JP6215767B2 - エクジソン受容体複合体を通して外因性遺伝子の発現を調節するためのキラルジアシルヒドラジンリガンド - Google Patents
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Description
ン受容体に基づく誘導性遺伝子発現システムと共に使用するための、式1のジアシルヒド
ラジンリガンド、および式2または3のキラルジアシルヒドラジンリガンドを提供する。
本発明のキラルジアシルヒドラジンリガンドは、R−またはS−立体異性体のいずれかの
鏡像異性体が豊富である。出願者は、これら新規のキラルジアシルヒドラジンリガンドが
驚くほど効果的であることを見出した。従って本発明は、遺伝子治療、タンパク質および
抗体の大量生産、細胞に基づくスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、プロテオミ
クス、メタボロミクス、ならびにトランスジェニック生物における形質の調節のような、
遺伝子発現レベルの制御が望ましい用途に有用である。本発明の利点は、遺伝子発現調節
のため、および使用者の要求に適した発現レベルを調整するための手段を提供することで
ある。
(式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアリールオキシ基を表し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、R1およびR2は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表す)
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリール
アルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表
し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、
かつR1およびR2は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基
、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に
置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、
任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R1
およびR2は同じではなく、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にSである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリール
アルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表
し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、
かつR1およびR2は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基
、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に
置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、
任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R1
およびR2は同じではなく、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にRである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aはアリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、R2は任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R2は−CR8R9CHR10CR11R12と同じではなく、かつR8、R9、R10、R11、およびR12は互いに独立して水素、アルキル基、シクロアルキル基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基から選択され、式中、R2が付着する不斉炭素原子はRまたはS異性体のどちらかの鏡像異性体が豊富である)
で表される化合物を調製するための方法であって、
a)式5
で表される化合物と式6
R2HC=N−NH−CO2R7 式6
(式中、XおよびYは互いに独立してO、あるいはRがアルキル基またはアリール基のNRであり、CaCbは互いに独立してS立体配置の不斉炭素原子またはR立体配置の不斉炭素原子であり、R14およびR15は互いに独立してアルキル基またはアリール基であり、R13はハロ基、水素、アルキル基、アルコキシ基またはOSO2CF3であり、R7はアルキル基、アリールアルキル基またはアリール基であり、かつR2、R8、R9、R10、R11、およびR12は上記と同じ意味である)
で表される化合物を、式7
で表される化合物を形成するために反応させる工程と、
b)式8
で表される化合物を形成するため、式7で表される化合物を還元する工程と、
c)式9
で表される化合物を形成するため、式8で表される化合物を、式B−CO−LGで表され、LGが脱離基である化合物と反応させる工程と、
d)式10
で表される化合物を形成するため、式9で表される化合物のR7CO2−残基を除去する工程、および
e)式4で表される化合物を形成するため、式10で表される化合物を、式A−CO−LGで表され、LGが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法にも関する。
i)トランス活性化ドメイン
ii)DNA結合ドメイン、および
iii)グループH核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む第1の遺伝子発現カセット、および
i)該DNA結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ii)該トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、および
iii)該標的遺伝子
を含む第2の遺伝子発現カセットを含み、
該方法は該ホスト細胞を式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドと接触させることを含み、ここで該標的遺伝子の発現は調節される。
a)ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程であって、該システムが
i)ホスト細胞内で発現可能な第1の遺伝子発現カセットであって、
(a)その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するDNA結合ドメイン、および
(b)エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第1の遺伝子発現カセット、
ii)該ホスト細胞内で発現可能な第2の遺伝子発現カセットであって、
(a)トランス活性化ドメイン、および
(b)キメラレチノイドX受容体リガンド結合ドメイン
を含む第2のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第2の遺伝子発現カセット、および
iii)ホスト細胞内で発現可能な第3の遺伝子発現カセットであって、
(a)第1のハイブリッドポリペプチドのDNA結合ドメインにより認識される反応エレメント、
(b)第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター、および
(c)その発現が調節されるべき遺伝子
を含むポリヌクレオチド配列を含む、該第3の遺伝子発現カセットを含む工程、および
b)ホスト細胞内に式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入し、ここでホスト細胞内の遺伝子発現が調節される工程を含む、ホスト細胞内で標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。
a)式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドへの曝露に実質的に非感受性である細胞を選択する工程、
b)細胞内へ
i)DNAコンストラクトであって、
(a)ポリペプチドをコードする外因性遺伝子、および
(b)該遺伝子が反応エレメントの制御下にある、該反応エレメント
を含むコンストラクト、および
ii)エクジソン受容体複合体であって、
(a)該反応エレメントに結合するDNA結合ドメイン、
(b)該リガンドの結合ドメイン、
(c)トランス活性化ドメインを含む複合体を導入する工程、および
c)ポリペプチドが産生される、該リガンドへ該細胞を曝露する工程を含む方法に関する。
(式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアリールオキシ基を表し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、R1およびR2は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表す)
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリール
アルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表
し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、
かつR1およびR2は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基
、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に
置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、
任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R1
およびR2は同じではなく、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にSである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリール
アルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表
し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、
かつR1およびR2は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基
、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に
置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、
任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R1
およびR2は同じではなく、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にRである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aは−OC(CH3)3、−OCH2Ph、任意に置換されたアリール基また
は任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Bは任意に置換されたアリール基を表し、
R1は任意に置換された(C1−C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1−C4)アルキル
基または任意に置換された(C2−C6)アルケニル基を表し、かつR2は任意に置換さ
れた(C1−C6)アルキル基、アリール(C1−C4)アルキル基、任意に置換された
(C3−C7)シクロアルキル基または任意に置換されたアリール基を表すが、R1およ
びR2は同じではなく、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が式2では主にSであり、かつR1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が式3では主にRである)
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形
に関する。
(式中、Aは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を
表し、Bは任意に置換されたアリール基を表し、R1は任意に置換された(C1−C6)
アルキル基、ヒドロキシ(C1−C4)アルキル基または任意に置換された(C2−C6
)アルケニル基を表し、かつR2は任意に置換された(C1−C6)アルキル基、アリー
ル(C1−C4)アルキル基、任意に置換された(C3−C7)シクロアルキル基または
任意に置換されたアリール基を表すが、R1およびR2は同じではなく、式中、R1およ
びR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が式2では主にSであり、かつR1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が式3では主にRである)
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形
に関する。
(式中、Aは
で表され、
R3a、R3b、R3c、R3dおよびR3eは互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ基
、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、
ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意
に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール
基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、ア
リールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、ス
ルフォンアミド基、−CORc、−SO2Rd、−N(Re)CORf、−N(Re)S
O2Rgまたは−N(Re)C=N(Rh)−アミノ基から選択され;または
R3aおよびR3bはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、縮合した、5、6、または7員のシクロアルキル基または複素環を形成するか;またはR3bおよびR3cはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、縮合した、5、6、または7員のシクロアルキル基または複素環を形成し;
R4a、R4b、R4c、R5a、R5b、R6a、R6b、およびR6cは互いに独立
して水素、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたア
ルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換さ
れたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基
、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された
複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ
基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−CORc、−SO2Rd、−N(Re
)CORf、−N(Re)SO2Rgまたは−N(Re)C=N(Rh)−アミノ基から
選択され;
XはOまたはSであり、Bは
で表され;かつ
R3f、R3g、R3h、R3i、およびR3jは互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ
基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基
、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任
意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリー
ル基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、
アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、
スルフォンアミド基、−CORc、−SO2Rd、−N(Re)CORf、−N(Re)
SO2Rgまたは−N(Re)C=N(Rh)−アミノ基から選択され;または
R3fおよびR3gはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、縮合した、5、6、または7員のシクロアルキル基または複素環を形成するか;またはR3gおよびR3hはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、縮合した、5、6、または7員のシクロアルキル基または複素環を形成し;
式中、Rcは水素、ヒドロキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールア
ルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置
換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任
意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリー
ルオキシ基、またはアリールアルキルオキシ基を表し;
Rdはハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換された
アルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意
に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基ま
たは任意に置換されたヘテロアリール基を表し;
Reは水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換
されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基
、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリー
ル基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し;
Rfは水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換
されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基
、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリー
ル基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリール
アルキルオキシ基、またはアミノ基を表し;
Rgはハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換された
アルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意
に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、
任意に置換されたヘテロアリール基、またはアミノ基を表し;
Rhは水素、アルキル基、アリール基、シアノ基、またはニトロ基を表し;
R1は任意に置換された(C1−C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1−C4)アルキル
基、または任意に置換された(C2−C6)アルケニル基を表し;かつ
R2は任意に置換された(C1−C6)アルキル基、アリール(C1−C4)アルキル基
、任意に置換された(C3−C7)シクロアルキル基、または任意に置換されたアリール
基で表されるが、R1およびR2は同じではなく、
式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が式2では主にSであり、かつ
R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が式3では主にRである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、A、B、R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h
、R3i、R3j、R4a、R4b、R4c、R5a、R5b、R6a、R6b、R6c
およびXは上記と同じ意味であり、
R1は(C1−C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1−C4)アルキル基、または(C2
−C4)アルケニル基を表し;かつR2は任意に置換された(C3−C7)シクロアルキ
ル基を表し、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にSである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、A、B、R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h
、R3i、R3j、R4a、R4b、R4c、R5a、R5b、R6a、R6b、R6c
およびXは上記と同じ意味であり、
R1は(C1−C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1−C4)アルキル基、または(C2
−C4)アルケニル基を表し;かつR2は任意に置換された(C1−C6)アルキル基を
表すがR1およびR2は同じではなく、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にRである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aは
で表され、
Bは
で表され、
R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i、およびR
3jは互いに独立して水素、ハロ基、(C1−C4)アルキル基、または(C1−C4)
アルコキシ基から選択され、
R1は(C1−C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1−C4)アルキル基、または(C2
−C4)アルケニル基を表し;かつR2は任意に置換された(C3−C7)シクロアルキ
ル基を表し、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にSである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aは
で表され、
Bは
で表され、
R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i、およびR
3jは互いに独立して水素、ハロ基、(C1−C4)アルキル基、または(C1−C4)
アルコキシ基から選択され、
R1は(C1−C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1−C4)アルキル基、または(C2
−C4)アルケニル基を表し;かつR2は任意に置換された(C1−C6)アルキル基を
表し、式中、R1およびR2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にRである)
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形に関する。
(式中、Aはアリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、R2は任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R2は−CR8R9CHR10CR11R12と同じではなく、かつR8、R9、R10、R11、およびR12は互いに独立して水素、アルキル基、シクロアルキル基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基から選択され、式中、R2が付着する不斉炭素原子はRまたはS異性体のどちらかの鏡像異性体が豊富である)
で表される化合物を調製するための方法であって、
a)式5
で表される化合物と式6
R2HC=N−NH−CO2R7 式6
(式中、XおよびYは互いに独立してO、あるいはRがアルキル基またはアリール基のNRであり、CaCbは互いに独立してS立体配置の不斉炭素原子またはR立体配置の不斉炭素原子であり、R14およびR15は互いに独立してアルキル基またはアリール基であり、R13はハロ基、水素、アルキル基、アルコキシ基またはOSO2CF3であり、R7はアルキル基、アリールアルキル基またはアリール基であり、かつR2、R8、R9、R10、R11、およびR12は上記と同じ意味である)
で表される化合物を、式7
で表される化合物を形成するために反応させる工程と、
b)式8
で表される化合物を形成するため、式7で表される化合物を還元する工程と、
c)式9
で表される化合物を形成するため、式8で表される化合物を、式B−CO−LGで表され、LGが脱離基である化合物と反応させる工程と、
d)式10
で表される化合物を形成するため、式9で表される化合物のR7CO2−残基を除去する工程、および
e)式4で表される化合物を形成するため、式10で表される化合物を、式A−CO−LGで表され、LGが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法にも関する。
(式中、R8、R9、R10、R11、およびR12が水素であり;XがNRであり、かつRがメチル基であり;YがOであり;R14がメチル基であり;R15がフェニル基であり;かつCaおよびCbのそれぞれがR立体配置である)
で表される化合物の調製方法に関する。
(式中、R8、R9、R10、R11、およびR12が水素であり;XがNRであり、かつRがメチル基であり;YがOであり;R14がメチル基であり;R15がフェニル基であり;かつCaおよびCbのそれぞれがS立体配置である)
で表される化合物の調製方法に関する。
(式中、R8、R9、R10、R11、およびR12が水素であり;XがNRであり、かつRがメチル基であり;YがOであり;R14がメチル基であり;R15がフェニル基であり;CaおよびCbのそれぞれがS立体配置であり;かつBが3,5−ジ−メチルフェニル基である)
で表される化合物の調製方法に関する。
(式中、R8、R9、R10、R11、およびR12が水素であり;XがNRであり、かつRがメチル基であり;YがOであり;R14がメチル基であり;R15がフェニル基であり;CaおよびCbのそれぞれがS立体配置であり;かつAが2−エチル−3−メトキシフェニル基である)
で表される化合物の調製方法に関する。
(式中、R8、R9、R10、R11、およびR12が水素であり;XがNRであり、かつRがメチル基であり;YがOであり;R14がメチル基であり;R15がフェニル基であり;CaおよびCbのそれぞれがS立体配置であり;かつR2がtert−ブチル基である)
で表される化合物の調製方法に関する。
a)式11
で表される化合物と式12
で表される化合物のケトンを、式13
(式中、R1およびR2は同じではない)
で表される化合物を形成するために反応させる工程と;
b)式S−14、または、式R−14
で表される化合物を形成するため、式13で表される化合物をキラル触媒の存在下で還元する工程;および
c)式2または3で表される化合物を形成するため、式S−14またはR−14で表される化合物を、式B−CO−LGで表され、LGが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法にも関する。
(S)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−シクロヘキシル−ブチル)−N’−(2−エチル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(S)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−シクロヘキシル−ブチル)−N’−(3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(S)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−シクロヘキシル−ブチル)−N’−(4−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル;
(R)−N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジンカルボン酸tert−ブチルエステル;
(R)−N’−(1−tert−ブチル−4−ヒドロキシ−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル;
(R)−N’−(1−tert−ブチル−4−ヒドロキシ−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エチル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−ベンゾイル−N−(1−tert−ブチル−ブチル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−フルオロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−クロロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−(2−ブロモ−ベンゾイル)−N−(1−tert−ブチル−ブチル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3−クロロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(4−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(4−エチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(4−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(4−クロロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2,6−ジフルオロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2,6−ジクロロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,4−ジメトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジフルオロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメトキシ−4−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(4−メチル−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(5−メチル−2,3−ジヒドロ−ベンゾ[1,4]ジオキシン−6−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(5−エチル−2,3−ジヒドロ−ベンゾ[1,4]ジオキシン−6−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(ナフタレン−1−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(ナフタレン−2−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(チオフェン−2−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2,5−ジメチル−フラン−3−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−クロロ−ピリジン−3−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(6−クロロ−ピリジン−3−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3−メトキシ−2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメトキシ−4−メチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3−メトキシ−2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;および
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−(4−エチル−ベンゾイル)−N−(1−フェネチル−ブト−3−エニル)−ヒドラジドを含むがこれらに限定されない。
1およびR2 を有する不斉炭素原子においてではない)にキラル中心を含んでよい。全ての可能な鏡像異性体、ジアステレオマーおよび立体異性体は、本発明の範囲内に包含されることが企図される。
i)トランス活性化ドメイン
ii)DNA結合ドメイン、および
iii)グループH核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む第1の遺伝子発現カセット、および
i)該DNA結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ii)該トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、および
iii)該標的遺伝子
を含む第2の遺伝子発現カセットを含み、
該方法は該ホスト細胞を式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドと接触させることを含み、ここで該標的遺伝子の発現は調節される。
i)DNA結合ドメイン、および
ii)グループH核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む第1の組み換え遺
伝子発現カセット、および
i)該DNA結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ii)プロモーター、および
iii)該所望の遺伝子
を含む第2の組み換え遺伝子発現カセットを含み、
該方法は該ホスト細胞を式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2また
は3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドと接触させることを含み、ここで該所望の遺伝子の発現は調節される。
a)ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程であって、該システムが
i)ホスト細胞内で発現可能な第1の遺伝子発現カセットであって、
(a)その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するDNA結合ドメイン、および
(b)エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第1の遺伝子発現カセット、
ii)該ホスト細胞内で発現可能な第2の遺伝子発現カセットであって、
(a)トランス活性化ドメイン、および
(b)キメラレチノイドX受容体リガンド結合ドメイン
を含む第2のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第2の遺伝子発現カセット、および
iii)ホスト細胞内で発現可能な第3の遺伝子発現カセットであって、
(a)第1のハイブリッドポリペプチドのDNA結合ドメインにより認識される反応エレメント、
(b)第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター、および
(c)その発現が調節されるべき遺伝子
を含むポリヌクレオチド配列を含む、該第3の遺伝子発現カセットを含む工程、および
b)ホスト細胞内の遺伝子発現が調節される、ホスト細胞内に式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入する工程を含む、ホスト細胞内で標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、
a)式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドへの曝露に実質的に非感受性であるホスト細胞を選択する工程、
b)ホスト細胞内へ
i)DNAコンストラクトであって、
(a)ポリペプチドをコードする外因性遺伝子、および
(b)該遺伝子が反応エレメントの制御下にある、反応エレメント
を含むコンストラクト、および
ii)エクジソン受容体複合体であって、
a)該反応エレメントに結合するDNA結合ドメイン、
b)前記化合物の結合ドメイン、
c)トランス活性化ドメインを含む複合体、を導入する工程、および
d)前記化合物へ該細胞を曝露し、ここでポリペプチドが産生される工程を含む、ポリペプチドを産生するための方法に関する。
などを含む。任意に置換されたシクロアルキル基は、下記のように任意に置換されたアリール基を供給するためにアリール基へ融合されてよい。
などを含む。
などを含む。
などを含む。
などを含む。任意に置換された複素環基は、上記のように任意に置換されたアリール基を供給するためにアリール基へ融合されてよい。
関する。選択マーカーはマーカー遺伝子の効果、すなわち抗生剤に対する抵抗性、除草剤
に対する抵抗性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択可能であり、こ
こで該効果は、所望の核酸の遺伝形質の追跡および/または所望の核酸を受け継いだ
細胞もしくは生物の同定のために用いられる。当該技術分野において公知かつ用いられて
いる選択マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、
カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗
性を提供する遺伝子;および表現型のマーカーとして用いられる遺伝子、すなわちアント
シアニン調節性遺伝子、イソペンタニル転移酵素遺伝子などを含む。
子をコードする核酸に関する。
ここで該効果は、所望の核酸を受け継いだ細胞もしくは
生物の同定のための、所望の核酸の遺伝形質の追跡および/または遺伝子発現誘導また
は転写の測定に用いられる。当該技術分野において公知かつ用いられているレポーター遺
伝子の例は、ルシフェラーゼ(Luc)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェ
ニコールアセチル基転移酵素(CAT)、β−ガラクトシダーゼ(LacZ)、β−グル
クロニダーゼ(Gus)などを含む。選択マーカー遺伝子もまた、レポーター遺伝子とみ
なされてよい。
素部位において、または相同性組み換えによって、核酸またはポリヌクレオチドへ挿入で
きるDNAのセグメントに関する。DNAのセグメントは所望のポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限酵素部位は、転写および翻訳に適切な
読み枠でカセットの挿入を確実にするよう設計される。「形質転換カセット」は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ該ポリヌクレオチドに加え、
特定のホスト細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターに関する。本
発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット、および形質転換カセットはまた、
所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのホスト細胞内での増強された発現
を可能にするエレメントも含んでよい。これらのエレメントは、プロモーター、最小プロ
モーター、エンハンサー、反応エレメント、転写終結区配列、ポリアデニル化配列などを
含んでよいが、これらに限定されない。
を有する。
本発明のリガンドに有用な外因性遺伝物質は、例えば、細胞から放出できる分泌タンパク
質;基質を毒性物質から無毒性物質へ、または非活性物質を活性物質へ代謝できる酵素;
細胞表面受容体などの、所望の生物学的に活性のあるタンパク質をコードする遺伝子を
含む。有用な遺伝子はまた、血液凝固因子、インスリン、副甲状腺ホルモン、黄体ホルモ
ン放出因子、アルファおよびベータ精液インヒビン、およびヒト成長ホルモンのようなホ
ルモンをコードする遺伝子;存在しないときに異常状態を発生させる酵素のようなタンパ
ク質をコードする遺伝子;インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、
コロニー刺激因子1、腫瘍壊死因子、およびエリスロポエチンのような、サイトカインま
たはリンフォカインをコードする遺伝子;アルファ抗トリプシンのような阻害物質をコー
ドする遺伝子、ジフテリアおよびコレラ毒素のような薬剤として作用する物質をコードす
る遺伝子などを含む。有用な遺伝子はまた、癌治療および遺伝疾患の治療のために有用な
ものも含む。当業者は実質的に全ての既知遺伝子の核酸配列情報へのアクセスを有し、公
共のデポジトリー、配列を公表した施設から直接核酸分子を入手できるか、または該分子
を調製するための日常的な方法を利用できる。
上記のように、式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式2または3で表
されるキラルジアシルヒドラジンリガンドは、ホスト細における遺伝子発現を調節するた
めに使用されてよい。トランスジェニックホスト細胞における発現は、所望の様々な遺
伝子の発現に有用であり得る。本発明は、原核および真核ホスト細胞における遺伝子発現
の調節のためのリガンドを提供する。
る抗原;アルファ−アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、およびキシラナーゼのような酵
素;植物における昆虫、線虫、真菌、細菌、ウィルス、および非生物的ストレスに対する
抵抗性の遺伝子;抗原;栄養補助食品;医薬品;ビタミン;アミノ酸含有量、除草剤抵抗
性、寒冷、干ばつ、および熱耐性を調節する遺伝子;工業製品;油、タンパク質、炭水化
物;抗酸化剤;雄性の生殖不能な植物;花;燃料;その他の結果としての性質;状態、疾
病、障害、機能不全、もしくは遺伝的欠陥の治療に使用され得る治療的ポリペプチドまた
は産物、例えばモノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェ
ロン、インスリン、エリスロポエチン、凝固因子、その他の血液因子または成分;遺伝子
治療のためのウィルス性ベクター;ワクチンのためのウィルス;創薬、機能的ゲノミクス
、およびプロテオミクス解析ならびに応用のための標的;ホスト内に既に存在する経路の
調節のための経路の介在物;これまでにホストの使用では不可能であった新しい産物の合
成のための経路の介在物;細胞に基づくアッセイ;機能的ゲノミクスアッセイ;プロテオ
ミクスアッセイなどを含むがこれらに限定されない、所望の様々なポリペプチドの発現
のために有用である。さらに遺伝子産物は、ホストのより高い増殖収率の付与、または用
いられる別の増殖モードを可能にするために有用であろう。
本発明は、エクジソン受容体に基づく誘導遺伝子発現システムにおいて有用な、式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドに関する。これらのジアシルヒドラジンリガンドは、原核および真核ホスト細胞の両方において、改善された誘導遺伝子発現システムを提供する。従って本発明は、遺伝子の発現を調節するために有用な、式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドに関する。特に本発明は、グループH核内受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むホスト細胞内で発現可能な、少なくとも1の遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現調節システムをトランス活性化する能力を有する、式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドに関する。一実施形態によれば、グループH核内受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体、偏在性受容体、オーファン受容体1、NER−1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体相互作用タンパク質−15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用タンパク質14、またはファルネソール受容体由来である。別の実施形態によれば、グループH核内受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体由来である。
本発明はまた、本発明の遺伝子発現調節システムおよびリガンドを用いた、ホスト細胞における遺伝子発現の調節方法にも関する。特に本発明は、
a)ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程;および
b)ホスト細胞内に式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入する工程であって、ここで調節されるべき遺伝子が
i)該遺伝子発現システムのDNA結合ドメインにより認識されるドメインを含む反応エレメント;
ii)該遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター;、および
iii)式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドのホスト細胞への導入によって遺伝子発現が調節される、その発現が調節されるべき遺伝子;を含む遺伝子発現カセットの構成成分である工程;
を含む、ホスト細胞内で遺伝子の発現を調節する方法を提供する。
a)ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程;および
b)ホスト細胞内に遺伝子発現カセットを導入する工程であって、ここで該遺伝子発現カセットが
i)該遺伝子発現システム由来のDNA結合ドメインにより認識されるドメインを含む反応エレメント;
ii)該遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター;、および
iii)その発現が調節されるべき遺伝子を含む工程;および
c)ホスト細胞内に式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入する工程であって;式1で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式2または3で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドのホスト細胞への導入によって遺伝子発現が調節される工程;
を含む、ホスト細胞内で遺伝子の発現を調節する方法もまた提供する。
在性または異種性遺伝子であってよい。望まれる遺伝子またはタンパク質の、核酸または
アミノ酸配列の情報は、多数の公共アクセスデータベースのうちの一つ、例えばGENB
ANK、EMBL、Swiss−ProtおよびPIR、あるいは多数の生物学関係学術
雑誌出版物中に見出すことができる。従って、当業者は実質的に全ての既知遺伝子の核酸
配列情報へのアクセスを有する。このような情報は、ここに記載される方法で使用される
遺伝子発現カセット内に所望の遺伝子を挿入するための、望まれるコンストラクトを構
築するために使用できる。
本発明の方法の有用な測定の一つは、RNA,好ましくはmRNA種の同一性および存在量を含む転写状態に関するものである。このような測定は、存在する幾つかの遺伝子発現技術のいずれかによってcDNAの存在量を測定することにより、便利に行われる。
ここで用いられる標準的な組み換えDNAおよび分子クローニング手法は当該技術分野において公知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)(Maniatis)により、および T.J.Silhavy,M.L.Bennan,and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)により、および Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc,and Wiley−Interscience(1987)により記述される。
A、BおよびR2が上記のように定義され、かつR1がアルケニル基を表す、式2または式3で表される鏡像異性体の豊富な化合物は、一般模式図1に記載される不斉合成を通して調製されてよい。
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エチル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(S)−[2−(6−メトキシ−ナフタレン−2−イル)−プロピオニル]−ヒドラジド
−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(S)−[2−(
6−メトキシ−ナフタレン−2−イル)−プロピオニル]−ヒドラジドのX線結晶構造を
決定した。この実験は、Rで表されるtert−ブチル基およびn−プロピル基を有する炭素の絶対配置を確立した。
メトキシ−2−メチル−安息香酸N’−(1−tert−ブチル−ブト−3−エニル)−
N’−((S)−3,3,3−トリフルオロ−2−メトキシ−2−フェニル−プロピオニ
ル)−ヒドラジドのX線結晶構造を決定した。この実験は、Rで表されるtert−ブチ
ル基およびn−プロピル基を有する炭素の絶対配置を確立した。
(R)−4−メトキシ−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−シクロヘキシル−ブト−3−エニル)−N’−(3−メトキシ−2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド
(R)−4−メトキシ−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−シクロヘキシル−ブト−3−エニル)−N’−(3−メトキシ−2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジドは、実施例60に記載の方法論を用い、収率71%で調製した。分析データ:Rf=0.14(1:3EtOAc:n−ヘキサン);1H NMR(400MHz、DMSO−d6)δ10.46+10.38(2s、1H)、7.21−6.42(m、5H)、6.16−5.93(m、1H)、5.23(dd、1H)、5.01(dd、1H)、4.45(m、1H)、3.79(s、3H)、3.77(s、6H)、2.42−2.28(m、2H)、2.04(s、3H)、1.88−1.05(m、14H);HRMS(ESI)m/z、C29H38N2O5[M+H]+についての計算値:495.2859、測定値:495.2848、C29H38N2NaO5[M+Na]+についての計算値:517.2678、測定値:517.2667。
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−(4−エチル−ベンゾイル)−N−(1−フェネチル−ブト−3−エニル)−ヒドラジド
(R)−N’−(1−tert−ブチル−4−ヒドロキシ−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルは、実施例63に記載の方法論を用い、>99%のeeにおいて調製した。
この実施例は、本発明の化合物の鏡像異性体過剰率(ee)の決定に使用される分析法を説明する。
この実施例は、本発明の化合物のin vitro試験を例証する。
GAL4 DBD(l−147)−CfEcR(DEF)/VP16AD−βRXREF−LmUSPEF:トウヒの青虫であるトウヒシントメハマキのEcR由来の野生型D、E、およびFドメイン(「CfEcR−DEF」;配列番号1)をGAL4DNA結合ドメイン(「Gal4DBD 1−147」;配列番号2)へ融合し、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(「PGK」;配列番号3)の制御下に配置した。ヒトRXRβ(「HsRXRβ−EF」;配列番号4のヌクレオチド1−465)由来のEFドメインのヘリックス1から8、およびトノサマバッタウルトラスピラクルタンパク質(「LmUSP−EF」;配列番号5のヌクレオチド403−630)のEFドメインのへリックス9から12を、VP16由来のトランス活性化ドメイン(「VP16AD」;配列番号6)へ融合し、伸長因子−1αプロモーター(「EF−1α」;配列番号7)の制御下に配置した。5つのコンセンサスGAL4反応エレメント結合サイト(「5XGAL4RE」;配列番号8を含むGAL4REの5コピーを含む)を、合成TATA最小プロモーター(配列番号9)へ融合し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子(拝謁番号10)の上流に配置した。
GAL4DBD(1−147)CfEcR(DEF)およびVP16AD βRXREF−LmUSPEFに対する転写カセットを、CHO細胞へ一過性にトランスフェクトした。これらは単一のプラスミド上で、広範に活性のある細胞プロモーター(それぞれPGKおよびEF−1α)の制御下にある。安定的にトランスフェクトされた細胞は、ゼオシン抵抗性によって選択した。個々に単離されたCHO細胞クローンに、GAL4RE−ルシフェラーゼレポーター(pFR Luc)を一過性にトランスフェクトした。ハイグロマイシンを用いて27〜63クローンを選択した。
細胞をトリプシン処理し、1mLあたり2.5x104の濃度に希釈した。100μLの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、5%CO2下で37℃において24時間培養した。リガンド保存液はDMSO中で調製し、全ての処理のために300倍希釈した。用量反応試験は、33μMないし0.01μMの範囲の8濃度で構成された。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現は、PromegaからのBright−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステム(E2650)を用い、細胞の処理から48時間後に測定した。発光はDynex MLXマイクロタイタープレートルミノメーターを用い、室温で検出した。
Suhr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7999−804 (1998)に記載のCVBEおよび6XEcREを含む、安定的に形質転換された細胞の集団を得た。HEK−293細胞とも呼ばれるヒト293腎臓細胞へ、最初にスイッチコンストラクトCVBE、次に6XEcRE LacZレポーターコンストラクトをコードするレトロウィルスベクターを連続的に感染させた。スイッチコンストラクトは、インフレームでVP16トランス活性化ドメイン(VBE)の下流へ挿入された、カイコEcR(BE)(Iatrou)由来のアミノ酸26〜546のコード配列を含んだ。合成ATG開始コドンを、サイトメガロウィルス(CVBE)前初期プロモーターの制御下で、末端反復配列(LTR)に隣接して配置した。レポーターコンストラクトは、LacZの上流に配置され、両端にLTR配列が隣接する、6コピーのエクジソン反応エレメント(EcRE)結合部位(6XEcRE)を含んだ。
Z3細胞を96ウェル細胞培養プレートへ1ウェルあたり2.5x103の濃度でまき、5%CO2下で37℃において24時間培養した。リガンドの保存液はDMSO中で調製した。リガンドの保存液を培地で100倍希釈し、この希釈されたリガンド溶液(33μM)の50μLを細胞に加えた。DMSOの最終濃度はコントロール群および処理群の両方で0.03%に維持した。
レポーター遺伝子発現は細胞の処理後48時間に評価し、β−ガラクトシダーゼ活性をTropix (GSY1000)のGal Screen(商標)生物発光レポーター遺伝子アッセイシステムを用いて測定した。誘導倍率活性は、リガンド処理細胞の相対光単位(「RLU」)をDMSO処理細胞のRLUで割ることにより算出した。発光はDynex MLXマイクロタイタープレートルミノメーターを用い、室温で検出した。
GAL4 DBD−CfEcR(DEF)/VP16AD−MmRXRE:トウヒの青虫であるトウヒシントメハマキのEcR由来の野生型D、E、およびFドメイン(「CfEcR−DEF」;配列番号1)をGAL4DNA結合ドメイン(「Gal4DBD 1−147」;配列番号2)へ融合し、pMベクター(PT3119−5, Clontech、パロアルト、カリフォルニア)のSV40eプロモーターの制御下に配置した。マウスRXR(「MmRXR−DE」;配列番号11)由来のDおよびEドメインをVP16(「VP16AD」;配列番号6)由来のトランス活性化ドメインへ融合し、pVP16ベクター(PT3127−5, Clontech、パロアルト、カリフォルニア)のSV40eプロモーターの制御下に配置した。
CHO細胞に、SV40eプロモーターにより制御されるGAL4 DBD−CfEcR(DEF)およびVP 16AD−MmRXREの転写カセットを一過性にトランスフェクトした。ハイグロマイシンを用い、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。個々に単離されたCHO細胞株に、GAL4 RE−ルシフェラーゼレポーター(pFR−Luc, Stratagene、ラホヤ、カリフォルニア)を一過性にトランスフェクトした。ゼオシンを用い、13B3クローンを選択した。
細胞をトリプシン処理し、1mLあたり2.5x104細胞の濃度に希釈した。100μLの細胞懸濁液を96ウェル細胞プレートの各ウェルに入れ、5%CO2下において37℃で24時間培養した。リガンド保存液はDMSO中で調製し、全ての処理のために300倍希釈した。用量反応試験は、33μMないし0.01μMの範囲の8濃度で構成された。
細胞の遺伝子スイッチアッセイは、以下のコンストラクトをマウス胚性繊維芽細胞(NIH3T3)へ一過性にトランスフェクトすることにより行った。トウヒシントメハマキのEcR由来の野生型D、E、およびFドメイン、あるいはそれらのV390I/Y410E/E274V変異体をGAL4−DBDへ融合し、pBINDベクター(Promega Corporation、マディソン、ウィスコンシン、米国)のCMVプロモーターの制御下に配置した。示されるEcRのDEFドメインは、5’および3’末端における20〜25nt配列に基づいて設計されたプライマーを用いて増幅された。制限酵素部位EcoR I/BamH IおよびXba Iを、5’および3’プライマーそれぞれに加えた。PCR産物を適切な制限酵素で消化し、pBINDベクターへクローン化した。pBINDベクターへクローン化したEcR LBDを、シークエンシングにより検証した。VP16−ADへ融合し、SV40eプロモーターの制御下に配置した、ヒトRXRβおよびトノサマバッタRXRのキメラRXRは、以前に記述されたように構築した(Kumar P & Katakam A in Gene Transfer, Friedmann T and Rossi J, eds, pp. 643−651 (2007), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。誘導性ルシフェラーゼレポータープラスミドのpFRLuc(Stratagene Cloning Systems、ラホヤ、カリフォルニア、米国)は、5コピーのGAL4反応エレメントおよび合成最小プロモーターを含む。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現は、PromegaからのBright−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステム(E2650)を用い、細胞の処理から48時間後に測定した。発光はDynex MLXマイクロタイタープレートルミノメーターを用い、室温で検出した。
この実施例は、本発明の化合物のin vivo試験を例証する。本発明のキラルジアシルヒドラジンリガンドによるレポーター酵素のin vivoでの誘導は、遺伝子スイッチを含むC57BL/6マウスモデルシステムにおいて評価した。
トウヒの青虫であるトウヒシントメハマキのEcR由来の野生型D、E、およびFドメイン(「CfEcR−DEF」;配列番号1)を[V107(gtt)→I107(att)およびY127(tac)→E127(gag)]に変異させ、GAL4DNA結合ドメイン(「Gal4DBD 1−147」;配列番号2)へ融合した。ヒトRXRβ(「HsRXRβ−EF」;配列番号4のヌクレオチド1−465)由来のEFドメインのヘリックス1から8、およびトノサマバッタウルトラスピラクルタンパク質(「LmUSP−EF」;配列番号5のヌクレオチド403−630)のEFドメインのへリックス9から12を、6xGAL4反応エレメント(配列番号13)およびトランスサイレチンプロモーター(配列番号14)の制御下に配置されるレポーター遺伝子であるヒト分泌型アルカリホスファターゼ(「SEAP」、配列番号12)を制御する、VP16由来のトランス活性化ドメイン(「VP16AD」;配列番号6)へ融合した。遺伝子スイッチの各エレメントは別々のプラスミド上に存在した。受容体発現は、CMVプロモーター(配列番号15)の制御下にあった。誘導は、リガンド存在下で発現したレポータータンパク質量で評価した。
マウス血清中のSEAP発現は、マウス四頭筋へ遺伝子スイッチをエレクトロポレーションした後に評価した。マウスはケタミン(100mg/mL)およびキシラジン(20mg/mL)の混合物2μL/gにより麻酔した。その後動物の毛を剃り、2x50μL量のポリグルタミン酸(12mg/mL水)中のDNAベクターを筋肉内に注入し、電極伝導性ゲルを適用し、電極キャリバー(1cmx1cm;モデル384)を後肢に配置した。筋肉を1秒間隔の20m秒/パルスで、200V/cm、8回、エレクトロポレーションした。動物がパルスの半分を受けた後、横電場方向を逆にした。エレクトロポレーションは、BTX Molecular Delivery SystemsのECM830エレクトロポレーターで行った。
幾つかの実験において、マウスは遺伝子スイッチのエレクトロポレーション後3日間、50μLのDMSO中の2,6μmolのリガンドを、腹腔内注射(IP)された。別の実験においては、リガンドの濃度を26nmol/50μLのDMSO/マウスに減少させた。SEAP発現はリガンド投与後2〜11日評価した。他の実験において、リガンドはげっ歯類用固形試料において投与された。固形試料は、2gのリガンドを20mLのアセトンに溶解し、これをオートクレーブ可能な固形試料であるPurina MillsのLabDiet 5010、1kgに加えることにより調製した。これをHobartミキサー中でよく混合し、その後Cross Blendミキサー中でさらに15分間混合した。動物は固形試料を1、2、または3日間自由に摂取した。全ての値は4動物からの平均である。リガンドを加えていないベクター単独により処置された動物からの血清中のバックグラウンドSEAPは0〜11ng/ml血清であった。
マウス血清は、微小ガラスキャピラリー管を用いて後眼窩からの出血を採取した血液を遠心することにより得た。SEAP定量は、Clontech Great Escapeケミルミネセンスキットを用い、Clontech SEAP標準物質との比較により決定した。
2−エチル−3−メトキシ−安息香酸N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジドのR鏡像異性体およびラセミ体の物理的特性:
容器:1000mL
溶媒:1%ポリソルベート80蒸留水溶液(0.8μMフィルターを通し、真空濾過した)
溶媒量:1000mL
速度:100RPM
温度:37℃
サンプリング点:15、30,45、60、90および120分
サンプリング量:1mL(30ミクロンを通して濾過)
分析:HPLC(各ロットから標準溶液を作製)
サンプルサイズ:n=2ペレット/試験物質
2−エチル−3−メトキシ−安息香酸N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジドのR鏡像異性体およびラセミ体の細胞膜透過性特性:
2−エチル−3−メトキシ−安息香酸N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジドのR鏡像異性体およびラセミ体のミクロソーム代謝(Jeffrey P,et al.,Utility of metabolic stability screening:comparison of in vitro and in vivo clearance.Xenobiotica.2001 Aug−Sep;31(8−9):591−8 および Lin JH,et al.,Role of pharmacokinetics and metabolism in drug discovery and development.Pharmacol Rev.1997 Dec;49(4):403−49を参照のこと)。
2−エチル−3−メトキシ−安息香酸N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジドのR鏡像異性体およびラセミ体の生物学的利用能
遺伝子改変腫瘍細胞からのトランス遺伝子IL−12産生のin vivo誘導に対する、2−エチル−3−メトキシ−安息香酸N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジドのR鏡像異性体およびラセミ体の比較。
2−エチル−3−メトキシ−安息香酸N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジドを含む医薬組成物
疾患の動物モデルにおける有効性
複製能力のない、RTSおよびhIL−12を有する組み換えアデノウィルス
RTS−IL−12:RheoSwitch(登録商標)Therapeutic Systemの制御下にあるヒトIL−12
Preg:活性化薬剤により調節される、IL12発現を駆動するプロモーター
hIL−12:IRES配列により分離される、ヒトIL−12のp40およびp35サブユニットのコード配列
polyA:ポリアデニル化シグナル
PubC:ユビキチンCプロモーター
VP16−RXR:VP16転写活性化ドメインおよびキメラRXRとの融合タンパク質
IRES:内部リボソーム侵入部位
Gal4−EcR:Gal4DNA結合ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインの融合タンパク質
Ad:E1およびE3遺伝子欠失を含むアデノウィルス−5骨格
hIL−12トランス遺伝子を含むアデノウィルスおよびRheoswitch(登録商標)Therapeutic Systemによる自己未熟樹状細胞の形質導入
未熟DCのアデノウィルス形質導入
ステージIIIおよびIVメラノーマの被験者において、RheoSwitch(登録商標)の制御下でhIL−12を発現するように操作され、アデノウィルスにより形質導入された自己樹状細胞のヒトへの投与。
図するものではなく、かつここに提示する請求項は、全ての実施形態および例証を明らか
に提示されているか否かに関わらず包含しようと意図することが理解されなければならな
い。
本発明は以下の態様を含み得る。
[1]
式1
式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアリールオキシ基を表し
、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、R
1 およびR 2 は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒド
ロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換さ
れたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に
置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表す;
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形
。
[2]
式2
式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリールア
ルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し
、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、か
つR 1 およびR 2 は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、
ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置
換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任
意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R 1 お
よびR 2 は同じではなく、式中、R 1 およびR 2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にSである;
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形。
[3]
式3
式中、Aはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリールア
ルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し
、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、か
つR 1 およびR 2 は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、
ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置
換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任
意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R 1 お
よびR 2 は同じではなく、式中、R 1 およびR 2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にRである;
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、
結晶形または非晶形。
[4]
少なくとも50%の鏡像異性体過剰率を有する請求項2または3に記載の化合物。
[5]
少なくとも75%の鏡像異性体過剰率を有する請求項4に記載の化合物。
[6]
少なくとも85%の鏡像異性体過剰率を有する請求項5に記載の化合物。
[7]
少なくとも95%の鏡像異性体過剰率を有する請求項6に記載の化合物。
[8]
式中、Aは−OC(CH 3 ) 3 、−OCH 2 Ph、任意に置換されたアリール基または
任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Bは任意に置換されたアリール基を表し、R
1 は任意に置換された(C 1 −C 6 )アルキル基、ヒドロキシ(C 1 −C 4 )アルキル基
または任意に置換された(C 2 −C 6 )アルケニル基を表し、かつR 2 は任意に置換され
た(C 1 −C 6 )アルキル基、アリール(C 1 −C 4 )アルキル基、任意に置換された(
C 3 −C 7 )シクロアルキル基または任意に置換されたアリール基を表す;
で表される請求項2または3に記載の化合物。
[9]
Aが任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表す、請
求項8に記載の化合物。
[10]
式中、
R 3a 、R 3b 、R 3c 、R 3d およびR 3e は互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ
基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基
、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任
意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリー
ル基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、
アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、
スルフォンアミド基、−COR c 、−SO 2 R d 、−N(R e )COR f 、−N(R e )
SO 2 R g または−N(R e )C=N(R h )−アミノ基から選択され;または
R 3a およびR 3b はまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル
基または複素環基と融合した5、6、または7員環を形成するか;またはR 3b およびR
3c はまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基
と融合した5、6、または7員環を形成し;
R 4a 、R 4b 、R 4c 、R 5a 、R 5b 、R 6a 、R 6b 、およびR 6c は互いに独
立して水素、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換された
アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換
されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル
基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換され
た複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチ
オ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−COR c 、−SO 2 R d 、−N(R
e )COR f 、−N(R e )SO 2 R g または−N(R e )C=N(R h )−アミノ基か
ら選択され;
XはOまたはSであり、Bは
で表され;かつ
R 3f 、R 3g 、R 3h 、R 3i 、およびR 3j は互いに独立して水素、ハロ基、ニト
ロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル
基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、
任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリ
ール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基
、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基
、スルフォンアミド基、−COR c 、−SO 2 R d 、−N(R e )COR f 、−N(R e
)SO 2 R g または−N(R e )C=N(R h )−アミノ基から選択され;または
R 3f およびR 3g はまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル
基または複素環基と融合した5、6、または7員環を形成するか;またはR 3g およびR
3h はまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基
と融合した5、6、または7員環を形成し;
式中、
R c は水素、ヒドロキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキ
ル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換さ
れたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に
置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオ
キシ基、またはアリールアルキルオキシ基を表し;
R d はハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換され
たアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任
意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基
または任意に置換されたヘテロアリール基を表し;
R e は水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置
換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル
基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリ
ール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し;
R f は水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置
換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル
基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリ
ール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリー
ルアルキルオキシ基、またはアミノ基を表し;
R g はハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換され
たアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任
意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基
、任意に置換されたヘテロアリール基、またはアミノ基を表し;
R h は水素、アルキル基、アリール基、シアノ基、またはニトロ基を表す;
請求項9に記載の化合物。
[11]
式中、R 1 は(C 1 −C 6 )アルキル基、ヒドロキシ(C 1 −C 4 )アルキル基、また
は(C 2 −C 4 )アルケニル基を表し;かつ
R 2 は任意に置換された(C 1 −C 6 )アルキル基を表し;
式中、R 1 およびR 2 を有する不斉炭素原子における絶対配置が主にRである;
請求項10に記載の化合物。
[12]
式中、Aは
で表され、
R 3a 、R 3b 、R 3c 、R 3d およびR 3e は互いに独立して水素、ハロ基、(C 1
−C 4 )アルキル基、または(C 1 −C 4 )アルコキシ基で表され;かつ
R 3f 、R 3g 、R 3h 、R 3i 、およびR 3j は互いに独立して水素、ハロ基、(C
1 −C 4 )アルキル基、または(C 1 −C 4 )アルコキシ基で表される;
請求項11に記載の化合物。
[13]
少なくとも50%の鏡像異性体過剰率を有する請求項8に記載の化合物。
[14]
少なくとも75%の鏡像異性体過剰率を有する請求項13に記載の化合物。
[15]
少なくとも85%の鏡像異性体過剰率を有する請求項14に記載の化合物。
[16]
少なくとも95%の鏡像異性体過剰率を有する請求項15に記載の化合物。
[17]
(R)−N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベン
ゾイル)−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル;
(R)−N’−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3,5−ジメチル−ベン
ゾイル)−ヒドラジンカルボン酸tert−ブチルエステル;
(R)−N’−(1−tert−ブチル−4−ヒドロキシ−ブチル)−N’−(3,5
−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル;
(R)−N’−(1−tert−ブチル−4−ヒドロキシ−ブチル)−N’−(3,5
−ジメチル−ベンゾイル)−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2−エチル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−ベンゾイル−N−(1−tert−ブチル
−ブチル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2−フルオロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2−クロロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−(2−ブロモ−ベンゾイル)−N−(1−
tert−ブチル−ブチル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(3−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(3−クロロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(4−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(4−エチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(4−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(4−クロロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2,6−ジフルオロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2,6−ジクロロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(3,4−ジメトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(3,5−ジフルオロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(3,5−ジメトキシ−4−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(4−メチル−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(5−メチル−2,3−ジヒドロ−ベンゾ[1,4]ジオキシン−6−カルボニル)−ヒ
ドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(5−エチル−2,3−ジヒドロ−ベンゾ[1,4]ジオキシン−6−カルボニル)−ヒ
ドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(ナフタレン−1−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(ナフタレン−2−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(チオフェン−2−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2,5−ジメチル−フラン−3−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(2−クロロ−ピリジン−3−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(6−クロロ−ピリジン−3−カルボニル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−
(3−メトキシ−2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメトキシ−4−メチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブ
チル)−N’−(3−メトキシ−2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;または
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−(4−エチル−ベンゾイル)−N−(1−
フェネチル−ブト−3−エニル)−ヒドラジド
から選択される請求項3に記載の化合物。
[18]
少なくとも95%の鏡像異性体過剰率を有する(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N
−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エチル−3−メトキシ−ベンゾイル
)−ヒドラジド、またはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形。
[19]
少なくとも99%の鏡像異性体過剰率を有する(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N
−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エチル−3−メトキシ−ベンゾイル
)−ヒドラジド、またはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形。
[20]
請求項1〜17のいずれか1項に記載の化合物を含む医薬組成物。
[21]
請求項18または19に記載の化合物を含む医薬組成物。
[22]
式4
式中、Aはアリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換された
ヘテロアリール基を表し、Bは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテ
ロアリール基を表し、R 2 は任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロ
キシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換され
たアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置
換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、R 2 は−CR 8
R 9 CHR 10 CR 11 R 12 と同じではなく、かつR 8 、R 9 、R 10 、R 11 、およ
びR 12 は互いに独立して水素、アルキル基、シクロアルキル基、複素環基、アリール基
またはヘテロアリール基から選択され、式中、R 2 が付着する不斉炭素原子はRまたはS
異性体のどちらかの鏡像異性体が豊富である;
で表される化合物を調製するための方法であって、
a)式5
で表される化合物と式6
R 2 HC=N−NH−CO 2 R 7 式6
式中、XおよびYは互いに独立してO、あるいはRがアルキル基またはアリール基のN
Rであり、C a およびC b は互いに独立してS立体配置の不斉炭素原子またはR立体配置
の不斉炭素原子であり、R 14 およびR 15 は互いに独立してアルキル基またはアリール
基であり、R 13 はハロ基、水素、アルキル基、アルコキシ基またはOSO 2 CF 3 であ
り、R 7 はアルキル基、アリールアルキル基またはアリール基であり、かつR 2 、R 8 、
R 9 、R 10 、R 11 、およびR 12 は上記と同じ意味である;
で表される化合物を、式7
で表される化合物を形成するために反応させる工程と、
b)式8
で表される化合物を形成するため、式7で表される化合物を還元する工程と、
c)式9
で表される化合物を形成するため、式8で表される化合物を、式B−CO−LGで表され
、LGが脱離基である化合物と反応させる工程と、
d)式10
で表される化合物を形成するため、式9で表される化合物のR 7 CO 2 −残基を除去する
工程、および
e)式4で表される化合物を形成するため、式10で表される化合物を、式A−CO−
LGで表され、LGが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法。
[23]
式中、R 8 、R 9 、R 10 、R 11 、およびR 12 が水素を表す;
請求項22に記載の方法。
[24]
式中、XがNRであり、かつRがメチル基であり;YがOであり;R 14 がメチル基で
あり;R 15 がフェニル基であり;かつC a およびC b のそれぞれがR立体配置である;
請求項23に記載の方法。
[25]
式中、XがNRであり、かつRがメチル基であり;YがOであり;R 14 がメチル基で
あり;R 15 がフェニル基であり;かつC a およびC b のそれぞれがS立体配置である;
請求項24に記載の方法。
[26]
請求項2または3に記載の化合物を調製するための方法であって、
a)式11
で表される化合物と式12
で表される化合物のケトンを、式13
式中、R 1 およびR 2 は同じではない;
で表される化合物を形成するために反応させる工程と;
b)式S−14、または、式R−14
で表される化合物を形成するため、式13で表される化合物をキラル触媒の存在下で還元
する工程;および
c)請求項2または3に記載の化合物を形成するため、式S−14またはR−14で表
される化合物を、式B−CO−LGで表され、LGが脱離基である化合物と反応させる工
程とを含む方法。
[27]
Bが3,5−ジ−メチルフェニル基である請求項25または26に記載の方法。
[28]
Aが2−エチル−3−メトキシフェニル基である請求項25または26に記載の方法。
[29]
R 2 がtert−ブチル基である請求項25または26に記載の方法。
[30]
ホスト細胞内で所望の遺伝子の発現を調節する方法であって、該ホスト細胞が
i)DNA結合ドメイン、および
ii)グループH核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む第1の組み換え遺
伝子発現カセット、および
i)該DNA結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ii)プロモーター、および
iii)該所望の遺伝子
を含む第2の組み換え遺伝子発現カセットを含み、
該方法が該ホスト細胞を請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物と接触させること
を含み、ここで該所望の遺伝子の発現が調節される方法。
[31]
リガンドを前記被験体の細胞内でエクジソン受容体複合体に接触させることを含む、ト
ランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現を調節するための方法で
あって、ここで前記細胞はさらに、リガンドと組み合わせたときの前記エクジソン受容体
複合体に対するDNA結合配列を含み、かつエクジソン受容体複合体‐リガンド‐DNA
結合配列複合体の形成が遺伝子の発現を誘導し、かつ前記リガンドが請求項1〜3のいず
れか1項に記載の化合物であり、トランスジェニック被験体における内在性または異種性
遺伝子発現が調節される方法。
[32]
前記エクジソン受容体複合体がキメラエクジソン受容体複合体であり、かつ前記DNA
結合配列がさらにプロモーターを含む、請求項31に記載の方法。
[33]
該被験体が植物である、請求項31に記載の方法。
[34]
該被験体が動物である、請求項31に記載の方法。
[35]
該被験体が哺乳類である、請求項31に記載の方法。
[36]
該被験体がヒトである、請求項34に記載の方法。
[37]
前記細胞が自己細胞である、請求項31に記載の方法。
[38]
前記自己細胞が前記エクジソン受容体複合体および該エクジソン複合体に対するDNA
結合配列を含み、かつ前記細胞が前記被験体をトランスジェニックにするため前記被験体
内へ移植される、請求項37に記載の方法。
[39]
前記移植が注射による、請求項38に記載の方法。
[40]
前記注射が腫瘍内へ行なわれる、請求項39に記載の方法。
[41]
前記リガンドが薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物の一部として前記トランス
ジェニック被験体へ投与される、請求項31に記載の方法。
[42]
前記医薬組成物が経口投与される、請求項41に記載の方法。
[43]
前記薬理学的に許容される担体が親油性溶媒を含む、請求項41に記載の方法。
[44]
トランスジェニック被験体におけるトランス遺伝子発現の調節方法であって、ここで前
記トランスジェニック被験体がトランス遺伝子発現の調節が可能な組み換えエクジソン受
容体複合体を含み、該方法が前記被験体に請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物を
投与することを含む方法。
[45]
(a)ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程であって、該システムが
(i)ホスト細胞内で発現可能な第1の組み換え遺伝子発現カセットであって、
(a)その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するDN
A結合ドメイン、および
(b)エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第
1の組み換え遺伝子発現カセット、
(ii)該ホスト細胞内で発現可能な第2の組み換え遺伝子発現カセットであって、
(a)トランス活性化ドメイン、および
(b)キメラレチノイドX受容体リガンド結合ドメイン
を含む第2のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第
2の組み換え遺伝子発現カセット、および
(iii)ホスト細胞内で発現可能な第3の組み換え遺伝子発現カセットであって、
(a)第1のハイブリッドポリペプチドのDNA結合ドメインにより認識される反
応エレメント、
(b)第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化さ
れるプロモーター、および
(c)その発現が調節されるべき遺伝子
を含むポリヌクレオチド配列を含む、該第3の組み換え遺伝子発現カセットを含む工程、
および
(b)ホスト細胞内に請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物を導入し、ここでホ
スト細胞内の遺伝子発現が調節される工程を含む、ホスト細胞内で遺伝子の発現を調節す
る方法。
[46]
(a)請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物への曝露に実質的に非感受性である
ホスト細胞を選択する工程、
(b)ホスト細胞内へ
(i)DNAコンストラクトであって、
(a)ポリペプチドをコードする外因性遺伝子、および
(b)該遺伝子が反応エレメントの制御下にある、反応エレメント
を含むコンストラクト、および
(ii)エクジソン受容体複合体であって、
a)該反応エレメントに結合するDNA結合ドメイン、
b)前記化合物の結合ドメイン、
c)トランス活性化ドメインを含む複合体、を導入する工程、および
(c)前記化合物へ該細胞を曝露し、ここでポリペプチドが産生される工程を含む、ポ
リペプチドを産生するための方法。
[47]
前記エクジソン受容体複合体またはエクジソン受容体リガンド結合ドメインが変異を含
む、請求項31〜44のいずれか1項に記載の方法。
Claims (10)
- (R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エチル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−ベンゾイル−N−(1−tert−ブチル−ブチル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−フルオロ−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N’−(2−ブロモ−ベンゾイル)−N−(1−tert−ブチル−ブチル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(4−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド;および
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(3−メトキシ−2−メチル−ベンゾイル)−ヒドラジド
からなる群から選択され、かつ少なくとも95%の鏡像異性体過剰率を有する化合物、またはその薬理学的に許容される塩。 - 請求項1に記載の化合物、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 非ヒト由来のホスト細胞内で所望の遺伝子の発現を調節する方法であって、該ホスト細胞が
i)DNA結合ドメイン、および
ii)グループH核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む第1の組み換え遺伝子発現カセット、および
i)該DNA結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ii)プロモーター、および
iii)該所望の遺伝子
を含む第2の組み換え遺伝子発現カセットを含み、
該方法が該ホスト細胞を請求項1に記載の化合物と接触させることを含み、ここで該所望の遺伝子の発現が調節される方法。 - トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現を調節するための組成物であって、請求項1に記載の化合物の有効量を含み、前記被験体の細胞がエクジソン受容体複合体および該エクジソン受容体複合体に対するDNA結合配列を含む、組成物。
- 該被験体が植物である、請求項4に記載の組成物。
- 該被験体がヒトである、請求項4に記載の組成物。
- 前記細胞が自己細胞であり、前記自己細胞が前記エクジソン受容体複合体および該エクジソン複合体に対するDNA結合配列を含み、かつ前記細胞が前記被験体をトランスジェニックにするため前記被験体内へ移植される、請求項4に記載の組成物。
- トランスジェニック被験体におけるトランス遺伝子発現を調節するための組成物であって、ここで前記トランスジェニック被験体がトランス遺伝子発現の調節が可能な組み換えエクジソン受容体複合体を含み、該組成物が請求項1に記載の化合物の有効量を含む組成物。
- (a)非ヒト由来のホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程であって、該システムが
(i)ホスト細胞内で発現可能な第1の組み換え遺伝子発現カセットであって、
a)その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するDNA結合ドメイン、および
b)エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第1のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第1の組み換え遺伝子発現カセット、
(ii)該ホスト細胞内で発現可能な第2の組み換え遺伝子発現カセットであって、
a)トランス活性化ドメイン、および
b)キメラレチノイドX受容体リガンド結合ドメイン
を含む第2のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、第2の組み換え遺伝子発現カセット、および
(iii)ホスト細胞内で発現可能な第3の組み換え遺伝子発現カセットであって、
a)第1のハイブリッドポリペプチドのDNA結合ドメインにより認識される反応エレメント、
b)第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター、および
c)その発現が調節されるべき遺伝子
を含むポリヌクレオチド配列を含む、第3の組み換え遺伝子発現カセットを含む工程、
および
(b)ホスト細胞内に請求項1に記載の化合物を導入し、ここでホスト細胞内の遺伝子発現が調節される工程を含む、
非ヒト由来のホスト細胞内で遺伝子の発現を調節する方法。 - (a)請求項1に記載の化合物への曝露に実質的に非感受性である非ヒト由来のホスト細胞を選択する工程、
(b)ホスト細胞内へ
(i)DNAコンストラクトであって、
a)ポリペプチドをコードする外因性遺伝子、および
b)反応エレメント
を含み、該外因性遺伝子が該反応エレメントの制御下にある、コンストラクト、および
(ii)エクジソン受容体複合体をコードするDNAコンストラクトであって、
a)該反応エレメントに結合するDNA結合ドメイン、
b)エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、および
c)トランス活性化ドメイン
を含むコンストラクト
を導入する工程、および
(c)前記化合物へ該細胞を曝露し、ここでポリペプチドが産生される工程を含む、ポリペプチドを産生するための方法。
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