JP4621497B2 - エクジソンレセプター複合体を介した外来遺伝子の発現を制御するためのテトラヒドロキノリン - Google Patents
エクジソンレセプター複合体を介した外来遺伝子の発現を制御するためのテトラヒドロキノリン Download PDFInfo
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Description
(式中、QはOまたはSであり、
R1は二置換または三置換フェニルであり、2つの隣接するフェニル置換基が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、および(C1〜C6)アルキルスルホニルからなる群から選択され、その結果これらの隣接する基が結合して5または6員環の複素環を形成し、第3の置換基が、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、シクロ(C3〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、ハロ(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、メルカプト、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C6)スルホノニルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)ハロアルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、カルボキシ、および(C1〜C6)アルコキシカルボニルからなる群から選択され、但し、R1は4−、5−、6−、および7−ベンゾフラニル、4−、5−、6−、および7−ベンゾチオフェニル、2,3−ジヒドロ−ベンゾ[1,4]ジオキシン−6−イル、またはベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イルではなく、
R2およびR3はそれぞれ独立して、水素、(C1〜C6)アルキル、および(C1〜C6)ハロアルキルからなる群から選択され、
R4は、水素、(C1〜C6)アルキル、および(C1〜C6)ハロアルキルからなる群から選択され、
R5およびR6はそれぞれ独立して、以下から選択される:
1)水素、(C1〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C1〜C12)ハロアルキル、(C2〜C12)アルケニル、(C3〜C12)シクロアルケニル、(C2〜C12)ハロアルケニル、(C2〜C12)アルキニル、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ(C1〜C6)アルキル、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、シクロ(C3〜C6)アルキルカルボニル、ハロ(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルカルボニル、もしくはフェニル(C2〜C3)アルケニルカルボニル、または
2)置換または非置換の、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、フェニルカルボニル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、ベンゾフラニル、チオフェニル、チオフェニルカルボニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチオフェニルカルボニル、イソキサゾリル、イミダゾリル、または他のヘテロ環式基(置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、シクロ(C3〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、ハロ(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、メルカプト、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)ハロアルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、カルボキシ、または(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択され、隣接する位置が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、または(C1〜C6)アルキルスルホニル基で置換される場合、これらの基が結合して、5または6員環の複素環を形成することができる)、但し、
(a)R5およびR6の1つが、独立して、以下から選択される:
(i)水素、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、シクロ(C3〜C6)アルキルカルボニル、ハロ(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルカルボニル、またはフェニル(C2〜C3)アルケニルカルボニル、または
(ii)置換または非置換の、フェニルカルボニル、チオフェニルカルボニル、およびベンゾチオフェニルカルボニル(置換基は独立して、シアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、シクロ(C3〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、ハロ(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、メルカプト、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)ハロアルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、カルボキシ、または(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択され、隣接する位置が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、または(C1〜C6)アルキルスルホニル基で置換される場合、これらの基が結合して5または6員環の複素環を形成することができる)および
(b)R5およびR6が共に水素ではなく、さらに
R7、R8、R9、およびR10がそれぞれ独立して以下から選択される:
1)水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C1〜C12)ハロアルキル、(C2〜C12)アルケニル、(C3〜C12)シクロアルケニル、(C2〜C12)ハロアルケニル、(C2〜C12)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、もしくは(C1〜C6)アルコキシカルボニル、または
2)置換または非置換の、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリル、または他のヘテロ環式基(置換基が、独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、シクロ(C3〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、ハロ(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、または(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択され、隣接する位置が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、または(C1〜C6)アルキルスルホニル基で置換される場合、これらの基を結合させて5または6員環の複素環を形成することができる))。
a)DNA結合ドメイン、
b)リガンド結合ドメイン、
c)トランス活性化ドメイン、および
d)リガンド
を含むエクジソン受容体複合体を、
a)外来遺伝子および
b)応答エレメント
を含むDNA構築物に接触させる工程を含み、
a)前記外来遺伝子が前記応答エレメントの制御下にあり、
b)前記リガンドの存在下での前記応答エレメントへの前記DNA結合ドメインの結合によって前記遺伝子が活性化または抑制され、さらに
c)前記リガンドが、式I:
(式中、QはOまたはSであり、
R1は以下から選択される:
1)水素、(C1〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C3〜C12)シクロアルキル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C12)ハロアルキル、(C2〜C12)アルケニル、(C3〜C12)シクロアルケニル、(C2〜C12)ハロアルケニル、(C2〜C12)アルキニル、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、スクシンイミジルメチル、もしくはベンゾスクシンイミジルメチル、または
2)置換または非置換の、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、ナフチル(C1〜C3)アルキル、フェノキシ(C1〜C3)アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリル、または他のヘテロ環式基(置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、シクロ(C3〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、ハロ(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、メルカプト、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C6)スルホニルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)ハロアルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、カルボキシ、または(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択され、隣接する位置が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、または(C1〜C6)アルキルスルホニル基で置換される場合、これらの基が結合して、5または6員環の複素環を形成することができる)、
R2およびR3はそれぞれ独立して、水素、(C1〜C6)アルキル、および(C1〜C6)ハロアルキルから選択され、
R4は、水素、(C1〜C6)アルキル、または(C1〜C6)ハロアルキルであり、
R5およびR6はそれぞれ独立して、以下から選択される:
1)水素、(C1〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C1〜C12)ハロアルキル、(C2〜C12)アルケニル、(C3〜C12)シクロアルケニル、(C2〜C12)ハロアルケニル、(C2〜C12)アルキニル、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、および(C1〜C6)アルキルチオ(C1〜C6)アルキル、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、シクロ(C3〜C6)アルキルカルボニル、ハロ(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルカルボニル、もしくはフェニル(C2〜C3)アルケニルカルボニル、または
2)置換または非置換の、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、フェニルカルボニル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、ベンゾフラニル、チオフェニル、チオフェニルカルボニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチオフェニルカルボニル、イソキサゾリル、イミダゾリル、または他のヘテロ環式基(置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、シクロ(C3〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、ハロ(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、メルカプト、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ (C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)ハロアルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、カルボキシ、または(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択され、隣接する位置が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、または(C1〜C6)アルキルスルホニル基で置換される場合、これらの基が結合して、5または6員環の複素環を形成することができる)、但し、
(a)R5およびR6の1つが、以下から選択される:
(i)水素、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、シクロ(C3〜C6)アルキルカルボニル、ハロ(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルカルボニル、またはフェニル(C2〜C3)アルケニルカルボニル、または
(ii)置換または非置換の、フェニルカルボニル、チオフェニルカルボニル、またはベンゾチオフェニルカルボニル(置換基は独立して、シアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、シクロ(C3〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、ハロ(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、メルカプト、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ホルミル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)ハロアルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、カルボキシ、または(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択され、隣接する位置が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、または(C1〜C6)アルキルスルホニル基で置換される場合、これらの基が結合して5または6員環の複素環を形成することができる)および
(b)R5およびR6が共に水素ではなく、さらに
R7、R8、R9、およびR10がそれぞれ独立して以下から選択される:
1)水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C1〜C12)ハロアルキル、(C2〜C12)アルケニル、(C3〜C12)シクロアルケニル、(C2〜C12)ハロアルケニル、(C2〜C12)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、もしくは(C1〜C6)アルコキシカルボニル、または
2)置換または非置換の、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリル、または他のヘテロ環式基(置換基が、独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、シクロ(C3〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、ハロ(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、ハロ(C2〜C6)アルキニル、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルケニルオキシ、(C2〜C6)アルキニルオキシ、ハロ(C2〜C6)アルキニルオキシ、アリールオキシ、(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ、ハロ(C1〜C6)アルキルチオ、(C2〜C6)アルケニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルケニルチオ、(C2〜C6)アルキニルチオ、ハロ(C2〜C6)アルキニルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C6)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C6)アルキルスルホニル、(C1〜C6)アルキルアミノ、ジ(C1〜C6)アルキルアミノ、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルフィニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルスルホニル(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、ジ(C1〜C6)アルキルアミノカルボニル、または(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択され、隣接する位置が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、または(C1〜C6)アルキルスルホニル基で置換される場合、これらの基を結合させて5または6員環の複素環を形成することができる))。
1)(C3〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C3〜C12)アルケニル、もしくは(C3〜C12)シクロアルケニル、または
2)置換または非置換の、フェニル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリル、または他のヘテロ環式基(置換基は、独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C3)アルキル、ハロ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルコキシ、ハロ(C1〜C3)アルコキシ、(C3)アルケニルオキシ、(C3)アルキニルオキシ、(C1〜C3)アルキルチオ、ハロ(C1〜C3)アルキルチオ、(C1〜C3)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C3)アルキルスルフィニル、(C1〜C3)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C3)アルキルスルホニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C2)アルキルチオ(C1〜C2)アルキル、または(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択され、隣接する位置が、水酸基、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C2〜C6)アルケニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ、(C1〜C6)アルキルスルフィニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、または(C1〜C6)アルキルスルホニル基で置換される場合、これらの基が結合して5または6員環の複素環を形成することができる)から選択される。
a)
1)DNA結合ドメイン、
2)前記リガンドの結合ドメイン、および
3)トランス活性化ドメイン
を含むエクジソン受容体複合体、ならびに
b)
1)外来遺伝子および
2)応答エレメント
を含むDNA構築物を含み、
a)前記外来遺伝子が前記応答エレメントの制御下にあり、そして
b)前記リガンドの存在下での前記DNA結合ドメインの応答エレメントへの結合により遺伝子が活性化または抑制される、被験体における1以上の外来遺伝子の発現を調節する方法である。
a)式Iの化合物を含むリガンドへの曝露に対して実質的に非感受性の細胞を選択する工程と、
b)1)a)前記ポリペプチドをコードする外来遺伝子、および
b)応答エレメントを含み、
前記遺伝子が前記応答エレメントの制御下にあるDNA構築物、ならびに、
2)a)DNA結合ドメイン、
b)前記リガンドの結合ドメイン、および
c)トランス活性化ドメインを含むエクジソン受容体複合体
を前記細胞に導入する工程と、
c)前記細胞を前記リガンドに曝露する工程とを含む、ポリペプチドを産生する方法である。
上記のように、本発明の遺伝子発現系を調節するためのリガンドを使用して、宿主細胞中の遺伝子発現を調節することができる。トランスジェニック宿主細胞における発現は、種々の目的遺伝子の発現に有用であり得る。本発明は、原核および真核宿主細胞における遺伝子発現の調節のためのリガンドを提供する。トランスジェニック宿主細胞における発現は、目的の種々のポリペプチド(ワクチンとして植物で産生される抗原、α−アミラーゼ、フィターゼ、グルカナーゼ、およびキシラナーゼなどの酵素、昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルス、および非生物ストレスの耐性遺伝子、抗原、栄養補助食品、医薬品、ビタミン、アミノ酸成分、除草剤耐性、寒気、干ばつ、および熱耐性、工業製品、油、タンパク質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不妊植物、花、燃料、他の産出形質、治療ポリペプチド、経路中間体を改変するための遺伝子;宿主を使用して従来不可能であった新規の産物の合成のための宿主中の既存の経路の改変のための遺伝子;細胞ベースのアッセイのための遺伝子;機能的ゲノミクスアッセイ、生体治療タンパク質産生、プロテオミクスアッセイのための遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない)の発現に有用である。さらに、遺伝子産物は、宿主の高成長収率の付与、または使用される別の成長様式を可能にすることに有用であり得る。
本発明は、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系で有用なリガンド群に関する。本明細書中に示されるように、新規のリガンド群により、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方で改良された誘導性遺伝子発現系が得られる。したがって、本発明は、遺伝子発現の調節に有用なリガンドに関する。特に、本発明は、グループH核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞中で発現することができる少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現調節系をトランス活性化する能力を有するリガンドに関する。好ましくは、グループH核受容体リガンド結合は、エクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体1、NER−1、ステロイドホルモン核受容体1、レチノイドX受容体相互作用たんぱく質−15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用タンパク質14、およびファルネソール受容体に由来する。より好ましくは、グループH核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体に由来する。
本発明はまた、本発明の遺伝子発現調節系を使用した宿主細胞における遺伝子発現の調節方法に関する。詳細には、本発明は、a)本発明の遺伝子発現調節系を宿主細胞に導入する工程と、b)前記宿主細胞にリガンドを導入する工程とを含み、調節されるべき遺伝子が、i)遺伝子発現系のDNA結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント、ii)遺伝子発現系のトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびiii)その発現が調節される遺伝子を含む遺伝子発現カセットの成分であり、それにより前記宿主細胞への前記リガンドの導入時に遺伝子の発現が調節される、宿主細胞における遺伝子発現の調節方法を提供する。
本発明の方法の1つの有用な測定は、RNA(好ましくは、mRNA種)の同一性および存在量を含む細胞の転写状態の測定である。このような測定を、任意のいくつかの既存の遺伝子発現テクノロジーによるcDNA存在量の測定によって都合よく行う。
本明細書中で使用される標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該分野で周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.MolecularClonillg:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)(Maniatis)、T.J.Silhavy,M.L.Bennan,and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)、およびAusubel,F.M.etal.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscience(1987)に記載されている。
本明細書中に開示のリガンドは、種々の適用(遺伝子治療、宿主細胞での目的のタンパク質の発現、トランスジェニック生物の産生、および細胞ベースのアッセイ)に有用である。種々の細胞バックグラウンド(哺乳動物細胞が含まれる)では、リガンド結合時に無脊椎動物EcRが脊椎動物RXRとヘテロ二量体化し、エクジソン応答エレメントの制御下で遺伝子がトランス活性化される。驚いたことに、本明細書中に記載のリガンドは、酵母および動物細胞適用のための新規の誘導遺伝子発現系を提供する。この例は、リガンド評価のためのEcRベースの誘導性遺伝子発現系で使用するためのいくつかの遺伝子発現カセットの構築を記載する。
トウヒシントメハマキChoristoneura fumiferana EcR(「CfEcR−DEF」; 配列番号:1)由来のD、E、およびFドメインを、GAL4 DNA結合ドメインに融合し(「Gal4DNABD」または「Gal4DBD」;配列番号:2)、CMVプロモーター(配列番号:3)の制御下においた。ヒトRXRβとLocusta migratoria RXRのEFドメインの間のキメラ(Hs RXRβ−LmRXREF、配列番号:4)をVP16由来のトランス活性化ドメイン(「VP16AD」;配列番号:5)に融合し、SV40eプロモーター(配列番号:6)の制御下に置いた。5つのコンセンサスGAL4応答エレメント結合部位(「5XGAL4RE」;配列番号:7を含む5コピーのGAL4REを含む)を、合成Elb最小プロモーター(配列番号:8)に融合し、ルシフェラーゼ遺伝子(配列番号:9)の上流に置いた。
この構築物を、GAL4CfEcR−DEF中のCfEcRをBaEcR−DEF(配列番号:10)に置換すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
この構築物を、GAL4CfEcR−DEF中のCfEcRをDmEcR−DEF(配列番号:11)に置換すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
この構築物を、CfEcRをAaEcR−DEF(配列番号:12)に置換し、VP16MmRXRb−LmRXREFキメラをHsRXRβ−EF(配列番号:13)に置換すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
この構築物を、CfEcR−DEFをAmaEcR−DEF(配列番号:14)に置換すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
この構築物を、CfEcR−DEFをBmEcR−DEF(配列番号:15)に置換すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
この構築物を、CfEcR−DEFをNcEcR−DEF(配列番号:16)に置換すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
この構築物を、CfEcR−DEFをTmEcR−DEF(配列番号:17)に置換すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
この構築物を、HsRXRβ−LmRXREFキメラの代わりにLmRXR−EF(配列番号:18)を使用すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
この構築物を、CfEcR−DEFの代わりにDmEcR−DEFを使用すること以外は、上記スイッチ1.1と同一の方法で調製した。
表1および表2に示した任意の化合物がトランス活性化アッセイにおけるレポーター遺伝子活性のインデューサーとして作用することができるかを決定するために、これらの化合物を、pFRLUCレポーターおよび遺伝子発現カセット(実施例1に記載の1.1〜1.8)でトランスフェクトしたNIH3T3細胞で試験した。トランスフェクトされた細胞を、0、0.01、0.1、1、および10μM濃度の化合物1−5〜1−11の存在下で成長させた。リガンド添加から48時間後、細胞を回収し、Dual Luciferaseアッセイキット(Promega社)を使用してレポーター活性をアッセイした。全相対光単位(RLU)を示す。標準的な細胞の培養および維持方法を行った。
以下のように、実施例1に概説した種々のスイッチ構築物(特に、スイッチ1.1〜1.8)に対応するDNAを、マウスNIH3T3細胞(ATCC)にトランスフェクトした。細胞が50%コンフルエントに達した時に回収し、それぞれ10%ウシ胎児血清(FBS)を含む2.5、1.0、または0.5mlの成長培地中に125,000個、50,000個、または25,000個の細胞数で6、12、または24ウェルプレートに入れた。翌日、成長培地で細胞をリンスし、4時間トランスフェクトした。Superfect(商標)(Qiagen Inc.)は、3T3細胞の最良のトランスフェクション試薬であることが見出されている。12ウェルプレートについては、4μlのSuperfect(商標)を、100μlの成長培地と混合した。1.0μgのレポーター構築物および0.25μgの分析すべき受容体対の各受容体構築物を、トランスフェクション混合物に添加した。チミジンキナーゼ(TK)構成的プロモーターに作動可能に連結されてこれの制御下に置かれたRenillaルシフェラーゼ遺伝子を含む第2のレポーター構築物(pTKRL(Promega)、0.1μg/トランスフェクション混合物)を添加し、基準化に使用した。トランスフェクション混合物の成分をボルテックスミキサーで混合し、室温で30分間静置した。インキュベーション後、トランスフェクション混合物を、400μlの成長培地中に維持した細胞に添加した。細胞を、37℃および5%CO2にて4時間維持した。インキュベーション後、20%FBSおよびジメチルスルホキシドDMSO;コントロール)または0.1、1、および10μMリガンドを含むDMSO溶液を含む500μlの成長培地を添加し、細胞を37℃および5%CO2にて48時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性をアッセイした。全ての試薬を6ウェルプレートで倍増させ、24ウェルプレートで半分に減少させること以外は、同じ手順が6ウェルプレートおよび24ウェルプレートで行われた。
全てのリガンドを、DMSOに溶解し、コントロールおよび処置群の両方のDMSOの最終濃度を0.1%に維持した。
リガンド添加から48時間後に細胞を回収した。125,250、または500μlの受動溶解緩衝液(Promega社のDual−luciferase(商標)レポーターアッセイ系の一部)を、24、12、または6ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートをロータリーシェーカー上に15分間置いた。20μlの溶解物をアッセイした。製造者の説明書に従ってPromega社のDual−luciferase(商標)レポーターアッセイ系を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。
表3〜4および図2、3、4、および5に示すように、合成化合物は、哺乳動物細胞における種々のEcRベースの遺伝子制御系を介してレポーター遺伝子を十分にトランス活性化するように作用した。驚いたことに、1−5、1−12、1−13、および1−14などのこれらの化合物のうちのいくつかはまた、AaEcRベースのスイッチにおいて非常に活性が高かった。100nMほどしかない化合物濃度で有意なレベルのレポーター遺伝子活性の誘導が認められた。したがって、式Iの化合物が遺伝子制御系のリガンドとして有用であることが初めて証明された。
安定な細胞株
F.Gage博士は、(Suhr et al.1998)に記載のCVBEおよび6×EcREを含む安定に形質転換された細胞集団を提供した。ヒト293腎臓細胞(HEK−293細胞とも呼ばれる)に、最初にスイッチ構築物CVBE、その後にレポーター構築物6×EcRE LacZをコードするレトロウイルスベクターを連続的に感染させた。スイッチ構築物は、フレーム中に挿入されたBombyx moriEcR(BE)(Iatrou)由来のアミノ酸26〜546のコード配列およびVP16トランス活性化ドメイン(VBE)の下流を含んでいた。合成ATG開始コドンを、サイトメガロウイルス(CVBE)即時型初期プロモーターの制御下に置き、ロングターミナルリピートに隣接させた。レポーター構築物は、LacZの上流に配置され、且つLTR配列が両側に隣接された6コピーのエクジソン応答エレメント(EcRE)結合部位(6×EcRE)を含んでいた。
CVBEおよび6×EcRE lackで安定に形質転換されたヒト293腎臓細胞を、10%FBS(Life Technologies,26140−087)、450 gumG418(Mediates,30−234−CR)、および100 gnome promising(Sigma,P−7255)を含む最少基礎培地(Mediates,10−010−CV)中にて、37℃、5%CO2を含む雰囲気下で維持し、75%コンフルエントに達した時点で継代培養を行った。
2.5×103細胞/ウェルの濃度のZ3細胞を、96ウェル組織培養プレートに播種し、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。DMSO中にリガンドのストック溶液を調製した。リガンドストック溶液を培地で100倍に希釈し、50μLのこの希釈リガンド溶液(33μM)を細胞に添加した。コントロールおよび処置群の両方で、DMSOの最終濃度を0.03%に維持した。
レポーター遺伝子発現を細胞処置から48時間後に評価し、β−ガラクトシダーゼ活性をTropixのGal Screen(商標)バイオ発光レポーター遺伝子アッセイ系(GSY1000)を使用して測定した。リガンド処理された細胞中の相対光単位(「RLU」)をDMSO処理された細胞中のRLUで割ることによって、誘導活性倍率を計算した。DynexMLXマイクロタイタープレート照度計を使用して室温で発光を検出した。用量応答試験は、33μMから0.01μMまでの濃度範囲の8種の濃度からなる。
遺伝子発現カセット
GAL4DBD(1−147)−CfEcR(DEF)/VP16AD−βRXREF−LmUSPEF:
トウヒシントメハマキのChoristoneura fumiferana EcR由来の野生型D、E、およびFドメイン(「CfEcR−DEF」;配列番号1)を、GAL4 DNA結合ドメイン(「Gal4DBD1−147」;配列番号2のヌクレオチド31〜471)に融合し、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(「PGK」;配列番号19)の制御下に置いた。Homo sapiens RXRβ由来のEFドメインのヘリックス1〜8およびLucusta migratoriaウルトラスピラクルタンパク質のEFドメインのヘリックス9〜12(「HsRXRβ−EF−LmUSP−EF」;配列番号4)を、VP16のトランス活性化ドメイン(「V16AD」;配列番号5)に融合し、伸長因子−1αプロモーター(「EF−1α」;配列番号20)の制御下に置いた。5つのコンセンサスGAL4応答エレメント結合部位(「5×GAL4RE」;配列番号7を含む5つのGAL4REを含む)を、合成TATA最少プロモーター(配列番号21)に融合し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子(配列番号9)の上流に置いた。
CHO細胞を、1つのプラスミド上の普遍的に活性な細胞プロモーター(それぞれPGKおよびEF−1α)によって制御されたGAL4DBD(1−147)CfEcR(DEF)およびVP16ADβRXREF−LmUSPEFについての転写カセットで一時的にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、ゼオシン耐性によって選択した。それぞれ単離したCHO細胞クローンを、GAL4RE−ルシフェラーゼレポーター(pFR Luc)で一時的にトランスフェクトした。ハイグロマイシンを使用して、27−63クローンを選択した。
細胞をトリプシン処理し、2.5×104細胞mLに希釈した。100μLの細胞懸濁液を、96ウェルプレートの各ウェルに置き、5%CO2下にて37℃で24時間インキュベートした。DMSO中でリガンドストック溶液を調製し、全処理のために300倍に希釈した。用量応答試験は、33μMから0.01μMまでの範囲の8つの濃度からなる。
PromegaのBright−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ系(E2650)を使用して、細胞処理から48時間後にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定した。Dynex MLXマイクロタイタープレート照度計を使用して、室温で発光を検出した。
遺伝子発現カセット
GAL4 DBD−CfEcR(DEF)/VP16AD−MmRXRE:
トウヒシントメハマキのChoristoneura fumiferana EcR由来の野生型D、E、およびFドメイン(「CfEcR−DEF」;配列番号1)を、GAL4 DNA結合ドメイン(「Gal4DBD1−147」;配列番号2のヌクレオチド31〜471)に融合し、pMベクターのSV40eプロモーター(PT3119−5、Clontech,Palo Alto,CA)の制御下に置いた。Mus MusculusRXR由来のDおよびEドメイン(「MmRXR−DE」;配列番号22)を、VP16由来のトランス活性化ドメイン(「VP16AD」;配列番号5)に融合し、pVP16ベクター(PT3127−5,Clontech,Palo Alto,CA)のSV40eプロモーターの制御下に置いた。
CHO細胞を、SV40eプロモーターによって制御されたGAL4DBD−CfEcR(DEF)およびVP16AD−MmRXREについての転写カセットで一時的にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、ハイグロマイシンによって選択した。それぞれ単離したCHO細胞クローンを、GAL4RE−ルシフェラーゼレポーター(pFR Luc、Stratagene,La Jolla,CA)で一時的にトランスフェクトした。ゼオシンを使用して、13B3クローンを選択した。
細胞をトリプシン処理し、2.5×104細胞mLに希釈した。100μLの細胞懸濁液を、96ウェルプレートの各ウェルに置き、5%CO2下にて37℃で24時間インキュベートした。DMSO中でリガンドストック溶液を調製し、全処理のために300倍に希釈した。用量応答試験は、33μMから0.01μMまでの範囲の8つの濃度からなる。
PromegaのBright−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ系(E2650)を使用して、細胞処理から48時間後にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定した。Dynex MLXマイクロタイタープレート照度計を使用して、室温で発光を検出した。
遺伝子発現カセット
Gal4DBD/AaEcR(DEF):
蚊Aedes aegypti EcR由来の野生型D、E、およびFドメイン(「AaEcR−DEF」;配列番号23)を、GAL4 DNA結合ドメイン(配列番号2のヌクレオチド31〜471)に融合し、長CMVプロモーター(配列番号24)の制御下に置いた。マウス(Mus Musculus)RXR由来のEドメイン(「βRXR−E」;配列番号25)を、VP16からの活性化ドメイン(配列番号5)のカルボキシル末端に融合し、SV40プロモーター(配列番号6)の制御下に置いた。
3T3細胞をトリプシン処理し、2.5×103細胞/ウェルを96ウェルプレートに入れた。5%CO2下にて37℃で24時間のインキュベーション後、Superfect(Qiagen)を使用して、Gal4DBD/AaEcR(DEF)遺伝子発現カセットおよび5×GAL4応答エレメントおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド(pFRLuc)を含む無血清培地で細胞をトランスフェクトした。37℃で4時間のトランスフェクション後、細胞をリガンドを含む血清培地で処理した。DMSO中にリガンドストック溶液を調製し、全処理のために300倍に希釈した。33μMで単回用量試験を行った。用量応答試験は、33μMから0.01μMまでの範囲の8つの濃度からなる。
PromegaのBright−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ系(E2650)を使用して、細胞処理から48時間後にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定した。Dynex MLXマイクロタイタープレート照度計を使用して、室温で発光を検出した。
Claims (9)
- 宿主細胞中の遺伝子の発現を調節するインビトロの方法であって、前記宿主細胞が、
(i)トランス活性化ドメイン、
(ii)DNA結合ドメイン、および
(iii)エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1の遺伝子発現カセットと、
(i)前記DNA結合ドメインに結合することができる応答エレメント、
(ii)前記トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、および
(iii)前記遺伝子
を含む第2の遺伝子発現カセットとを含み、
当該方法が、前記宿主細胞を、式I:
(式中、QはOであり、
R1は、
1)(C3〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C3〜C12)アルケニル、もしくは(C3〜C12)シクロアルケニル、または
2)置換または非置換の、フェニル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、またはイミダゾリル(置換基は、独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C 3 )アルキル、ハロ(C1〜C 3 )アルキル、(C1〜C 3 )アルコキシ、ハロ(C1〜C 3 )アルコキシ、(C1〜C 3 )アルキルチオ、ハロ(C1〜C 3 )アルキルチオ、(C1〜C 3 )アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C 3 )アルキルスルフィニル、(C1〜C 3 )アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C 3 )アルキルスルホニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択されるか、または隣接する位置がメチレンジオキシまたはエチレンジオキシで置換されている)から選択され、
R2 は(C1〜C3)アルキルであり、
R 3 は水素であり、
R4は、水素であり、
R5は置換または非置換の、フェニルであり(置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C3)アルコキシ、(C3)アルケニルオキシ、(C3)アルキニルオキシ、(C1〜C3)アルキルチオ、ハロ(C1〜C3)アルキルチオ、(C1〜C3)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C3)アルキルスルフィニル、(C1〜C3)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C3)アルキルスルホニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択される)、
R6は、以下から選択され:
(i)水素、(C1〜C6)アルキルカルボニル、シクロ(C3〜C6)アルキルカルボニル、ハロ(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルカルボニル、またはフェニル(C2〜C3)アルケニルカルボニル、または
(ii)置換または非置換の、フェニルカルボニル、チオフェニルカルボニル、またはベンゾチオフェニルカルボニル(置換基は独立して、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシの1〜3つから選択されるか、または隣接する位置が、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシで置換されている)、
R7 およびR9はそれぞれ水素であり、および
R 8 およびR 10 はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、または(C 1 〜C 12 )アルキルである)。 - R1が、置換または非置換の、フェニル、ピリジル、およびフェニルアミノ(置換基は、シアノ、ニトロ、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード、メチル、エチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、メトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、メチルチオ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチルチオ、メチルスルフィニル、トリフルオロメチルスルフィニル、ジフルオロメチルスルフィニル、メチルスルホニル、トリフルオロメチルスルホニル、ジフルオロメチルスルホニル、メトキシメチル、メトキシカルボニル、メチレンジオキシ、またはエチレンジオキシの1〜3つから選択される)からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- R1が、4−フルオロフェニル、3−フルオロフェニル、4−フルオロ−3−メチルフェニル、4−フルオロ−3−(トリフルオロメチル)フェニル、4−フルオロ−3−ヨードフェニル、3−フルオロ−4−ヨードフェニル、3,4−ジフルオロフェニル、4−エチルフェニル、3−フルオロ−4−メチルフェニル、3−フルオロ−4−エチルフェニル、3−クロロ−4−フルオロフェニル、3−フルオロ−4−クロロフェニル、2−メチル−3−メトキシフェニル、2−エチル−3−メトキシフェニル、2−エチル−3、4−エチレンジオキシフェニル、3−ニトロフェニル、4−ヨードフェニル、3−フルオロ−4−トリフルオロメチルフェニル、3−メチルフェニル、4−メチルフェニル、4−クロロフェニル、3−トリフルオロメチルフェニル、3−メトキシフェニル、3−クロロ−6−ピリジル、2−クロロ−4−ピリジル、フェニルアミノ、3−クロロフェニルアミノ、3−メチルフェニルアミノ、4−クロロフェニルアミノ、および4−メチルフェニルアミノからなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- R2が、メチルである、請求項2記載の方法。
- R6が、水素、(C1〜C3)アルキルカルボニル、およびシクロ(C3〜C6)アルキルカルボニルからなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- R5がフェニルおよび4−フルオロフェニルからなる群から選択され、さらにR6がHである、請求項5記載の方法。
- R7、R9、およびR10が水素であり、さらにR8が、水素およびフッ素からなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- 式I:
R1は、
1)(C3〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C3〜C12)アルケニル、もしくは(C3〜C12)シクロアルケニル、または
2)置換または非置換の、フェニル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、またはイミダゾリル(置換基は、独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C 3 )アルキル、ハロ(C1〜C 3 )アルキル、(C1〜C 3 )アルコキシ、ハロ(C1〜C 3 )アルコキシ、(C1〜C 3 )アルキルチオ、ハロ(C1〜C 3 )アルキルチオ、(C1〜C 3 )アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C 3 )アルキルスルフィニル、(C1〜C 3 )アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C 3 )アルキルスルホニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択されるか、または隣接する位置がメチレンジオキシまたはエチレンジオキシで置換されている)から選択され、
R2 は(C1〜C3)アルキルであり、
R 3 は水素であり、
R4は、水素であり、
R5は、置換または非置換の、フェニルであり(置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C3)アルコキシ、(C3)アルケニルオキシ、(C3)アルキニルオキシ、(C1〜C3)アルキルチオ、ハロ(C1〜C3)アルキルチオ、(C1〜C3)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C3)アルキルスルフィニル、(C1〜C3)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C3)アルキルスルホニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択される)、
R6は、以下から選択され:
(i)水素、(C1〜C6)アルキルカルボニル、シクロ(C3〜C6)アルキルカルボニル、ハロ(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルカルボニル、またはフェニル(C2〜C3)アルケニルカルボニル、または
(ii)置換または非置換の、フェニルカルボニル、チオフェニルカルボニル、またはベンゾチオフェニルカルボニル(置換基は独立して、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシの1〜3つから選択されるか、または隣接する位置が、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシで置換されている)、
R7 およびR9はそれぞれ水素であり、および
R 8 およびR 10 はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、または(C 1 〜C 12 )アルキルである)
のリガンドまたはその鏡像異性体、ジアステレオマー、もしくは立体異性体のリガンドを含み、
被験体の細胞が、
a)1)DNA結合ドメイン、
2)リガンドのための結合ドメイン、および
3)トランス活性化ドメイン
を含むエクジソン受容体複合体、ならびに
b)1)外来遺伝子、および
2)応答エレメント
を含むDNA構築物を含み、
前記外来遺伝子が前記応答エレメントの制御下にあり、さらに前記リガンドの存在下での、前記応答エレメントへの前記DNA結合ドメインの結合が前記遺伝子の活性化または抑制を生じさせる、被験体中で1以上の外来遺伝子の発現を調節するための医薬組成物。 - 宿主細胞における遺伝子の発現を調節するインビトロの方法であって、
a)i)(a)発現が調節されるべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するDNA結合ドメイン、および
(b)エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞で発現されることができる第1の遺伝子発現カセット、
ii)(a)トランス活性化ドメイン、および
(b)キメラレチノイドX受容体リガンド結合ドメイン
を含む第2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞で発現されることができる第2の遺伝子発現カセット、ならびに
iii)(a)第1のポリペプチドのDNA結合ドメインによって認識される応答エレメント、
(b)第2のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、および
(c)前記遺伝子
を含むポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞で発現されることができる第3の遺伝子発現カセット
を含む遺伝子発現調節系を宿主細胞に導入し、さらに
a.式I:
それにより宿主細胞へのリガンドの導入時に上記iii)c)の遺伝子の発現が調節される方法
(式中、QはOであり、
R1は、
1)(C3〜C12)アルキル、(C3〜C12)シクロアルキル、(C3〜C12)アルケニル、もしくは(C3〜C12)シクロアルケニル、または
2)置換または非置換の、フェニル、フェニル(C1〜C3)アルキル、フェニル(C2〜C3)アルケニル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、またはイミダゾリル(置換基は、独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C 3 )アルキル、ハロ(C1〜C 3 )アルキル、(C1〜C 3 )アルコキシ、ハロ(C1〜C 3 )アルコキシ、(C1〜C 3 )アルキルチオ、ハロ(C1〜C 3 )アルキルチオ、(C1〜C 3 )アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C 3 )アルキルスルフィニル、(C1〜C 3 )アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C 3 )アルキルスルホニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択されるか、または隣接する位置がメチレンジオキシまたはエチレンジオキシで置換されている)から選択され、
R2 は(C1〜C 3 )アルキルであり、
R 3 は水素であり、
R4は、水素であり、
R5は、置換または非置換の、フェニルであり(置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、ハロ(C1〜C3)アルコキシ、(C3)アルケニルオキシ、(C3)アルキニルオキシ、(C1〜C3)アルキルチオ、ハロ(C1〜C3)アルキルチオ、(C1〜C3)アルキルスルフィニル、ハロ(C1〜C3)アルキルスルフィニル、(C1〜C3)アルキルスルホニル、ハロ(C1〜C3)アルキルスルホニル、(C1〜C3)アルコキシ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルキルチオ(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルコキシカルボニルの1〜3つから選択される)、
R6は、以下から選択され:
(i)水素、(C1〜C6)アルキルカルボニル、シクロ(C3〜C6)アルキルカルボニル、ハロ(C1〜C6)アルキルカルボニル、(C1〜C6)アルコキシカルボニルカルボニル、またはフェニル(C2〜C3)アルケニルカルボニル、または
(ii)置換または非置換の、フェニルカルボニル、チオフェニルカルボニル、またはベンゾチオフェニルカルボニル(置換基は独立して、ニトロ、ハロゲン、(C1〜C6)アルキル、ハロ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシの1〜3つから選択されるか、または隣接する位置が、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシで置換されている)、
R7 およびR9はそれぞれ水素であり、および
R 8 およびR 10 はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、または(C 1 〜C 12 )アルキルである)。
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