもの（例えば、物性
の類似するアミノ酸に置換したもの）、およびその一部
に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれ
る。

【００１６】よく知られているように、ひとつのアミノ
酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは
１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基
配列を変えることができる。

【００１７】（４）で特定される本発明のＤＮＡには、
（３）の配列番号１で示される受容体をコードするすべ
ての塩基配列群が含まれる。塩基配列は変えることによ
って、受容体の生産性が向上することがある。（５）で
特定されるｃＤＮＡは、（４）で示されるＤＮＡの一態
様であり、天然型配列を表わす。（６）に示されるｃＤ
ＮＡは、（５）で特定されるｃＤＮＡに天然の非翻訳部
分を加えた配列を示す。

【００１８】配列番号３で示される塩基配列を有するｃ
ＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれた。すな
わち、(i) 本発明のＧ蛋白活性抑制型オピオイドκ受
容体を産生する細胞、例えば、モルモット小脳細胞から
ｍＲＮＡを分離し、(ii) そのｍＲＮＡからファースト
ストランド（１本鎖ｃＤＮＡ）、次いでセカンドストラ
ンド（２本鎖ｃＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの合成）、
(iii) そのｃＤＮＡを適当なファージベクターに組み込
み、(iv) 得られた組み換えファージを宿主細胞に感染
させ（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、(v) ライブラ
リーをクローニングしたあと、得られたファージＤＮＡ
より、転写反応でｍＲＮＡを合成し、(vi) 得られたｍ
ＲＮＡより、アセチルコリン受容体ｍＲＮＡおよびＧ蛋
白ｍＲＮＡを共存させることで、受容体を卵母細胞で発
現させ、(vii) この卵母細胞の電気生理学的応答による
スクリーニングを繰り返し、シングルクローンを得た。
(viii)得られたシングルクローンを用いて、プラスミド
を作成し、ｃＤＮＡ断片を作成し、シークエンシングに
より、ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を決定し
た。

【００１９】これらの工程をより詳細に説明すると、工
程(i) では、マウス小脳をホモジネートし、超遠心分離
後、沈澱中よりＲＮＡを回収する。さらにその中からｐ
ｏｌｙＡを持つｍＲＮＡのみカラムにより精製する。カ
ラムには、オリゴｄＴセルロースカラム等が用いられ
る。

【００２０】工程(ii)、(iii) および(iv)は、ｃＤＮＡ
ライブラリー作製の工程であり、改変した Gubler ＆ H
offman法（Gene, 25, 263 (1983)参照）に準じて行なわ
れる。

【００２１】工程(iii) で用いられるプラスミドベクタ
ーとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３
２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１
０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機能
するλＺＡＰII（Stratagene社）が用いられる。

【００２２】工程(iv)で用いられる宿主細胞は既に多く
のものが知られており、いずれを用いてもよいが、好ま
しくはＤＨ５のコンピテントセル（Gene, 96, 23(1990)
記載の方法により調整される。）である。

【００２３】工程(v) のクローニングはｃＤＮＡの鋳型
を用いて、ポリメラーゼIIでｍＲＮＡを合成し、さらに
キャッピングを行なうことにより行なわれる。

【００２４】工程(vi)では、工程(v) で用いたｍＲＮＡ
と同様に合成したｍＡｃｈ受容体のｍＲＮＡ、Ｇ蛋白の
ｍＲＮＡをチューブ内で混合し、これを卵母細胞に微量
注入法で注入される。培養により、これらの蛋白が卵母
細胞に発現される。

【００２５】工程(vii) では、κアゴニストの存在下、
アセチルコリンにより誘起されるｍＡｃｈ受容体を介す
る電流を測定する。この時、κ受容体に相当するｍＲＮ
Ａが共存するとＧ蛋白を競合的に使用するため、アセチ
ルコリン誘発電流が減少することを指標としてスクリー
ニングを行なう。

【００２６】工程(viii)では、Stratageneのプロトコー
ルに従い、in vitro excision でファージベクターから
プラスミドを調製し、インサートのシーケンスを行な
う。またシークエンシングはマキサム・ギルバート（Ma
xam-Gilbert ）法やジデオキシ・ターミネーター法によ
り行なわれる。

【００２７】このようにして得られたＤＮＡは、（Ｉ）
ＤＮＡシークエンスを可能なフレームにおいてアミノ酸
配列に変換し、（II）そのＤＮＡが全長あるいはほぼ全
長であることを確認する必要がある。これらの確認は、
工程の(viii)の後に行なわれる。

【００２８】配列番号２および３で示される塩基配列
が、一旦確定されると、その後は化学合成によって、ま
たはＰＣＲ法によって、あるいはその塩基配列の断片を
プローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発
明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含
有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増
殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要
量得ることができる。

【００２９】本発明のオピオイドκ受容体を取得する方
法としては、（１）生体または培養細胞から精製単離す
る方法、（２）ペプチド合成する方法、または（３）遺
伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げら
れるが、工業的には（３）の方法が好ましい。

【００３０】遺伝子組み換え技術を用いて受容体を生産
するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例え
ば、細菌、酵母、昆虫細胞、両生類細胞および哺乳動物
細胞の発現系が挙げられる。

【００３１】例えば、大腸菌で発現させる場合には、成
熟蛋白部分をコードするＤＮＡの５′末端に開始コドン
（ＡＴＧ）を付加し、得られたＤＮＡを、適当なプロモ
ーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモー
ター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下
流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、λ
ＺＡＰII、ｐＢＲ３２２、pBluescript II、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９等）に挿入して、発現ベクターを作製す
る。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例
えば、E.ColiＸＬ−Ｂｌｕｅ、E.Coliｓｕｒｅ、E.Coli
ＤＨ１、E.ColiＪＭ１０９、E.ColiＨＢ１０１株等）を
適当な培地で培養して、その菌体に目的とする受容体を
発現させることができる。

【００３２】また、バクテリアのシグナルペプチド（例
えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペ
リプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌すること
もできる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン
・プロテイン（fusion protein）を生産することもでき
る。

【００３３】両生類細胞（例えば、卵母細胞等）で発現
させる場合には、例えば、配列番号３で示される塩基配
列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、λＺ
ＡＰII、ｐＳＰ６４（ｐｏｌｙＡ）、ｐｃＤＮＡＩ、λ
ＧＥＭ、λＳＨｌｏｘ、λＥＸｌｏｘ等）に挿入し、発
現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質
転換した大腸菌（例えば、E.ColiＸＬ−Ｂｌｕｅ、E.Co
liｓｕｒｅ、E.ColiＤＨ１、E.ColiＪＭ１０９、E.Coli
ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体よ
りＤＮＡを回収精製し、適当な制限酵素（例えば、Ｎｏ
ｔＩ等）で消化し、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７
ＴＲＮＡポリメラーゼ等）による転写により、ｍＲＮＡ
を得る。得られたｍＲＮＡを細胞に微量注入し、培養す
ることによりその細胞に発現させることができる。

【００３４】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードす
るＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベ
クター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイ
ルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロ
モーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロ
モーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に
挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現
ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−
７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ
細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養
することによって、その細胞に発現させることができ
る。

【００３５】以上のようにして得られた受容体は、一般
的な生化学的方法によって単離精製し、抗原やプローブ
として用いることもできるし、また発現させた細胞その
まま、または細胞膜を用いて、特定の物質との結合を試
験することもできる。

【００３６】形質転換または、微量注入時に、相当する
Ｇ蛋白をコードするｍＲＮＡを同時に細胞内に組み込む
こともできる。この場合には、受容体と特定の物質の結
合の様子を電位の測定をおこなうことにより、受容体の
アゴニスト、アンタゴニストにかかる知見を得ることが
できる。

【００３７】

【発明の効果】本発明のＧ蛋白活性抑制型受容体は、神
経伝達物質の遊離調節に深く関わっていると考えられ、
そのため、今後の脳機能改善（賦活）剤や鎮痛剤の研究
開発のための知見を得る上で、重要な役割を果たすこと
が期待される。

【００３８】また、その受容体のポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を用いて、生体におけるその受
容体の定量が行なえ、これによってその受容体と疾患と
の関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することがで
きる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は
その受容体あるいはその断片を抗原として用いて常法に
より作製することができる。

【００３９】本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待さ
れる本発明のＧ蛋白活性抑制型受容体を生産する際の重
要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治
療（遺伝子欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（Ｒ
ＮＡ）によって、Ｇ蛋白活性抑制型受容体の発現を停止
させることによる治療等）に利用できる。また、本発明
のＤＮＡをプローブとしてジェノミック(genomic) ＤＮ
Ａを分離できる。

【００４０】オピオイドκ受容体は、ヒトにおいても存
在することが知られており、多くの例が示すように、神
経系の受容体は、種を越えて相同性が高く、クロススク
リーニングすることが可能である。

【００４１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００４２】実施例１：モルモット小脳のｍＲＮＡの分
離、精製 雄性モルモット（体重１５０〜２００ｇ）１６匹を無麻
酔下で断首し、迅速に小脳のみを切り出した。４ＭＧＴ
Ｃ溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート、１％２−メル
カプトエタノール）中に懸濁した。次にこの懸濁液をセ
シウムクロライド／ＥＤＴＡ溶液の上に注意深く重層
し、超遠心分離（120,000 ×ｇ、２４時間）を行なっ
た。沈澱の全ＲＮＡ（ 1.5ｍｇ）を回収し、オリゴｄＴ
セルロースカラムに３回通して、ｐｏｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡ
（５８μｇ）を精製した。

【００４３】実施例２：アフリカツメガエル卵母細胞へ
の注入 代謝性グルタミン酸受容体ｃＤＮＡ ラットｍＧＲ１
（Nature, 349, 760 (1991) 参照）、ムスカリン性アセ
チルコリン受容体ブタＭ２型ｃＤＮＡ ＨＭ４５（Natu
re, 327, 623 (1987) 参照）、ラットＧ蛋白サブユニッ
トｃＤＮＡ Ｇｉｌ（Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 37
76 (1986) 参照）より in vitro 転写でそれぞれｍＲＮ
Ａを作成した。コラゲナーゼ処理により、細胞膜を除去
したアフリカツメガエル卵母細胞に、実施例１で精製し
たｐｏｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡおよび上記で作成したｍＲＮＡ
を、以下の組合せで注入した。

【００４４】（ａ）ｐｏｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡ（５０〜１０
０ｎｇ）＋ｍＧＲ１（１〜５ｎｇ) （ｂ）ｐｏｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡ（５０〜１００ｎｇ）＋ｍ
ＧＲ１（１〜５ｎｇ）＋Ｇｉｌ（５０ｎｇ） （ｃ）ｐｏｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡ（５０〜１００ｎｇ）＋Ｈ
Ｍ４５（５〜１５ｎｇ） （ｄ）ｐｏｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡ（５０〜１００ｎｇ）＋Ｈ
Ｍ４５（５〜１５ｎｇ）＋Ｇｉｌ（５０ｎｇ）

【００４５】実施例３：Ｇ蛋白活性抑制型オピオイドκ
受容体の発現 ｍＲＮＡ注入後、２〜５日目に卵母細胞を０〜５０ｍＶ
に電位固定し、選択的なκアゴニストであるＵ−５０４
８８Ｈ（アップジョン社、特開昭53-63351号記載の化合
物）の存在下、グルタミン酸（Ｇｌｕ）または、アセチ
ルコリン（ＡＣｈ）誘発電流の変化を測定した。Ｕ−５
０４８８Ｈ（１μＭ）は、実施例２の（ａ）の組合せに
おける受容体の発現において、Ｇｌｕ誘発電流を完全に
抑制した（図１に示す）。また、同じく、Ｕ−５０４８
８Ｈは、実施例２の（ｄ）の組合せにおける受容体の発
現において、ＡＣｈ誘発電流を、５０％抑制した（図２
に示す）。これにより、以下に述べるｃＤＮＡライブラ
リー作成のスクリーニング法として、本方法が妥当であ
ることが確認された。

【００４６】実施例４：モルモット小脳ｃＤＮＡライブ
ラリーの作成 実施例１で調製したｐｏｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡ（５μｇ）か
ら、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により、
ｃＤＮＡ（ファーストストランド）を合成した。続い
て、常法によりセカンドストランドを合成した。さらに
常法により、ＥｃｏＲＩで消化したファージベクターλ
ＺＡＰIIに組み込み、さらに in vitro のパッケージン
グを行なった。得られたｃＤＮＡライブラリーの一部を
とり、宿主大腸菌ｓｕｒｅに感染させ、ファージ力価を
測定した。その結果、プライマリープラーク（ 1.2×１
０⁵ ｐｆｕ）のｃＤＮＡライブラリーを得た。ｃＮＤＡ
の合成には、タイムセーバーｃＤＮＡ合成キット（ Pha
rmacia社）を用いた。ＥｃｏＲＩアダプターおよびファ
ージλＺＡＰIIは、Stratagene社のものを用いた。

【００４７】実施例５：Ｇ蛋白活性抑制型オピオイドκ
受容体の発現およびスクリーニング （１） 一晩培養した宿主大腸菌ＸＬ−Ｂｌｕｅに、実
施例４で調製したファージ６×１０⁵ ｐｆｕを感染さ
せ、２２枚のＮＺＹプレートに蒔き、一晩培養した。１
プレート当り平均３×１０⁴ 個のプラークが形成され
た。このプレートにＳＭ溶液（ＮａＣｌ １００ｍＭ，
ＭｇＳＯ₄ ８ｍＭ，tris−ＨＣｌ ５０ｍＭおよびゼ
ラチン0.01％）を加え、室温下、２時間振とうし、ライ
セートを回収し、それぞれのサンプルにｆｒ１から２２
の番号を付した。ライセートの一部（ 0.5ｍｌ）をと
り、これにクロロホルム（２０μｌ）を加え、４℃にて
保存した。残りにポリエチレングリコールを加えて、フ
ァージＤＮＡを沈澱させ、GENECLEAN II（ＢＩＯ １０
１社）を用いて精製し、１０⁴ 個のプラークから平均１
μｇの精製ファージＤＮＡを得た。

【００４８】（２） （１）で精製したファージＤＮＡ
をＮｏｔ Ｉで消化し、Ｔ７ＴＲＮＡポリメラーゼを用
いた in vitro の転写反応を行ない、ｍＲＮＡを合成し
た。この反応には、Stratagene社のｍＣＡＰｍＲＮＡ
ＣＡＰＰＩＮＧ ＫＩＴを用いた。

【００４９】（３） ｆｒ１から２２由来のｍＲＮＡ
（それぞれ５０ｎｇ）を用いて、実施例２で実施した組
合せと同じ組合せ（（ａ）から（ｄ）））でそれぞれア
フリカツメガエル卵母細胞に注入した。さらに、この卵
母細胞を実施例３と同様の操作を行ない、電気生理学的
応答を検討した。その結果、ｆｒ１０にのみ、ポジティ
ブな応答がみられ、他のフラクションは、ネガティブで
あった（図３に示す）。これよりｆｒ１０を陽性と決定
した。

【００５０】（４） ｆｒ１０のプレートライセートの
一部を宿主（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）に感染させ、１プレー
ト当り、１０⁴ プラークとなるように計５枚のＮＺＹプ
レートに蒔き、先の（１）および（２）と同様の操作に
より、ファージＤＮＡを調製し、Ｃａｐｐｅｄ ｍＲＮ
Ａを作成した。それぞれのサンプルには、ｆｒ１０−１
から１０−５までの番号を付した。これらのｍＲＮＡ
（５０ｎｇ）をアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、
解析した結果ｆｒ１０−１がポジティブであることが判
明した。

【００５１】（５） ｆｒ１０−１のライセートを2000
プラーク／プレートの密度で計８枚のＮＺＹプレートに
蒔いた。宿主大腸菌には以後、ｓｕｒｅ（Stratagene
社）を用いた。ＳＭ溶液にてそれぞれのプレートライセ
ートを作成し、ｓｕｒｅに再感染させて、１０⁴ プラー
ク／プレートに増幅し、ファージｃＤＮＡの精製および
ｍＲＮＡの合成を行なった。得られたｍＲＮＡをアフリ
カツメガエル卵母細胞に注入し、各サンプルにｆｒ１０
１−１から１０１−８の番号を付した。卵母細胞による
スクリーニングにおいて、ｆｒ１０１−４を陽性と決定
した。

【００５２】（６） ｆｒ１０１−４のライセートを平
均４００プラーク／プレートの密度で計８枚のプレート
に蒔き、（５）と同様の操作によりそれぞれ１０⁴ プラ
ーク／プレートに増幅し、ファージｃＤＮＡの精製およ
びｍＲＮＡの合成を行なった。各サンプルには、それぞ
れ１０１４−１から１０１４−８の番号を付した。解析
の結果、ｆｒ１０１４−４が陽性であった。

【００５３】（７） ｆｒ１０１４−４のプレートライ
セートを用いて、ファージ力価を測定したところ、２０
０ｐｆｕ／μｌであった。このライセートを用いて、平
均４０プラーク／プレートで８枚のプレートを作成し、
増幅後、卵母細胞にてスクリーニングを行なった。各サ
ンプルにはｆｒ１０１４４−１から１０１４４−８の番
号を付した。このうち、ｆｒ１０１４４−４がＵ−５０
４８８Ｈに対し、応答を示した。このｆｒ１０１４４−
４のファージ力価は２０ｐｆｕ／μｌであった。

【００５４】（８） ｆｒ１０１４４−４のライセート
を宿主大腸菌（ｓｕｒｅ）に感染させ、３０プラーク／
プレートの密度になるようにＮＺＹプレートに蒔いた。
その結果３１個の独立したプラークが形成されたので、
個々のプラークを減菌ガラス管でピックアップし、ＳＭ
溶液中に懸濁した。それぞれのシングルクローンに対
し、ｆｒ１０１４４−１から１０１４４−３１までの番
号を付し、増幅後、ｍＲＮＡの合成を行なった。合成さ
れたそれぞれのｍＲＮＡが、それぞれ単独であることを
電気泳動にて確認した後、卵母細胞に注入した。クロー
ン１０１４４４−１７がＵ−５０４４８Ｈ感受性である
ことが分かった。ＮｏｒＢＮＩ（norbinaltorphimine;
ミネソタ大学、WO-8706935号明細書記載の化合物）によ
る拮抗作用も確認した（図４に示す）。このクローンを
ＧＰＫＯＰＲ１と命名した。

【００５５】実施例６：遺伝子配列の決定 Stratagene社のＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットマニュアル
に従い、クローンＧＰＫＯＰＲ１から in vivo excisio
n を行ない、プラスミドｐＧＰＫＯＰＲ１を作成した。
常法により、タカラ社の Kilo-Sequence Deletion Kit
を用いてｃＤＮＡ断片を作成した（図５に示す）。

【００５６】ｃＤＮＡ配列は、三重の方法、すなわち、
アプライド社の Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequ
encing Kitにより反応させ、Applied Biosystems 373A
DNASequencer にて蛍光検出する方法、Taq Dye Primer
Cycle Sequence Kit により反応させ、 Applied Biosys
tems 373A DNA Sequencerにて蛍光検出する方法およびT
OYOBO社の Sequenaseキットを用いて、ジデオキシ法で
³²Ｐ放射活性を検出する方法により決定した。配列番号
１は、本発明モルモットのオピオイドκ受容体の推定ア
ミノ酸配列を示す。配列番号２は、本発明モルモットの
オピオイドκ受容体のｃＤＮＡ配列を示す。配列番号３
は、本発明モルモットのオピオイドκ受容体のｃＤＮＡ
配列を含むｃＤＮＡ配列の全長を示す。配列番号４は、
ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１０１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Pro Leu Pro Pro Pro Pro Leu Pro Arg Ser Ser Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ser Arg Ser Arg Arg Ala Arg Ser Arg Leu Arg Leu Leu Arg Arg Phe 20 25 30 Arg Ser Arg Ser Leu Ser Leu Leu Arg Ser Leu Asp Arg Arg Arg Ser 35 40 45 Ser Leu Ser Arg Leu Arg Glu Arg Leu Arg Arg Ser Arg Glu Arg Glu 50 55 60 Arg Arg Arg Ser Arg Ser Leu Ser Leu Ser Arg Leu Arg Ser Leu Arg 65 70 75 80 Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Leu Cys Gly Ser Gly Glu Gly 85 90 95 Pro Gly Leu Ser Ser 100

【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：３０３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCACCAC TACCACCACC TCCACTACCA CGAAGCTCCT CCTTGCGTTC CCGCTCCCGT 60 CGTGCCCGTT CCCGGCTTCG ACTGCTTCGA CGCTTCCGGT CTCGGTCCTT GTCCTTGCTC 120 CGCTCCCTGG ACCGACGCCG CTCATCCTTG TCACGACTCC GTGAGCGCCT CCGCCGGTCC 180 CGAGAGCGGG AGCGTCGCCG TTCCCGCTCC TTGTCTCTCT CCCGACTCCG CTCTCTACGC 240 TCCCGCTCTC GGTCCCGGTC CCGGTCCCTG TGCGGAAGCG GGGAGGGGCC AGGCCTCTCA 300 TCA 303

【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：１２３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CGGCACGAGG AAATTAATTT AATTCTTAAA TCCAAGGGCC CGAACAAAGG AACTCCTACC 60 CTCAGAGGGC AAACTGAGGT GGCCAGGAAG GTTAGGGAGA GGACGACAGT GAGGGCTGGC 120 TGGGATCTCG TCCGAATAGA GCAGCTAGGA AGACCTCCTC ACTCAGGTGC TGCCTCCATG 180 AGATACCCGT TCTCCGGAGC CATGTATCCG TCGCCGCCCT CAGACTCTAT GTACATGTCT 240 CGGCTGTCAT CATGTATCCG TCGCCGCCCT CAGACTCTAT GTACATGTCT CGGCTGTCAT 300 TGCCCAGACC TTCCAGCCCG TTGTCCTGGC CACCCCCGCC CCCGCCGCGG ATCACGGTCC 360 CGGTCCCGGT CCCGGCGTCG CTCGCGCTCG CTCCTGTGAC TCCGACGTCG TTCCCGGTCA 420 CGATCCCGGC CCTTCTCCTC CGGGCCATCA GGGCCATCAG GACCAAGCTC CCCAGGAGGC 480 CCATCATCAG GAGGTGCATC ACCAGGCTCA GAGGGCTCGG CCATGTCACC ACTACCACCA 540 CCTCCACTAC CACGAAGCTC CTCCTTGCGT TCCCGCTCCC GTCGTGCCCG TTCCCGGCTT 600 CGACTGCTTC GACGCTTCCG GTCTCGGTCC TTGTCCTTGC TCCGCTCCCT GGACCGACGC 660 CGCTCATCCT TGTCACGACT CCGTGAGCGC CTCCGCCGGT CCCGAGAGCG GGAGCGTCGC 720 CGTTCCCGCT CCTTGTCTCT CTCCCGACTC CGCTCTCTAC GCTCCCGCTC TCGGTCCCGG 780 TCCCGGTCCC TGTGCGGAAG CGGGGAGGGG CCAGGCCTCT CATCATAGCG GGATGTATCA 840 TCACGGCCTG AATGCCGGAT GTTCACATCA GCCCCACCTC TTCTGGTACC ACCAAGGCCA 900 CCTCCCAGCC GCCGAGGCCT CCAGCCCTTC ACGGTCCGGC CCCTTTCCAC ATCCACGAGG 960 ACTCTTCTGC CATCAATCTT CTTGCCATCT GCGTGTTTGT AAGCGGCTGC AACAGATGTG 1020 GGGAGGGGGA AGGGGAAGGA GTCCCCACAG GGTCCTCTAG TCAAGATAGA ACCCCACACT 1080 GCAGCATCCC CATTCCCCAG ACTATCATGG CACGAGCACT CGCACACGCA CGCCCACACC 1140 ACCAGCCAGG CACCTGCCAG CCAGACCGAC CCTCTCCCAA CCCAGGGAGG GGCCTGCTCC 1200 ATCTCAGTGC CTGCTCCTTT CCTCGTGCCG 1230

【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：１２３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名 ： Guinea Pig 組織の種類：cerebellum 配列の特徴 特徴を表わす記号 ： CDS 存在位置 ： 523..825 特徴を決定した方法 ： E 配列 CGGCACGAGG AAATTAATTT AATTCTTAAA TCCAAGGGCC CGAACAAAGG AACTCCTACC 60 CTCAGAGGGC AAACTGAGGT GGCCAGGAAG GTTAGGGAGA GGACGACAGT GAGGGCTGGC 120 TGGGATCTCG TCCGAATAGA GCAGCTAGGA AGACCTCCTC ACTCAGGTGC TGCCTCCATG 180 AGATACCCGT TCTCCGGAGC CATGTATCCG TCGCCGCCCT CAGACTCTAT GTACATGTCT 240 CGGCTGTCAT CATGTATCCG TCGCCGCCCT CAGACTCTAT GTACATGTCT CGGCTGTCAT 300 TGCCCAGACC TTCCAGCCCG TTGTCCTGGC CACCCCCGCC CCCGCCGCGG ATCACGGTCC 360 CGGTCCCGGT CCCGGCGTCG CTCGCGCTCG CTCCTGTGAC TCCGACGTCG TTCCCGGTCA 420 CGATCCCGGC CCTTCTCCTC CGGGCCATCA GGGCCATCAG GACCAAGCTC CCCAGGAGGC 480 CCATCATCAG GAGGTGCATC ACCAGGCTCA GAGGGCTCGG CC ATG TCA CCA CTA 534 Met Ser Pro Leu 1 CCA CCA CCT CCA CTA CCA CGA AGC TCC TCC TTG CGT TCC CGC TCC CGT 582 Pro Pro Pro Pro Leu Pro Arg Ser Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ser Arg 5 10 15 20 CGT GCC CGT TCC CGG CTT CGA CTG CTT CGA CGC TTC CGG TCT CGG TCC 630 Arg Ala Arg Ser Arg Leu Arg Leu Leu Arg Arg Phe Arg Ser Arg Ser 25 30 35 TTG TCC TTG CTC CGC TCC CTG GAC CGA CGC CGC TCA TCC TTG TCA CGA 678 Leu Ser Leu Leu Arg Ser Leu Asp Arg Arg Arg Ser Ser Leu Ser Arg 40 45 50 CTC CGT GAG CGC CTC CGC CGG TCC CGA GAG CGG GAG CGT CGC CGT TCC 726 Leu Arg Glu Arg Leu Arg Arg Ser Arg Glu Arg Glu Arg Arg Arg Ser 55 60 65 CGC TCC TTG TCT CTC TCC CGA CTC CGC TCT CTA CGC TCC CGC TCT CGG 774 Arg Ser Leu Ser Leu Ser Arg Leu Arg Ser Leu Arg Ser Arg Ser Arg 70 75 80 TCC CGG TCC CGG TCC CTG TGC GGA AGC GGG GAG GGG CCA GGC CTC TCA 822 Ser Arg Ser Arg Ser Leu Cys Gly Ser Gly Glu Gly Pro Gly Leu Ser 85 90 95 100 TCA TAGCGG GATGTATCAT CACGGCCTGA ATGCCGGATG TTCACATCAG CCCCACCTCT 881 Ser TCTGGTACCA CCAAGGCCAC CTCCCAGCCG CCGAGGCCTC CAGCCCTTCA CGGTCCGGCC 941 CCTTTCCACA TCCACGAGGA CTCTTCTGCC ATCAATCTTC TTGCCATCTG CGTGTTTGTA 1001 AGCGGCTGCA ACAGATGTGG GGAGGGGGAA GGGGAAGGAG TCCCCACAGG GTCCTCTAGT 1061 CAAGATAGAA CCCCACACTG CAGCATCCCC ATTCCCCAGA CTATCATGGC ACGAGCACTC 1121 GCACACGCAC GCCCACACCA CCAGCCAGGC ACCTGCCAGC CAGACCGACC CTCTCCCAAC 1181 CCAGGGAGGG GCCTGCTCCA TCTCAGTGCC TGCTCCTTTC CTCGTGCCG 1230

【図面の簡単な説明】

【図１】 −５０ｍＶ電位固定下におけるＧｌｕ誘発電
流に対する作用を示す。

【図２】 ０ｍＶ電位固定下におけるＡｃｈ誘発電流に
対する作用を示す。

【図３】 −５０ｍＶ電位固定下におけるｆｒ１０のＡ
ｃｈ誘発電流に対する作用を示す。

【図４】 ０ｍＶ電位固定下におけるｆｒ１０１４４４
−１７のＡｃｈ誘発電流に対する作用を示す。

【図５】 ｐＧＰＫＯＰＲ１の deletion マップを示
す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年８月１１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：１２３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CGGCACGAGG AAATTAATTT AATTCTTAAA TCCAAGGGCC CGAACAAAGG AACTCCTACC 60 CTCAGAGGGC AAACTGAGGT GGCCAGGAAG GTTAGGGAGA GGACGACAGT GAGGGCTGGC 120 TGGGATCTCG TCCGAATAGA GCAGCTAGGA AGACCTCCTC ACTCAGGTGC TGCCTCCATG 180 AGATACCCGT TCTCCGGAGC CATGTATCCG TCGCCGCCCT CAGACTCTAT GTACATGTCT 240 CGGCTGTCAT TGCCCAGACC TTCCAGCCCG TTGTCCTGGC CACCCCCGCC CCCGCCGCGG 300GCCTCATCCC TGCCTCGCTC ACCACCCCGT TCCCCCCGCT TGTGCTCTC G ATCACGGTCC 360 CGGTCCCGGT CCCGGCGTCG CTCGCGCTCG CTCCTGTGAC TCCGACGTCG TTCCCGGTCA 420 CGATCCCGGC CCTTCTCCTC CGGGCCATCA GGGCCATCAG GACCAAGCTC CCCAGGAGGC 480 CCATCATCAG GAGGTGCATC ACCAGGCTCA GAGGGCTCGG CCATGTCACC ACTACCACCA 540 CCTCCACTAC CACGAAGCTC CTCCTTGCGT TCCCGCTCCC GTCGTGCCCG TTCCCGGCTT 600 CGACTGCTTC GACGCTTCCG GTCTCGGTCC TTGTCCTTGC TCCGCTCCCT GGACCGACGC 660 CGCTCATCCT TGTCACGACT CCGTGAGCGC CTCCGCCGGT CCCGAGAGCG GGAGCGTCGC 720 CGTTCCCGCT CCTTGTCTCT CTCCCGACTC CGCTCTCTAC GCTCCCGCTC TCGGTCCCGG 780 TCCCGGTCCC TGTGCGGAAG CGGGGAGGGG CCAGGCCTCT CATCATAGCG GGATGTATCA 840 TCACGGCCTG AATGCCGGAT GTTCACATCA GCCCCACCTC TTCTGGTACC ACCAAGGCCA 900 CCTCCCAGCC GCCGAGGCCT CCAGCCCTTC ACGGTCCGGC CCCTTTCCAC ATCCACGAGG 960 ACTCTTCTGC CATCAATCTT CTTGCCATCT GCGTGTTTGT AAGCGGCTGC AACAGATGTG 1020 GGGAGGGGGA AGGGGAAGGA GTCCCCACAG GGTCCTCTAG TCAAGATAGA ACCCCACACT 1080 GCAGCATCCC CATTCCCCAG ACTATCATGG CACGAGCACT CGCACACGCA CGCCCACACC 1140 ACCAGCCAGG CACCTGCCAG CCAGACCGAC CCTCTCCCAA CCCAGGGAGG GGCCTGCTCC 1200 ATCTCAGTGC CTGCTCCTTT CCTCGTGCCG 1230

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：１２３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名 ： Guinea Pig 組織の種類：cerebellum 配列の特徴 特徴を表わす記号 ： CDS 存在位置 ： 523..825 特徴を決定した方法 ： E 配列 CGGCACGAGG AAATTAATTT AATTCTTAAA TCCAAGGGCC CGAACAAAGG AACTCCTACC 60 CTCAGAGGGC AAACTGAGGT GGCCAGGAAG GTTAGGGAGA GGACGACAGT GAGGGCTGGC 120 TGGGATCTCG TCCGAATAGA GCAGCTAGGA AGACCTCCTC ACTCAGGTGC TGCCTCCATG 180 AGATACCCGT TCTCCGGAGC CATGTATCCG TCGCCGCCCT CAGACTCTAT GTACATGTCT 240 CGGCTGTCAT TGCCCAGACC TTCCAGCCCG TTGTCCTGGC CACCCCCGCC CCCGCCGCGG 300GCCTCATCCC TGCCTCGCTC ACCACCCCGT TCCCCCCGCT TGTGCTCTC G ATCACGGTCC 360 CGGTCCCGGT CCCGGCGTCG CTCGCGCTCG CTCCTGTGAC TCCGACGTCG TTCCCGGTCA 420 CGATCCCGGC CCTTCTCCTC CGGGCCATCA GGGCCATCAG GACCAAGCTC CCCAGGAGGC 480 CCATCATCAG GAGGTGCATC ACCAGGCTCA GAGGGCTCGG CC ATG TCA CCA CTA 534 Met Ser Pro Leu 1 CCA CCA CCT CCA CTA CCA CGA AGC TCC TCC TTG CGT TCC CGC TCC CGT 582 Pro Pro Pro Pro Leu Pro Arg Ser Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ser Arg 5 10 15 20 CGT GCC CGT TCC CGG CTT CGA CTG CTT CGA CGC TTC CGG TCT CGG TCC 630 Arg Ala Arg Ser Arg Leu Arg Leu Leu Arg Arg Phe Arg Ser Arg Ser 25 30 35 TTG TCC TTG CTC CGC TCC CTG GAC CGA CGC CGC TCA TCC TTG TCA CGA 678 Leu Ser Leu Leu Arg Ser Leu Asp Arg Arg Arg Ser Ser Leu Ser Arg 40 45 50 CTC CGT GAG CGC CTC CGC CGG TCC CGA GAG CGG GAG CGT CGC CGT TCC 726 Leu Arg Glu Arg Leu Arg Arg Ser Arg Glu Arg Glu Arg Arg Arg Ser 55 60 65 CGC TCC TTG TCT CTC TCC CGA CTC CGC TCT CTA CGC TCC CGC TCT CGG 774 Arg Ser Leu Ser Leu Ser Arg Leu Arg Ser Leu Arg Ser Arg Ser Arg 70 75 80 TCC CGG TCC CGG TCC CTG TGC GGA AGC GGG GAG GGG CCA GGC CTC TCA 822 Ser Arg Ser Arg Ser Leu Cys Gly Ser Gly Glu Gly Pro Gly Leu Ser 85 90 95 100 TCA TAGCGG GATGTATCAT CACGGCCTGA ATGCCGGATG TTCACATCAG CCCCACCTCT 881 Ser TCTGGTACCA CCAAGGCCAC CTCCCAGCCG CCGAGGCCTC CAGCCCTTCA CGGTCCGGCC 941 CCTTTCCACA TCCACGAGGA CTCTTCTGCC ATCAATCTTC TTGCCATCTG CGTGTTTGTA 1001 AGCGGCTGCA ACAGATGTGG GGAGGGGGAA GGGGAAGGAG TCCCCACAGG GTCCTCTAGT 1061 CAAGATAGAA CCCCACACTG CAGCATCCCC ATTCCCCAGA CTATCATGGC ACGAGCACTC 1121 GCACACGCAC GCCCACACCA CCAGCCAGGC ACCTGCCAGC CAGACCGACC CTCTCCCAAC 1181 CCAGGGAGGG GCCTGCTCCA TCTCAGTGCC TGCTCCTTTC CTCGTGCCG 1230

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｇ蛋白活性抑制型受容体。
2. 【請求項２】 Ｇ蛋白活性抑制型受容体をコードするＤ
   ＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号１で示されるアミノ酸配列を含
   むＧ蛋白活性抑制型オピオイドκ受容体。
4. 【請求項４】 配列番号１で示されるアミノ酸配列を含
   むＧ蛋白活性抑制型オピオイドκ受容体をコードするＤ
   ＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   ｃＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号３で示される塩基配列を有する
   ｃＤＮＡ。