JP2011518121A - ステロイドリガンドおよび遺伝子スイッチモジュレーションにおけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ステロイド化学および遺伝子発現制御の分野に関する。より具体的には、本発明は、天然のおよび変異した核内受容体に関するステロイドリガンド、ならびに核内受容体に基づく誘導型遺伝子発現系におけるその使用に関する。本発明はさらに、これらのリガンドおよび対応する遺伝子スイッチを用いて宿主細胞内で関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。本発明はさらに、1つまたは複数のステロイドリガンドを含有する組成物および治療組成物に関する。
本明細書において引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全内容物が完全に参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の態様は、宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートするために有用なステロイド受容体に基づく誘導型遺伝子発現系と共に用いるためのリガンドを提供する。1つの態様において、本発明は、低減されたレベルのバックグラウンド遺伝子発現を有し、マイクロモル未満の濃度のステロイドリガンドに応答する遺伝子スイッチ系を提供する。本発明は、市販の誘導型発現系の限界を克服して、遺伝子発現を制御するための有効な様式を提供する。
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a)H、(C1-C6)アルキル;(C1-C6)ハロアルキル;(C1-C6)シアノアルキル;(C1-C6)ヒドロキシアルキル;(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C3-C5)シクロアルキル;ハロ、シアノ、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいオキシラニルであるか、または
b)置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アルキル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり;ならびに
R5は、H;OH;F;Cl;または(C1-C6)アルコキシである。
R1、R2、R3、およびR4がHである場合、R5はメトキシではなく、
R1、R2、R3、およびR4がイソプロピルである場合、R5はヒドロキシではなく、ならびに
R1、R2、およびR3がHであり、およびR5がヒドロキシである場合、R4はメチルでもエチルでもない。
a)H、(C1-C6)アルキル;(C1-C6)ハロアルキル;(C1-C6)シアノアルキル;(C1-C6)ヒドロキシアルキル;(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル;(C2-C6)アルケニル;(C2-C6)アルキニル;ハロ、シアノ、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいオキシラニルであるか;または
b)置換基が独立して1〜5つのH、ハロ、シアノ、もしくは(C1-C6)アルキルである、非置換または置換ベンジルであり;ならびに
R5は、H、OH、F、Cl、または(C1-C6)アルコキシである。
R5はH、OH、またはFである。
R1、R2、R3、およびR4がイソプロピルである場合、R5はヒドロキシルではなく、
R5がH、ヒドロキシル、メトキシ、またはフルオロである場合、R1、R2、R3、およびR4の少なくとも1つはHではなく;
R1、R2、R3、およびR4の1つのみがメチルであり、R5がHまたはヒドロキシルである場合、R1、R2、R3、およびR4の残りはHではなく;
R4と、R1、R2、およびR3のうちの1つの両方がメチルである場合、R5はHでもヒドロキシルでもなく;
R1、R2、R3、およびR4が全てメチルである場合、R5はヒドロキシルではなく;ならびに
R1、R2、およびR3が全てHであり、R5がヒドロキシルである場合、R4はエチルでも、n-プロピルでも、n-ブチルでも、アリルでも、ベンジルでもない。
a)DNA結合ドメイン;
b)リガンド結合ドメイン;
c)トランス活性化ドメイン;および
d)リガンド
を含む核内受容体複合体を、
関心対象遺伝子;および
応答エレメント
を含むDNA構築物に接触させる段階を含む、関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、関心対象遺伝子が応答エレメントの制御下に置かれ、およびDNA結合ドメインがリガンドの存在下で応答エレメントに結合すると、関心対象遺伝子の活性化または抑制が起こる方法に関する。
に由来しない化合物を指す。たとえばAkhrem, A. A. and Yu. A. Titov. Total Steroid Sythesis. New York: Plenum Press, 1970を参照されたい。
式中R1はアルキルであり、Ar1およびAr2は独立して、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシからなる群より選択される1〜3個の置換基を有するフェニルである。1つの態様において、R1は分岐C4-C8アルキル、たとえば-C(CH3)3、-C(CH3)C(CH3)3、-C(CH2CH3)C(CH3)3、または-C(CH2CH2CH3)C(CH3)3である。1つの態様において、フェニル置換基は独立してC1-C4アルキルまたはアルコキシであり、たとえばAr1は、2-エチル-3-メトキシフェニルであり、Ar2は3,5-ジメチルフェニルである。この態様に従う代表的なジアシルヒドラジンは、たとえばU.S. 7,456,315およびWO 2008/153801において開示されている。
(Cherbas L., et. al., (1991), Genes Dev. 5, 120-131を参照されたい);
配列中、N(n)は、1つまたは複数のスペーサーヌクレオチド(SEQ ID NO:29)であり得る(D'Avino PP., et. al., (1995), Mol. Cell. Endocrinol, 113, 1-9を参照されたい);および
(Antoniewski C, et. al., (1994). Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474を参照されたい)が含まれる。
a)以下を含む受容体複合体:
DNA結合ドメイン;
リガンド結合ドメイン;および
トランス活性化ドメイン;ならびに
b)以下を含むDNA構築物:
関心対象遺伝子;および
応答エレメント、
を含み、前記関心対象遺伝子が応答エレメントの制御下にあり、およびリガンドの存在下での応答エレメントに対するDNA結合ドメインの結合によって、関心対象遺伝子の活性化または抑制が起こる、方法である。
本発明の遺伝子発現系をモジュレートするためのリガンドは、宿主細胞における遺伝子発現をモジュレートするために用いられてもよい。トランスジェニック宿主細胞における発現は、様々な関心対象遺伝子の発現にとって有用である可能性がある。本発明は、原核生物および真核生物宿主細胞における遺伝子発現のモジュレーションのためのリガンドを提供する。宿主細胞における発現は、中でもワクチンとして植物において産生される抗原、α-アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、およびキシラナーゼのような酵素が含まれる酵素が含まれるがこれらに限定されるわけではない様々な関心対象ポリペプチドの発現、昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルスおよび非生物ストレス、抗原、栄養剤、薬剤、ビタミンに対する抵抗性遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、低温、干ばつ、高温耐性、工業産物、油、タンパク質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の産物特性、治療ポリペプチド、経路中間体を改変するための遺伝子の発現;細胞に基づくアッセイ;機能的ゲノミクスアッセイ、生物治療タンパク質産生、プロテオミクスアッセイにとって有用である。
本発明は、核内受容体に基づく誘導型遺伝子発現系において有用であるリガンドのグループに関する。特に、本発明は、グループH核内受容体などの核内受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞において発現されうる少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現モジュレーション系のトランス活性化能を有するリガンドに関する。グループH核内受容体リガンド結合は、ステロイド受容体、エクジステロイド受容体、変異体エクジソン受容体、汎在する受容体、オーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン受容体様タンパク質1、レチノイドX受容体相互作用タンパク質-15、肝X受容体βステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝X受容体、肝X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用タンパク質14、およびファルネソル受容体からの結合である。1つの態様において、グループH核内受容体リガンド結合ドメインは、エクジステロイド受容体からのドメインである。
本発明は、a)本発明に従う遺伝子発現モジュレーション系を宿主細胞に導入する段階;およびb)リガンドを宿主細胞に導入する段階を含む、宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、関心対象遺伝子がi)遺伝子発現系のDNA結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント;ii)遺伝子発現系のトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター;およびiii)その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子、を含む遺伝子発現カセットの成分であり、それによってリガンドが宿主細胞に導入されると、関心対象遺伝子の発現がモジュレートされる方法を提供する。
本発明の方法の1つの有用な測定は、mRNA種などのRNAの同一性および量が含まれる、細胞の転写状態の測定である。そのような測定は、いくつかの既存の遺伝子発現技術のいずれかによってcDNA量を測定することによって簡便に行われる。
本明細書において用いられた標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当技術分野において周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) (Maniatis)によって、T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984) によって、およびAusubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley-Interscience (1987)によって記述されている。
化学物質および試薬
酸化銀(Ag2O)、ヨードメタン(CH3I)、ヨードエタン(CH3CH2I)、1-ヨードプロパン(CH3CH2CH2I)、1-ヨードブタン(CH3CH2CH2CH2I)、臭化アリル(CH2=CHCH2Br)、臭化ベンジル(C6H5CH2Br)、l-ブロモ-2-ブタノン(CH3CH2COCH2Br)、無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、2,2-ジメトキシプロパン(DMP)、フェニルホウ酸(PBA)、一水和パラトルエンスルホン酸(p-TsOH)、テトラヒドロフラン(THF)、1,4-ジオキサン、メチルトリフレート(CF3SO2OCH3)、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジン(C14H23N)、およびp-アニスアルデヒドはAldrichから購入した。Celite(登録商標)は、BDHから購入した。Minisart(登録商標)フィルターは、Sartoriusから購入した。過酸化水素(H2O2)100倍量、硫酸(H2SO4)、塩酸(HCl)、酢酸(AcOH)、水酸化ナトリウム(NaOH)、アセトン、酢酸エチル(AcOEt)、ならびにHPLC-等級のメタノール(MeOH)、エタノール(EtOH)、クロロホルム(CHCl3)およびジクロロメタン(CH2Cl2)は、Fisher Scientificから購入した。メタノール-d4はGoss Scientific Instruments Ltdから購入した。20-ヒドロキシエクジソン(20E)は、Dr. V. Volodin, Institute of Biology, Russian Academy of Sciences, Syktyvkar, Russiaによって供給された。ポナステロンA(PoA)は、Dr. Rene Lafont, Universite Pierre et Marie Curieによって供給された。無水アセトンは、4Åの分子ふるい上での溶媒の貯蔵後に蒸留によって得た。
無水反応条件は、試薬を導入する前に、真空下でシュレンク反応管をフレームドライして窒素またはアルゴン雰囲気を導入することによって、無水溶媒および液体を移すためにカニューレを用いることによって、および開始材料として使用されるステロイドを凍結乾燥させることによって、得た。Ag2Oを伴う反応は、シュレンク管をアルミニウムホイルで覆うことによって光から保護された。反応物を薄層クロマトグラフィー(TLC)および/または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のいずれかによってモニターした。TLCは、Merck HPTLCアルミニウムシート20×20 cmシリカゲル60 F254を用いて行った。プレートを、5%p-アニスアルデヒド/5%H2SO4のEtOH溶液に浸して加熱した後にUV光の下で可視化した。化合物の移動度をRf値として表記する(Rf=化合物が移動した距離/溶媒の先端が移動した距離)。HPLCによる反応のモニタリングは、一定間隔で反応容器から等量の反応混合物を採取して、試料をMeOHによって反応停止させて、遠心して上清をMinisart(登録商標)0.20μmフィルターを通して濾過する必要があった。濾液を減圧下で濃縮して、30%MeOHのH2O溶液(v/v)に溶解して、DAD(以下のカラムの詳細を参照されたい)を備えた分析用C18-HPLCに注入して、30%〜100%MeOHのH2O溶液の直線勾配で25分間溶出させて、その後アイソクラティック100%MeOHによって流速1 mL/分で10分間溶出させて、λ=242およびλ=300 nmの双方でモニターして、示される特徴的な保持時間(R.t.)に基づくのみならず、特異的ピークの完全なUVスペクトルの検分によって異なる産物を同定した。
Waters Sep-Pak(登録商標)Vac 35cc C18-10gカートリッジを粗反応混合物のプレ精製のために用いた。試料を5%MeOHのH2O溶液として適用した後、溶媒強度を増加させる(典型的に、30%、80%、および100%MeOHのH2O溶液)段階的勾配を用いて洗浄して、関心対象化合物を選択的に溶出した。単離および精製は、RPまたはNP-HPLCのいずれかによって行い、Gilson 170ダイオードアレイ検出器(DAD)またはGilson単波長Holochrome/115 UV検出器のいずれかによって、流出液を、ステロイド発色団の存在に関して242 nmでモニターした。分析用HPLCは、C18カラム(Phenomenex Sphereclone ODS2、5 μm、150×4.60 mm、もしくはPhenomenex Prodigy ODS2、5 μm、250×4.60 mm)、C6カラム(Phenomenex Sphereclone、5 μm、150×4.60 mm)、ジオールカラム(Jones Apex II Diol、5 μm、150×4.60 mm 、もしくはGRACE Apex II Diol、5 μm、150×4.60 mm)、またはシリカカラム(Zorbax Sil、5 μm、250×4.60 mm)のいずれかによって流速1 mL/分で行った。セミ分取HPLCは、C18カラム(Phenomenex Sphereclone ODS2、5 μm、250×10 mm)、シリカカラム(Zorbax Sil、5 μm、250×9.40 mm)、またはジオールカラム(GRACE Apex II、5 μm、150×8.00 mm)のいずれかによって流速2 mL/分で行った。分取HPLCはC18カラム(Phenomenex Sphereclone ODS2、5 μm、250×21.20 mm)によって流速5 mL/分で行った。14α-ヒドロキシ-7-エン-6-オン部分(ε、242 nmでの吸光度係数:12400 Lmol-1cm-1)またはダクリハイナンステロン様共役系(299 nmでのε:14190 Lmol-1cm-1)のいずれかを含有する化合物に関しては、定量を、Shimadzu UV-2401PCにおいて紫外線分光法によって行った。濃度はランバート-ベール等式に従って計算した。
核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、プロトン周波数400 MHzおよび炭素周波数100 MHzで操作するBruker Avance/DRX 400 NMR分光計において、またはプロトン周波数300 MHzおよび炭素周波数75 MHzで操作するBruker ACF 300 NMR分光計のいずれかにおいて記録した。試料を、内部標準としてテトラメチルシランと共に重水素化メタノールに溶解した。ケミカルシフトを百万分率(ppm)として表記する。高解像度質量分析を、化学イオン化モード(CIMS)または陽イオン高速原子衝突質量分析(FABMS)モードのいずれかで行った。CIMSは、いずれの場合においても、試薬ガスとしてメタンをおよび溶媒としてメタノールを用いて直接入口プローブを備えたMicromass GCT分光計または直接入口プローブを備えたJeol MS700分光計のいずれかにおいて記録した。FABMSは、試薬ガスとしてキセノンを用いておよびマトリクスとして「魔法の弾丸(Magic Bullet)」(1,4-ジチオ-L-スレイトールと1,4-ジチオエリスリトールの4:1混合物)を用いて、Jeol MS700分光計において、またはグリセロールマトリクスおよびメタノールを溶媒として用いてVG Quattro質量分析計において記録した。
20E(197.7 mg、411.9μmol)およびPBA(58.6 mg、480μmol)を無水DMF(4.5 mL)に溶解して、混合物を無水条件下で室温で1時間撹拌した。縮合p-TsOH(39.3 mg、0.5等量、窒素雰囲気下で融解状態に達するまでブンセンバーナーの火で緩やかに加熱することにより結晶水を除去することによって一水和p-TsOHから調製)およびDMP(2.3 mL)の無水アセトン溶液(4.6 mL)を加えて、混合物を3時間撹拌した。アセトンおよびDMPを減圧下で除去して、混合物をAcOEt(20 mL)によって希釈して、塩水(3×10 mL)によって洗浄し、有機溶媒を減圧下で除去した。THF/H2O2 9:1 v/v(0.1 N NaOHによって予め中和したH2O2、100容量)15 mLを残渣に加えて、混合物を中性pH(pHは自然に低下して、20E 2,3-アセトニドの20Eへの再変換を引き起こす)を維持しながら室温で2.5時間撹拌した。THFをロータリーエバポレーションによって除去して、混合物を25%MeOH/H2O溶液に懸濁して、0℃に冷却した。懸濁液をコットンウールを通して濾過することによって沈殿物を収集して、MeOHに溶解した後ロータリーエバポレーションによって残渣を回収すると純粋な20E 2,3-アセトニド(138.5 mg、収率=65%)が得られた。
Ag2O(207.0 mg、10等量)およびCH3I(90μL、15等量)を20E 2,3-アセトニド(48.0 mg、92.3μmol)の無水DMF溶液1.3 mLに加えて、混合物を室温で無水条件で撹拌した。反応の2.5時間後、混合物を以下のように仕上げた(worked up):AcOEt(25 mL)を加えて、混合物をCelite(登録商標)パッドを通して濾過して、パッドをAcOEt(150 mL)によって洗浄して、溶媒をロータリーエバポレートした。粗反応混合物をC18 Sep-Pak(登録商標)を用いてプレ精製して、産物を、セミ分取C18-HPLC系によってアイソクラティック70%MeOH/H2Oによって精製すると、22-メチルエーテル20E 2,3-アセトニド24.1 mg(49%)(R.t=23分)が得られた。2,3-イソプロピリデン基の除去は以下のように行った:HCl水溶液(0.1 M、1.0 mL)を産物の1,4-ジオキサン(1.0 mL)溶液に滴下して加えて、混合物を室温で撹拌した。反応の2.5時間後、混合物を5%1,4-ジオキサン/H2O溶液に希釈してC18 Sep-Pak(登録商標)によってプレ精製した。次に、所望の産物をセミ分取C18-HPLC(58%MeOH/H2O)によって精製すると、20E 22-メチルエーテル(R.t=17分)22 mg(48%)が得られた。完全な特徴決定は400MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMSによって行った。
Ag2O(116.0 mg、10等量)を新たに調製した20E 20,22-フェニルボロネート(30 mg、53μmol)のDMF溶液(2 mL)に加えた。CH3I(258μL、44.7等量)を反応のあいだに4回に分けて加えて、混合物を無水条件で室温で撹拌した。4時間後、さらにAg2O(10等量)を加えて、混合物を全体で7.5時間撹拌し続けた。20E 2,3-アセトニドの調製に関して記載したように、反応物を仕上げて、フェニルボロネート基を除去した。予想産物を、セミ分取C18-HPLC系を用いてアイソクラティック50%MeOH/H2Oによって精製したところ、20E 3-メチルエーテルは20分後に溶出し(6 mg、25%)、20E 2-メチルエーテルは23分後に溶出した(13 mg、50%)。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS(20E 2-メチルエーテル
)によって行った。
20E(236 mg、492 μmol)を、無水条件で無水アセトン(10 mL)に溶解した。無水DMF(0.5 mL)も同様に溶解を助けるために加えた。縮合p-TsOH(51 mg、0.2等量;前述のように調製)およびDMP(0.2 mL)を反応容器に移して、混合物を窒素流において室温で6時間撹拌した。溶媒を減圧下で部分的に除去して、残りの溶液をAcOEt(100 mL)に加えて、H2O(50 mL)によって洗浄した後、飽和NaCl溶液(3×50 mL)によって洗浄した。有機相をTLC(CHCl3/MeOH;15:1、v/v;Rf 20E 2,3,20,22-ジアセトニド=0.35;Rf 20E 20,22-モノアセトニド=0.13)および分析用C18-HPLCによって分析すると、20E 2,3,20,22-ジアセトニド(R.t.=23.2)および20E 20,22-モノアセトニド(R.t.=19.5分)の双方で構成された。2つの産物の単離を、シリカゲル(Merck, Kieselgel 60)オープンカラム(内径2.5×25 cm)クロマトグラフィーによって行い、CH2Cl2/MeOH(17:1、v/v)によって前者の化合物79.7 mg(29%)が溶出し、CH2Cl2/MeOH(13:1、v/v)によって後者の化合物142.4 mg(52%)が溶出した。特徴決定はNMRおよびCIMS分析によって行い、データが文献値(ecdybase.org.)と一致していることを確認した。
Ag2O(324.4 mg、20等量)およびCH3I(260μL、60等量)を2,3,20,22-ジアセトニド(39.3 mg、70.2μmol)溶液に加えて、混合物を60℃で無水条件下で撹拌した。3時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように反応混合物を仕上げた。アセトニド基の除去は、粗反応混合物を1,4-ジオキサン(1 mL)に溶解する段階、70%AcOH水溶液(10 mL)を加える段階、および80℃で8時間還流する段階の後に、加熱をやめて反応物を終夜撹拌する段階によって行われた。次に、反応混合物をH2O(50 mL;1-ブタノールによって予め飽和)によって希釈した後、1-ブタノール(4×50 mL;H2Oによって予め飽和)によって洗浄した。合わせた有機相を減圧下で蒸発させて、残渣をC18-HPLC(50%MeOH/H2O)によって精製すると、20E 14-メチルエーテル(R.t.=21分)4.5 mg(13%)が得られた。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS
によって行った。
ジ-tert-ブチル-4-メチル-ピリジン(88.8 mg、6等量)およびメチルトリフレート(47μL、6等量)を20E 2,3-アセトニド(37.5 mg、72.1 μmol)の無水CH2Cl2溶液(3 mL)に加えて、混合物を無水条件下で室温で撹拌した。55時間後、メチルトリフレートを真空下で除去して、残渣を、中和および2,3-アセトニド基の除去のためにHCl(0.1 M):1,4-ジオキサン1:1(v/v)によって処置した。所望の産物の精製を、アイソクラティック60%MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLC系によって行い、それにより20E 25-メチルエーテル(R.t.=20.1分)11.15 mg(31%)および20E 22,25-ジメチルエーテル(R.t.=42.0分)5.63 mg(15%)が収集された。2つの化合物の特徴決定は、300 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびFAB-MS(20E 25-メチルエーテル
)によって行った。
Ag2O(534 mg、40等量)およびCH3CH2I(92μL、20等量)を20E 2,3-アセトニド(30 mg、57.7μmol)の無水DMF溶液(2 mL)に加えて、反応物を室温にて無水条件下で撹拌した。28時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック70%MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.=12分で溶出し、次にアイソクラティックCH2Cl2/イソプロパノール/H2O(125/30/2、v/v/v)を用いるセミ分取シリカカラムによって行うと、これはR.t.=19.6分で溶出して、20E 22-エチルエーテル5.5 mg(19%)が得られた。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS
によって行った。
Ag2O(208 mg、10等量)およびCH3(CH2)3I(187μL、20等量)を20E 2,3-アセトニド(50 mg、96.1μmol)の無水DMF(2 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。8時間後、さらにCH3CH2CH2I(20等量)を加えた。24時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック70%MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.=18分で溶出して、20E 22-n-プロピルエーテル11.6 mg(23%)が得られた。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS
によって行った。
Ag2O(649.7 mg、40等量)およびCH3(CH2)2I(239μL、30等量)を20E 2,3-アセトニド(36.4 mg、70.1μmol)の無水DMF(3 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。8時間後、さらにCH3CH2CH2I(20等量)を加えた。45時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック75%MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.=33分で溶出して、20E 22-n-ブチルエーテル11.1 mg(30%)が得られた。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびFAB-MS
によって行った。
Ag2O(790.0 mg、40等量)およびCH3CH2COCH2Br(391μL、45等量)を20E 2,3-アセトニド(44.3 mg、85.2μmol)の無水DMF(4 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。72時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製を、最初にアイソクラティック75%MeOH/H2O系を用いる分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.=21分で溶出して、次にアイソクラティック70%MeOH/H2Oを用いて行うと、これはR.t.=30分で溶出し、20E 22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル5.0 mg(11%)が得られた。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびFAB-MS
によって行った。
Ag2O(137.7 mg、10等量)およびCH2=CHCH2Br(75μL、15等量)を20E 2,3-アセトニド(30.9 mg、59.4μmol)の無水DMF(2 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌して、TLC(CHCl3/MeOH;10:1、v/v;Rf 20E 2,3-アセトニド=0.16;Rf 22-アリル20E 2,3-アセトニド=0.33)によってモニターした。26時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック70%MeOH/H2O系を用いる分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.=26分で溶出して、20E 22-アリルエーテル11.6 mg(38%)が得られた。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびFAB-MS
によって行った。
Ag2O(139.5 mg、10等量)およびC6H5CH2Br(107μL、15等量)を20E 2,3-アセトニド(31.3 mg、60.2μmol)の無水DMF(2 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌して、TLC(CHCl3/MeOH;10:1、v/v;Rf 22-ベンジル20E 2,3-アセトニド=0.36)によってモニターした。72時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック70%MeOH/H2O系を用いる分取C18-HPLCによって行うと、これはR.t.=48分で溶出して、20E 22-ベンジルエーテル3.0 mg(9%)が得られた。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびFAB-MS
によって行った。
Ag2O(538 mg、10等量)およびCH3I(210μL、15等量)を20E(108 mg、225μmol)の無水DMF(3 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。1.5時間後、さらにAg2O 10等量およびCH3I 15等量を加えて、5時間後、混合物を、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように仕上げた。予想産物の精製をアイソクラティック60%MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、20E 3,22-ジメチルエーテルが21分後に溶出して(28.4 mg、25%)、20E 2,22-ジメチルエーテルが24分後(45.8 mg、40%)に溶出した。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS(20E 2,22-ジメチルエーテル:
20E 3,22-ジメチルエーテル:
)によって行った。
Ag2O(84.7 mg、10等量)およびCH3I(48μL、20等量)を20E 2,3-アセトニド(19.0 mg、36.5μmol)の無水DMF(1.5 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。反応の21時間後、さらにAg2O(3×10等量)およびCH3I(3×20等量)を10時間の間隔で加えた。51時間後20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。精製を、最初にアイソクラティック60%MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、R.t.=18分で主要なピーク1.9 mgが収集され、その後アイソクラティックCH2Cl2/イソプロパノール/H2O(160:30:1.5、v/v/v)を用いるセミ分取シリカカラムによって精製を行うと、20E 14,22-ジメチルエーテルは16.3分後に溶出して、収率は1.0 mg(6%)であった。完全な特徴決定は、400 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS
によって行った。
Ag2O(1.745 g、23等量)およびCH3I(1.175 mL、60等量)を20E(155 mg、324μmol)の無水DMF(4.0 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。12時間後、さらにAg2O 19等量およびCH3I 60等量を加えて、反応の20時間後にさらにCH3I 60等量を加えた。合計36時間後、反応物を、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように仕上げた。精製をアイソクラティック70%MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって行うと、20E 2,3,14,22-テトラメチルエーテルが19分後に溶出して収率は51 mg(30%)であった。特徴決定は、400 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS
によって行った。nOe実験は、20Eと同様にC-14で立体化学を確認した(H-9での電磁波照射により14-OMeシグナルの2.2%の増強を生じた)。
Ag2O(960.0 mg、40等量)およびCH3I(129μL、20等量)をPoA 2,3-アセトニド(52.2 mg、135.5μmol)の無水DMF(3.5 mL)溶液に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。23時間後、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように、反応物を仕上げて2,3-アセトニド基を除去した。予想産物の精製をアイソクラティック65%MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって45分間行うと、PoA 22-メチルエーテル(R.t.=42分)3.0 mg(6%)が収集されて、その後MeOH 5 mLを複数回注入すると、ジメチル化化合物が溶出して、これをアイソクラティック75%MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLCによって精製した(3.8 mg、8%)。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS(PoA 22-メチルエーテル:
PoA 14,22-ジメチルエーテル:
)によって行った。
ダクリハイナンステロン22-メチルエーテルは、PoA 2,3-アセトニド(61.0 mg、121.0μmol)とAg2O(278.0 mg、10等量)およびCH3I(121μL、15等量)の無水DMF溶液(1.7 mL)との46時間のメチル化反応の副産物として得られた。ダクリハイナンステロン様共役系(λmax=299 nm)がλ=300 nmでのDADモニタリングを伴うHPLCによって検出された。産物をアイソクラティック75%MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLCによって精製した後(R.t.=24.7分)、アイソクラティック65%MeOH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLCによって精製して(R.t.=26.9分)、ダクリハイナンステロン22-メチルエーテル1.7 mg(3%)を得た。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS(ダクリハイナンステロン22-メチルエーテル:
によって行った。
Ag2O(590.0 mg、10等量)およびCH3I(238μL、15等量)をPoA(118.1 mg、254.6 μmol)の無水DMF溶液(3.3 mL)に加えて、反応物を無水条件下で室温で撹拌した。反応を18時間後に停止させPoA 2,22-メチルエーテルを得るか、または46時間後に停止させて他の全ての産物を得た。全ての場合において、20E 22-メチルエーテルに関して記載したように仕上げた。予想産物の精製をアイソクラティック75%MeOH/H2Oを用いる分取C18-HPLCによって行うと、6% PoA 2-メチルエーテル(R.t.=20.2分)、2%PoA 14-メチルエーテル(R.t.=24.7分)、16.0%PoA 2,22-メチルエーテル(R.t.=39.7分)、および7%PoA 3,22-メチルエーテル(R.t.=32.9分)が収集された。完全な特徴決定は、300 MHz NMR分析(表3a〜3e)およびCIMS(PoA 2-メチルエーテル:
PoA 14-メチルエーテル:
PoA 3,22-ジメチルエーテル:
PoA 2,22-ジメチルエーテル:
)によって行った。
a 保持時間を分で表す。
方法 A:C18-RP-HPLC(150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配30%〜100%メタノール/水で25分、流速=1 mL/分、λ=242 nm)
方法 B:C6-RP-HPLC(150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配30%〜100%メタノール/水で25分、流速=1 mL/分、λ=242 nm)
方法 C:ジオールNP-HPLC(150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配2%〜10%メタノール/ジクロロメタンで20分、流速=1 mL/分、λ=242 nm)
方法 D:ジオールNP-HPLC(150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配4%〜10%メタノール/ジクロロメタンで20分、流速=1 mL/分、λ=242 nm)。
a 保持時間を分で表す。
方法 A:C18-RP-HPLC(150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配30%〜100%メタノール/水で25分、流速=1 mL/分、λ=242 nmおよび300 nm)
方法 B:C6-RP-HPLC(150×4.6 mm、5 mm粒子径、勾配30%〜100%メタノール/水で25分、流速=1 mL/分、λ=242 nmおよび300 nm)
方法 C:Apex IIジオールNP-HPLC(150×4.6 mm、5 mm粒子径、アイソクラティック2%メタノールのジクロロメタン溶液、流速=1 mL/分、λ=242 nmおよび300 nm)。
試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率(ppm)で表記する。u.s.s.:溶媒シグナル下。
a :400 MHzで収集した1H-NMR、100 MHzで収集した13C-NMR。
b :300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。
* :20Eに関する文献データ(www.ecdybase.org)と比較して割付。
試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率(ppm)で表記する。u.s.s.:溶媒シグナル下。
a :400 MHzで収集した1H-NMR、100 MHzで収集した13C-NMR。
b :300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。
* :20Eに関する文献データ(www.ecdybase.org)と比較して割付。
試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率(ppm)で表記する。u.s.s.:溶媒シグナル下。
a :400 MHzで収集した1H-NMR、100 MHzで収集した13C-NMR。
b :300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。
* :20Eに関する文献データ(www.ecdybase.org)と比較して割付。
試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率(ppm)で表記する。u.s.s.:溶媒シグナル下。
a :400 MHzで収集した1H-NMR、100 MHzで収集した13C-NMR。
b :300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。
* :20Eに関する文献データ(www.ecdybase.org)と比較して割付。
300 MHzで収集した1H-NMR、75 MHzで収集した13C-NMR。試料をメタノール-d4に溶解した。ケミカルシフトを百万分率(ppm)で表記する。u.s.s.:溶媒シグナル下。
*:PoAに関する文献データ(www.ecdybase.org)と比較して割付。
**:ダクリハイナンステロンに関する文献データ(www.ecdybase.org)と比較して割付。
合成および精製された化合物を全て、エクジステロイド受容体に対するその親和性を査定するためにBIIバイオアッセイにおいて試験した。インビトロバイオアッセイにおけるステロイド応答性を、キイロショウジョウバエBII細胞株を用いて行った。アッセイは、代謝および輸送の曖昧さがほとんどないことが知られている。これは、エクジステロイド受容体複合体を発現しかつエクジステロイドに対して特徴的な応答を示すショウジョウバエのl(2)mbn腫瘍性血液細胞株に基づいており、この応答は濁度測定によって測定される。正常な条件では、細胞は有糸分裂を受けて均一な被膜の小さな細胞を形成する。ステロイドアゴニストに曝露されると、細胞は肥大して貪食を受け、密度の高い細胞塊のように見え;したがって吸光度が低下する。アンタゴニストはこの応答を阻止し、それにより細胞密度の増加をもたらし;吸光度は20E処置対照と比較して増加する。バイオアッセイを行うため、試験される化合物を10-3 M〜10-10 Mのいくつかの濃度の20μLアリコートで96ウェルマイクロタイタープレート(Nalge Nunc, Hereford, UK)のウェルに加える。アンタゴニスト活性に関して試験するために濃度5×10-8 Mの20Eの20μLアリコートをウェルに加えた。プレートを25℃で6〜7日間インキュベートして、405 nmでの吸光度を測定するプレートリーダー(Anthos htll, Anthos Labtec, Salzburg, Austria)を用いて応答を定量的に測定した。アッセイの結果を表4に示す。
本実施例は、核内受容体に基づく誘導型遺伝子発現系において用いるためのグループH核内受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む遺伝子発現カセットの構築を説明する。出願人は、ハマキガであるトウヒノシントメハマキEcR(CfEcR)に基づく遺伝子発現カセットを構築した。調製された受容体構築物は、EcRのリガンド結合ドメイン、またはヒト(Homo sapiens)RXRβ-LmUSPもしくはハツカネズミRXRβのキメラ、およびGAL4 DNA結合ドメイン(DBD)またはVP16トランス活性化ドメイン(AD)を含む。レポーター構築物には、Gal4 DBDが結合する対象であるGAL4応答エレメントを含む合成プロモーター構築物に機能的に連結した、レポーター遺伝子ルシフェラーゼが含まれる。
本発明の任意の化合物が哺乳動物トランス活性化アッセイにおけるレポーター遺伝子活性の誘導物質として作用しうるか否かを判定するために、これらの化合物を、pFRLUCレポーターおよび実施例3に記載の遺伝子発現カセット3.1〜3.9をトランスフェクトしたNIH3T3細胞において試験した。トランスフェクトした細胞を、0.01〜33μMの化合物濃度の存在下で生育させた。リガンド添加の48時間後、細胞を回収して、レポーター活性をDual Luciferaseアッセイキット(Promega Corporation)を用いてアッセイした。相対光量単位(RLU)の合計を示す。細胞の培養および維持に関する標準的な方法に従った。
ルシフェラーゼ活性を、 Promega CorporationのBright-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ系を用いて製造元の説明書に従って処置後48時間で測定した。相対最大誘導倍率(Rel Max FI)は、任意の濃度で観察されたポナステロンA(PoA)および20-ヒドロキシエクジソン(20E)の最大誘導倍率に対する、任意の濃度で観察された試験リガンドの最大誘導倍率として、決定した。EC50値を、3パラメータロジスティックモデルを用いて用量反応データから計算した。アッセイの結果を表7に示す。
CF=トウヒノシントメハマキ(Cf)EcR
AA=ネッタイシマカ(Aa)EcR
AMA=マダニ(Ama)EcR
BA=シルバーリーフコナジラミ(Bamecia argentifoli)(Ba)EcR
DM=キイロショウジョウバエ(Dm)EcR
MS=タバコスズメガ(Ms)EcR
NC=ツマグロヨコバイ(Nc)EcR
TM=チャイロコメノゴミムシダマシ(Tm)EcR
遺伝子スイッチの半合成ステロイドモジュレータを開示する。代表的なエクジステロイドである20-ヒドロキシエクジソン(20E)およびポナステロンA(PoA)を、2位、3位、14位、22位、および25位で1メチル化およびマルチメチル化するか、または22位で1アルキル化した。半合成ステロイドを、キイロショウジョウバエ、トウヒノシントメハマキおよびネッタイシマカEcRおよび/またはその変異体を用いて、天然の昆虫系(ショウジョウバエBII細胞)と工学操作された遺伝子スイッチ系の双方においてアッセイした。遺伝子スイッチの効果は、22位でメチル化された20EおよびPoAに関して維持または増強される。アルキル化ステロイドのSARは、22-OHがH-結合アクセプターであり、25-OHはおそらくH-結合ドナーであり、ならびに2-OHおよび3-OHが互いに対しておよびEcRに対してドナーおよび/またはアクセプターであることを示している。全体として、膜相互作用(MI)-QSAR方法論を用いて計算されたADME特性は、logPまたは血漿タンパク質結合を過剰にモジュレートすることなく、より低い溶解度、より高い透過性、およびより高い血液脳関門浸透性に向けて望ましい傾向を示している。アルキル化により、遺伝子スイッチ技術の遺伝子治療用途のためのステロイド活性化剤の改善が実証される。
PoAは、Rene Lafont, Universite Pierre et Marie Curie, Parisによって供給された。20Eは、Dr. V. Volodin, Institute of Biology, Russian Academy of Sciences, Syktyvkar, Russiaから供給された。溶解度およびlogD測定のためのPoAをAxxora/ Alexis Corp.から購入したが、20EおよびムリステロンAは、Sigma-Aldrich Inc.から得た。他の試薬および溶媒は、Fisher ScientificおよびSigma-Aldrichから購入した。NMR分析のための重水素化溶媒は、Goss Scientific Instruments Ltd(Great Baddow, U.K.)から購入した。無水アセトンおよびCH2Cl2を使用前に蒸留した。HPLC用水を純度17オームの程度まで脱イオン化した。他の全てのHPLC溶媒を0.45μm(水溶液の場合)または0.5μm(有機溶液の場合)Waters Millipore(登録商標)フィルターを通しての吸引濾過によって使用直前に脱気した。無水反応条件は、シュレンク反応管を真空下でフレームドライすることおよび試薬の前に窒素またはアルゴン雰囲気を導入することによって、達成された。液体の移動にはカニューレを用いた。ステロイドを使用前に凍結乾燥した。酸化銀反応は、アルミニウムホイルで覆うことによって光から保護された。
エーテル化の前に、開始エクジステロイドの2,3-および/または20,22-ジオール基を、対応する20.22-フェニルボロネート、2,3-アセトニド、または2,3,20,22-ジアセトニド類似体に転換することによって選択的に保護した(図1)。ステロイドエーテル1および2に関する合成技法を、説明実施例として以下に記載する。
Ag2O(116.0 mg、10等量)を新しく調製した20E 20,22-フェニルボロネート(25a;30 mg、53μmol)のDMF溶液(2 mL)の撹拌溶液に室温で無水条件下で加えた。CH3I(258μL、44.7等量)を反応の過程において4回に分けて加えて、追加のAg2O(10等量)を4時間後に加えた。反応物をHPLC-DADによってモニターした。7.5時間後、酢酸エチル(25 mL)を加えて、混合物を 多孔度4の焼結ガラスフィルター漏斗(Weiss-Gallenkamp, U.K.)に載せたCelite(登録商標)(BDH Chemical Ltd., Poole, U.K.)パッドによって濾過した。フィルターを追加の酢酸エチル(150 mL)によって洗浄して、溶媒を真空下で蒸発させた。粗反応混合物を、Sep-Pak(登録商標)Vac 35cc C18-10gカートリッジ(Waters, Elstree, U.K.)を用いて固相抽出によって予め精製した。産物をTHFとH2O2の9:1(v/v)混合物(100容量、0.1 N NaOHによって予め中和)に溶解して、室温および中性pHで2.5時間撹拌した後、H2Oによって希釈してTHFを蒸発させ、および固相抽出によって、フェニルボロネート基を除去した。粗産物を、アイソクラティック1:1 CH3OH/H2Oを用いるセミ分取C18-HPLC(Phenomenex Sphereclone ODS2、250×10 mm、5μm、流速=2 mL/分、242 nm)によって精製すると、2が20分後に溶出して(6 mg、25%;純度>99%)、1が23分後に溶出した(13 mg、50%;純度>99%)。
DTBMP(88.8 mg、6等量)およびメチルトリフラート(47μL、6等量)を20E 2,3-アセトニド(25b、37.5 mg、72.1μmol)の無水CH2Cl2溶液(3 mL)に加えた。混合物を無水条件で室温で撹拌した。55時間後、メチルトリフラートを真空下で除去して、残渣を0.1 M HClと1,4-ジオキサンの1:1(v/v)混合物によって処置した。メチル化ステロイドを分取C18-HPLC(Phenomenex Sphereclone ODS2、250×21.20 mm、5μm、流速=5 mL/分)によってアイソクラティック60%CH3OH/H2Oを用いて精製した。収量:10 は11.15 mg(31%;純度>99%)および14は5.63 mg(15%;純度>99%)であった。
キイロショウジョウバエBII細胞株バイオアッセイを用いてEcRリガンドの活性を試験した。アッセイを1試料あたり4個ずつ行った。簡単に説明すると、保存液(10-3 M〜10-10 M)のMeOH溶液を、試験化合物の各々に関して調製した。各希釈液のアリコート(20μL)を、マイクロタイタープレートのウェルに移して、溶媒を蒸発させた。細胞およそ2×105個/mLの細胞浮遊液(200μL)を各ウェルに加えて、蓋をしたプレートを25℃の湿潤環境で7日間インキュベートした。細胞の応答をステロイド濃度の関数として濁度測定(405 nm)によって測定する。
マウス胚線維芽細胞(NIH3T3)に以下の構築物をトランスフェクトすることによって、細胞遺伝子スイッチアッセイを行った。(a)トウヒノシントメハマキEcR(CfEcR-DEF)、(b)E-ドメインにおいてE274V / V390I / Y410E変異を有するトウヒノシントメハマキEcR、(c)ネッタイシマカEcR(AaEcR-DEF)、および(d)キイロショウジョウバエEcR(DmEcR-DEF)の野生型のD-、E-、およびF-ドメインを、GAL4-DBDに融合させて、CMVプロモーターの制御下に配置した。ヒトRXRβおよびトノサマバッタRXRからのキメラRXRをVP-16-ADに融合させて、SV40eの制御下に配置した。誘導型ルシフェラーゼレポータープラスミドであるpFRLuc(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA)は、5コピーのGAL4応答エレメントおよび1つの合成最小プロモーターを含有する。VP16活性化ドメインならびに非対称EcRおよびグルココルチコイド受容体応答エレメントを認識する3残基の変異DBDを有するハイブリッドEcRを使用するVgEcR/RXR遺伝子スイッチ系を、Invitrogen Inc.(Carlsbad, CA, USA)から得て、ルシフェラーゼレポーター-含有ベクターを用いてNIH3T3細胞における一過性のトランスフェクションによって類似のように使用した。
エクジステロイドおよび関連BII活性値のライブラリを用いて、3D-QSARモデルを生成またはバリデーションした。O-アルキル化ステロイド15個(1〜7、9〜15、および18)を分析に含めたが、他の化合物は、植物から単離したか、購入したか、または他の研究者から供与された。活性試験に供される全ての化合物に関して少なくとも97%の純度要件を設定した。試験したステロイドエーテルは、少なくとも98%純粋であった。QSARライブラリにおける構造および活性データの双方に関して、精度のチェックを行った。
SYBYL 7.0を用いて、分子モデリング、比較分子場解析(CoMFA)および比較分子類似性指数解析(CoMSIA)を行った。ニセアメリカタバコガ(Hv)EcR(PDBコード=1R1K)に結合したPoAに関して報告された結晶構造をQSAR分子セットに関するコンフォメーション選択のための分子鋳型として用いた。任意のコンフォメーション決定を必要とする分子を個別に、HvEcRとの複合体におけるPoAに重ね合わせ、ステロイド足場構造における問い合わせ置換基を、リガンド結合ポケットにおける立体的容認性を最大限にするように手動で調節した。得られた化合物の3D-モデルをGasteiger-Huckel 電荷を有する標準的なTriposの力の場を用いてエネルギーを最小限にして、17-炭素ステロイドコアによって整列させ、SYBYL座標格子の中心に配置した。部分的な原子電荷を、MOPACインターフェースによってSYBYLにおいて計算した半経験的MNDO法(ESP適合)を用いて割付した。
ステロイドO-アルキルエーテル類似体のオクタノール-水分配係数(MlogP)を、既に計算された非エーテルステロイドのMlogP値に対してスケーリングすることによって決定した。確立された膜-相互作用QSAR(MI-QSAR)モデルを用いて、Caco-2細胞透過性係数および血液脳関門分配係数を算出した。MI-QSAR分析には、QSARモデルの開発において用いられた記述子プールにおいて、リン脂質、この場合はジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)分子で構成されるモデル膜アセンブリを通してのトレーニングセットを含む各溶質(低分子有機化合物)の輸送のシミュレーションに明白に由来する特性および特色が含まれる。ヒト血清アルブミン(HSA)に対するステロイド結合の推定値は、3D-FEFF-QSAR分析を用いて得られた。このアプローチは、スコア関数としてスケーリングされたQSARモデルを用いて、ステロイドリガンドのHSAに対する結合の自由エネルギー、ΔGを計算する。ΔG=RT ln(Ka)を用いてKa値を誘導した。Ka=(1/Kb)であり、式中Kbは、結合がHSAのみに対して起こり、バイナリ複合体が形成されて、リガンドの濃度と比較して過剰量のHSA([HSA]=0.6 mM)が存在すると仮定した場合の、HSAに対する分子の結合親和性である。ステロイドO-アルキルエーテル類似体の水溶解度をAMSOL法およびソフトウェアを用いて決定した。
LogDを Absorption Systems, Incによって測定した。ポナステロンAおよび20Eを、テストステロン標準物質を用いて1試料あたり2個ずつ1.5 mL振とうフラスコシステムにおいて等量のpH 7.4の緩衝液および水飽和オクタノール中、100μMで測定した。各々の振とうフラスコを室温で60分間撹拌した後、室温で1時間放置した。有機層および水層の連続希釈液を調製して、各希釈での試験化合物の濃度を、少なくとも4点較正曲線によって一般的なLC/MS/MS法を用いて計算した。水溶解度はRobertson-Microlit, Inc.によって測定された。PoA、20E、ムリステロンA、およびジアシルヒドラジンの飽和溶液試料をHPLC等級の水に溶解して、25℃で1、5、および10日間撹拌した後、0.45ミクロンフィルターを用いて濾過し、透明な溶液を得た。各基質に関して、UV吸収を、必要に応じて希釈して249、248、239 nmおよび219 nmの最大値で測定した。吸光度を、CH3OH中の同じステロイドの1〜2%溶液に対して同じ最大吸光度で、参照標準物質の吸光度と比較し、溶媒効果による最大シフト10 nMまでを許容した。
最も豊富な昆虫脱皮ホルモンである20E(25)、最も強力な天然のエクジステロイドの1つであるPoA(26)、珍しいコア構造を有する中等度に強いアゴニストであるダクリハイナンステロン(27)の誘導体が含まれる、ステロイドO-アルキルエーテル23個を合成した(図2)。20Eの誘導体は、2-OH、3-OH、14-OH、22-OH、または25-OHでのモノメチルエーテル5種類(1〜4、10)、22-OHならびに2-OH、3-OH、14-OH、および25-OHの各々1つでのジメチルエーテル4種類(11〜14)、およびテトラメチルエーテル1種類(15)である。PoA誘導体には、2-OH、14-OH、または22-OHでのモノ-O-メチルエーテル3種類(16〜18)、および二重エーテル官能性を有する類似体3種類(19〜21)が含まれる。メチルエーテルのほかにいくつかの20E-22-O-エーテル類似体を調製したが、これには炭素4個までの鎖を有するO-n-アルキル基(5、6、および8)、ならびにアリル(7)、ベンジル(8)、および2'-エチルオキシラニル(23)エーテル基を有する化合物が含まれる。個々のヒドロキシル位置へのメチル基の選択的導入は、2,3-シスおよび/または20,22-ジオール基のアセトニドまたはフェニルボロネート基への変換を伴う、図1において描写される保護/脱保護戦略を用いて得られた。1メチル化および多重メチル化類似体(16、17、19、20)の同時の調製は、非保護エクジステロイドによって開始する1ポット反応アプローチによって達成された。この方法は、反応時間の点において有利であるが、注意深いHPLCによる反応のモニタリングを必要とし、多重メチル化類似体対1メチル化類似体の比率が高くなる。Ag2OおよびCH3Iを伴うメチル化反応において、エクジステロイドヒドロキシル基の反応性の順序は、22-OH>2-OH>3-OH>>14-OHである。20Eの三級25-OHのメチル化は、Ag2O/CH3Iを用いて観察されなかったが、14-OHは、反応温度(60℃まで)または試薬量を増加させることによってCH3O基に変換された。しかし、Ag2Oに対する過剰なまたは持続的な曝露によって、脱水および/または発色団の変化などの産物の分解に至る。適例として、変化した発色団(7,9(11)-ジエン-6-オン基)を有するメチル化PoA誘導体であるDaH 22-メチルエーテル(22)の形成が、室温でのAg2O/CH3Iに対するPoAの持続的な曝露(46時間)後に観察された。仮定される反応機序は、Ag2Oによる2つの11-H原子のうち1つの消失に続き、共役に向けての二重結合移動を伴いうる。エクジステロイドなどの化学的感受性分子にとって適した代わりのO-メチル化法の探索において、本発明者らは、25℃における無水条件下で、メチルトリフラートおよびDTBMPの各6等量が、25-OH>22-OH>>14-OHの反応シーケンスで、20E 2,3-アセトニド(25b)の25-OHメチル化を円滑におよび選択的に促進することを見いだした。このアプローチは、ポリヒドロキシル化ステロイドのO-メチル化のために新しく開発された技法を表す。本発明者らの実験の全てにおいて、20-OH位はメチル化に対して不応性のままであった。
O-アルキルエクジステロイド1〜23の1Hおよび13Cスペクトルの割付は、親化合物(20E、PoA、またはDaH)のスペクトルと比較し、かつ1H-1H COSY、1H-13C HMQC、および1H-13C HMBCスペクトルにおけるJカップリング連結度を調べることによって行った。2位、3位、および/または22位での二級エーテル置換基の1Hシグナルは、およそ0.4 ppmの特徴的な高磁場シフトを示し、親エクジステロイドに対しておよそ10 ppm低磁場にシフトする13Cシグナルに対応した。14α-OCH3基を有するステロイドは、その1H-NMRスペクトル(9α-Hシグナルがおよそ0.3 ppmの高磁場シフトを示す(δH=2.76〜2.78 ppm))から、およびその13C-NMRスペクトル(14-Cシグナルがおよそ6 ppmの低磁場シフトを示す(δC=90.95〜90.98 ppm))から、容易に認識されうる。14-O-メチル基のα-立体化学は、NOESY実験において、9α-Hシグナルの電磁波照射によって確認され、14-OCH3シグナルの3%増強(2.97 ppm)および2α-Hシグナルの13%増強(3.53〜3.81 ppm)に至った。20E 25-メチルエーテル類似体は、20Eに関する25-Cシグナルに関しておよそ5 ppmの低磁場シフトを示し(76.16 ppm)、26-Cおよび27-Cシグナルに関しておよそ4 ppmの高磁場シフトを示した(25.52および25.27 ppm)。エクジステロイドメチルエーテル類似体の1H NMRスペクトルにおいて、2β-OCH3、3β-OCH3、14α-OCH3、22-OCH3および25-OCH3から生じた一重線はそれぞれ、3.39、3.40、2.97、3.50、および3.19 ppmで出現した。20E 22-エチル、プロピル、およびブチルエーテル類似体の1H-NMRスペクトルにおいて、22-OR基のα炭素に付着する2つのプロトンは、3.51〜3.75 ppmの範囲のδHでジアステレオトピックシグナルとして出現した。23の1H-NMRスペクトルにおいて、63.54 ppmでの13Cシグナルに対応する3.49 ppmおよび3.39 ppm(2J=12 Hz)での2つの二重線は、22-エチルオキシラニル基の一対のオキシラニルプロトンに割付され;23のO-C-O基の4価の13Cシグナルは110.25 ppmに下落した。
キイロショウジョウバエBII細胞は天然で、本来のEcR-USP複合体を発現し、EcRアゴニストおよびアンタゴニストに対して特異的で定量的な応答を与える。O-アルキルステロイド1〜23は、分子中のエーテル置換基の数および位置に応じて、100μMから1 nMの範囲の濃度でBIIバイオアッセイにおいてアゴニスト効果を発揮した。特に、20Eの2-、3-、14-、および25-ヒドロキシル基のメチル化は、効果を低減させるが、20E 22-メチルエーテル(4)は、20Eの効果を維持する。22-エチルエーテル類似体(5)は、メチルよりわずかに弱いが、活性の差は、プロピル、アリル、およびブチル(6、7、8)とアルキル基が大きくなるに従って増大する。しかし、22-O-ベンジル置換基(9)は、20Eの効果をあまり増加させない。任意の位置でのPoAのO-アルキル化は、BIIバイオアッセイにおける効果を減少させる。
O-アルキルステロイドが遺伝子発現を作動させることができるか否かを、誘導系の成分を一過性にトランスフェクトしたマウス細胞株において調べた。主に、2つの遺伝子スイッチ型を用いた:一方は野生型ハマキガ(Cf)EcR(wt-CfEcR-DEF)に基づき、他方はこの受容体のE274V/V390I/Y410E変異体(変異体-CfEcR-DEF)に基づいた。いくつかのステロイドに関して、黄熱病媒介蚊(Aa)およびショウジョウバエ(Dm)EcRについて同じ遺伝子スイッチフォーマットで類似の実験を行った。ヒトRXRβとトノサマバッタの昆虫USP(LmUSP)とのキメラをVP 16-ADに融合させて、EcRに関するパートナータンパク質として用いた。
CoMFAの立体的静電場、CoMSIA H-結合ドナー、H-結合アクセプター、および疎水性場のみならず極性表面積(PSA)が含まれる分子場の多様な組み合わせを、エクジステロイドライブラリを最もよく表すように選んだ。得られた3D-QSARモデルの統計値を図5に要約する。
EcR遺伝子スイッチの使用は、細胞および組織培養の双方のみならず動物モデルにおいて証明されている。最も強力なリガンドは、主に2つの化学タイプ:合成ジアシルヒドラジンおよび天然の、通常は植物由来であるステロイドによって表される。双方の群からの代表的なリガンドは、モデル試験においてEcR遺伝子スイッチにおいて用いられて成功している。生物学的利用率の見通しから、ジアシルヒドラジンは、いくつかの容易に代謝可能な座を有するクラスII型ADME特徴(低い溶解度、高いlogP、高い透過性)を有するが、エクジステロイドはより溶解度が高く、logPがより低く、容易に代謝または共役されうる多くのヒドロキシル基を有する。
20E、PoA、およびDaHのO-アルキルエクジステロイド類似体23個を合成した。(a)22-メチル化と共にしか得られないPoAの3-メチルエーテル、および(b)20-ヒドロキシルが不活性であると証明されているので20メチルエーテルを除いて、20EおよびPoAの全てのモノメチルエーテルを、得た。合成全体は、2,3-および20,22-ジオール基それぞれに対する十分に確立されたケタールおよびボレートジオール保護戦略に依った。20E 22-メチルエーテル(4)および22-エチルエーテル(5)の合成、ならびに20E 25-メチルエーテル(ポリポドアウレイン10、シダであるダイオウウラボシ(Polypodium aureum L.)由来)の単離は、本研究の前に既に記載されているが、これらのいずれも遺伝子スイッチアッセイに供されていない。
エーテル1〜23の遺伝子スイッチ有効度を試験するために、2つの遺伝子スイッチフォーマットを用い、3番目はいくつかのリガンドを用いて簡単に調査した。1番目は天然のキイロショウジョウバエBII細胞株であった。BII細胞株は、腫瘍形成性血球変異体(l[2]mbn)の血球に由来する。BII細胞にステロイドを加えると、貪食を誘導するシグナルとして作用して、細胞は、均一な層の小さな細胞から、透明な領域に取り囲まれるより大きい細胞塊へと発達する。この応答を濁度測定によって定量することができる。
ステロイドを、所定の位置での1つまたは複数のメチルキャップの有無に従って対にして、ショウジョウバエBIIアッセイにおける効果の差を計算した(図6)。2位、3位、14位、22位および25位の範囲で1エーテル置換を有する20EおよびPoAエーテル誘導体(1〜10、16〜18、22〜23)により、効果の差と特定のOH基のキャッピングとのあいだの関係の直接導出が可能である。平均すると、各ヒドロキシル位置でのメチル化によって、効果の低下が起こり、これは以下のEC50の対数単位の低下順に従って序列化される効果:14-OH(2.12)、2-OH(1.67)、25-OH(1.09)、3-OH(1.06)、および22-OH(0.35)。しかし重大なことに、20E自体(4、-logEC50=8.20)を含むステロイド9個中5個の22-メチル化は、わずかな効果増大をもたらす。多重メチル化は一般的にその効果に関して相加的である。
エクジステロイドエーテルは、好ましいADMEプロフィールを有する。ADME特性のいくつかである、水溶解度、logP(MlogP)、血液脳関門(BBB)透過性、Caco-2細胞透過性、およびヒト血清アルブミン(HSA)結合を、例示的なステロイドエーテルおよび参照化合物に関して計算した(図7)。
PoAおよび20Eの水溶解度計算値は、経験的に得られた値(それぞれ、0.18 mg/mLおよび6.7 mg/mL)と一致する。一般的に、溶解度はヒドロキシル基の数と共に増加する(たとえば、ムリステロンA>20E>PoA);これに対応してヒドロキシル基をキャッピングすると一般的に、溶解度は減少する。注目すべき例外は、20E 22-アルキルエーテルである。たとえば、ステロイド5(20E 22-O-エチルエーテル)および7(20E 22-O-アリルエーテル)の溶解度は、遊離の20,22-ジオールを有するその親化合物よりわずかに高い。1つの説明は20Eの20,22-ジオールの分子内水素結合であり、それによって、20-OHドナー/22-OHアクセプターの状況に限って関与し得かつしたがって溶媒との水素結合に対する熱力学的拘束がより強い、可溶性の分子間水素結合が、22-アルキル類似体と比較して減少する。同様にして、22-OH/25-OH分子内水素結合効果も同様に有意である可能性がある。20EのO-22でのメチル化により、22-OHドナー/25-OHアクセプターの状況において分子内H-結合が破壊され、ゆえに、20Eに対する20E 22-O-メチルエーテルの水溶解度の低下は、PoAに対する、25-OHを欠如しかつしたがってこの内部H-結合を形成することができないPoA 22-O-メチルエーテルの低下よりも、少ない。ジアシルヒドラジン30に関して、水溶解度の計算値(3.6 mg/mL)と実測値(6.2 μg/mL)のあいだには約3オーダー分の差が存在する。実験上、ジアシルヒドラジンは、容易に結晶化される材料である。おそらく、溶解度の矛盾は、MI-QSARモデルが原因ではない物理的挙動により現れている。
水溶解度と同様に、MlogP値は、アルキル化に伴い正に傾く。この場合も、22-アルキル化は例外である:この位置でのアルキル化は、水溶解度の傾向に関して引き合いに出したのと同じ分子内結合の理由から、MlogPを実際には低下させる。MlogPは実験値を過大評価する:20E logDexp=0.01(logPcalc=1.25);PoA logDexp=1.95(logPcalc=2.19)。
分子のBBB通過能の測定値は、BBB分配係数の対数(logBB)であり、これはlog(Cbrain/Cblood)に等しく、式中Cbrainは化合物の脳内濃度であり、Cbloodは化合物の血液中濃度である。公表された実験的BBB分配データによれば、log(BB)値>0.3は、脳に容易に分布する化合物に関連し、log(BB)値<-1は、脳への分布が不十分な分子を指す。本発明者らのADME推定値は、20E、PoAおよびムリステロンAが脳内に中等度に分布することを示している(-0.89<log(BB)<-0.35)。他方、O-アルキルエーテルステロイド、特にPoA 2-メチルエーテル(16;log(BB)=0.16)およびPoA 22-メチルエーテル(18:log(BB)=0.23)は、増加したBBB通過能を示す。正のlog(BB)値は、可能性がある中枢神経系(CNS)治療物質にとって望ましい。同様に20E O-アルキルエーテル類似体は、20Eと比較して高いlog(BB) 計算値を有する。
いくつかのステロイドのCaco-2細胞透過性係数(PCaco-2)を、確立されたCaco-2細胞透過性QSARモデルを用いて決定した。図7において示されるように、PCaco-2値は、ムリステロンAから20E、PoAまで連続的に増加するが、これに伴って分子の親油性(MlogP値)が増加して、水溶解度が減少する。PoA O-アルキルエーテル誘導体16、18および20は、親分子PoA(19×10-6 cm/秒)と等しいかまたはそれより高いPCaco-2値(20×10-6〜29×10-6 cm/秒)を示し、20E O-アルキルエーテル誘導体4、5、7、10、および14も同様に、親化合物20E(16.3×10-6 cm/秒)と等しくまたはそれより容易に(14〜24×10-6 cm/秒)Caco-2細胞を透過する。これらの結果は、O-エーテルエクジステロイド誘導体の経口での生物学的利用特性の改善を示している。
A)Caco II透過性アッセイ:Transwell(登録商標)ウェルにおいて21〜28日目のCaco-2細胞のコンフルエント単層(n=2)に、pH 7.4±0.2で先端および基底外側の各々において試験ステロイドを投与した。各々の側面を120分に試料採取して、先端-基底外側(A-B)および基底外側-先端の透過性(B-A)を決定した。試験化合物の濃度を少なくとも4点の較正曲線によって一般的なLC/MS/MS法を用いて測定した。(Papp A→B)<1.0×10-6 cm/sを特徴とする物質は低い透過性を有すると見なされる。この値より大きいと高い透過性である。物質は、流出>3.0で(Papp B→A)>1.0×10-6 cm/sである場合には、有意な流出を有すると見なされる;B)血漿タンパク質結合アッセイ:各透析ウェルの片面がpH 7.4のリン酸緩衝生理食塩液(PBS)を含有し、ウェルの片面が男女のヒト血漿を含有する透析ウェル(n=2)に、試験ステロイドを投与した。37℃でおよそ24時間後、各ウェルの血漿および緩衝液面の試料を採取して、LC/MS/MSを用いて分析した。これらの実験はAbsorption Systems, Inc.で行われ、結果を表8に表す。
HSA結合親和性は、薬物の発見および開発において考慮される重要な薬物動態特性である。HSAとの結合によって、循環中で疎水性分子は可溶化する。血清アルブミンに対する化合物の結合強度は、標的組織に対する化合物の分布、およびゆえにその生物学的利用率を決定する主な要因の1つである。図7において示されるように、エクジステロイドは、2.1×10-4〜3.8×10-4(Ka値)の範囲の類似のHSA結合親和性を示す。この組におけるHSA結合が最も弱い化合物は20E 22-エチルエーテル(5)であり、これはまたこの組のエーテルのうち最も低いMlogP値および最も高い水溶性計算値を有する。HSA結合が最も強い化合物は、PoA 3,22-ジメチルエーテル(20)であり、これはまたこの組のエーテルのうち最も高いMlogP値を有し、エクジステロイドに対する水溶解度計算値が低い範囲にある。このように、エクジステロイドHSA結合と化合物の疎水性と水溶解度のあいだには一般的な相関がある。
エクジステロイドが含まれるステロイドは、EcRに基づくスイッチ系においてもう1つの有用な化学タイプであるジアシルヒドラジンに加えて遺伝子スイッチリガンドを表す。
本発明者らは、一般的な2-ハイブリッド遺伝子スイッチフォーマットにおいて9種の節足動物を表すEcR 10個の群に対して42個のステロイドの組をアッセイした;BIIアッセイおよびVGECR/RXR遺伝子スイッチからのデータを本文において解釈した。傾向および異常な効果の逆転も同様に作表した。EcR配列を整列させて、利用可能な結晶構造からの接触残基(鱗翅目ニセアメリカタバコガ(Heliothis virescens)[Hv]、半翅目タバココナジラミ(Bemisia tabaci)[Bt]、および甲虫コクヌストモドキ(Tribolium castaneum)[Tc]からのLBD)に注釈をつけて、リガンドに対する置換基の変化と受容体に対する残基パターンのあいだの効果の相関を書き留めた。SAR域外値は、リガンドデータセットにおいてリガンドを明らかにすることを提供する。効果の逆転は直交遺伝子スイッチの構築のために同定される。
ステロイドの単離、精製、および合成
半合成ステロイド20E 2-メチルエーテル、20E 3-メチルエーテル、20E 22-メチルエーテル、20E 2,22-ジメチルエーテル、20E 3,33-ジメチルエーテル、20E 2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン22-O-ピロールカルボキシレート、およびツルケステロン-11αプロピオネート、ツルケステロン-11αヘキサノエート、ツルケステロン-11αデカノエートを20Eまたはツルケステロンから調製した。20-ヒドロキシエクジソンから合成されたポナステロンAを除き、残りのステロイドは、植物材料から単離された。ムリステロンAは、AG Scientific Inc.(San Diego, CA)から購入した。以下の化合物は他の研究者によって提供された:2-デオキシエクジソン、エクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、およびシアステロン(Prof. Rene Lafont)、タキシステロン、ポリポジンB、アジュガステロンC、(25S)-イノコステロン、(25R)-イノコステロン、マキステロンA、マキステロンC、カルタモステロン(carthamosterone)、インテグリステロンA(intergristerone A)(Dr. Juraj Harmatha)、20-ヒドロキシエクジソン(Dr. Vladimir Volodin)、ツルケステロン(Prof. Zyadilla Saatov)およびカネセンステロン(Prof. Apichart Suksamrarn)。合成/精製において用いられる試薬および溶媒はFisher ScientificおよびSigma-Aldrichから購入した。HPLC用水は、純度17 Wの程度にまで脱イオン化した。
ショウジョウバエBII細胞株バイオアッセイを用いて、潜在的EcRリガンドの活性を試験した。アッセイは1試料あたり4個ずつ行った。保存液(10-3 M〜10-10 M)のメタノール溶液を、試験化合物の各々に関して調製した。各希釈液のアリコート(20μL)をマイクロタイタープレートのウェルに移して、溶媒を蒸発させた。ウェルに細胞浮遊液200μLをおよそ2×105個/mL培地で加えて、蓋をしたプレートを25℃の湿潤環境において7日間インキュベートした。ステロイド濃度の関数としての細胞の応答を405 nmでの濁度によって測定した。
細胞遺伝子スイッチアッセイを、マウス胚線維芽細胞(NIH3T3)において以下の構築物をトランスフェクトすることによって行った。表9のEcRのD、E、およびFドメインをGAL4-DBDに融合させて、CMVプロモーターの制御下に配置した。プライマーおよびクローニング段階は上記の通りである。ヒトRXRβおよびトノサマバッタRXRのキメラRXRをVP 16-ADに融合させて、SV40eプロモーターの制御下に配置した。誘導型ルシフェラーゼレポータープラスミドpFRLuc(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA)は、5コピーのGAL4応答エレメントおよび1つの合成最小プロモーターを含有した。VP 16活性化ドメインならびに非対称EcRおよびグルココルチコイド受容体応答エレメントを認識する3残基変異DBDを有するハイブリッドEcRを使用するVgEcR/RXR遺伝子スイッチ系を、Invitrogen Inc.(Carlsbad, CA, USA)から得て、NIH3T3細胞における一過性のトランスフェクションによって類似の様式で使用した。
42個のステロイドのスクリーニングセットを図9、10、および11に記載する。ステロイドの最大のサブセットは、2位、3位、5位、11位、14位、20位、22位、および25位でのヒドロキシル化状態、ならびに2位、3位、14位、および22位でのメチル化が多様である(図9)。ステロイドの第二のサブセットは、脱飽和、アルキル化、および鎖-環縮合が含まれる側鎖改変のセレクションを含む(図10)。第三および最終サブセットは、異常な構造の変動を有するステロイドおよび1つのブラシノステロイド(イソホモブラッシノリド)を含有する(図11)。
E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR//BaEcR対は、中等度に相関する(R2=0.6、図4)。これに対応して、受容体-log(EC50)の重ねた折れ線グラフ(図17)は、相対効率(RMFI)の検討と共に、シアステロン(E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR>BaEcR)とカネセンステロン(BaEcR>E274V/V390I/Y410E変異体-CfEcR)のあいだで効果の逆転を示す。用量反応曲線(図18)は、直交性を例証する。
リガンド誘導型遺伝子発現系は、機能的ゲノミクス、薬物開発、生物治療タンパク質産生、トランスジェニック農作物および動物における形質発現、系統および合成生物学、細胞の工学操作、ならびに遺伝子治療にとって有用である。
Claims (31)
- 以下の式を有する化合物:
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a)H、(C1-C6)アルキル;(C1-C6)ハロアルキル;(C1-C6)シアノアルキル;(C1-C6)ヒドロキシアルキル;(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C3-C5)シクロアルキルであるか;または
b)置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アルキル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり;ならびに
R5は、H;OH;F;Cl;または(C1-C6)アルコキシであり;
但し
R1、R2、R3、およびR4がイソプロピルである場合、R5はヒドロキシルではなく、
R5がH、ヒドロキシル、メトキシ、またはフルオロである場合、R1、R2、R3、およびR4の少なくとも1つはHではなく;
R1、R2、R3、およびR4の1つのみがメチルであり、R5がHまたはヒドロキシルである場合、R1、R2、R3、およびR4の残りはHではなく;
R4と、R1、R2、およびR3のうちの1つの両方がメチルである場合、R5はHでもヒドロキシルでもなく;
R1、R2、R3、およびR4が全てメチルである場合、R5はヒドロキシルではなく;
R1、R2、およびR3が全てHであり、R5がヒドロキシルである場合、R4はエチルでも、n-プロピルでも、n-ブチルでも、アリルでも、ベンジルでもない。 - 請求項1記載の1つまたは複数の化合物と担体とを含む組成物。
- 少なくとも1つの遺伝子スイッチ;および
少なくとも1つの活性化リガンド
を含む組換え型遺伝子スイッチ組成物であって、前記活性化リガンドが以下である、組成物:
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン(dacryhainansterone)、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、(イソ-スタキステロン(iso-stachysterone)C(Δ25(26)))、シダステロン(shidasterone)(スタキステロンD)、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン(タキシステロン(taxisterone))、ポナステロンA、ポリポルステロン(polyporusterone)B、22-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、ジメチルフラニルエクジソン、(22R)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジソン、22-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン(20-デオキシマキステロンA)、エクジソン-22- ヘミスクシネート、25-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-エクジソン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン、シレネオシド(sileneoside)E(2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド;ブレクノシド(blechnoside)A)、2-デオキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン(シレノステロン(silenosterone))、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジリデンアセタール、ポストステロン(poststerone)、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポストステロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン、5α-ケトジオール、ボンビコステロール(bombycosterol)、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレスタン-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エピ-カスタステロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロン(deoxyintegristerone)A、(5α-H)-22-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナンステロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン(deoxykaladasterone)(ダクリハイナンステロン)、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロステロン、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン(sidisterone)、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン(malacosterone)、2-デオキシポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントン(cheilanthone)B、2β,3β,6α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、14-デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロキシ-5β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12-エン-シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソン B、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オン(25-フルオロポドエクジソンB)、カロニステロン(calonysterone)、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9β,14β-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン2,3,20,22-ジアセトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、非ステロイドリガンド、または請求項1記載の化合物。 - 少なくとも2つの遺伝子スイッチを含む、請求項3記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
- 遺伝子スイッチの1つが非ステロイドリガンドによって活性化される、請求項4記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
- 非ステロイドリガンドが、ジアシルヒドラジン、アミドケトン、およびオキサジアゾリンからなる群より選択される、請求項5記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
- 各遺伝子スイッチが、同じベクターポリヌクレオチドに存在する1つまたは複数の核酸によってコードされる、請求項4記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
- 各遺伝子スイッチが、ヘテロ二量体受容体複合体を形成する、請求項4記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
- 各遺伝子スイッチのヘテロ二量体受容体複合体が共通の成分を有する、請求項8記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
- 共通の成分がRXRリガンド結合ドメインまたはRXR/USPキメラリガンド結合ドメインを含む、請求項9記載の組換え型遺伝子スイッチ組成物。
- 個々に機能的な複数の組換え型遺伝子スイッチを含む組成物であって、
個々に機能的な各組換え型遺伝子スイッチが
以下を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む、第一の組換え型カセット:
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結された応答エレメントを認識するDNA結合ドメイン;
エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、変異体エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、トウヒノシントメハマキ(Choristoneura fumiferana)エクジソン受容体リガンド結合ドメインのV390I/Y410E変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体;
以下を含む第二の組換え型カセット:
前記DNA結合ドメインに対して結合することができる応答エレメント;
トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター;および
関心対象遺伝子
を含み、
前記組成物が複数のリガンドを含み、
少なくとも1つのリガンドが以下である、前記組成物:
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20- ヒドロキシエクジソン、3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、(イソ-スタキステロンC(Δ25(26)))、シダステロン(スタキステロンD)、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン(タキシステロン)、ポナステロンA、ポリポルステロンB、22-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、プテロステロン(pterosterone)、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン、ピンナタステロン(pinnatasterone)、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロマキステロンA、24-エピ-マキステロンA、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23-ジ-エピ-ジェラジアステロン(geradiasterone)、20,26-ジヒドロキシエクジソン(ポドエクジソンC)、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアステロン、29-ノルシアステロン、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロン(dehydroamarasterone)B、アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロン(rapisterone)C、20-ヒドロキシエクジソン-22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタモステロン(carthamosterone)、24(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン(leuzeasterone)、シアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-アリルエーテル、24(28)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、ビチコステロン(viticosterone)E(20-ヒドロキシエクジソン 25-アセテート)、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネート、22-アセトアセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンジルエーテル、カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イノコステロン-26-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒドロキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グルコピラノシド、シレネオシドA(20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド)、3-デオキシ-1β,20-ジヒドロキシエクジソン(3-デオキシインテグリステロンA)、2-デオキシインテグリステロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオシドC(インテグリステロンA 22α-ガラクトシド)、2,22-ジデオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、2-デオキシ-20,26-ジヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、ポナステロンA 2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2-アセテート、20-ヒドロキシエクジソン-2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-βD-グルコピラノシド、2-ダンシル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA 3β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシド(limnantheoside)B)、20-ヒドロキシエクジソン-3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシドA)、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-グルコピラノシド、シレネオシドD(20-ヒドロキシエクジソン-3α-ガラクトシド)、20-ヒドロキシエクジソン 3β-D-グルコピラノシル-[l-3]-β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシドC)、20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジメチルエーテル、シアステロン-3-アセテート、2-デヒドロ-3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン(コロナタステロン(coronatasterone))、ラピステロンD、3-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、5β-ヒドロキシ-25,26-ジデヒドロポナステロンA、5β-ヒドロキシスタキステロンC、25-デオキシポリポジンB、ポリポジンB、25-フルオロポリポジンB、5β-ヒドロキシアブタステロン、26-ヒドロキシポリポジンB、29-ノルセンゴステロン、センゴステロン、6β-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、6α-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-6-オキシム、ポナステロンA 6-カルボキシメチルオキシム、20-ヒドロキシエクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、アジュガステロンC、ラピステロンB、ムリステロンA、アトロトステロン(atrotosterone)B、アトロステロンA、ツルケステロン-2-アセテート、プニステロン(punisterone)(ラポンチステロン(rhapontisterone))、ツルケステロン、アトロトステロンC、25-ヒドロキシアトロトステロンB、25-ヒドロキシアトロトステロンA、パキシロステロン、ツルケステロン-2,22-ジアセテート、ツルケステロン-22-アセテート、ツルケステロン- 11α-アセテート、ツルケステロン-2,11α-ジアセテート、ツルケステロン-11α-プロピオネート、ツルケステロン-11α-ブタノエート、ツルケステロン-11α-ヘキサノエート、ツルケステロン-11α-デカノエート、ツルケステロン-11α-ラウレート、ツルケステロン-11α-ミリステート、ツルケステロン-11α-アラキデート、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシノルセンゴステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシシアステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシセンゴステロン、14-デオキシ(14α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-14-メチルエーテル、14α-ペルヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン 14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,14,22-テトラメチルエーテル、(20S)-22-デオキシ-20,21-ジヒドロキシエクジソン、22,25-ジデオキシエクジソン、(22S)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、(22R)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジソン、22-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン(20-デオキシマキステロンA)、エクジソン-22-ヘミスクシネート、25-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-エクジソン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン、シレネオシドE(2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド;ブレクノシドA)、2-デオキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン(シレノステロン)、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジリデンアセタール、ポストステロン、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポストステロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン、5α-ケトジオール、ボンビコステロール、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレスタン-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エピ-カスタステロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-22-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナンステロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン(ダクリハイナンステロン)、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロステロン、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン、2-デオキシポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントンB、2β,3β,6α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、14-デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロキシ-5β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12-エン-シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソン B、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オン(25-フルオロポドエクジソン B)、カロニステロン、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9βα,14β-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン 2,3,20,22-ジアセトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、個々に機能的な組換え型遺伝子スイッチをモジュレートする非ステロイドリガンド、または以下の式の化合物:
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a)H、(C1-C6)アルキル;(C1-C6)ハロアルキル;(C1-C6)シアノアルキル;(C1-C6)ヒドロキシアルキル;(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいC3-C5シクロアルキルであるか;または
b)置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アルキル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり;ならびに
R5は、H;OH;F;Cl;または(C1-C6)アルコキシである。 - 各遺伝子スイッチが異なるリガンドによって制御される個々に機能的な複数の組換え型遺伝子スイッチを含む組成物であって、個々に機能的な各遺伝子スイッチが以下を含む、組成物:
A)以下を含む1つまたは複数の遺伝子発現カセット:
以下を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド:
トランス活性化ドメイン;
核内受容体リガンド結合ドメイン;
以下を含む、第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド:
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結した応答エレメントを認識するDNA結合ドメイン;
核内受容体リガンド結合ドメイン;
以下を含む第三のポリヌクレオチド:
前記DNA結合ドメインに結合することができる応答エレメント;
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター;および
前記関心対象遺伝子;
B)以下である、リガンド:
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20- ヒドロキシエクジソン、3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、(イソ-スタキステロンC(Δ25(26)))、シダステロン(スタキステロンD)、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン(タキシステロン)、ポナステロンA、ポリポルステロンB、22-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、プテロステロン、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン、ピンナタステロン、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロマキステロンA、24-エピ-マキステロンA、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23-ジ-エピ-ジェラジアステロン、20,26-ジヒドロキシエクジソン(ポドエクジソンC)、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアステロン、29-ノルシアステロン、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロンB、アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタモステロン、24(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン、シアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-アリルエーテル、24(28)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、ビチコステロンE(20-ヒドロキシエクジソン 25-アセテート)、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネート、22-アセトアセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンジルエーテル、カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イノコステロン-26-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒドロキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グルコピラノシド、シレネオシドA(20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド)、3-デオキシ-1β,20-ジヒドロキシエクジソン(3-デオキシインテグリステロンA)、2-デオキシインテグリステロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオシドC(インテグリステロンA 22α-ガラクトシド)、2,22-ジデオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、2-デオキシ-20,26-ジヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、ポナステロンA 2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2-アセテート、20-ヒドロキシエクジソン-2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-βD-グルコピラノシド、2-ダンシル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA 3β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシドB)、20-ヒドロキシエクジソン-3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシドA)、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-グルコピラノシド、シレネオシドD(20-ヒドロキシエクジソン-3α-ガラクトシド)、20-ヒドロキシエクジソン 3β-D-グルコピラノシル-[l-3]-β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシドC)、20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジメチルエーテル、シアステロン-3-アセテート、2-デヒドロ-3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン(コロナタステロン)、ラピステロンD、3-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、5β-ヒドロキシ-25,26-ジデヒドロポナステロンA、5β-ヒドロキシスタキステロンC、25-デオキシポリポジンB、ポリポジンB、25-フルオロポリポジンB、5β-ヒドロキシアブタステロン、26-ヒドロキシポリポジンB、29-ノルセンゴステロン、センゴステロン、6β-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、6α-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-6-オキシム、ポナステロンA 6-カルボキシメチルオキシム、20-ヒドロキシエクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、アジュガステロンC、ラピステロンB、ムリステロンA、アトロトステロンB、アトロステロンA、ツルケステロン-2-アセテート、プニステロン(ラポンチステロン)、ツルケステロン、アトロトステロンC、25-ヒドロキシアトロトステロンB、25-ヒドロキシアトロトステロンA、パキシロステロン、ツルケステロン-2,22-ジアセテート、ツルケステロン-22-アセテート、ツルケステロン- 11α-アセテート、ツルケステロン-2,11α-ジアセテート、ツルケステロン-11α-プロピオネート、ツルケステロン-11α-ブタノエート、ツルケステロン-11α-ヘキサノエート、ツルケステロン-11α-デカノエート、ツルケステロン-11α-ラウレート、ツルケステロン-11α-ミリステート、ツルケステロン-11α-アラキデート、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシノルセンゴステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシシアステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシセンゴステロン、14-デオキシ(14α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-14-メチルエーテル、14α-ペルヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン 14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,14,22-テトラメチルエーテル、(20S)-22-デオキシ-20,21-ジヒドロキシエクジソン、22,25-ジデオキシエクジソン、(22S)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、(22R)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジソン、22-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン(20-デオキシマキステロンA)、エクジソン-22-ヘミスクシネート、25-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-エクジソン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン、シレネオシドE(2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド;ブレクノシドA)、2-デオキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン(シレノステロン)、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジリデンアセタール、ポストステロン、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポストステロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン、5α-ケトジオール、ボンビコステロール、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレスタン-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エピ-カスタステロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-22-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナンステロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン(ダクリハイナンステロン)、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロステロン、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン、2-デオキシポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントンB、2β,3β,6α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、14-デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロキシ-5β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12-エン-シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソン B、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オン(25-フルオロポドエクジソン B)、カロニステロン、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9βα,14β-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン 2,3,20,22-ジアセトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、個々に機能的な組換え型遺伝子スイッチをモジュレートする非ステロイドリガンド、または以下の式の化合物:
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a)H、(C1-C6)アルキル;(C1-C6)ハロアルキル;(C1-C6)シアノアルキル;(C1-C6)ヒドロキシアルキル;(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいC3-C5シクロアルキルであるか;または
b)置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アルキル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり;ならびに
R5は、H;OH;F;Cl;または(C1-C6)アルコキシである。 - 少なくとも2つの遺伝子スイッチを含む、請求項12記載の組成物。
- 遺伝子スイッチの1つが非ステロイドリガンドによって活性化される、請求項13記載の組成物。
- 非ステロイドリガンドがジアシルヒドラジン、アミドケトン、およびオキサジアゾリンからなる群より選択される、請求項14記載の組成物。
- 各遺伝子スイッチが、同じベクターポリヌクレオチドに存在する1つまたは複数の核酸によってコードされる、請求項12記載の組成物。
- 各遺伝子スイッチが、ヘテロ二量体受容体複合体を形成する、請求項12記載の組成物。
- 各遺伝子スイッチのヘテロ二量体受容体複合体が共通の成分を有する、請求項17記載の組成物。
- 共通の成分がRXRリガンド結合ドメインまたはRXR/USPキメラリガンド結合ドメインを含む、請求項18記載の組成物。
- 個々に機能的な各遺伝子スイッチが異なる関心対象遺伝子を制御する、請求項12記載の組成物。
- 1つの関心対象遺伝子が細胞を殺すことができる、請求項12記載の組成物。
- 細胞を殺すことができる関心対象遺伝子が毒素である、請求項21記載の組成物。
- 1つの関心対象遺伝子が関心対象治療遺伝子である、請求項12記載の組成物。
- 1つの関心対象遺伝子がサイトカインである、請求項12記載の組成物。
- 1つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがグループH核内受容体リガンド結合ドメインである、請求項12記載の組成物。
- 1つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがUSPリガンド結合ドメイン、RXRリガンド結合ドメイン、RXR相同体リガンド結合ドメイン、またはRXRリガンド結合ドメインのキメラである、請求項12記載の組成物。
- 1つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがグループH核内受容体リガンド結合ドメインであり、1つまたは複数の核内受容体リガンド結合ドメインがUSPリガンド結合ドメイン、RXRリガンド結合ドメイン、RXR相同体リガンド結合ドメイン、またはRXRリガンド結合ドメインのキメラである、請求項12記載の組成物。
- グループH核内受容体リガンド結合ドメインが、エクジソン受容体、変異体エクジソン受容体、鱗翅目エクジソン受容体、変異体鱗翅目エクジソン受容体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体のV390I/Y410E変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体のE274V / V390I / Y410E変異体に由来する、請求項27記載の組成物。
- リガンドの有効量を投与することによって、組換え型遺伝子スイッチ系を活性化する方法であって、該リガンドが、
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20- ヒドロキシエクジソン、3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、(イソ-スタキステロンC(Δ25(26)))、シダステロン(スタキステロンD)、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン(タキシステロン)、ポナステロンA、ポリポルステロンB、22-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、プテロステロン、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン、ピンナタステロン、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロマキステロンA、24-エピ-マキステロンA、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23-ジ-エピ-ジェラジアステロン、20,26-ジヒドロキシエクジソン(ポドエクジソンC)、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアステロン、29-ノルシアステロン、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロンB、アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタモステロン、24(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン、シアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-アリルエーテル、24(28)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、ビチコステロンE(20-ヒドロキシエクジソン 25-アセテート)、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネート、22-アセトアセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンジルエーテル、カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イノコステロン-26-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒドロキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グルコピラノシド、シレネオシドA(20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド)、3-デオキシ-1β,20-ジヒドロキシエクジソン(3-デオキシインテグリステロンA)、2-デオキシインテグリステロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオシドC(インテグリステロンA 22α-ガラクトシド)、2,22-ジデオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、2-デオキシ-20,26-ジヒドロキシエクジソン、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、ポナステロンA 2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2-アセテート、20-ヒドロキシエクジソン-2-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-2-β-D-グルコピラノシド、2-ダンシル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA 3β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシドB)、20-ヒドロキシエクジソン-3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-3-アセテート、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシドA)、20-ヒドロキシエクジソン-3β-D-グルコピラノシド、シレネオシドD(20-ヒドロキシエクジソン-3α-ガラクトシド)、20-ヒドロキシエクジソン 3β-D-グルコピラノシル-[l-3]-β-D-キシロピラノシド(リムナンテオシドC)、20-ヒドロキシエクジソン-3,22-ジメチルエーテル、シアステロン-3-アセテート、2-デヒドロ-3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-20-ヒドロキシエクジソン(コロナタステロン)、ラピステロンD、3-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、5β-ヒドロキシ-25,26-ジデヒドロポナステロンA、5β-ヒドロキシスタキステロンC、25-デオキシポリポジンB、ポリポジンB、25-フルオロポリポジンB、5β-ヒドロキシアブタステロン、26-ヒドロキシポリポジンB、29-ノルセンゴステロン、センゴステロン、6β-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、6α-ヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-6-オキシム、ポナステロンA 6-カルボキシメチルオキシム、20-ヒドロキシエクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、アジュガステロンC、ラピステロンB、ムリステロンA、アトロトステロンB、アトロステロンA、ツルケステロン-2-アセテート、プニステロン(ラポンチステロン)、ツルケステロン、アトロトステロンC、25-ヒドロキシアトロトステロンB、25-ヒドロキシアトロトステロンA、パキシロステロン、ツルケステロン-2,22-ジアセテート、ツルケステロン-22-アセテート、ツルケステロン- 11α-アセテート、ツルケステロン-2,11α-ジアセテート、ツルケステロン-11α-プロピオネート、ツルケステロン-11α-ブタノエート、ツルケステロン-11α-ヘキサノエート、ツルケステロン-11α-デカノエート、ツルケステロン-11α-ラウレート、ツルケステロン-11α-ミリステート、ツルケステロン-11α-アラキデート、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシノルセンゴステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシシアステロン、22-デヒドロ-12β-ヒドロキシセンゴステロン、14-デオキシ(14α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-14-メチルエーテル、14α-ペルヒドロキシ-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン 14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,14,22-テトラメチルエーテル、(20S)-22-デオキシ-20,21-ジヒドロキシエクジソン、22,25-ジデオキシエクジソン、(22S)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、(22R)-20-(2,2'-ジメチルフラニル)エクジソン、22-デオキシエクジソン、25-デオキシエクジソン、22-デヒドロエクジソン、エクジソン、22-エピ-エクジソン、24-メチルエクジソン(20-デオキシマキステロンA)、エクジソン-22-ヘミスクシネート、25-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、エクジソン-22-ミリステート、22-デヒドロ-20-イソ-エクジソン、20-イソ-エクジソン、20-イソ-22-エピ-エクジソン、2-デオキシエクジソン、シレネオシドE(2-デオキシエクジソン 3β-グルコシド;ブレクノシドA)、2-デオキシエクジソン-22-アセテート、2-デオキシエクジソン-3,22-ジアセテート、2-デオキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシエクジソン 25-β-D-グルコピラノシド、2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、3-エピ-22-イソ-エクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン(シレノステロン)、3-デヒドロエクジソン、3-デヒドロ-2-デオキシエクジソン-22-アセテート、エクジソン-6-カルボキシメチルオキシム、エクジソン-2,3-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-2,3-アセトニド、20-ヒドロキシエクジソン-20,22-アセトニド、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン-2,3,20,22-ジアセトニド、パキシロステロン-20,22-p-ヒドロキシベンジリデンアセタール、ポストステロン、(20R)-ジヒドロポストステロン、(20S)ジヒドロポストステロン、ポストステロン-20-ダンシルヒドラジン、(20S)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)-ジヒドロポストステロン-2,3,20-トリベンゾエート、(20R)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(20S)ジヒドロポストステロン-2,3-アセトニド、(5α-H)-ジヒドロルブロステロン、2,14,22,25-テトラデオキシ-5α-エクジソン、5α-ケトジオール、ボンビコステロール、2α,3α,22S,25-テトラヒドロキシ-5α-コレスタン-6-オン、(5α-H)-2-デオキシ-21-ヒドロキシエクジソン、カスタステロン、24-エピ-カスタステロン、(5α-H)-2-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-22-デオキシインテグリステロンA、(5α-H)-20-ヒドロキシエクジソン、24,25-ジデヒドロダクリハイナンステロン、25,26-ジデヒドロダクリハイナンステロン、5-デオキシカラダステロン(ダクリハイナンステロン)、(14α-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、ルブロステロン、(5β-H)-ジヒドロルブロステロン、ジヒドロルブロステロン-17β-アセテート、シジステロン、20-ヒドロキシエクジソン-2,3,22-トリアセテート、14-デオキシ(14β-H)-20-ヒドロキシエクジソン、14-エピ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,20-ジヒドロキシエクジソン、マラコステロン、2-デオキシポリポジンB-3-β-D-グルコピラノシド、アジュガラクトン、ケイラントンB、2β,3β,6α-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、2β,3β,6β-トリヒドロキシ-5β-コレスタン、14-デヒドロシダステロン、スタキステロンB、2β,3β,9α,20R,22R,25-ヘキサヒドロキシ-5β-コレスト-7,14-ジエン-6-オン、カラダステロン、(14β-H)-14-デオキシ-25-ヒドロキシダクリハイナンステロン、4-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、14-メチル-12-エン-シダステロン、14-メチル-12-エン-15,20-ジヒドロキシエクジソン、ポドエクジソン B、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスト-8,14-ジエン-6-オン(25-フルオロポドエクジソン B)、カロニステロン、14-デオキシ-14,18-シクロ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9β,14β-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン、9α,14α-エポキシ-20-ヒドロキシエクジソン 2,3,20,22-ジアセトニド、28-ホモブラッシノリド、イソ-ホモブラッシノリド、非ステロイドリガンド、または請求項1記載の化合物であり、前記組換え型遺伝子スイッチ組成物が該リガンドに応答性である、前記方法。 - 宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、該宿主細胞が
集合的に以下を含む1つまたは複数のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む、第一の組換え型カセット:
トランス活性化ドメイン;
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結した応答エレメントを認識するDNA結合ドメイン;
核内受容体リガンド結合ドメイン、グループH核内受容体リガンド結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体リガンド結合ドメインの置換変異体、トウヒノシントメハマキエクジソン受容体リガンド結合ドメインのV390I/Y410E変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体のドメイン;および
以下を含む第二の組換え型カセット:
前記DNA結合ドメインに結合することができる応答エレメント;
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター;および
前記関心対象遺伝子
を含み、
前記方法が、前記宿主細胞に以下の式の化合物を接触させる段階を含む、前記方法:
式中、
R1、R2、R3、およびR4は
a)H、(C1-C6)アルキル;(C1-C6)ハロアルキル;(C1-C6)シアノアルキル;(C1-C6)ヒドロキシアルキル;(C1-C4)アルコキシ(C1-C6)アルキル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルケニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよい(C2-C6)アルキニル;ハロ、シアノ、ヒドロキシル、もしくは(C1-C4)アルキルによって置換されてもよいC3-C5シクロアルキルであるか;または
b)置換基が独立して、1〜5つのH、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、(C1-C6)アルキル、もしくは(C1-C6)アルコキシである、非置換もしくは置換ベンジルであり;ならびに
R5は、H;OH;F;Cl;または(C1-C6)アルコキシであり;
但し、
R1、R2、R3、およびR4がイソプロピルである場合、R5はヒドロキシではなく、
R1、R2、R3、およびR4がHである場合、R5はメトキシではなく;
R1、R2、およびR3がHであり、R5がヒドロキシである場合、R4はメチルでもエチルでもなく;
R1、R2、またはR4の1つ、2つ、または3つがメチルである場合、グループH核内受容体リガンド結合ドメインは、野生型カイコガ(Bombyx mori)、タバコスズメガ(Manduca sexta)、トウヒノシントメハマキ、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、マダニ(Amblyomma americanum)、シルバーリーフコナジラミ(Bemisia argentifolii)、ツマグロヨコバイ(Nephotettix cincticeps)、チャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor)のリガンド結合ドメインではなく、またはトウヒノシントメハマキリガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体でもなく、
(1)R1、R2、R3、およびR4がHであり、R5がH、ヒドロキシル、またはフルオロである場合、または(2)R1、R2、R3、およびR4の1つがメチルであり、残りがHであり、R5がHまたはヒドロキシルである場合、または(3)R1、R2、およびR3の1つがメチルであり、R4がメチルであり、およびR5がHまたはヒドロキシルである場合、または(4)R1、R2、R3、およびR4が全てメチルであり、R5がヒドロキシルである場合、または(5)R1、R2、およびR3が全てHであり、R4がn-プロピルまたはベンジルであり、R5がヒドロキシルである場合、グループH核内受容体リガンド結合ドメインは、野生型トウヒノシントメハマキではなく、トウヒノシントメハマキリガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体でもない。 - 宿主細胞における関心対象遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、該宿主細胞が、
以下を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む、第一の組換え型カセット:
トランス活性化ドメイン;
グループH核内受容体リガンド結合ドメイン;
以下を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む、第二の組換え型カセット:
その発現がモジュレートされる関心対象遺伝子に機能的に連結された応答エレメントを認識するDNA結合ドメイン;
グループH核内受容体リガンド結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメインの置換変異体、トウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのV390I/Y410E変異体、またはトウヒノシントメハマキのエクジソン受容体リガンド結合ドメインのE274V / V390I / Y410E変異体;
以下を含む第三の組換え型カセット:
前記DNA結合ドメインに結合することができる応答エレメント;
前記応答エレメントに機能的に連結したプロモーター;および
前記関心対象遺伝子
を含み、
前記方法が、前記宿主細胞に以下を接触させる段階を含む、前記方法:
20-ヒドロキシエクジソン、2-メチルエーテル、20- ヒドロキシエクジソン、3-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、3,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、14,22-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、2,3,14,22-テトラメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-プロピルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-n-ブチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-アリルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-ベンジルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、22-(28R,S)-2'-エチルオキシラニルエーテル、ポナステロンA、2-メチルエーテル、ポナステロンA、14-メチルエーテル、ポナステロンA、22-メチルエーテル、ポナステロンA、2,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、3,22-ジメチルエーテル、ポナステロンA、14,22-ジメチルエーテル、ダクリハイナンステロン、22-メチルエーテル、25,26-ジデヒドロポナステロンA、(イソ-スタキステロンC(Δ25(26)))、シダステロン(スタキステロンD)、スタキステロンC、22-デオキシ-20-ヒドロキシエクジソン(タキシステロン)、ポナステロンA、ポリポルステロンB、22-デヒドロ-20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA 22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン、プテロステロン、(25R)-イノコステロン、(25S)-イノコステロン、ピンナタステロン、25-フルオロポナステロンA、24(28)-デヒドロマキステロンA、24-エピ-マキステロンA、マキステロンA、20-ヒドロキシエクジソン-22-メチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-25-メチルエーテル、アブタステロン、22,23-ジ-エピ-ジェラジアステロン、20,26-ジヒドロキシエクジソン(ポドエクジソンC)、24-エピ-アブタステロン、ジェラジアステロン、29-ノルシアステロン、アジュガステロンB、24(28)[Z]-デヒドロアマラステロンB、アマラステロンA、マキステロンC、ラピステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22,25-ジメチルエーテル、20-ヒドロキシエクジソン-22-エチルエーテル、カルタモステロン、24(25)-デヒドロプレシアステロン、ロイゼアステロン、シアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-アリルエーテル、24(28)[Z]-デヒドロ-29-ヒドロキシマキステロンC、20-ヒドロキシエクジソン-22-アセテート、ビチコステロンE(20-ヒドロキシエクジソン 25-アセテート)、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-プロピルエーテル、24-ヒドロキシシアステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-n-ブチルエーテル、ポナステロンA 22-ヘミスクシネート、22-アセトアセチル-20-ヒドロキシエクジソン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンジルエーテル、カネセンステロン、20-ヒドロキシエクジソン-22-ヘミスクシネート、イノコステロン-26-ヘミスクシネート、20-ヒドロキシエクジソン-22-ベンゾエート、20-ヒドロキシエクジソン-22-β-D-グルコピラノシド、20-ヒドロキシエクジソン-25-β-D-グルコピラノシド、シレネオシドA(20-ヒドロキシエクジソン-22α-ガラクトシド)、3-デオキシ-1β,20-ジヒドロキシエクジソン(3-デオキシインテグリステロンA)、2-デオキシインテグリステロンA、1-エピ-インテグリステロンA、インテグリステロンA、シレネオシドC(インテグリステロンA 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