KR101528378B1 - 엑디손 수용체 복합체를 통한 외인성 유전자 발현 조절용 카이랄 디아실히드라진 리간드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엑디손 수용체-계열 유도성 유전자 발현 시스템과의 사용을 위한 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 제공한다. 따라서, 본 발명은 유전자 요법, 단백질 및 항체의 대규모 생산, 세포-계열 선별 검정, 기능적 유전체학, 단백질체학, 대사체학 및 유전자 발현 제어가 요구되는 형질전환 유전자 유기체 내에서의 특성 조절과 같은 응용에 대하여 유용하다. 본 발명의 장점은 유전자 발현의 조절 및 사용자 요구사항에 적합한 유전자 레벨을 재단하는 수단을 제공하는데 있다.
카이랄 디아실히드라진 리간드, 엑디손 수용체-계열 유도성 유전자 발현 시스템, 거울상이성질체, 라세미체

Description

엑디손 수용체 복합체를 통한 외인성 유전자 발현 조절용 카이랄 디아실히드라진 리간드{CHIRAL DIACYLHYDRAZINE LIGANDS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF EXOGENOUS GENES VIA AN ECDYSONE RECEPTOR COMPLEX}
본 발명은 생명공학, 유전 공학 및 의약 화학 분야에 관한 것이다. 일 실시예에서, 본 발명은 유전자 발현 분야에 관한 것이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 천연 및 돌연변이 핵 수용체용 디아실히드라진 리간드 및 카이랄 디아실히드라진 리간드, 핵 수용체-계열(nuclear receptor-based) 유도성 유전자 발현 시스템에의 그 사용 및 상기 리간드 및 유도성 유전자 발현 시스템을 이용한 숙주 세포 내에서 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 다양한 발간물이 인용되었으며, 그 개시물은 그대로 참고로 포함되어 있다. 그러나, 본 명세서에서 임의의 참조 인용은 상기 참조가 본 출원에 "선행 기술"로서 이용가능할 수 있는 허락으로 해석해서는 안 된다.
유전 공학 분야에서, 유전자 발현의 정밀한 조절은 개발 및 다른 생리학적 공정의 연구, 조작 및 조절에 중요한 도구이다. 유전자 발현은 수많은 특이적인 단백질-단백질 상호작용을 포함하는 복잡한 생물학적 공정이다. 유전자 발현이 단백질 합성의 제1 단계로서 필요한 RNA를 생성하도록 유전자 발현이 촉발(trigger)되 기 위하여, 전사 활성체(transcriptional activator)는 유전자 전사를 조절하는 프로모터와 인접되어야 한다. 통상적으로, 상기 전사 활성체는 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 DNA 결합 부위와 결합하는 적어도 하나의 DNA 결합 도메인을 갖는 단백질과 연관되어 있다. 따라서, 유전자 발현이 발생하려면, 상기 DNA 결합 도메인으로부터 적당한 거리에 위치하는 DNA 결합 도메인 및 전사활성화(transactivation) 도메인을 포함하는 단백질이 유전자의 프로모터 영역의 정확한 위치로 가야한다.
기존의 형질전환 접근법은 세포-유형 특이적 프로모터를 사용하여 설계된 형질전환 유전자(transgene)의 발현을 작동시킨다. 상기 형질전환 유전자를 함유하는 DNA 구조체(construct)는 우선 숙주 게놈으로 주입된다. 전사 활성체에 의하여 촉발되는 경우, 상기 형질전환 유전자의 발현은 주어진 세포 유형 내에서 발생한다.
세포 내에서 외래 유전자의 발현을 조절하는 다른 수단은 유도성 프로모터를 통한 것이다. 상기 유도성 프로모터 사용의 예는 PR1-a 프로모터, 원핵 억제자-작동자(repressor-operator) 시스템, 면역억제-이뮤노필린(immunosuppressive-immunophilin) 시스템 및 스테로이드 호르몬 수용체 시스템과 같은 고등 진핵 전사 활성화 시스템을 포함하며 하기에 기술되어 있다.
담배에서 얻은 PR1-a 프로모터는 병원체 공격 후의 전신 후천성 저항(systemic acquired resistance) 반응 도중에 유도된다. PR1-a은 내인성 물질 및 병원체, UV-B 복사 및 오염물질과 같은 외부 인자에 흔히 반응하기 때문에 PR1-a의 사용이 제한될 수 있다. 열 충격, 인터페론 및 중금속에 의하여 유도되는 프로모터 를 바탕으로 하는 유전자 조절 시스템이 기술되어 있다(문헌[Wurn et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 83:5414-5418 (1986)]; 문헌[Arnheiter et al., Cell 62:51-61 (1990)]; 문헌[Filmus et al ., Nucleic Acids Research 20:27550-27560 (1992)]). 그러나, 이 시스템은 비-타겟 유전자의 발현에 미치는 효과로 인하여 제한을 갖는다. 또한, 이 시스템은 누출적(leaky)이다.
원핵 억제자-작동자 시스템은 박테리아 억제자 단백질 및 이들이 결합하는 독특한 작동자 DNA 서열을 이용한다. 대장균 박테리아(baceterium Escherichia coli) 테트라사이클린("Tet") 및 락토오스("Lac") 억제자-작동자 양쪽 모두는 식물 및 동물에 사용되어 유전자 발현을 조절한다. Tet 시스템에서, 테트라사이클린은 TetR 억제자 단백질과 결합하여 작동자로부터 억제자 단백질을 방출시키는 구조 변화(conformational change)로 이어져서, 그 결과로 전사가 발생하게 된다. Lac 시스템에서, lac 오페론은 락토오스 또는 이소프로필-b-D-티오갈락토시드(isopropyl-b-D-thiogalactoside)와 같은 합성 유사체의 존재에 반응하여 활성화된다. 불행하게도, 상기 시스템의 사용은 리간드, 즉 테트라사이클린 및 락토오스의 불안정한 화학적 성질, 독성, 자연적 존재 또는 유도 또는 억제에 필요한 상대적으로 높은 레벨에 의하여 제한된다. 유사한 이유로 인하여, 동물에서의 상기 시스템의 용도가 한정되어 있다.
FK506, 라파마이신 및 사이클로스포린(cyclosporine) A와 같은 면역억제 분자는 이뮤노필린인 FKBP12, 사이클로필린(cyclophilin) 등과 결합할 수 있다. 이 정보를 이용하여 임의의 2 개의 단백질 각각에 FK506을 두거나 하나의 단백질 상에 는 FK506을 두고 나머지 하나에는 사이클로스포린 A를 두어 상기 임의의 두 단백질을 합류시키는 일반적인 전략을 고안하였다. FK506(FK1012)의 합성 동종이합체(homodimer) 또는 FK506-사이클로스포린(FKCsA)의 융합으로 생성된 화합물이 이후 사용되어 이러한 분자들의 이합체화를 유도할 수 있다(문헌[Spencer et al ., Science 262:1019-24 (1993)]; 문헌[Belshaw et al ., Proc Natl Acad Sci USA 93:4304-7 (1996)]). FKBP12에 융합된 Gal4 DNA 결합 도메인, 사이클로필린에 융합된 VP16 활성체 도메인 및 FKCsA 화합물이 사용되어 Gal4 결합 부위를 함유하는 프로모터의 조절하에서 리포터(reporter) 유전자의 이종이합체화(heterodimerization) 및 활성화를 보여주었다. 불행하게도, 이 시스템은 원하지 않는 부작용을 가질 수 있는 면역억제제를 포함하며, 그러므로 다양한 포유류 유전자 스위치 응용에의 그 사용을 제한하게 된다.
스테로이드 호르몬 수용체 시스템과 같은 고등 진핵 전사 활성화 시스템도 채용되었다. 스테로이드 호르몬 수용체는 핵 수용체 상과(superfamily)의 요소이며 척추 및 무척추 세포에서 발견된다. 불행하게도, 유전자 발현, 특히, 식물 및 동물에서의 유전자 발현 조절에 상기 수용체를 활성화시키는 스테로이드성 화합물의 사용은 상기 유기체에서의 수많은 다른 천연 생물학적 경로에의 관여(involvement)로 인하여 제한된다. 상기 어려움들을 극복하기 위하여, 곤충 엑디손 수용체(EcR)를 사용한 다른 시스템이 개발되었다.
곤충에서의 성장, 탈피(molting) 및 발달은 엑티손 스테로이드 호르몬(탈피 호르몬) 및 유약 호르몬(문헌[Dhadialla et al., Annu. Rev. Entomol. 43: 545- 569(1998)])에 의하여 조절된다. 곤충 엑디손에 대한 분자 표적은 적어도 하나의 엑디손 수용체(EcR) 및 울트라스피라클(ultraspiracle) 단백질(USP)로 이루어져 있다. EcR은 기호 DNA(signature DNA), 리간드 결합 도메인 및 활성화 도메인으로 특징되는 핵 스테로이드 수용체 상과의 요소이다(문헌[Koelle et al ., Cell , 67:59-77 (1991)]). EcR 수용체는 포나스테론(ponasterone) A 및 뮤리스테론(muristerone) A와 같은 다수의 스테로이드성 화합물에 반응한다. 최근에, Rhom and Haas사가 전세계적으로 판매하는 상용 살충제인 테부페노자이드(tebufenozide) 및 메톡시페노자이드(methoxyphenozide)를 포함하는 엑디스테로이드 작용제 활성(ecdysteroid agonist activity)을 갖는 비-스테로이드성 화합물이 기술되었다(제WO96/27673 및 미국 특허 제5,530,028호 참조). 양 유사체는 다른 유기체에서 빼어난 안정 프로파일를 갖는다.
상기 곤충 엑디손 수용체(EcR)는 포유류 레티노이드 X 수용체(RXR)의 곤충 동족체인 울트라스피라클(USP)와 이종이합화하고, 엑디스테로이드 및 엑디손 수용체 반응 구성요소를 결합시키며 엑디손 반응 유전자의 전사를 활성화시킨다. EcR/USP/리간드 복합체는 곤충 발달 및 생식 도중에 중요한 역할을 한다. Ecr은 A/B(전이활성화(transactivation), C(DNA 결합, 이종이합체화), D(힌지(Hinge), 이종이합체화), E(리간드 결합, 이종이합체화 및 전이활성화) 및 F(전이활성화) 도메인의 5 개의 모듈 도메인을 갖는다. A/B, C 및 E와 같은 상기 도메인의 일부는 다른 단백질과 융합되는 경우 그 기능을 유지한다.
엄격히 조절된 유도성 유전자 발현 시스템 또는 "유전자 스위치"는 유전자 요법, 세포에서 단백질의 대량 생산, 세포계 고처리 선별 검사(cell based high throughput screening assays), 기능 유전체학(functional genomics) 및 형질전환 식물 및 동물에서의 형질 조절과 같은 다양한 응용에 유용하다.
EcR-계 유전자 스위치의 제1 버젼(version)은 노랑초파리(Drosophila melanogaster) EcR(DmEcR) 및 생쥐(Mus musculus) RXR(MmRXR)를 사용하였으며, 포나스테론 A 스테로이드의 존재하에 이러한 수용체는 포유류 세포주 및 형질전환 쥐에서의 리포터 유전자를 전이활성화시킨다는 것을 보여주었다(문헌[Christopherson et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 89:6314-6318(1992)]; 문헌[No et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A. 93:3346-3351(1996)]). 이후, 문헌[Suhr et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . 95:7999-8004(1998)]은 비-스테로이드성 엑디손 작용제인 테부페노자이드가 외인성 이종이합체 파트너(partner)가 없는 경우 Bombyx mori EcR(BmEcR)를 통해 포유류 세포에서 리포터 유전자의 활성화를 높은 레벨로 유도하였음을 보였다.
제WO 97/38117호 및 제WO 99/58155호는 외인성 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 외인성 유전자 및 엑디손 반응 구성요소를 포함하는 DNA 구조체는 리간드가 존재하는 경우 및 선택적으로는 사일런트(silent) 파트너로 작용할 수 있는 수용체가 존재하는 경우에 상기 엑디손 반응 구성요소와 결합하여 유전자 발현을 유도하는 엑디손 수용체를 포함하는 제2 DNA 구조체에 의하여 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법을 개시한다. 선택의 대상이 되는 엑디손 수용체는 Drosophila melanogaster로부터 분리되었다. 통상적으로, 상기 시스템은 최적의 활성화를 제공 하기 위하여 사일런트 파트너, 바람직하게는 레티노이드 X 수용체(RXR)의 존재를 필요로 한다. 포유류 세포에서, 곤충 엑디손 수용체(EcR)는 레티노이드 X 수용체(RXR)와 이종이합하고 리간드 의존 방식으로 표적 유전자의 발현을 조절한다. 제WO 99/02683호는 누에 나방 Bombyx mori로부터 분리된 엑디손 수용체는 외인성 이합체 파트너에 대한 요구 없이 포유류 시스템에서 기능적임을 개시한다.
미국 특허 제6,265,173 B1호는 수용체의 스테로이드/타이로이드(thyroid) 상과의 다양한 요소들이 Drosophila melanogaster 울트라스피라클 수용체(USP) 또는 유전자 발현 시스템에의 사용을 위한 USP의 적어도 이합체화 도메인을 포함하는 그 단편과 혼합할 수 있음을 개시한다. 미국 특허 제5,880,333호는 전이활성화 도메인 및 DNA 결합 도메인이 두 개의 다른 하이브리드(hybrid) 단백질 상에 위치하는 식물에 사용되는 Drosophila melanogaster EcR 및 울트라스피라클(USP) 이종이합체 시스템을 개시한다. 불행하게도, 이러한 USP-계열 시스템은 동물 세포에서 항시적(constitutive)이므로, 리포터 유전자 발현을 조절하는데는 효과적이지 않다.
이러한 각각의 경우에, 전이활성화 도메인 및 DNA 결합 도메인(제WO 99/02683호에서와 같은 천연 EcR 및 또는 제WO 97/38117호에서와 같은 변형된 EcR)은 단일 분자로 주입되었으며, 다른 이종이합체 파트너는 USP 또는 RXR 중 어느 하나로 자신의 자연 상태에서 사용되었다.
상기 기술된 EcR-계 유전자 조절 시스템의 단점은 리간드가 없는 경우에 상당한 배경 활성(background activity) 및 식물 및 동물 모두에의 사용을 위한 이러한 시스템의 비응용성(non-applicability)을 포함한다(미국 특허 제5,880,333호 참 조). 그러므로, 식물 및 동물 양쪽 모두에서 외인성 유전자의 발현을 정확히 조절하는 개선된 EcR-계 시스템에 대한 업계의 요구가 존재한다. 상기 개선된 시스템은 유전자 요법, 단백질 및 항체의 대량 생산, 세포계 고처리 선별 검사, 기능 유전체학 및 형질전환 동물에서의 형질 조절과 같은 다양한 응용에 유용하다. 유전자 요법과 같은 특정 응용에 대하여, 합성 비-스테로이드 리간드류에 잘 반응하고 동시에 천연 스테로이드류에 영향받지 않는(insensitive) 유도성 유전자 발현 시스템을 갖는 것은 바람직할 수 있다. 따라서, 단순하고 조밀하며 용이하게 이용가능한 상대적으로 값싸며 숙주에 독성이 낮은 리간드류에 의존하는 개선된 시스템은 생물학적 시스템 조절에 유용한 것으로 판명될 것이다.
최근에, 전이활성화 및 DNA 결합 도메인이 두 개의 다른 단백질 상에 이들을 배치시켜 서로 분리되게 하는 엑디손 수용체계열 유도성 유전자 발현 시스템은 리간드가 없는 경우 배경 활성을 상당히 감소시키며 리간드가 존재하는 경우 배경보다 활성을 상당히 증가시킨다는 것이 알려지게 되었다(본 명세서에 그대로 참고로 포함된 제WO 01/70816 A1호 참조). 이 2개의 하이브리드 시스템은 제WO 97/38117호 및 제WO 99/02683호 출원에 개시된 2 개의 시스템과 비교하여 상당히 개선된 유도성 유전자 발현 모듈화(modulation) 시스템이다. 상기 2 개의 하이브리드 시스템은 한 쌍의 상호작용하는 단백질의 능력을 이용하여 DNA 결합 도메인이 유전자상의 DNA 결합 부위와 결합하는 경우에, 전이활성화 도메인이 프로모터를 더 효과적으로 활성화시키도록, DNA 결합 도메인에 대하여 더 바람직한 위치로 전사 활성화 도메인을 가져오게 한다(예를 들면, 미국 특허 제5,283,173호 참조). 요약하면, 상기 2-하이브리드 유전자 발현 시스템은 2 개의 유전자 발현 카세트(cassettes)를 포함한다; 핵 수용체 폴리펩티드에 융합된 DNA 결합 도메인을 인코딩하는 제1 유전자 발현 카세트 및 다른 핵 수용체 폴리펩티드에 융합된 전이활성화 도메인을 인코딩하는 제2 유전자 발현 카세트. 리간드가 존재하는 경우, 상기 제1 폴리펩티드의 상기 제2 폴리펩티드와의 상호작용으로 DNA 결합 도메인을 전이활성화 도메인에 효과적으로 속박하게 한다. 상기 DNA 결합 및 전이활성화 도메인은 두 개의 다른 분자 상에 존재하기 때문에, 리간드가 없는 경우의 배경 활성은 상당히 감소된다.
또한, 2-하이브리드 시스템은 예를 들면, 포나스테론 A("PonA") 또는 뮤리스테론 A("MurA")과 같은 스테로이드성 리간드와 비교하는 경우에, 예를 들면, 디아실히드라진류와 같은 비-스테로이드성 리간드에 대한 개선된 민감도를 제공한다. 즉, 스테로이드류와 비교하여 상기 비-스테로이드성 리간드는 더 낮은 농도에서 더 높은 활성을 제공한다. 또한, EcR 유전자 스위치를 바탕으로 하는 전이활성화는 세포주 의존성이 흔하기 때문에, 각각의 응용을 위하여 최대 전이활성화 능력을 얻도록 유전자 스위치 시스템을 재단하는 것이 더 용이하다. 또한, 상기 2-하이브리드 시스템은 변형되지 않은 RXR이 이종이합체 수용체 파트너로서 사용되는 경우에 흔히 발생하는 RXR의 과다발현으로 인한 일부 부작용을 회피하게 된다. 2-하이브리드 시스템에서, EcR 또는 RXR의 천연 DNA 결합 및 전이활성화 도메인이 제거되면, 그 결과 이러한 하이브리드 분자는 세포에 존재하는 다른 스테로이드 호르몬 수용체와 상호작용하는 기회가 더 줄어들어, 결국에는 부작용이 감소하게 된다. 다른 유전자 스위치 시스템은 그 각각이 참고로 포함되어 있는 하기에 기술된 시스템을 포함한 다: 미국 특허 제7,091,038호; 제WO 2004078924호; 유럽 출원 제EP1266015호; 미국 출원 제US20010044151호; 미국 출원 제US20020110861호; 미국 출원 제US20020119521호; 미국 출원 제US20040033600호; 미국 출원 제US20040197861호; 미국 출원 제US20040235097호; 미국 출원 제US20060020146호; 미국 출원 제US20040049437호; 미국 출원 제US20040096942호; 미국 출원 제US20050228016호; 미국 출원 제US20050266457호; 미국 출원 제US20060100416호; 제W0 2001/70816호; 제WO 2002/29075호; 제WO 2002/066612호; 제WO 2002/06613호; 제WO 2002/066614호; 제WO 2002/066615호; 제WO 2005/108617호; 미국 특허 제6,258,603호; 미국 출원 제US20050209283호; 미국 출원 제US20050228016호; 미국 출원 제US20060020146호; 유럽 출원 제EP0965644호; 미국 특허 제7,304,162호; 미국 특허 제7,304,161호; 제MX234742호; 한국 특허 제10-053143호; 제AU765306호; 제AU2002-248500호 및 제AU2002-306550호.
엑디손 수용체계열 유전자 조절 시스템에서의 개선으로 인하여, 다양한 응용에서 그 사용이 증가되어 현재 존재하는 것보다 더 높은 활성을 갖는 리간드에 대한 요구가 증가하게 되었다. 미국 특허 제6,258,603 B1호, 미국 출원 제 2005/0209283 A1호 및 미국 출원 제2006/0020146 A1호 (및 본 명세서에 인용된 특허)는 디벤조일히드라진(dibenzoylhydrazine) 리간드를 개시한다. 그러나, 개선된 약학적 특성을 갖는 다른 리간드에 대한 요구가 존재한다. 본 출원인은 이전에 기술되지 않았으며, 놀라운 생물학적 활성 및 예상하지 못한 방식으로 형질전환 유전자의 발현을 조절하는 능력을 갖는 카이랄 디아실히드라진 리간드를 발견하였다.
본 발명은 숙주 세포에서 관심대상 표적 유전자의 발현을 조절하는데 유용한 엑디손 수용체-계열 유도성 유전자 발현 시스템과의 사용을 위한 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 제공한다. 본 발명의 카이랄 디아실히드라진 리간드는 R 또는 S-입체상이성질체 중 어느 하나로 거울상이성질체적으로 농축된다. 본 출원인은 상기 신규한 디아실히드라진 리간드가 놀랄만큼 유효하다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 유전자 요법, 단백질 및 항체의 대규모 생산, 세포-계열 선별 검정, 기능적 유전체학, 단백질체학, 대사체학 및 유전자 발현 제어가 요구되는 형질전환 유전자 유기체 내에서의 특성 조절과 같은 응용에 대하여 유용하다. 본 발명의 장점은 유전자 발현의 조절 및 사용자 요구사항에 적합한 유전자 레벨을 재단하는 수단을 제공하는데 있다.
본 발명은 화학식 I의 화합물,
Figure 112009080717400-pct00001
화학식 I
여기서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시 또는 아릴옥시이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; 그리고
R1 및 R2는 각각 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 알키닐(alkynyl), 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 II의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물(enantiomerically enriched compound),
Figure 112009080717400-pct00002
화학식 II
여기서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; 그리고
R1 및 R2는 각각 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
단, R1이 R2와 동일하지 않다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열(absolute configuration)은 압도적으로 S이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물,
Figure 112009080717400-pct00003
화학식 III
여기서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; 그리고
R1 및 R2는 각각 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
단, R1이 R2와 동일하지 않다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 압도적으로 R이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 적어도 95%의 거울상이성질체 잉여를 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide) 또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 적어도 95%의 거울상이성질체 잉여를 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide) 또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학식 IV의 화합물에 있어서,
Figure 112009080717400-pct00004
화학식 IV
여기서, A는 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로 아릴이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
R2는 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
단, R2는 -CR8R9CHR10CR11R12와 동일하지 않다; 그리고
R8, R9, R10, R11 및 R12는 독립적으로 각각 수소, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 선택된다;
여기서, R2가 부착되어 있는 비대칭 탄소 원자는 R 또는 S 이성질체에서 거울상이성질체적으로 농축되어 있다;
a) 화학식 V의 화합물을
Figure 112009080717400-pct00005
화학식 V
화학식 VI의 화합물과 반응시켜 화학식 VII의 화합물을 형성하는 단계
R2HC=N-NH-CO2R7 화학식 VI
여기서,
X 및 Y는 독립적으로 O 또는 NR이다, 여기서 R은 알킬 또는 아릴이다;
Ca 및 Cb는 독립적으로 각각 S 배열의 비대칭 탄소 원자 또는 R 배열의 비대칭 탄소 원자이다;
R14 및 R15는 독립적으로 각각 알킬 또는 아릴이다;
R13은 할로, 수소, 알킬, 알콕시 또는 OSO2CF3이다;
R7은 알킬, 아릴알킬 또는 아릴이다; 그리고
R2, R8, R9, R10, R11 및 R12는 상기 표기와 동일한 의미를 갖는다;
Figure 112009080717400-pct00006
화학식 VII
b) 화학식 VII의 화합물을 환원시켜 화학식 VIII의 화합물을 형성하는 단계;
Figure 112009080717400-pct00007
화학식 VIII
c) 화학식 VIII의 화합물을 LG가 이탈기인 화학식 B-CO-LG의 화합물과 반응시켜 화학식 IX의 화합물을 형성하는 단계;
Figure 112009080717400-pct00008
화학식 IX
d) 상기 화학식 IX의 화합물의 R7CO2 - 기를 제거하여 화학식 X의 화합물을 형성하는 단계; 및
화학식 X
e) 상기 화학식 X의 화합물을 LG가 이탈기인 화학식 A-CO-LG의 화합물과 반응시켜 화학식 IV의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 공정에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 II의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 갖는 유전자 발현 조절 시스템을 사용한 숙주 세포에서의 유전자 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 배경 유전자 발현의 감소된 레벨을 가지며 상기 리간드의 몰이하 농도에서 반응하는 유도성 유전자 발현 시스템에의 용도에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 숙주 세포는
i) 전이활성화 도메인;
ii) DNA-결합 도메인; 및
iii) 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트: 및
i) 상기 DNA 결합 도메인과 결합할 수 있는 반응 구성요소;
ii) 상기 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및
iii) 상기 표적 유전자를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 포함하며,
상기 숙주 세포를 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하며; 상기 표적 유전자의 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 형질전환 피검자에서 내인성 또는 이종(heterologus) 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서, 리간드를 상기 피검자의 세포 내에서 엑디손 수용체 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 리간드와 조합시에 상기 엑디손 수용체 복합체에 대한 DNA 결합 서열을 더 함유하며, 엑디손 수용체 복합체-리간드-DNA 결합 서열 복합체의 형성은 상기 유전자의 발현을 유도하며, 그리고 상기 리간드는 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드이며; 형질전환 피검자에서 내인성 또는 이종 유전자 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 숙주 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 방법에 있어서,
a) 상기 숙주 세포에 하기를 포함하는 유전자 발현 조절 시스템을 도입하는 단계:
i) 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제1 유전자 발현 카세트로서, 상기 제1 유전자 발현 카세트는:
(a) 그 발현이 조절될 유전자와 연관된 반응 구성요소를 인식하는 DNA-결합 도메인; 및
(b) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다;
ii) 상기 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제2 유전자 발현 카세트로서, 상기 제2 유전자 발현 카세트는:
(a) 전이활성화 도메인; 및
(b) 키메라 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다; 그리고
iii) 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제3 유전자 발현 카세트로서, 상기 제3 유전자 발현 카세트는:
(a) 상기 제1 하이브리드 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의하여 인식되는 반응 구성요소;
(b) 상기 제2 하이브리드 폴리펩티드의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및
(c) 그 발현이 조절될 유전자를 포함한다; 그리고
b) 상기 숙주 세포에 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 도입하는 단계를 포함하며; 숙주 세포에서의 유전자의 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 생성하는 방법에 있어서,
a) 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드에의 노출에 실질적으로 영향받지 않는 세포를 선택하는 단계;
b) 상기 세포에 하기를 도입하는 단계;
i) DNA 구조체로서:
(a) 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 유전자; 및
(b) 반응 구성요소를 포함하며; 상기 유전자가 상기 반응 구성요소의 제어하에 있는 DNA 구조체; 그리고
ii) 엑디손 수용체 복합체로서:
(a) 상기 반응 구성요소와 결합하는 DNA 결합 도메인;
(b) 상기 리간드에 대한 결합 도메인; 및
(c) 전이활성화 도메인을 포함하는 엑디손 수용체 복합체; 그리고
c) 상기 세포를 상기 화합물에 노출시키며; 폴리펩티드가 생성되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시예는 상기 세포에 의하여 폴리펩티드 생성를 일시적으로 제어하는 장점을 제공한다. 또한, 상기 폴리펩티드의 축적으로 상기 세포를 손상시킬 수 있는 경우에, 상기 폴리펩티드의 발현은 상기 세포를 본 발명의 화합물에 노출시킴으로써 짧은 기간으로 한정될 수 있다. 상기 제어는 외인성 유전자가 치료 유전자인 경우 특히, 중요하다. 치료 유전자는 당뇨병 환자에서 인슐린 생성과 같은 필요한 기능을 제어하는 폴리펩티드를 생산하도록 요청될 수 있다. 또한, 이는 암 세포에 치명적인 단백질과 같은 손상 또는 심지어 치명적인 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 제어는 생성된 단백질 레벨이 형질전환 식물에서와 같이 성장 또는 재생성에 관한 대사 배수(metabolic drain)를 구성할 수 있다.
본 발명은 화학식 I의 화합물
Figure 112009080717400-pct00010
화학식 I
여기서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시 또는 아릴옥시이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; 그리고
R1 및 R2는 각각 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 알키닐(alkynyl), 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 II의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물(enantiomerically enriched compounds)
Figure 112009080717400-pct00011
화학식 II
여기서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; 그리고
R1 및 R2는 각각 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
단, R1이 R2와 동일하지 않다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 압도적으로 S이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물
Figure 112009080717400-pct00012
화학식 III
여기서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; 그리고
R1 및 R2는 각각 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
단, R1이 R2와 동일하지 않다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 압도적으로 R이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 II 또는 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물
여기서, A는 -OC(CH3)3, -OCH2Ph, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴이다;
R1은 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬 또는 선택적으로 치환된 (C2-C6)알케닐이다; 그리고
R2는 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬, 아릴(C1-C4)알킬, 선택적으로 치환된 (C3-C7)사이클로알킬 또는 선택적으로 치환된 아릴이다;
단, R1이 R2와 동일하지 않다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 화학식 II에서 압도적으로 S이다; 그리고
R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 화학식 III에서 압도적으로 R이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 II 또는 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물
여기서, A는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴이다;
R1은 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬 또는 선택적으로 치환된 (C2-C6)알케닐이다; 그리고
R2는 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬, 아릴(C1-C4)알킬, 선택적으로 치환된 (C3-C7)사이클로알킬 또는 선택적으로 치환된 아릴이다;
단, R1이 R2와 동일하지 않다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 화학식 II에서 압도적으로 S이다; 그리고
R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 화학식 III에서 압도적으로 R이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 II 또는 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물
여기서, A는
Figure 112009080717400-pct00013
로서,
R3a, R3b, R3c, R3d 및 R3e는 독립적으로 각각 수소, 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오(alkylthio), 카르복사미도(carboxamido), 술폰아미도(sulfonamido), -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 선택된다; 또는
R3a 및 R3b이 부착되어 있는 탄소 원자들과 함께 취한 R3a 및 R3b은 5, 6 또는 7원 융합된 사이클로알킬 또는 헤테로사이클 고리를 형성한다; 또는
R3b 및 R3c가 부착되어 있는 탄소 원자들과 함께 취한 R3b 및 R3c는 5, 6 또는 7원 융합된 사이클로알킬 또는 헤테로사이클 고리를 형성한다;
R4a, R4b, R4c, R5a, R5b, R6a, R6b 및 R6c는 독립적으로 각각 수소, 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 선택된다;
X는 O 또는 S이다;
B는
Figure 112009080717400-pct00014
이다
그리고;
R3f, R3g, R3h, R3i 및 R3j는 독립적으로 각각 수소, 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 선택된다; 또는
R3f 및 R3g가 부착되어 있는 탄소 원자들과 함께 취한 R3f 및 R3g는 5, 6 또는 7원 융합된 사이클로알킬 또는 헤테로사이클 고리를 형성한다; 또는
R3g 및 R3h가 부착되어 있는 탄소 원자들과 함께 취한 R3b 및 R3c는 5, 6 또는 7원 융합된 사이클로알킬 또는 헤테로사이클 고리를 형성한다;
여기서, Rc는 수소, 히드록시, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시 또는 아릴알킬옥시이다;
Rd는 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
Re는 수소, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
Rf는 수소, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시 또는 아미노이다;
Rg는 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 아미노이다;
Rh는 수소, 알킬, 아릴, 사이아노 또는 니트로이다;
R1은 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬 또는 선택적으로 치환된(C2-C6)알케닐이다; 그리고
R2는 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬, 아릴(C1-C4)알킬, 선택적으로 치환된 (C3-C7)사이클로알킬 또는 선택적으로 치환된 아릴이다;
단, R1이 R2와 동일하지 않다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 화학식 II에서 압도적으로 S이다; 그리고
R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 화학식 III에서 압도적으로 R이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 II의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물
여기서, A, B, R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f, R3g, R3h, R3i, R3j, R4a, R4b, R4c, R5a, R5b, R6a, R6b, R6c 및 X는 상기 표시된 바와 같은 동일한 의미를 갖는다;
R1은 (C1-C6)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬 또는 (C2-C4)알케닐이다; 그리고
R2는 선택적으로 치환된 (C3-C7)사이클로알킬이다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 압도적으로 S이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물
여기서, A, B, R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f, R3g, R3h, R3i, R3j, R4a, R4b, R4c, R5a, R5b, R6a, R6b, R6c 및 X는 상기 표시된 바와 같은 동일한 의미를 갖는다;
R1은 (C1-C6)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬 또는 (C2-C4)알케닐이다; 그리고
R2는 선택적으로 치환된 (C1-C6)사이클로알킬이다;
단, R1이 R2와 동일하지 않다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 압도적으로 R이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 화학식 II의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물
여기서, A는
Figure 112009080717400-pct00015
이다
B는
Figure 112009080717400-pct00016
이다
R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f, R3g, R3h, R3i 및 R3j는 독립적으로 각각 수소, 할로, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알콕시로부터 선택된다;
R1은 (C1-C6)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬 또는 (C2-C4)알케닐이다; 그리고
R2는 선택적으로 치환된 (C3-C7)사이클로알킬이다
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 압도적으로 S이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물
여기서, A는
Figure 112009080717400-pct00017
이다
B는
Figure 112009080717400-pct00018
이다
R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f, R3g, R3h, R3i 및 R3j는 독립적으로 각각 수소, 할로, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알콕시로부터 선택된다;
R1은 (C1-C6)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬 또는 (C2-C4)알케닐이다; 그리고
R2는 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이다;
여기서, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자에서 절대 배열은 압도적으로 R이다;
또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 상기 S-이성질체의 적어도 50%, 75%, 85%, 95% 또는 99%를 초과하는 거울상이성질체 잉여(enantiomeric excess)를 갖는 화학식 II의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물에 관한 것이다. 일 실시예에서, 화학식 II의 화합물은 필수적으로 상기 S-이성질체로 이루어져 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 상기 R-이성질체의 적어도 50%, 75%, 85%, 95% 또는 99%를 초과하는 거울상이성질체 잉여를 갖는 화학식 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물에 관한 것이다. 일 실시예에서, 화학식 III의 화합물은 필수적으로 상기 R-이성질체로 이루어져 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 적어도 95% 또는 적어도 99%의 거울상이성질체 잉여를 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide) 또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다. 일 실시예에서, 상기 화합물은 거울상이성질체적으로 순수하다.
다른 실시예에서, 본 발명은 적어도 95% 또는 적어도 99%의 거울상이성질체 잉여를 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(t-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드 또는 그 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정질 형태 또는 무정질 형태에 관한 것이다. 일 실시예에서, 상기 화합물은 거울상이성질체적으로 순수하다.
거울상이성질체적으로 순수한 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드는 체내 약학적 사용에 유일하게 적합하게 하는 이득이 되는 특성들의 조합을 가지는 것으로 예상하지 않게도 발견하게 되었다. 상기 특성은 라세미체와 비교하여 더 낮은 녹는점 및 더 낮은 융해열(실시예 68); 라세미체와 비교하여 수많은 액체 약학적 부형제 내에서 더 높은 용해도(실시예 68); 라세미체와 비교하여 특정 세포 내에서 더 높은 투과율(실시예 69)을 포함한다; 라세미체보다 혈액-뇌 장벽을 더 잘 통과할 수 있을 것 같으며(실시예 69); 라세미체와 비교하여 간세포 대사에 대하여 더 안정하며(실시예 70); 라브라졸 용액 또는 현탁액으로 경구 투여시에, 라세미체와 비교하여 상당히 더 높은 혈장 레벨을 달성하며(실시예 71); 그리고 라세미체와 비교하여 EcR-계 유전자 스위치의 활성화에 의하여 훨씬 더 높은 체내 유전자 발현을 달성한다(실시예 72).
또한, 본 발명은 화학식 IV의 화합물 제조 공정에 있어서,
Figure 112009080717400-pct00019
화학식 IV
여기서, A는 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로 아릴이다;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
R2는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다;
단, R2는 -CR8R9CHR10CR11R12와 동일하지 않다; 그리고
R8, R9, R10, R11 및 R12는 독립적으로 각각 수소, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 선택된다;
여기서, R2가 부착되어 있는 비대칭 탄소 원자는 R 또는 S 이성질체에서 거울상이성질체적으로 농축되어 있다;
a) 화학식 V의 화합물을
Figure 112009080717400-pct00020
화학식 V
화학식 VI의 화합물과 반응시켜 화학식 VII의 화합물을 형성하는 단계
R2HC=N-NH-CO2R7 화학식 VI
여기서,
X 및 Y는 독립적으로 O 또는 NR이다, 여기서 R은 알킬 또는 아릴이다;
Ca 및 Cb는 독립적으로 각각 S 배열의 비대칭 탄소 원자 또는 R 배열의 비대칭 탄소 원자이다;
R14 및 R15는 독립적으로 각각 알킬 또는 아릴이다;
R13은 할로, 수소, 알킬, 알콕시 또는 OSO2CF3이다;
R7은 알킬, 아릴알킬 또는 아릴이다; 그리고
R2, R8, R9, R10, R11 및 R12는 상기 표기와 동일한 의미를 갖는다;
Figure 112009080717400-pct00021
화학식 VII
b) 화학식 VII의 화합물을 환원시켜 화학식 VIII의 화합물을 형성하는 단계;
Figure 112009080717400-pct00022
화학식 VIII
c) 화학식 VIII의 화합물을 LG가 이탈기인 화학식 B-CO-LG의 화합물과 반응시켜 화학식 IX의 화합물을 형성하는 단계;
Figure 112009080717400-pct00023
화학식 IX
d) 상기 화학식 IX의 화합물의 R7CO2 - 기를 제거하여 화학식 X의 화합물을 형성하는 단계; 및
Figure 112009080717400-pct00024
화학식 X
e) 상기 화학식 X의 화합물을 LG가 이탈기인 화학식 A-CO-LG의 화합물과 반응시켜 화학식 IV의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 공정에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 IV의 화합물 제조 공정으로서,
R8, R9, R10, R11 및 R12는 수소인 화합물 제조 공정에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 IV의 화합물 제조 공정으로서,
R8, R9, R10, R11 및 R12는 수소이다;
X는 NR 이며 R은 메틸이다;
Y는 O이다;
R14는 메틸이다;
R15는 페닐이다; 그리고
Ca 및 Cb의 각각은 R 배열인 화합물 제조 공정에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 IV의 화합물 제조 공정으로서,
R8, R9, R10, R11 및 R12는 수소이다;
X는 NR 이며 R은 메틸이다;
Y는 O이다;
R14는 메틸이다;
R15는 페닐이다; 그리고
Ca 및 Cb의 각각은 S 배열인 화합물 제조 공정에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 IV의 화합물 제조 공정으로서,
R8, R9, R10, R11 및 R12는 수소이다;
X는 NR 이며 R은 메틸이다;
Y는 O이다;
R14는 메틸이다;
R15는 페닐이다;
Ca 및 Cb의 각각은 S 배열이다; 그리고
B는 3,5-디-메틸페닐(3,5-di-methylphenyl)인 화합물 제조 공정에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 IV의 화합물로서,
R8, R9, R10, R11 및 R12는 수소이다;
X는 NR 이며 R은 메틸이다;
Y는 O이다;
R14는 메틸이다;
R15는 페닐이다;
Ca 및 Cb의 각각은 S 배열이다; 그리고
A는 2-에틸-3-메톡시페닐(2-ethyl-3-methoxyphenyl)인 화합물 제조 공정에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 IV의 화합물 제조 공정으로서,
R8, R9, R10, R11 및 R12는 수소이다;
X는 NR 이며 R은 메틸이다;
Y는 O이다;
R14는 메틸이다;
R15는 페닐이다;
Ca 및 Cb의 각각은 S 배열이다; 그리고
R2는 터트-부틸(tert-butyl)인 화합물 제조 공정에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학식 II 또는 III의 화합물 제조 공정으로서:
a) 화학식 XI의 아실 히드라진을
Figure 112009080717400-pct00025
화학식 XI
화학식 XII의 케톤과 반응시켜
Figure 112009080717400-pct00026
화학식 XII
화학식 XIII의 화합물을 형성하며;
Figure 112009080717400-pct00027
화학식 XIII
여기서, R1은 R2와 동일하지 않은 단계;
b) 카이랄 촉매의 존재하에 화학식 XIII의 화합물을 환원시켜 화학식 S-XIV 또는 R-XIV의 화합물을 형성하는 단계; 및
Figure 112009080717400-pct00028
화학식 S-XIV
Figure 112009080717400-pct00029
화학식 R-XIV
c) 화학식 S-XIV 또는 R-XIV의 화합물을 LG는 이탈기로서 화학식 B-CO-LG의 화합물과 반응시켜 화학식 II 또는 III의 화합물을 형성하는 것을 특징으로 하는 제조 공정에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 I의 디아실히드라진류는 rac-N'(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르; 또는 rac-N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
본 발명의 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진류는 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다:
(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(3-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(4-메틸-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzoyl)-hydrazide);
(R)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르((R)-N'-(1-tert-Butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester);
(R)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르((R)-N'-(1-tert-Butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester);
(R)-N'-(1-터트-부틸-4-히드록시-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르((R)-N'-(1-tert-Butyl-4-hydroxy-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester);
(R)-N'-(1-터트-부틸-4-히드록시-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르;
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-벤조일-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-benzoyl-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methyl-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-fluoro-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(2-브로모-벤조일)-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-(2-bromo-benzoyl)-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methyl-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-chloro-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-ethyl-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-chloro-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-difluoro-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-dichloro-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,4-디메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,4-dimethoxy-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,5-difluoro-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethoxy-4-methyl-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메틸-벤조[1,3]디옥솔-5-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzo[1,3]dioxole-5-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(5-메틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(5-methyl-2,3-dihydro-benzo[1,4]dioxine-6-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(5-ethyl-2,3-dihydro-benzo[1,4]dioxine-6-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(나프탈렌-1-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(naphthalene-1-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(나프탈렌-2-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(naphthalene-2-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(티오펜-2-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(thiophene-2-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2.5-디메틸-퓨란-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,5-dimethyl-furan-3-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(6-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide);
(R)-3,5-디메틸-4-메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide); 및
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(4-에틸-벤조일)-N-(1-펜에틸-부트-3-에닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-(4-ethyl-benzoyl)-N-(1-phenethyl-but-3-enyl)-hydrazide).
화학식 II 및 III의 카이랄 디아실히드라진류는 상기 분자의 다른 부분(즉, R1 및 R2를 보유한 비대칭 탄소 원자가 아닌 곳)에서 카이랄리티 중심(chirality centers)을 함유할 수 있다. 모든 가능한 거울상이성질체, 부분입체이성질체(diatereomers) 및 입체이성질체는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 본 발명은 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 II의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 갖는 유전자 발현 조절 시스템을 사용하는 숙주 세포에서 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 리간드가 없는 경우 배경 유전자 발현의 감소된 레벨을 가지며 상기 리간드의 마이크로몰이하 농도에 반응하는 유도성 유전자 발현 시스템에 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 사용하는 용도에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 숙주 세포는
i) 전이활성화 도메인;
ii) DNA-결합 도메인; 및
iii) 그룹(Group) H 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 제1 유전자 발현 카세트(cassette): 및
i) 상기 DNA 결합 도메인과 결합할 수 있는 반응 구성요소;
ii) 상기 전이활성화 도메인에 의하여 활성화는 프로모터; 및
iii) 상기 표적 유전자를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 포함하며,
상기 숙주 세포를 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하여; 상기 표적 유전자의 발현이 조절되는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 숙주 세포에서 관심대상 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 숙주 세포는
i) DNA-결합 도메인; 및
ii) 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 재조합 유전자 발현 카세트: 및
i) 상기 DNA 결합 도메인과 결합할 수 있는 반응 구성요소;
ii) 프로모터; 및
iii) 상기 관심대상 유전자를 포함하는 제2 재조합 유전자 발현 카세트를 포함하며,
상기 숙주 세포를 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하여; 상기 관심대상 유전자의 발현이 조절되는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 형질전환 피검자에서 내인성 또는 이종(heterologus) 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서, 리간드를 상기 피검자의 세포 내에서 엑디손 수용체 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 리간드와 조합시에 상기 엑디손 수용체 복합체에 대한 DNA 결합 서열을 더 함유하며, 엑디손 수용체 복합체-리간드-DNA 결합 서열 복합체의 형성은 상기 유전자의 발현을 유도하며, 그리고 상기 리간드는 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드이며, 형질전환 피검자에서 내인성 또는 이종 유전자 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
일 실시예에서, 상기 세포는 자가조직 세포, 즉, 피검자로부터 구해지며, 엑디손 수용체 복합체 및 DNA 결합 서열로 핵산전달감염된 세포이다. 상기 핵산전달감염된 자가조직 세포는 이후 리간드로 처리된 피검자에게로 다시 이식된다. 상기 자가조직 세포는 주입 또는 주사, 예컨대 직접 주사에 의한 것을 포함하는 수많은 방법들 중 임의의 것으로 이식될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 자가조직 세포는 종양내 주사에 의하여 이식된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 형질전환 피검자에서 내인성 또는 이종 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서, 리간드를 상기 피검자의 세포 내에서 키메라 엑디손 수용체 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 리간드와 조합시에 상기 엑디손 수용체 복합체에 대한 프로모터를 더 포함하는 DNA 결합 서열을 더 함유하며, 엑디손 수용체 복합체-리간드-DNA 결합 서열 복합체의 형성은 상기 유전자의 발현을 유도하며, 그리고 상기 리간드는 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드이며, 형질전환 피검자에서 내인성 또는 이종 유전자 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 상기 형질전환 피검자는 식물, 곤충, 동물 또는 예컨대, 인간 또는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 개 또는 고양이와 같은 가축 동물과 같은 포유류이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 형질전환 피검자에서 형질전환유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서, 상기 형질전환 피검자는 형질전환 발현을 조절할 수 있는 재조합 엑디손 수용체 복합체를 포함하며, 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드의 유효량을 상기 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법에 있어서,
a) 상기 숙주 세포에 하기를 포함하는 유전자 발현 조절 시스템을 도입하는 단계:
i) 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제1 유전자 발현 카세트로서, 상기 제1 유전자 발현 카세트는:
(a) 그 발현이 조절될 유전자와 연관된 반응 구성요소를 인식하는 DNA-결합 도메인; 및
(b) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며;
ii) 상기 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제2 유전자 발현 카세트로서, 상기 제2 유전자 발현 카세트는:
(a) 전이활성화 도메인; 및
(b) 키메라 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며; 그리고
iii) 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제3 유전자 발현 카세트로서, 상기 제3 유전자 발현 카세트는:
(a) 상기 제1 하이브리드 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의하여 인식되는 반응 구성요소;
(b) 상기 제2 하이브리드 폴리펩티드의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및
(c) 그 발현이 조절될 유전자를 포함하며; 그리고
b) 상기 숙주 세포에 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 도입하는 단계를 포함하여; 숙주 세포에서의 유전자의 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 생성하는 방법에 있어서,
a) 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드에의 노출에 실질적으로 영향받지 않는 숙주 세포를 선택하는 단계;
b) 상기 숙주 세포에 하기를 도입하는 단계;
i) DNA 구조체로서:
(a) 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 유전자; 및
(b) 반응 구성요소를 포함하며; 상기 외인성 유전자가 상기 반응 구성요소의 제어하에 있는 DNA 구조체; 그리고
ii) 엑디손 수용체 복합체로서:
a) 상기 반응 구성요소와 결합하는 DNA 결합 도메인;
b) 상기 화합물에 대한 결합 도메인; 및
c) 전이활성화 도메인을 포함하는 엑디손 수용체 복합체; 그리고
c) 상기 세포를 상기 화합물에 노출시키며; 폴리펩티드가 생성되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 상기 엑디손 수용체 복합체 또는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인이 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 약어들은 달리 명시되지 않으면, 화학 및 생물학 업계 내에서 사용하는 관용적인 의미를 갖는다. 예를 들면, "h"는 시간(들)을 의미하고, "min"는 분(들)을 의미하고, "sec"은 초(들)을 의미하고, "d"는 일(들)을 의미하고, "μL"는 마이크로미터(들)을 의미하고, "mL"은 밀리리터를 의미하고, "L"은 리터(들)을 의미하고, "μM"은 마이크로몰을 의미하고, "mM"은 밀리몰을 의미하고, "M"은 몰, "mol"은 몰을 의미하고, "mmol"은 밀리몰을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램(들)을 의미하고, "㎎"은 밀리그램(들)을 의미하고, "A"는 아데닌 또는 아데노신을 의미하고, "T"는 티민 또는 티미딘을 의미하고, "G"는 구아닌 또는 구아노신을 의미하고, "C"는 시티딘 또는 시토신을 의미하고, "x g"는 중력곱(times gravity)을 의미하고, "nt"는 뉴클레오티드(들)을 의미하고, "aa"는 아미노산(들)을 의미하고, "bp"는 염기쌍(들)을 의미하고, "kb"는 킬로베이스(들)(kilobase(s))을 의미하고, "k"는 킬로를 의미하고, "μ"는 마이크로를 의미하고, "℃"는 섭씨를 의미하고, "THF"는 테트라하이드로퓨란을 의미하고, "DME"는 디메톡시에탄(dimethoxyethane)을 의미하고, "DMF"는 디메틸포름아미드(dimethylformaide)를 의미하고, "NMR"은 핵자기 공명을 의미하고, "psi"는 평방 인치당 파운드를 가리키며, "TLC"는 얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography)를 의미한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "알킬"이라는 용어는 1 내지 10 개의 탄소 또는 지정된 탄소수(C1-C10은 1 내지 10 개 탄소)를 갖는 직쇄 또는 분지 포화 지방족 탄화수소를 가리킨다. 예시적인 알킬 그룹은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, 터트-부틸(tert-butyl), n-펜틸, n-헥실, 이소헥실, n-헵틸, 4,4-디메틸펜틸, n-옥틸, 2,2,4-트리메틸펜틸, 노닐, 데실 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "선택적으로 치환된 알킬"이라는 용어는 니트로, 사이아노, 아미노, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이크, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Rc)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환체로 선택적으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬을 가리킨다. 예시적인 치환된 알킬기는 -CH2OCH3, -CH2CH2NH2, -CH2CH2CN, -CH2SO2CH3 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "할로알킬"이라는 용어는 1 내지 6 개의 할로 치환체를 갖는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 가리킨다. 예시적인 할로알킬기는 트리플루오로메틸, -CH2CH2F 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "히드록시알킬"이라는 용어는 1 내지 3 개의 히드록시 치환체, 통상적으로는 하나의 히드록시 치환체를 갖는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 가리킨다. 예시적인 히드록시알킬기는 히드록시메틸, 히드록시에틸, 히드록시프로필 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "아릴알킬"이라는 용어는 1 내지 3 개의 아릴 치환체(상기 치환체는 하기에 기술된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다), 통상적으로 1 또는 2 개의 아릴 치환체를 갖는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 가리킨다. 예시적인 아릴알킬기는 예를 들면, 벤질, 페닐에틸, 4-플루오로페닐에틸, 페닐프로필, 디페닐메틸 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "사이클로알킬"이라는 용어는 1 내지 12 개의 탄소 원자 또는 지정된 탄소수를 갖는 1 내지 3 개의 고리를 함유하는 포화 및 부분적으로 불포화(1 또는 2 개의 이중 결합을 함유하는) 사이클릭 탄화수소기를 가리킨다. 예시적인 사이클로알킬기는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸(cyclooctyl), 노르보르닐(norbornyl), 데칼린(decalin), 아다만틸(adamantyl) 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "선택적으로 치환된 사이클로알킬"이라는 용어는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Rc)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환체로 선택적으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 사이클로알킬을 가리킨다. 예시적인 선택적으로 치환된 사이클로알킬기는
Figure 112009080717400-pct00030
등을 포함한다. 선택적으로 치환된 사이클로알킬은 알킬기에 융합되어 하기에 기술된 바와 같이 선택적으로 치환된 아릴을 제공할 수 있다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "알케닐"이라는 용어는 1 내지 3 개의 탄소-대-탄소 이중 결합, 통상적으로 1 또는 2 개의 이중 결합을 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 가리킨다. 예시적인 알케닐기는 -CH=CH2, -CH2CH=CH2, -CH2CH2CH=CH2, -CH2CH2CH=CHCH3 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "선택적으로 치환된 알케닐"이라는 용어는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Rc)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환체로 선택적으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알케닐을 가리킨다. 예시적인 선택적으로 치환된 알케닐기는 -CH=CHPh, -CH2CH=CHPh 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "알키닐"이라는 용어는 1 내지 3 개의 탄소-대-탄소 삼중 결합, 통상적으로 1 또는 2 개의 삼중 결합을 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 가리킨다. 예시적인 알키닐기는 -C≡CH, -C≡CCH3, -CH2C≡CH, -CH2CH2C≡CH 및 -CH2CH2C≡CCH3를 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "선택적으로 치환된 알키닐"이라는 용어는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Rc)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환체로 선택적으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알키닐을 가리킨다. 예시적인 선택적으로 치환된 알키닐기는 -C≡CPh, -CH2C≡CPh 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "아릴"이라는 용어는 페닐(Ph로 약술됨), 1-나프틸 및 2-나프틸과 같은 6 내지 12 개의 탄소 원자를 갖는 모노사이클릭(monocyclic) 및 바이사이클릭(bicyclic) 방향족 고리 시스템을 가리킨다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "선택적으로 치환된 아릴"이라는 용어는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5 개의 치환체, 통상적으로 1 내지 3 개의 치환체로 선택적으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 아릴을 가리킨다. 예시적인 선택적으로 치환된 아릴기는 2-메틸페닐, 2-메톡시페닐, 2-플루오로페닐, 2-클로로페닐, 2-브로모페닐, 3-메틸페닐, 3-메톡시페닐, 3-클로로페닐, 4-메틸페닐, 4-에틸페닐, 4-메톡시페닐, 4-클로로페닐, 2,6-디-플루오로페닐, 2,6-디-클로로페닐, 2-메틸, 3-메톡시페닐, 2-에틸, 3-메톡시페닐, 3,4-디-메톡시페닐, 3,5-디-플루오로페닐, 3,5-디-메틸페닐 및 3,5-디메톡시, 4-메틸페닐 등을 포함한다. 선택적으로 치환된 아릴이라는 용어는 융합된 선택적으로 치환된 사이클로알킬 및 융합된 선택적으로 치환된 헤테로사이클 고리를 갖는 기를 포함하는 것으로 의미한다. 이의 예는
Figure 112009080717400-pct00031
등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "헤테로아릴"이라는 용어는 1 내지 14 개 탄소 원자 및 산소, 질소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4 개의 헤테로원자를 갖는 모노사이클릭 및 바이사이클릭 방향족 고리 시스템을 가리킨다. 예시적인 헤테로 아릴기는 1-피롤릴(pyrrolyl), 2-피롤릴, 3-피롤릴, 2-이미다졸릴(imidazolyl), 4-이미다졸릴, 피라지닐(pyrazinyl), 2-옥사졸릴(oxazolyl), 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴(isoxazolyl), 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴(thiazolyl), 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐(thienyl), 3-티에닐, 2-피리딜(pyridyl), 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜(pyrimidyl), 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴(benzothiazolyl), 퓨리닐(purinyl), 2-벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl), 4-벤즈이미다졸릴, 5-벤즈이미다졸릴, 2-벤즈티아졸릴, 4-벤즈티아졸릴, 5-벤즈티아졸릴, 5-인돌릴(indolyl), 5-인돌릴, 3-인다졸릴(indazolyl), 4-인다졸릴, 5-인다졸릴, 1-이소퀴놀릴(isoquinolyl), 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐(quinoxalinyl), 5-퀴녹살리닐, 2-퀴놀릴(quinolyl), 3-퀴놀릴, 6-퀴놀릴 등을 포함한다. 헤테로아릴이라는 용어는 가능한 N-산화물류를 포함하는 것을 의미한다. 예시적인 N-산화물류는 피리딜 N-산화물 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "선택적으로 치환된 헤테로아릴"이라는 용어는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4 개의 치환체, 통상적으로 1 또는 2 개의 치환체로 임의의 이용가능한 탄소 원자에서 선택적으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴을 가리킨다. 예시적인 치환된 헤테로아릴기는
Figure 112009080717400-pct00032
등을 포함한다.
이전에 확인된 카이랄 디아실히드라진 리간드에서 말단 모이어티 A 및 B에 대한 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴기의 특이적인 화학적 성질은 협소하게 의미가 있는 것은 아니며, 주목하는 바와 같이 다양한 치환체들이 고찰된다. 바람직하게는, 상기 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴에 대한 치환체는 탄소 및 헤테로원자의 총 수가 약 20 개 정도, 더 바람직하게는 약 15 개 정도가 되도록 선택된다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "헤테로사이클"이라는 용어는 2 내지 12 개 탄소 원자 및 1 또는 2 개의 산소, 황 또는 질소 원자를 갖는 1 내지 3 개의 고리를 함유하는 포화 및 부분적으로 불포화(1 또는 2 개의 이중 결합 함유) 사이클릭기를 가리킨다. 상기 헤테로사이클은 탄소 원자 또는 질소 원자를 통하여 나머지 분자에 선택적으로 연결될 수 있다. 예시적인 헤테로사이클기는
Figure 112009080717400-pct00033
등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "선택적으로 치환된 헤테로사이클"이라는 용어는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 술폰아미도, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg 또는 -N(Re)C=N(Rh)-아미노로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4 개의 치환체, 통상적으로 1 또는 2 개의 치환체로 선택적으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 헤테로사이클을 가리킨다. 예시적인 선택적으로 치환된 헤테로사이클기는
Figure 112009080717400-pct00034
등을 포함한다. 선택적으로 치환된 헤테로사이클은 아릴기에 융합되어 상기 기술된 바와 같이 선택적으로 치환된 아릴을 제공할 수 있다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "알콕시"라는 용어는 히드록시알킬, 할로알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐 또는 말단 산소 원자에 부착된 선택적으로 치환된 알키닐을 가리킨다. 예시적인 알콕시기는 메톡시, 터트-부톡시(tert-butoxy), -OCH2CH=CH2 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에서 사용된 "아릴옥시(aryloxy)"라는 용어는 말단의 산소 원자에 부착된 선택적으로 치환된 아릴을 가리킨다. 예시적인 아릴옥시기는 페녹시(phenoxy) 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "아릴알킬옥시"라는 용어는 말단 산소 원자에 부착된 아릴알킬을 가리킨다. 예시적인 아릴알킬옥시기는 벤질옥시 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "알킬티오"라는 용어는 히드록시알킬, 할로알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐 또는 말단 황 원자에 부착된 선택적으로 치환된 알키닐을 가리킨다. 예시적인 알킬기는 -SCH3 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "할로" 또는 "할로겐"이라는 용어는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도(iodo)를 가리킨다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "아미노"라는 용어는 식 -NRaRb의 라디칼로서, Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택저으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며; 또는 Ra 및 Rb가 부착된 질소 원자와 함께 취하여 4 내지 7원 헤테로사이클을 형성하는 라디칼을 가리킨다. 예시적인 아미노산기는 -NH2, -N(H)CH3, -N(H)CH3, -N(CH3)2, -N(H)CH2Ph 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "카르복사미도(carboxamido)"라는 용어는 식 -CO-아미노의 라디칼을 가리킨다. 예시적인 카르복사미도기는 -CONH2, -CON(H)CH3, -CON(H)Ph 등을 포함한다.
그 자체로서 또는 다른 기의 부분으로 본 명세서에 사용된 "술폰아미도(sulfonamido)"라는 용어는 식 -SO2-아미노의 라디칼을 가리킨다. 예시적인 술폰아미도기는 -SO2NH2, -SO2N(H)CH3, SO2N(H)Ph 등을 포함한다.
상술한 선택적으로 치환된 기를 참조하면, Rc는 수소, 히드록시, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시 또는 아릴알킬옥시이다; Rd는 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; Re는 수소, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; Rf는 수소, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시 또는 아미노이다; Rg는 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 아미노이다; 그리고 Rh는 수소, 알킬, 아릴, 사이아노 또는 니트로이다.
본 명세서 전반에 걸쳐서, 작용기 및 그 선택적 치환체를 선택하여 안정한 모이어티 및 화합물을 제공한다.
본 발명의 화합물은 상기 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에서 동위원소 원자의 비천연(unnatural) 부분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 삼중수소(3H), 이오다인(iodine)-125(125I) 또는 탄소-14(14C)와 같은 방사능 동위원소로 방사성라벨링될 수 있다. 방사능 여부에 관계없이, 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물은 본 발명의 범위 내에 있는 염을 형성할 수 있다. 본 명세서의 본 발명의 화합물에 대한 참조는 달리 지시되지 않으면 그 염류에 대한 참조를 포함하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 사용된 "염(류)"라는 용어는 무기 및/또는 유기 산 및 염기로 형성된 산 및/또는 염기성 염류를 지칭한다. 또한, 화학식 I, II 또는 III의 화합물이 염기성 모이어티 및 산성 모이어티 양쪽 모두를 함유하는 경우에, 양쪽성이온("내부 염류(inner salts)")이 형성될 수 있으며 본 명세서에 사용된 "염(류)"라는 용어 내에 포함된다. 다른 염류도 예컨대, 제조 도중에 채용될 수 있는 분리 또는 정제 단계에 유용하다고는 하지만, 약학적으로 허용가능한(즉, 유용한, 생리학적으로 허용가능한) 염류가 바람직하다. 화학식 I, II 또는 III의 화합물의 염류는 예를 들면, 화합물을 염이 침전하는 매질에서 또는 수용성 매질에서 당량(equivalent amount)과 같은 산 또는 염기의 양과 반응시켜 형성된 후에 동결건조시킬 수 있다.
염기성 모이어티를 함유하는 본 발명의 화합물은 다양한 유기 및 무기산을 갖는 염류를 형성할 수 있다. 예시적인 산 부가 염류는 아세트산염(아세트산 또는 예를 들면, 트리플루오로아세트산과 같은 트리할로아세트산으로 형성된 아세트산염과 같은), 아디프산염(adipates), 알긴산염, 아스코르빈산염, 아스파르트산염, 벤조산염, 벤젠술폰산염(benzenesulfonates), 이황산염(bisulfates), 붕산염, 부티르산염(butyrates), 시트르산염, 캄파산염(camphorates), 캄파술폰산염(camphorsulfonates), 사이클로펜탄프로피온산염(cyclopentanepropionates), 디글루콘산염(digluconates), 도데실황산염(dodecylsulfates), 에탄술폰산염(ethanesulfonates), 푸마르산염(fumarates), 글루코헵타논산염(glucoheptanoates), 글리세로인산염(glycerophosphates), 헤미황산염(hemisulfates), 헵타논산염(heptanoates), 헥사논산염(hexanoates), 염산염(염산으로 형성됨), 브롬화수소산염(브롬화 수소로 형성됨), 하이드로요오드화물(hydroiodides), 2-히드록시에탄술폰산염(2-hydroxyethanesulfonates), 젖산염, 말레산염(말레산으로 형성됨), 메탄술폰산염(메탄술폰산으로 형성됨), 2-나프탈렌술폰산염(2-naphthalenesulfonates), 니코틴산염, 질산염, 옥살산염, 펙틴산염(pectinates), 과황산염(persulfates), 3-페닐프로피온산염(3-phenylpropionates), 인산염, 피크르산염(picrates), 피발산염(pivalates), 프로피온산염, 살리실산염(salicylates), 숙신산염(succinates), 황산염(황산으로 형성된 것과 같은), 술폰산염(본 명세서에 언급된 것과 같은), 주석산염(tartrates), 티오사이안산염(thiocyanates), 토실산염(tosylates)과 같은 톨루엔술판산염, 언데칸산염(undecanoates) 등을 포함한다.
산성 모이어티를 함유하는 본 발명의 화합물은 다양한 유기 및 무기 염기를 갖는 염류를 형성할 수 있다. 예시적인 염기성 염류는 암모늄 염, 나트륨, 리튬 및 칼륨염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘 및 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 벤즈아틴류(benzathines), 디사이클로헥실아민류(dicyclohexylamines), 히드라바민류(hydrabamines)(N,N-비스(데히드로아비에틸)에틸렌디아민(N,N-bis(dehydroabietyl)ethylenediamine으로 형성됨), N-메틸-D-글루카민류, N-메틸-D-글루카미드류(N-methyl-D-glucamides), t-부틸 아민류(t-butyl amines)와 같은 유기 염기(예를 들면, 유기 아민류)를 갖는 염류 및 아르기닌, 리신과 같은 아미노산을 갖는 염류 등을 포함한다.
본 명세서에 사용된 입체화학적 용어 및 관용구는 달리 지시되지 않으면, Pure & Appl . Chem 68:2193 (1996)에 기술된 것과 일치한다.
"거울상이성질체 잉여(enantiomeric excess)" 또는 "ee"라는 용어는 하나의 거울상이성질체가 나머지 이성질체와 비교하여 얼마나 존재하는지에 대한 수치를 가리킨다. R 및 S 거울상이성질체의 혼합물에 대하여, 퍼센트 거울상이성질체 잉여는 │R - S│*100으로 정의되며, 여기서 R 및 S는 R + S =1이 되는 혼합물에서 거울상이성질체의 각각의 몰 또는 중량 분율이다. 카이랄 물질의 광학 회전에 관한 지식을 이용하여, 퍼센트 거울상이성질체 잉여는 ([α]obs/[α]max)*100으로 정의되며, 여기서 [α]obs는 거울상이성질체 혼합물의 광학 회전이며 [α]max는 순수한 거울상이성질체의 광학 회전이다. 거울상이성질체 잉여의 결정은 NMR 분광법, 카이랄 칼럼 크로마토그래피 또는 광학 편광측정법(polarimetry)을 포함하는 다양한 분석 기법을 이용하여 이루어질 수 있다.
"거울상이성질체적으로 순수한" 또는 "거울상순수(enantiopure)"라는 용어는 자신의 분자 모두가(검출 한계 내에서) 동일한 카이랄리티 의미를 갖는 카이랄 물질의 표본을 가리킨다.
"거울상이성질체적으로 농축된" 또는 "거울상농축된"이라는 용어는 그 거울상이성질체 비율이 50:50을 초과하는 카이랄 물질의 표본을 가리킨다.거울상이성질체적으로 농축된 화합물은 거울상이성질체적으로 순수할 수 있다.
"비대칭 탄소 원자"라는 용어는 4 개의 다른 원자 또는 원자들의 작용기에 부착된 유기 화합물의 분자에 있는 탄소 원자를 가리킨다.
"압도적으로"라는 용어는 50:50을 초과하는 비율을 의미한다.
"이탈기" 또는 "LG"라는 용어는 특이적인 반응에서 기질의 잔류 또는 주된 부분인 것으로 간주되는 것에서 원자 또는 작용기로부터 탈착된 원자 또는 작용기를 가리킨다. 아미드 커플링(coupling) 반응에서, 예시적인 이탈기는 -F, -Cl, -Br, -OC6F5 등을 포함한다.
본 발명의 목적을 위하여 "분리된(isolated)"이라는 용어는 최초 환경(자연적으로 존재하는 환경)으로부터 제거된 물질(예컨대, 핵산 또는 단백질과 같은 화합물 또는 생물학적 물질)을 지적한다. 예를 들면, 식물 또는 동물에서 자연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드는 분리되지 않지만, 자연적으로 존재하는 인접한 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드는 "분리된"이라고 간주된다.
생물학적 물질에 적용되는 바와 같은 "정제된"이라는 용어는 그 물질이 다른 화합물의 존재를 배제하며, 절대적 순도를 보이는 형태로 존재할 것을 요구하지는 않는다. 그것은 오히려 상대적으로 정의되는 것이다.
"핵산', "핵산 분자", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되며, 단일 가닥 형태로나 이중-가닥 나선으로 된 포스포로티오에이트류(phosphorothioates) 및 티오에스테르류(thioesters)와 같은 리보뉴클레오시드류(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시토신; "RNA 분자") 또는 디옥시리보뉴클레오시드류(데옥시아데노신(deoxyadenosine), 데옥시구아노신(deoxyguanosine), 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 인산염 에스테르 중합 형태 또는 그 임의의 포스포에스테르 유사체를 가리킨다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선들도 가능하다. 핵산 분자라는 용어 및 특히, DNA 또는 RNA 분자는 상기 분자의 1차 및 2차 구조만을 가리키며, 이를 임의의 특정한 3차 형태로 한정하지 않는다. 따라서, 이 용어는 특히, 선형 또는 원형 DNA 분자(예컨대, 제한 단편(restriction fragments)), 플라스미드, 수퍼코일된(supercoiled) DNA 및 염색체에서 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 특정한 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 토론하는 경우, 서열은 DNA의 비-전사 가닥(즉, mRNA에 상동인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로 가는 서열만 표기하는 정상적인 관례에 따라 본 명세서에 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"은 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA(genomic DNA), 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반-합성(semi-synthetic) DNA를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
"단편"이라는 용어는 기준 핵산에 대하여 감소된 길이의 뉴클레오티드 서열이며 공통 부분 상에서, 상기 기준 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 본 발명에 따르면, 상기 핵산 단편은 구성성분(constituent)으로 있는 크기가 더 큰 폴리뉴클레오티드에 적절하게 포함될 수 있다. 상기 단편은 본 발명에 따른 핵산의 길이가 적어도 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000 또는 1500 개에 이르는 연속 뉴클레오티드들로부터 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 또는 상기 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있다.
본 명세서에 사용된 "분리된 핵산 단편"은 단일 또는 이중 가닥이며, 선택적으로는 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는 RNA 또는 DNA의 중합체를 가리킨다. DNA 중합체 형태의 분리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 세그먼트(segment)로 구성될 수 있다.
"유전자"는 기능성 분자(예컨대, 폴리펩티드 또는 RNA)를 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티를 가리키며, cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. 또한, "유전자"는 코딩 서열을 선행하고(5' 비-코딩 서열) 및 후행하는(3 비-코딩 서열) 조절 서열을 포함한, 특이적인 RNA, 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 단편을 가리킨다. "자연적인 유전자"는 그 자신의 조절 서열을 갖는, 자연에서 발견되는 유전자를 가리킨다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및/또는 코딩 서열을 포함하는, 자연적인 유전자가 아닌 임의의 유전자를 가리킨다. 이에 따라, 키메라 유전자는 다른 원천으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일 원천으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있지만, 자연에서 발견되는 것과는 다른 방식으로 배열된다. 키메라 유전자는 다른 원천으로부터 유래된 코딩 서열 및/또는 다른 원천으로부터 유래된 조절 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 자연적 위치에 있는 자연적인 유전자를 가리킨다. "외래(foreign)" 유전자 또는 "이종(heterologous)" 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로 발견되지 않지만, 유전자 전달에 의하여 숙주 유기체에 도입되는 유전자를 가리킨다. 외래 유전자는 비자연적인 유기체에 삽입되는 자연 유전자 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "형질전환 유전자"는 형질전환 과정에 의하여 게놈 속으로 도입되는 유전자이다.
"이종" DNA는 세포 또는 세포의 염색체 부위에서 자연적으로 위치하지 않은 DNA를 가리킨다. 바람직하게는, 상기 이종 DNA는 세포에 외래인 유전자를 포함한다.
"게놈"이라는 용어는 미토콘드리아, 엽록체 및 바이러스성 DNA 또는 RNA뿐만 아니라 염색체 DNA 또는 RNA를 포함한다.
핵산 분자는 적절한 온도 및 용액 이온 강도의 조건 하에서 상기 핵산 분자의 단일 가닥 형태가 다른 핵산 분자로 복원할 수 있는 경우에, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 다른 핵산 분자로 "혼성화 할 수 있다(hybridizable)"(문헌[Sambrook et al., 1989] 하기 참조). 혼성화 및 세척 조건은 공지되어 있으며 문헌[Sambrook et al.의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)] 중, 특히 11 장 및 표 11.1(본 명세서에 참고로 전체가 포함됨)에 예시되어 있다. 상기 온도 및 이온 강도의 조건은 상기 혼성화의 "엄격함(stringency)"을 결정한다.
엄격함 조건은 먼 친적관계의(distantly related) 유기체로부터 이종 서열과 같은 중간정도로 유사한 단편에서 가까운 친적관계의(closely related) 유기체로부터 기능성 효소를 복제하는 유전자와 같은 고도로 유사한 단편에 이르기까지 선별하도록 조절될 수 있다. 이종 핵산에 대한 예비 선별을 위해, 55°의 Tm에 해당하는 낮은 엄격함 혼성화 조건(예컨대, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크 및 무 포름아미드; 또는 30% 포르마이드, 5x SSC, 0.5% SDS)을 이용할 수 있다. 중간정도의 엄격함 혼성화 조건은 예컨대, 5x 또는 6x SCC를 이용한 40% 포름아미드의 더 높은 Tm에 해당한다. 높은 엄격함 혼성화 조건은 가장 높은 Tm, 예컨대, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 해당한다.
혼성화는 두 핵산이 혼성화의 엄격함에 의존하지만, 염기 사이의 부정합이 가능한 상보적 서열을 함유할 것을 요구한다. "상보적"이라는 용어는 서로서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 대하여 아데노신은 티민과 상보적이고 시토신은 구아닌과 상보적이다. 이에 따라, 본 발명은 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 본 명세서에 개시되거나 사용된 완전한 서열에 상보적인 분리된 핵산 단편도 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 채용하고 상기 설명된 조건을 이용하여 검출된다. 다른 실시예에서, 상기 Tm은 60℃이다; 일 실시예에서, 상기 Tm은 63℃이다; 다른 실시예에서, 상기 Tm은 65℃이다.
이후의 혼성화 세척(post-hybridization wash)은 또한 엄격한 조건을 결정한다. 한 세트의 조건은 실온에서 15분 동안 6X SSC, 0.5% SDS로 시작하여 일련의 세척을 사용하고, 그런 다음 45℃에서 30분 동안 2X SSC, 0.5% SDS로 반복하였고, 50℃에서 30분 동안 0.2X SSC, 0.5% SDS로 2회 반복하였다. 한 세트의 엄격한 조건은 더 고온을 사용하고, 상기 세척은 0.2X SSC, 0.5% SDS로 최종 2회의 30분 동안의 온도를 60℃로 증가시킨 것을 제외하고는 상기와 동일하다. 또 다른 세트의 매우 엄격한 조건은 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 최종 2회의 세척을 사용한다.
핵산을 혼성화하는데 적절한 엄격함은 핵산의 길이 및 상보성 정도(degree of complementation)에 의존하는데, 이는 업계에 공지된 변수이다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 크면 클수록 상기 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 Tm 값이 더 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성(더 높은 Tm에 해당)은 하기의 순서로 감소한다: RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA. 길이가 100 뉴클레오티드를 초과하는 하이브리드에 대하여, Tm을 계산하는 방정식이 유도된다(상기의 문헌[Sambrook et al., 9.50-0.51] 참조). 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드를 이용한 혼성화에 대하여, 부정합의 위치는 더욱 중요해지며, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 이의 특이성을 결정한다(상기의 문헌[Sambrook et al., 11.7-11.8] 참조).
본 발명의 일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 50 mM 미만의 염 및 적어도 섭씨 37 도에서의 혼성화 단계 및 2XSSPE에서 적어도 섭씨 63로 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 채용하여 검출된다. 일 실시예에서, 상기 혼성화 조건은 혼성화 단계에 대하여 200 mM 미만 염 및 적어도 섭씨 37 도를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 혼성화 조건은 혼성화 및 세척 단계 양쪽 모두에 대하여 2XSSPE 및 섭씨 63 도를 포함한다.
다른 실시예에서, 혼성화가능한 핵산에 대한 길이는 적어도 약 10 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 혼성화가능한 핵산에 대한 최소 길이는 적어도 약 15 뉴클레오티드이다; 더 바람직하게는 적어도 약 20 뉴클레오티드이다; 그리고 가장 바람직하게는 상기 길이는 적어도 30 뉴클레오티드이다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브(probe)의 길이와 같은 인자에 따라 필요한 만큼 조절될 수 있다는 것을 알 것이다.
"프로브(probe)"라는 용어는 상보성 단일 가닥 표적 핵산과 염기쌍을 지어 이중 가닥 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥 핵산 분자를 가리킨다.
본 명세서에 사용된 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"라는 용어는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 플라스미드 DNA 또는 mRNA 분자와 혼성화가능한 짧은 핵산을 가리킨다. 올리고뉴클레오티드는 예컨대, 32P-뉴클레오티드 또는 바이오틴(biotin)과 같은 라벨이 공유적으로 결합된(conjugated) 뉴클레오티드를 이용하여 라벨링될 수 있다. 라벨링된 올리고뉴클레오티드는 프로브로 사용되어 핵산의 존재를 검출할 수 있다. 올리고뉴클레오티드(라벨링될 수 있는 하나 또는 그 양쪽 모두)는 핵산의 전장 또는 단편을 클로닝하거나 핵산의 존재를 검출하기 위하여 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 DNA 분자와 삼중 나선을 형성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 핵산 합성기 상에서 합성 제조된다. 이에 따라, 올리고뉴클레오티드는 티오에스테르 결합 등과 같은 비-천연적으로 발생하는 포스포에스테르 유사체 결합을 이용하여 제조될 수 있다.
"프라이머"(primer)는 적절한 조건 하에서 DNA 합성을 위한 개시점으로 역할할 수 있는 이중 가닥 핵산 영역을 생성하는 표적 핵산 서열과 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 가리킨다. 상기 프라이머는 중합효소 연쇄 반응에 사용될 수 있다.
"중합효소 연쇄 반응" 약어로 PCR이며, 특이적 핵산 서열을 효소적으로 증폭시키는 시험관 내(in vitro) 방법을 가리킨다. PCR은 하기 3 단계를 포함하는 각각의 사이클을 이용한 반복적인 온도 사이클의 서열 순열을 포함한다: 주형 핵산을 변성시켜 표적 분자의 가닥들을 분리시키는 단계, 단일 가닥 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상기 주형 핵산에 복원시키는 단계 및 상기 복원된 프라이머(들)을 DNA 중합효소에 의하여 연장시키는 단계. PCR은 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량 또는 반-정량 조건 하에서 핵산의 시작 풀(starting pool) 내에서 상기 표적 분자의 상대량을 결정하는 수단을 제공한다.
"역전사-중합효소 연쇄 반응"은 약어로 PT-PCR이며, RNA 분자 또는 분자들로부터 표적 cDNA 분자 또는 분자들을 효소적으로 생성하여 이후, 상술한 표적 cDNA 분자 또는 분자들 내에서 특이적인 핵산 서열 또는 서열들을 효소적으로 증폭시키는 시험관 내 방법을 가리킨다. 또한, RT-PCR은 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량 또는 반-정량 조건 하에서 핵산의 시작 풀 내에서 상기 표적 분자의 상대량을 결정하는 수단을 제공한다.
DNA "코딩 서열"은 폴리펩티드를 인코딩하며, 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓인 경우에 시험관 내 또는 체내에서 세포 내의 폴리펩티드로 전사 및 번역될 수 이중-가닥 DNA 서열을 가리킨다. "적절한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 코딩 서열의 내에서 또는 코딩 서열의 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하며, 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 처리 또는 안정성 또는 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 조절 서열은 프로모터, 번역 선도 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 부위, 작동체(effector) 결합 부위 및 줄기(stem)-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서의 시작 코돈 및 3' (카르복실) 말단에서의 번역 정지(stop) 코돈에 의하여 결정된다. 코딩 서열은 원핵 서열, mRNA로부터 cDNA, 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 상기 코딩 서열이 진핵 세포에서 발현 의도이라면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 주로 상기 코딩 서열에 대해 3'에 위치될 것이다.
"개방형 판독 프레임(open reading frame)"은 약어로 ORF이며, ATG 또는 AUG와 같은 번역 시작 신호 또는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함하고 폴리펩티드 서열로 잠재적으로 번역될 수 있는 DNA, cDNA 또는 RNA 중 어느 하나와 같은 핵산 서열의 길이를 가리킨다.
"머리(head)-대-머리"라는 용어는 본 명세서에서 서로서로 관련된 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열의 배향성을 기술하는데 사용된다. 2 개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단이 나머지 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단에 인접하는 경우에 머리-대-머리 배향성으로 위치하여, 이에 의하여 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 상기 나머지 다른 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 멀어지면서 진행하게 된다. "머리-대-머리"라는 용어는 약어로 (5')-대-(5')로 약술될 수 있으며, 또한 기호 (← →) 또는 (3' ← 5'5' → 3')에 의하여 표시될 수 있다.
"꼬리-대-꼬리"라는 용어는 본 명세서에서 서로서로 관련된 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열의 배향성을 기술하는데 사용된다. 2 개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단이 나머지 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단에 인접하는 경우에 꼬리-대-꼬리 배향성으로 위치하여, 이에 의하여 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 상기 나머지 다른 폴리뉴클레오 쪽으로 진행하게 된다. "꼬리-대-꼬리"라는 용어는 약어로 (3')-대-(3')으로 약술될 수 있으며, 또한 기호 (→ ←) 또는 (5' → 3'3' ← 5')에 의하여 표시될 수 있다.
"머리-대-꼬리"라는 용어는 본 명세서에서 서로서로 관련된 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열의 배향성을 기술하는데 사용된다. 2 개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단이 나머지 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단에 인접하는 경우에 머리-대-꼬리 배향성으로 위치하여, 이에 의하여 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 상기 나머지 다른 폴리뉴클레오의 방향과 동일한 방향으로 진행하게 된다. "머리-대-꼬리"라는 용어는 약어로 (5')-대-(3')으로 약술될 수 있으며, 또한 기호 (→ →) 또는 (5' → 3'5' → 3')에 의하여 표시될 수 있다.
"하류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 3'에 위치된 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 특히, 하류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 전사 시작점을 따르는 서열에 관한 것이다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 하류에 위치된다.
"상류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치된 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 특히, 상류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 코딩 서열의 5' 측면 또는 전사 시작점 상에 위치된 서열에 관한 것이다. 예를 들면, 대부분의 프로모터는 전사의 시작 부위의 상류에 위치된다.
"제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)" 및 "제한 효소"라는 용어는 상호교환가능하게 사용되며 이중 가닥 DNA 내의 특이적인 뉴클레오티드 서열과 결합하여 그 내부에서 절단하는 효소를 가리킨다.
"상동 재조합"은 외래 DNA 서열을 다른 DNA 분자로의 삽입, 예컨대, 염색체 내에서의 벡터의 삽입을 가리킨다. 바람직하게는, 상기 벡터는 상동 재조합에 대한 특이적인 염색체 부위를 표적한다. 특이적인 상동 재조합에 대하여, 상기 벡터는 염색체의 서열과 상동인 충분히 길이가 긴 영역을 함유하여 상기 벡터와 상보적인 결합 및 상기 벡터의 염색체로의 주입(incorporation)을 가능하게 한다. 상동성의 영역이 길면 길수록, 서열 유사성의 정도가 크면 클수록 상동 재조합의 효율을 증가시킬 수 있다.
업계에 공지된 일부 방법은 본 발명에 따라 폴리뉴클레오티드를 증식시키는데 이용될 수 있다. 적당한 숙주 시스템 및 성장 조건이 수립되면, 재조합 발현 벡터는 증식되어 대량으로 제조될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터는 하기 벡터 또는 그 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다: 몇 가지 예를 들자면, 우두(vaccinia) 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 인간 또는 동물 바이러스; 바쿨로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예컨대, 람다(lambda)) 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
"벡터"는 숙죽 세포에 핵산의 클로닝 및/또는 전달을 위한 임의의 운반체를 가리킨다. 벡터는 다른 DNA 세그먼트가 부착되어 부착된 세그먼트의 복제를 발생시킬 수 있는 레플리콘(replicon)일 수 있다. "레플리콘"은 체내에서 DNA 복제의 독립적인 단위로서 작용하는, 즉, 자기 자신의 제어 하에서 복제할 수 있는 임의의 유전자 구성요소(예컨대, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 가리킨다. "벡터"라는 용어는 핵산을 시험관 내, 체외 또는 체내의 세포로 도입하는 바이러스성 및 비바이러스성 운반체 양쪽 모두를 포함한다. 업계에 공지된 수많은 벡터는 핵산을 조작하고, 반응 구성요소 및 프로모터를 유전자 등으로 주입하는데 사용될 수 있다. 가능한 벡터는 예를 들면, 람다 유도체와 같은 박테리오파지 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터를 포함하는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함한다. 예를 들면, 반응 구성요소 및 프로모터에 해당하는 DNA 단편의 적당한 벡터로의 삽입은 상보적인 점착성 말단(cohesive termini)을 갖는 선택된 벡터로 적절한 DNA 단편을 연결시켜 달성될 수 있다. 또한, 상기 DNA 분자들의 말단은 효소적으로 변형될 수 있거나 임의의 부위가 상기 DNA 말단 속으로 뉴클레오티드 서열(링커)를 연결시켜 생성될 수 있다. 상기 벡터는 세포 게놈 속으로 선택 표지를 주입하는 세포 선택을 제공하는 상기 선택 표지를 함유하도록 처리될 수 있다. 상기 표지는 상기 표지에 의하여 인코딩되는 단백질을 주입하고 발현시키는 숙주 세포의 확인 및/또는 선택을 가능하게 한다.
바이러스성 벡터 및 특히, 레트로바이러스성 벡터는 살아있는 동물 피검자뿐만 아니라 세포에서 다양한 유전자 전달 응용에 사용되어 왔다. 사용될 수 있는 바이러스성 벡터는 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스, 천연두(pox), 바쿨로바이러스, 우두, 단순 포진, 엡슈타인-바르(Epstein-Barr), 아데노바이러스, 제미니바이러스(geminivirus) 및 카울리모(caulimovirus) 벡터를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 비-바이러스성 벡터는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 대전된 지질(시토펙틴), DNA-단백질 복합체 및 생물중합체(biopolymer)를 포함한다. 핵산에 더하여, 벡터는 또한 하나 이상의 조절 영역 및/또는 핵산 운반 결과(어느 조직으로의 운반, 발현의 기간 등)를 선택, 측정 및 모니터링하는데 유용한 선택 표지를 포함할 수 있다.
"플라스미드"라는 용어는 세포의 중심 대사 부분은 아니면서, 주로 원형 이중 가닥 DNA 분자 형태인 유전자를 흔히 보유하는 엑스트라-염색체(extra-chromosomal) 구성요소를 가리킨다. 상기 구성요소는 임의의 원천으로부터 유래된 단일- 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 선형, 원형 또는 수퍼코일된 독립적으로 복제하는 서열, 게놈 주입(integrating) 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열로서, 여기에 수많은 뉴클레오티드 서열이 프로모터 단편 및 적절한 3' 미번역 서열과 함께 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 세포 속으로 도입할 수 있는 유일한 구조로 연결되거나 재조합된다.
"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제하고 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 기원을 포함하여 다른 핵산 세그먼트가 부착되어 부착된 세그먼트의 복제를 발생시킬 수 있는 핵산, 바람직하게는 DNA의 단위 길이인 "레플리콘"을 가리킨다. 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형에서 복제 및 다른 유형에서 발현이 가능할 수 있다("셔틀 벡터(shuttle vector)").
"발현 벡터"라는 용어는 숙주로의 형질전환 이후 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하도록 설계된 벡터, 플라스미드 또는 운반체를 가리킨다. 클론된 유전자, 즉, 삽입된 핵산 서열은 주로 프로모터, 최소 프로모터, 인헨서(enhancer) 등과 같은 제어 구성요소의 제어 하에 놓인다. 원하는 숙주 세포에서 핵산의 발현을 구동하는데 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 수없이 많으며 당업자에게 알려져 있다. 이러한 유전자를 구동시킬 수 있는, 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 거의 모든 프로모터는 본 발명에 적합하다: 바이러스성 프로모터, 박테리아성 프로모터, 동물 프로모터, 포유류 프로모터, 합성 프로모터, 항상 프로모터(constitutive promoter), 조직 특이적 프로모터(tissue specific promoter), 발달 특이적 프로모터(developmental specific promoters), 유도성 프로모터, 광 조절 프로모터; CYC1 , HIS3 , GAL1 , GAL4 , GAL10 , ADH1 , PGK , PHO5 , GAPDH , ADC1 , TRP1, URA3 , LEU2 , ENO , TPI, 알칼리 인산가수분해효소 프로모터(효모균(Saccharomyces)에서 발현에 유용한); AOX1 프로모터(피히아속(Pichia)에서 발현에 유용한); β-락타마제(lactamase), lac , ara , tet , trp , lP L , lP R , T7 , tac 및 trc 프로모터(대장균(Escherichia coli)에서 발현에 유용한); 광 조절-, 종자 특이적-, 화분 특이적-, 난소 특이적-, 병원론(pathogenesis) 또는 질병 관련-, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S, CMV 35S 최소(minimal), 카사바 정맥 모자이크 바이러스(CsVMV), 엽록소 a/b 결합 단백질, 리불로오스 1, 5-비스인산염(bisphosphate) 카르복시화효소, 묘조-특이적(shoot-specific), 뿌리 특이적, 키티나아제(chitinase), 스트레스 유도성(stress inducible), 벼 퉁그로 간상 바이러스(rice tungro bacilliform virus), 식물 수퍼-프로모터(plant super-promoter), 감자 류신 아미노펩티다제, 질산염 환원효소, 마노핀 합성효소(mannopine synthase), 노팔린 합성효소, 유비퀴틴(ubiquitin), 제인 단백질(zein protein) 및 안토시아닌 프로모터(식물 세포에서 발현에 유용한); 업계에 공지된 동물 및 포유류 프로모터는 SV40 초기(SV 40e) 프로모터 영역, 로우스 육종 바이러스(RSV)의 3' 장형 반복 말단(long terminal repeat: LTR)에 함유된 프로모터, E1A의 프로모터 또는 아데노바이러스(Ad)의 메이져 레이트 프로모터(major late promoter: MLP) 유전자, 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터, 단순포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나아제(TK) 프로모터, 바쿨로바이러스 IE1 프로모터, 연장 인자 1 알파(EF1) 프로모터, 인산글리세린산염 키나아제(phosphoglycerate kinase: PGK) 프로모터, 유비퀴틴(Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 마우스 메탈로티오네인(mouse metallothionein)-L 프로모터의 조절 서열 및 전사 제어 영역(transcriptional control regions), 유비퀴터스 프로모터류(ubiquitous promoters)(HPRT, 비멘틴(vimentin), α-액틴(actin), 튜불린 등), 중간 섬유류(데스민, 신경필라멘트, 케라틴, GFAP 등)의 프로모터, 치료 유전자(MDR, CFTR 또는 인자 VIII 유형 등의) 프로모터, 병원론 및 질병 관련-프로모터 및 췌장 샘 세포에서 활성인 엘라스타제(elastase) I 유전자 제어 영역과 같이, 조직 특이성을 보이며 형질전환 동물에서 활용되어온 프로모터; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역, 림프양(lymphoid) 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역, 고환, 유방, 림프양 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유선(mammary) 종양 바이러스 제어 영역; 알부민 유전자, 간에서 활성인 Apo AI 및 Apo AII 제어 영역, 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 제어 영역, 간에서 활성인 알파 1-안티트립신(antitrypsin) 유전자 제어 영역, 골수성 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역, 대뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte cells)에서 활성인 수초 기본 단백질(myelin basic protein) 유전자 제어 영역, 골격근에서 활성인 미오신 광 사슬-2 유전자 제어 영역 및 시상하부에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역, 피루브산염 키나아제 프로모터, 빌린(villin) 프로모터, 지방산 결합 장관 단백질(fatty acid binding intestinal protein)의 프로모터, 평활근 세포 α-액틴의 프로모터 등. 또한, 이 발현 서열은 인헨서 또는 조절 서열 등의 첨가에 의하여 변형될 수 있다.
벡터는 업계에 공지된 방법, 예컨대, 핵산전달감염, 전기천공법, 현미 주입법(microinjection), 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(lipofection)(리소좀 융합), 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 트랜스포터에 의하여 원하는 숙주 세포 속으로 도입될 수 있다(예컨대, 문헌[Wu et al ., J. Biol . Chem. 267:963-967 (1992)]; 문헌[Wu et al ., J. Biol . Chem . 263:14621-14624 (1988)]; 및 Hartmut et al ., 캐나다 특허 출원 번호 제2,012,311호(1990 년 3 월 15 일 출원) 참조).
또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 리포펙션에 의하여 체내로 도입될 수 있다. 지난 10 년 동안에, 시험관 내로 핵산의 캡슐화 및 핵산전달감염을 위하여 리포좀의 사용이 증가하였다. 리포좀-매개 핵산전달감염을 이용하여 발생된 어려운 사항 및 위험을 제한하려고 설계된 합성 양이온 지질은 표지를 인코딩하는 유전자의 체내 핵산전달감염을 위한 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있다(문헌[Felgner et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 84:7413 (1987)]; 문헌[Mackey et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:8027-8031 (1988)]; 및 문헌[Ulmer et al., Science 259:1745-1748 (1993)]). 양이온 지질의 사용으로 인하여 음으로 대전된 핵산의 캡슐화를 촉진시킬 수 있으며, 또한 음으로 대전된 세포막으로 융합을 촉진시킬 수 있다(문헌[Felgner et al., Science 337:387-388 (1989)]). 특히 유용한 핵산 운반용 지질 화합물 및 조성물은 제WO95/18863호, 제WO96/17823호 및 미국 특허 제5,459,127호에 기술되어 있다. 체내 특이적인 기관 속으로 외인성 유전자를 도입하는데 리포펙션을 사용하면 특정한 실제적인 장점이 있다. 특이적인 세포에 리포좀의 분자 표적은 혜택을 받는 한 영역을 나타낸다. 특정 세포 유형에 핵산전달감염을 지시하는 것은 췌장, 간, 신장 및 대뇌와 같이 세포 이질성(heterogeneity)을 갖는 조직에서 특히 바람직할 것이라는 것은 명백하다. 지질은 표적 목적을 위하여 다른 분자에 화학적으로 커플링될 수 있다(Mackey et al. 1988, 상기). 표적된 펩티드, 예컨대, 호르몬 또는 신경전달물질 및 항체와 같은 단백질 또는 비펩티드 분자는 리포좀과 화학적으로 커플링될 수 있다.
또한, 다른 분자는 양이온 올리고펩티드(예컨대, 제WO 95/21931호), DNA 결합 단백질로부터 유래된 펩티드(예컨대, 제WO 96/25508호) 또는 양이온 중합체(예컨대, 제WO 95/21931호)과 같은 체내 핵산의 핵산전달감염을 용이하게 하는데 유용하다.
또한, 체내 벡터를 나출된(naked) DNA 플라스미드로서 도입하는 것이 가능하다(미국 특허 제5,693,622호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호 참조). 또한, 수용체-매개 DNA 전달 접근법이 사용될 수 있다(문헌[Curiel et al., Hum. Gene The. 3:147-154(1992)]; 및 문헌[Wu et al, J. Bio. Chem. 262:4429-4432(1987)]).
"핵산전달감염(transfection)"이라는 용어는 세포에 의한 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA의 섭취를 가리킨다. 세포는 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA가 세포 내부로 도입되는 경우, 상기 RNA 또는 DNA에 의하여 "핵산전달감염된다". 세포는 상기 핵산전달감염된 RNA 또는 DNA가 표현형 변화를 초래하는 경우, 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA에 의하여 "형질전환"된다. RNA 또는 DNA 형질전환은 세포의 게놈을 이루는 염색체 DNA 속으로 주입(공유적으로 연결)될 수 있다.
"형질전환(transformation)"은 숙주 유기체의 게놈 속으로 핵산 단편을 운반하여 유전적으로 안정한 유전적 성질(inheritance)을 발생시키는 것을 가리킨다. 상기 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "형질전환(transgenic)" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체라고 지칭한다.
또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 그 증폭 또는 발현이 이루어지는 세포 숙주에서의 복제를 위한 하나 이상의 기원, 표지 또는 선택 표지를 포함할 수 있다.
"선택 표지"라는 용어는 표지 유전자의 효과 즉, 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 측색 표지(colorimetric markers), 효소, 형광 표지 등을 바탕으로 선택될 수 있는 주로 항생제 또는 화학적 내성 유전자인 확인 인자로서, 상기 효과가 관심대상 핵산의 유전적 성질을 추적하고/하거나 관심대상 핵산을 유전시키는 세포 또는 유기체를 확인하는데 사용되는 확인 인자를 가리킨다. 업계에 공지되어 사용되는 선택 표지 유전자의 예는 하기를 포함한다: 앰피실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 히그로마이신(hygromycin), 비알라포스(bialaphos) 제초제, 술폰아미드 등; 및 표현형 표지로 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 전이효소 유전자(isopentanyl transferase gene) 등.
"리포터 유전자"라는 용어는 리포터 유전자의 효과를 바탕으로 확인될 수 있는 확인 인자를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 효과가 관심대상 핵산의 유전적 성질을 추적하고, 관심대상 핵산을 유전시키는 세포 또는 유기체를 확인하고/하거나 유전자 발현 도입 또는 전사를 측정하는데 사용되는 핵산을 가리킨다. 업계에 공지되어 사용되는 리포터 유전자의 예는 하기를 포함한다: 루시페라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등. 또한, 선택 표지 유전자는 리포터 유전자로 간주될 수 있다.
"프로모터 및 프로모터 서열"은 상호교환가능하게 사용되며 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 가리킨다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치된다. 프로모터는 그 전체가 자연적인 유전자로부터 유래되거나 자연에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유래된 다른 구성요소로 이루어지거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 다른 프로모터는 다른 조직 또는 세포 유형에서 또는 다른 단계의 발달에서 또는 다른 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 당업자는 알아야 할 것이다. 유전자가 대부분의 시간에서 대부분의 세포 유형에서 발현되도록 하는 프로모터는 흔히 "항상 프로모터"라 지칭된다. 유전자가 특이적인 세포 유형에서 발현되도록 하는 프로모터는 흔히 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"라고 지칭된다. 유전자가 발달 또는 세포 분화의 특이적 단계에서 발현되도록 하는 프로모터는 "발달적으로-특이적 프로모터(developmentally-specific promoters)" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"라고 지칭된다. 프로모터는 유도되며, 프로모터를 유도하는 작용제, 생물학적 분자, 화학적 리간드, 빛 등으로 세포를 노출시키거나 처리한 후에 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 흔히 "유도성 프로모터" 또는 조절성(regulatable) 프로모터"라고 지칭된다. 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계는 완전하게 정의되지 않으며, 다른 길이의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음도 알아야 한다.
프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의하여 3' 말단에서 통상적으로 경계되며 상류(5' 방향)로 연장하여 배경 이상으로 검출될 수 있는 레벨에서 전사를 개시하는데 필요한 최소수의 염기 또는 구성요소를 포함한다. 상기 프로모터 서열 내에서 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(보존 서열(consensus sequences))뿐만 아니라, 전사 개시 부위(예를 들면, 뉴클레아제 S1으로 매핑(mapping)에 의하여 용이하게 정의됨)가 발견될 것이다.
코딩 서열은 RNA 중합효소가 상기 코딩 서열을 mRNA로 전사하고, 이후 (상기 코딩 서열이 인트론을 함유하는 경우) 트랜스-RNA 스플라이스되며 상기 코딩 서열에 의하여 인코딩된 단백질로 번역되는 경우, 세포 내에서 전사 및 번역 제어 서열의 "제어 하(under control)"에 있다.
"전사 및 번역 제어 서열"은 숙주 세포 내에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인헨서, 종결자 등과 같은 DNA 조절 서열을 가리킨다. 진핵 세포에서, 폴리아데닐화 신호는 제어 서열이다.
"반응 구성요소"라는 용어는 전사 인자의 DNA 결합 도메인, 예컨대, 제1 하이브리드 단백질의 DNA 결합 도메인과의 상호작용을 통하여 매개되는 프로모터에 반응성을 부여하는 하나 이상의 시스-작용(cis-acting) DNA 구성요소를 가리킨다. 이 DNA 구성요소는 그 서열에서 회문식(palindromic)(완전 또는 불완전)이거나 다양한 수의 뉴클레오티드에 의하여 분리된 서열 모티프(motifs) 또는 절반 부위로 구성될 수 있다. 상기 절반 부위는 유사하거나 동일하며 직접 또는 반전된(inverted) 반복체로 배열되거나 단일 절반 부위로서 또는 평행한(in tandem) 인접 절반 부위들의 다합체(multimer)로서 배열될 수 있다. 반응 구성요소는 상기 반응 구성요소가 주입될 세포 또는 유기체의 특성에 의존하여 다른 유기체로부터 분리된 최소 프로모터를 포함할 수 있다. 제1 하이브리드 단백질의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부존재시에 관계없이 반응 구성요소의 DNA 서열과 결합하여 이 반응 구성요소의 조절 하에 하류 유전자(들)의 전사를 개시하거나 억제하게 된다. 천연 엑디손 수용체의 반응 구성요소에 대한 DNA 서열의 예는 하기를 포함한다: RRGG/TTCANTGAC/ACYY(서열 ID 번호: 16)(문헌[Cherbas et al ., Genes Dev . 5:120-131(1991)]); AGGTCAN(n)AGGTCA, 여기서 N(n)은 하나 이상의 스페이서 뉴클레오티드일 수 있다(서열 ID 번호: 17)(문헌[D'Avino et al ., Mol . Cell . Endocrinol . 113:1-9(1995)]); 및 GGGTTGAATGAATTT(서열 ID 번호: 18)(문헌[Antoniewski et al., Mol . Cell Biol . 14:4465-4474(1994)]).
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 연관으로서, 하나의 기능이 다른 하나에 의하여 영향받는 연관을 가리킨다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우, 프로모터는 상기 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다(즉, 상기 코딩 서열은 상기 프로모터의 전사 제어 하에 있다). 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향성으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "발현"이라는 용어는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유도된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 가리킨다. 또한, 발현은 mRNA를 단백질 또는 폴리펩티드로의 번역을 가리킨다.
"카세트", "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"라는 용어는 특이적인 제한 부위에서 또는 상동 재조합에 의하여 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 속으로 삽입될 수 있는 DNA의 세그먼트를 가리킨다. 상기 DNA의 세그먼트는 관심대상 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 카세트 및 제한 부위는 전사 및 번역에 대한 적정한 판독 프레임에서 상기 카세트의 삽입을 확보하도록 설계되어 있다. "형질전환 카세트"는 관심대상 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 상기 폴리뉴클레오티드에 더하여 구성요소를 갖는 특이적인 벡터를 가리킨다. 또한, 본 발명의 카세트, 발현 카세트, 유전자 발현 카세트 및 형질전환 카세트는 숙주 세포에서 관심대상의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 향상된 발현을 가능하게 하는 구성요소를 포함할 수 있다. 상기 구성요소는 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다: 프로모터, 최소 프로모터, 인헨서, 반응 구성요소, 종결자 서열(terminal sequence), 폴리아데닐화 서열 등.
본 발명의 목적을 위하여, "유전자 스위치"라는 용어는 프로모터와 연관된 반응 구성요소 및 하나 이상의 리간드의 존재하에 상기 반응 구성요소 및 프로모터가 주입되어 있는 유전자의 발현을 조절하는 EcR-계 시스템의 조합을 가리킨다.
"조절하다" 및 "조절하게 된다"라는 용어는 핵산 또는 유전자 발현을 유도, 감소 또는 억제로 인하여, 단백질 또는 폴리펩티드 생성의 개별적인 유도, 감소 또는 억제를 일으키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 플라스미드 또는 벡터는 숙주 세포 내에서 유전자의 발현을 구동시키는데 적절한 적어도 하나의 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 사용될 수 있는 인헨서는 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다: SV40 인헨서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 인헨서, 연장 인자 1(EF1) 인헨서, 효모 인헨서, 바이러스성 유전자 인헨서 등.
또한, 종결 제어 영역, 즉, 종결자 또는 폴리아데닐화 서열은 바람직한 숙주에 대해 고유의 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 종결 부위는 불필요할 수 있지만, 포함된다면 매우 선호된다. 본 발명의 일 실시예에서, 종결 제어 영역은 합성 서열, 합성 폴리아데닐화 신호, SV40 레이트(late) 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 바이러스성 종결자 서열 등.
"3' 비-코딩 서열" 또는 "3' 비번역 영역(UTR)"이라는 용어는 코딩 서열의 하류(3')에 위치된 DNA 서열을 가리키며 폴리아데닐화[폴리(A)] 인식 서열 및 mRNA 처리 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 신호를 인코딩하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리아데닐화 신호는 주로 mRNA 전구체의 3' 말단으로 폴리아데닐산 길(tract)의 부가에 영향을 주어 특징된다.
"조절 영역"은 제2 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 가리킨다. 조절 영역은 특정 핵산(상동 영역)의 발현을 고유하게 담당하는 서열을 포함할 수 있거나 다른 단백질 또는 심지어 합성 단백질(이종 영역)의 발현을 담당하는 다른 원점(origin)의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열은 원핵, 진핵 또는 바이러스성 유전자의 서열일 수 있거나, 특이적 또는 비특이적 방식 및 유도성 또는 비유도성 방식으로 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 유래된 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 원점, RNA 스플라이스 부위, 프로모터, 인헨서, 전사 종결 서열 및 표적 세포의 분비 경로로 폴리펩티드를 지시하는 신호 서열을 포함한다.
"이종 원천"으로부터 조절 영역은 발현된 핵산과 자연적으로 연관되지 않은 조절 영역을 가리킨다. 이종 조절 영역 중에서 다른 종으로부터 조절 영역, 다른 유전자로부터 조절 영역, 하이브리드 조절 서열 및 자연적으로는 발생하지 않지만 당업자에 의하여 설계된 조절 서열이 포함된다.
"RNA 전사체(transcript)"는 DNA 서열의 RNA 중합효소-촉매된 전사로부터 발생하는 생성물을 가리킨다. 상기 RNA 전사체가 DNA 서열의 완벽한 상보성 카피인 경우, 이는 일차 전사체라 지칭되거나 상기 일차 전사체의 전사후 처리로부터 유래된 RNA 서열일 수 있으며 성숙한 RNA로 지칭된다. "메신저 RNA(mRNA)"는 인트론이 없으며 세포에 의하여 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 가리킨다. "cDNA"는 mRNA와 상보적이며 mRNA로부터 유래된 이중 가닥 DNA를 가리킨다. "센스" RNA는 상기 mRNA를 포함하고 세포에 의하여 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 가리킨다. "안티센스 RNA"는 표적 일차 전사체 또는 mRNA의 모두 또는 일부와 상보적이며 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 가리킨다. 안티센스 RNA의 상보성은 특이적 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉, 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열 또는 코딩 서열과 상보성일 수 있다. "기능적 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA 또는 아직 번역되지 않으며 세포 처리에 영향을 주는 다른 RNA를 가리킨다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교환하여 사용되며 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 중합체 화합물을 가리킨다. 아미노산을 하기와 같은 일반적인 구조를 갖는다:
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"분리된 폴리펩티드", "분리된 펩티드" 또는 "분리된 단백질"은 자연 상태에서는 정상적으로 그와 연관된 화합물이 실질적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 단백질을 가리킨다(예컨대, 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질). "분리된"은 다른 화합물과의 인공적 또는 합성 혼합물 또는 생물학적 활성과 간섭하지 않으며, 예를 들면, 불완전한 정제, 안정화제(stabilizers)의 첨가 또는 약학적으로 허용가능한 제제로의 혼합으로 인하여 존재할 수 있는 불순물의 존재를 배제하려는 의도는 아니다.
"치환 돌연변이 폴리펩티드" 또는 "치환 돌연변이"는 적어도 하나(1)의 야생형 또는 자연적으로 발생하는 아미노산을 상기 야생형 또는 자연 발생적 폴리펩티드에 대한 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 돌연변이 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 치환 돌연변이 폴리펩티드는 단지 하나(1)의 야생형 또는 자연 발생적 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, "점 돌연변이" 또는 "단일 점 돌연변이" 폴리펩티드로 지칭될 수 있다. 또한, 치환 돌연변이 폴리펩티드는 둘 이상의 야생형 또는 자연 발생적 아미노산을 상기 야생형 또는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드에 대한 둘(2) 이상의 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드는 적어도 하나(1)의 야생형 또는 자연 발생적 아미노산을 상기 야생형 또는 자연 발생적 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드에 대한 다른 아미노산으로의 치환을 포함한다.
상기 치환 돌연변이 폴리펩티드는 둘(2) 이상의 야생형 또는 자연 발생적 아미노산의 치환을 포함하는 점에서, 이 치환은 상기 치환을 위해 결실되는 동등 수(equivalent number)의 야생형 또는 자연 발생적 아미노산, 즉, 2 개의 비-야생형 또는 비-자연 발생적 아미노산으로 대체된 2 개의 야생형 또는 자연 발생적 아미노산 또는 상기 치환을 위해 결실되는 비동등 수의 야생형 아미노산, 즉, 1 개의 비-야생형 아미노산으로 대체된 2 개의 야생형 아미노산(치환+결실 돌연변이) 또는 3 개의 비-야생형 아미노산으로 치환된 2 개의 야생형 아미노산(치환+삽입 돌연변이)을 포함할 수 있다.
치환 돌연변이체는 기준 폴리펩티드 서열 및 새로운 치환된 아미노산 잔기 내에서 대체된 아미노산 잔기 및 수를 지시하는 약어로 된 명명 시스템을 사용하여 기술될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 20번째 아미노산 잔기가 치환되어 있는 치환 돌연변이체는 "x20z"로 약술될 수 있으며, "x"는 대체되는 아미노산이며, "20"은 상기 폴리펩티드 내에서 아미노산 잔기 위치 또는 수이며, "z"는 새로운 치환된 아미노산이다. 그러므로, "E20A" 또는 "Glu20Ala"라고 상호교환 가능하게 약술되는 치환 돌연변이체는 상기 돌연변이체가 폴리펩티드의 20 위치에서 글루탐산(업계에서는 흔히 "E" 또는 "Glu"로 약술됨) 대신에 알라닌 잔기(업계에서는 흔히 "A" 또는 "Ala"로 약술됨)를 포함하는 것을 시사한다.
치환 돌연변이는 시험관 내 점 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)(Hutchinson et al ., J. Biol . Chem . 253:6551 (1978); Zoller et al., DNA 3:479-488 (1984); Oliphant et al ., Gene 44:177 (1986); Hutchinson et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:710 (1986)), TAB
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링커(Pharmacia)의 사용, 제한 엔도뉴클레아제 소화/단편 결실 및 치환, PCR-매개/올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이(oligonucleotide-directed mutagenesis) 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 업계에 공지된 돌연변이 유발을 위한 임의의 기법에 의하여 이루어질 수 있다. PCR-계 기법은 점 돌연변이유발에 대하여 선호된다(Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70 참조).
본 발명에 따른 폴리펩티드의 "단편"은 폴리펩티드로서, 그 아미노산 서열이 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열보다 더 짧으며 이러한 기준 폴리펩티드들 갖는 전체 부분에 걸쳐서 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 가리킨다. 상기 단편은 이들이 일 부분이 되는 더 큰 폴리펩티드에 적절하게 포함될 수 있다. 본 발명에 다른 폴리펩티드의 상기 단편은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240 또는 300 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체(variant)"는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래되며 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성을 유지하는 임의의 유사체, 단편, 유도체 또는 돌연변이체를 가리킨다. 폴리펩티드 또는 단백질의 다른 변이체는 자연적으로 존재할 수 있다. 이러한 변이체는 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 차이에 의하여 특징되는 대립형질 변이(alleic variation)일 수 있거나 시차 스플라이싱(differential splicing) 또는 번역 후 변형을 포함할 수 있다. 당업자는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 대체를 갖는 변이체를 생성할 수 있다. 이러한 변이체는 특히: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비-보존적 아미노산으로 치환되어 있는 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드 또는 단백질에 부가되어 있는 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하고 있는 변이체, 및 (d) 폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 다른 폴리펩티드와 융합되어 있는 변이체를 포함한다. 유전적(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적 및 효소 기법을 포함하는, 이러한 변이체를 획득하는 기법은 당업자에게 알려져 있다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 14 개의 아미노산을 포함한다.
"상동성"이라는 용어는 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 2 개의 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 가리킨다. 하나의 모이어티에서 다른 하나의 모이어티로 서열 간의 일치는 업계에 공지된 기법에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 정렬시키고 용이하게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 두 폴리펩티드 분자 사이의 서열 정보의 직접적인 비교에 의하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역 간의 안정한 듀플렉스를 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화하고 이후 단일-가닥 뉴클레아제(들)로 소화 및 상기 소화된 단편의 크기 결정에 의하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용되어 있으며, 모든 문법적 형태 및 스펠링 변이에 있는 "상동"이라는 용어는 상과(superfamilies)의 단백질(예컨대, 면역글로불린 상과) 및 다른 종의 상동 단백질(예컨대, 미오신 광 연쇄 등)을 포함하는 "공통 진화 원점"을 소유하는 단백질 사이의 관계를 가리킨다(Reeck et al., Cell 50:667 (1987)). 상기 단백질(및 그 인코딩 유전자)는 이들의 높은 서열 유사성에 의하여 반영되는 바와 같이 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 흔히 사용되며 본 출원에서 "상동"이라는 용어는 "고도로"와 같은 부사와 함께 변형되는 경우에, 서열 유사성을 가리키며 공통의 진화 원점은 아니다.
이에 따라, 모든 분법적 형태에 있어 "서열 유사성"이라는 용어는 공통의 진화 원점을 공유하거나 공유할 수 없는 단백질의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 정도 또는 일치를 가리킨다. 일 실시예에서, 2 개의 DNA 서열은 뉴클레오티드의 적어도 약 50%(바람직하게는 적어도 약 75% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90 또는 95%)가 DNA 서열의 정의된 길이에 걸쳐 정합(match)하는 경우에, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사한"이다. 실질적으로 상동인 서열은 서열 데이터 은행에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 사용한 서열 비교에 의하여 확인되거나 예를 들면, 특정 시스템에 대하여 정의된 엄격한 조건 하에서 서던(Southern) 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건의 정의는 업계의 기술 내에 있다(예컨대, Sambrook et al., 1989, 상기 참조).
본 명세서에 사용된 "실질적으로 유사한"은 핵산 단편으로서, 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에의 변화가 하나 이상의 아미노산의 치환으로 이어지지만, DNA 서열에 의하여 인코딩된 단백질의 기능적 특성에 영향을 주지 않는 핵산 단편을 가리킨다. 또한, "실질적으로 유사한"은 핵산 단편으로서, 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에의 변화가 안티센스 또는 공통-억제(co-suppression) 기술에 의하여 유전자 발현의 변화를 매개하는 핵산 단편의 능력에 영향을 주지 않는 핵산 단편을 가리킨다. 또한, "실질적으로 유사한"은 생성되는 전사체의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형(modification)을 가리킨다. 그러므로, 본 발명은 특이적인 예시적 서열 이상을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 제안된 변형의 각각은 인코딩되는 생성물의 생물학적 활성의 유지 결정과 같이, 업계의 통상적인 기술 내에 있다.
또한, 당업자는 본 명세서에 예시된 서열과 본 발명에 의해 포함된 실질적으로 유사한 서열이 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 2X SSC, 0.1% SDS로 세척한 후 0.1X SSC, 0.1% SDS) 하에서 이용하여 혼성화하는 서열 자신의 능력에 의하여 정의된다는 것도 알 것이다. 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 핵산 단편으로서, 그 DNA 서열이 본 명세서에 보고된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 70% 동일한 핵산 단편이다. 본 발명의 핵산 단편은 핵산 단편으로서, 그 DNA 서열이 본 명세서에 보고된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 단편을 포함한다. 다른 핵산 단편은 본 명세서에 보고된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 90% 동일하다. 다른 핵산 단편은 본 명세서에 보고된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 95% 동일하다.
두 개의 아미노산 서열은 상기 아미노산의 40%를 초과하여 동일하거나 60%를 초과하여 유사한(기능적으로 동일한) 경우에, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사한"이다. 바람직하게는, 유사한 또는 상동 서열은 예를 들면, GCG(Genetics Computer Group, 상기 GCG 패키지에 대한 프로그램 매뉴얼, 버젼 7, Madison, Wisconsin) 파일업(pileup) 프로그램을 사용한 정렬에 의하여 확인된다.
본 명세서에 사용된 "해당하는"이라는 용어는 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하거나 다른가에 관계없이 유사 또는 상동 서열을 가리킨다. 핵산 또는 아미노산 서열 정렬은 공간을 포함할 수 있다. 따라서, "해당하는"이라는 용어는 서열 유사성을 가리키며, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기의 넘버링(numbering)이 아니다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "실질적 부분"은 당업자에 의하여 서열의 수동 측정에 의하거나 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1993)); 또는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 참조)와 같은 알고리즘을 이용한 컴퓨터-자동화 서열 비교 및 확인에 의하여 폴리펩티드 또는 유전자를 추정적으로 확인하기에 충분한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로, 10 개 이상의 연속한(contiguous) 아미노산 또는 30 개 이상의 뉴클레오티드의 서열은 공지된 단백질 또는 유전자에 폴리펩티드 또는 핵산 서열이 상동인 것으로 확인하기 위하여 필요하다. 또한, 뉴클레오티드 서열에 대하여, 20 내지 30 개 연속한 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 유전자 확인(예컨대, 서던 혼성화) 및 분리(예컨대, 박테리아 군체 또는 박테리오파지 플라크의 제자리(in situ) 혼성화)의 서열-의존적 방법에 사용될 수 있다. 또한, 12 내지 15 개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻기 위하여 PCR에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 이에 따라, 뉴클레오티드 서열의 "실질적 부분"은 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 확인하고/하거나 분리하는데 충분한 서열을 포함한다.
업계에 공지된 "퍼센트 동일성"이라는 용어는 서열을 비교하여 결정되는 바와 같이 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 관계이다. 업계에서, "동일성"은 상기 경우에서 처럼 서열의 띠(strings) 간의 정합에 의하여 결정되는 바와 같이 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 하기에 기술된 방법을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 공지된 방법에 의하여 용이하게 계산될 수 있다: Computational Molecular Biology (Lesk A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data , Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockson Press, New York (1991). 동일성을 결정하는 방법은 시험된 서열 간에 최상의 정합을 부여하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공중이 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 코드화(codified)되어 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 LASERGENE 바이오인포매틱스(bioinformatics) 계산 스위트(suite)(DNASTAR Inc., Madison, WI)의 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 디폴트(default) 변수(갭 패널티(GAP PENALTY)=10, 갭 길이 패널티(GAP LENGTH PENALTY)=10)를 갖는 정렬의 클러스탈(Clustal) 방법(Higgins et al., CABIOS. 5:151-153)을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 클러스탈 방법을 이용한 짝 매개변수는 선택될 수 있다: KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5.
"서열 분석 소프트웨어"라는 용어는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 가리킨다. "서열 분석 프로그램"은 시판중이거나 독립적으로 개발될 수 있다. 통상적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 프로그램 스위트(위스콘신 패키지 버젼 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al ., J. Mol . Biol. 215:403-410 (1990)) 및 DNASTART(DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 본 출원의 맥락 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석용으로 사용되는 곳에서는 분석의 결과는 달리 명시되지 않으면, 참조되는 프로그램의 "디폴트 수치(default values)"를 바탕으로 한다는 것을 알 것이다. 본 명세서에 사용된 "디폴트 수치"는 소프트웨어를 처음 개시하는 경우에 최초로 상기 소프트웨어를 사용하여 로딩하는 값 또는 매개변수의 임의의 세트를 의미한다.
DNA의 서열에 관련된 "화학적으로 합성된"은 구성요소 뉴클레오티드가 시험관 내에서 조립되었다는 것을 의미한다. DNA의 수동 화학적 합성은 확립된 절차를 이용하여 수행될 수 있거나 또는 자동화된 화학적 합성은 시판중인 수많은 기계들 중 하나를 사용하여 수행될 수 있다. 이에 따라, 유전자는 숙주 세포의 코돈 바이어스(codon bias)를 반영하는 뉴클레오티드 서열의 최적화를 바탕으로 최적 유전자 발현을 위하여 재단(tailored)될 수 있다. 당업자는 코돈 사용이 상기 숙주에 의하여 선호되는 코돈 쪽으로 바이어스된다면 성공적인 유전자 발현일 가능성이 있다는 것을 알 것이다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보가 이용가능한 숙주 세포로부터 유래된 유전자들의 조사를 바탕으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 두 개 이상의 개별적으로 작동가능한 유전자 조절 시스템은 하기와 같은 경우에 "직교(orthogonal)"한다고 칭한다: a) 선택된 농도에서 그 각각의 리간드에 의하여 주어진 시스템의 각각을 조절(modulation)하여 상기 시스템의 유전자의 발현의 크기에서 측정가능한 변화가 일어나는 경우, 및 b) 상기 변화가 실제 조절의 동시성(simultaneity) 또는 순차성(sequentiality)에 관계없이 세포, 조직 또는 유기체에서 동시적으로 작동가능한 다른 모든 시스템의 발현에서의 변화와는 통계적으로 상당히 다른 경우. 바람직하게는, 각각의 개별적으로 작동가능한 유전자 조절 시스템의 조절로 인하여 세포, 조직 또는 유기체에서의 다른 모든 작동가능한 시스템보다 적어도 2 배 더 큰 유전자의 변화를 초래한다. 더 바람직하게는, 상기 변화는 적어도 5 배 더 크다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 변화는 적어도 10 배는 더 크다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 변화는 적어도 100 배는 더 크다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 변화는 적어도 500 배는 더 크다. 이상적으로는, 선택된 농도에서 그 각각의 리간드에 의하여 주어진 시스템의 각각을 조절하여 상기 시스템의 유전자의 발현의 크기에서 측정가능한 변화를 일어나게 하며 세포, 조직 또는 유기체에서 작동가능한 다른 모든 시스템의 발현에서 어떠한 측정가능한 변화도 발생시키지 않는다. 상기 경우에, 다중 유도성 유전자 조절 시스템은 "충분히 직교"한다고 칭한다. 본 발명은 본 명세서에 그대로 참고로 포함되어 있는 US 2002/0110861 A1에 기술된 것과 같은 직교 리간드 및 직교 수용체-계 유전자 발현 시스템에 대한 검색에 유용하다.
"조절한다"라는 용어는 외인성 유전자의 전이활성화를 유도하거나 억제하는 주어진 리간드/수용체 복합체의 능력을 의미한다.
"외인성 유전자"라는 용어는 피검자에 대하여 외래인 유전자, 즉, 형질전환 공정, 외인성 돌연변이된 유전자의 돌연변이되지 버젼 또는 외인성 돌연변이되지 않은 유전자의 돌연변이된 버젼을 통하여 피검자에게 도입되는 유전자를 의미한다. 형질전환의 방법은 본 발명에 대하여 중요하지 않으며 업계에 공지된 상기 피검자에 대하여 적당한 임의의 방법일 수 있다. 예를 들면, 형질전환 식물은 상기 형질전환 세포로부터 재생(regeneration)에 의하여 구해진다. 수많은 형질전환 절차는 근두암종병(Agrobacterium tumefaciens) 또는 그 T1 플라스미드를 사용한 아그로감염(agroinfection), 전기천공법, 식물 세포 및 원형질체의 현미 주입법 및 미세발사체(microprojectile) 형질전환과 같이 문헌에 공지되어 있다. 상보성 기법은 동물 세포의 형질전환 및 형질전환 동물에서 상기 형질전환 세포의 재생에 대해 공지되어 있다. 외인성 유전자는 천연 또는 합성 유전자 및 역전사 효소에 의하는 것과 같이 DNA 중간물질을 통하여 기능할 수 있는 DNA 또는 RNA의 형태로 피검자에게 도입되는 치료 유전자(therapeutic gene)일 수 있다. 상기 유전자는 표적 세포속으로 도입되고, 피검자에게 직접 도입되거나, 예컨대, 자가조직 세포와 같은 형질전환된 세포의 운반에 의하여 피검자에게 간접적으로 도입될 수 있다. "치료 유전자"라는 용어는 유전자가 발현되는 숙주 세포에 이로운 기능을 부여하는 유전자를 의미한다.
"엑디손 수용체 복합체"라는 용어는 일반적으로 엑디손 수용체("EcR") 및 울트라스피라클("USP") 단백질의 스테로이드 수용체 계열의 2 개 요소로 이루어진 이종이합체(heterodimeric) 단백질 복합체(Yao et al ., Nature 366:476-479 (1993)); Yao et al ., Cell 71:63-72 (1992))를 가리킨다. 또한, 기능적 엑디스테로이드(ecdysteroid) 수용체 복합체는 이뮤노필린과 같은 다른 단백질(들)을 포함할 수 있다. 또한, 전사 인자(DHR38, 베타FTZ-1 또는 다른 곤충 동족체와 같은)로 공지된 단백질의 스테로이드 수용체 계열의 다른 요소는 EcR 및/또는 USP에 대한 리간드 의존적 또는 독립적 파트너일 수 있다. 또한, 엑디손 수용체 복합체는 엑디손 수용체 단백질 및 울트라스피라클 단백질의 척추동물 동족체, 레티노산-X-수용체("RXR") 단백질의 이종이합체일 수 있다. 또한, 상기 엑디손 수용체 단백질 또는 USP의 동종이합체 복합체는 일부 상황 하에서 기능적일 수 있다.
엑디스테로이드 수용체 복합체는 EcR을 포함하지만, 복합체의 다른 단백질을 배제하지 않는 복합체의 단백질들 중 하나에 결합된 활성 엑디스테로이드 또는 비-스테로이드성 리간드에 의하여 활성화될 수 있다.
엑디손 수용체 복합체는 스테로이드 수용체 상과의 요소인 단백질로서, 모든 요소가 아미노-터미널 전이활성화 도메인, DNA 결합 도메인("DBD") 및 힌지 영역에 의하여 분리되는 리간드 결합 도메인("LBD")의 존재에 의하여 특징되는 단백질을 포함한다. 상기 상과의 일부 요소는 상기 LBD의 카르복시-말단 측면 상에 다른 전이활성화 도메인을 가질 수 있다. 상기 DBD는 엑디손 반응 구성요소에 특이성을 부여하는 P-박스(P-box) 및 D-박스(D-box)인 두 개의 아미노산 모티프인 두 개의 시스테인 아연 손가락(zinc fingers)의 존재에 의하여 특징된다. 상기 도메인은 자연적, 변형된 이종 수용체 단백질이거나 이종 수용체 단백질의 다른 도메인의 키메라일 수 있다.
외인성 유전자, 반응 구성요소 및 엑디손 수용체 복합체를 구성하는 DNA 서열은 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus subtilis) 또는 다른 장내세균과 같은 고세균 원핵 세포, 또는 식물 또는 동물 세포와 같은 진핵 세포에 주입될 수 있다. 그러나, 유전자에 의하여 발현된 많은 단백질들이 박테리아에서 부정확하게 처리되기 때문에, 진핵 세포가 바람직하다. 상기 세포는 단일 세포 또는 다중세포 유기체의 형태일 수 있다. 외인성 유전자, 반응 구성요소 및 수용체 복합체에 대한 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스와 같은 기능적 바이러스성 RNA의 형태로 RNA 분자로서 주입될 수 있다. 진핵 세포 중에서, 척추동물 세포가 바람직한데, 상기 세포는 엑디손 수용체에 대한 본 발명의 리간드에 반응을 부여하는 분자가 본래 부족하기 때문이다. 그 결과, 이들은 본 발명의 리간드에 대하여 "실질적으로 영향받지 않는다". 따라서, 본 발명의 리간드는 형질전환 세포 또는 전체 유기체에 미치는 생리학적 또는 다른 영향이 무시할 만큼 작을 것이다. 그러므로, 세포는 리간드 자체의 존재에 의하여 실질적으로 영향받지 않으면서, 성장하고 원하는 생성물을 발현시킬 수 있다.
"피검자"라는 용어는 온전한(intact) 곤충, 식물 또는 동물, 또는 곤충, 식물 또는 동물로부터 나온 세포를 의미한다. 리간드는 피검자가 진균류 또는 효모인 경우에 동일하게 잘 작동할 것이라고 예상된다. 상기 피검자가 온전한 동물인 경우, 상기 동물은 바람직하게는 척추동물이며, 가장 바람직하게는 포유류이다.
본 발명의 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드는 외인성 유전자에 연결된 반응 구성요소에 차례로 결합된 엑디손 수용체 복합체와 함게 사용되는 경우, 상기 외인성 유전자의 발현을 외부에서 일시적으로 조절하는 수단을 제공한다. 다양한 구성요소가 서로서로 결합하는 순서, 즉, 수용체 복합체에 대한 리간드 및 반응 구성요소에 대한 수용체 복합체 같은 순서는 중요하지 않다. 통상적으로, 상기 외인성 유전자의 발현 조절은 엑디손 수용체 복합체의 특이적 제어 또는 조절 DNA 요소와의 결합에의 반응에 있다. 스테로이드 수용체 계열의 다른 요소와 같은 엑디손 수용체 단백질은 전이활성화 도메인, DNA 결합 도메인 및 리간드 결합 도메인의 적어도 3 개 도메인들을 갖는다. 또한, 스테로이드 수용체 계열의 하위세트(subset)와 같은 이 수용체는 이종이합체화 특성을 담당하는 덜 정의된(less well-defined) 영역을 갖는다. USP 또는 RXR 단백질과의 이종이합체화 이후에 엑디손 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인에 상기 리간드를 결합시키면 상기 이종이합체 단백질의 DNA 결합 도메인이 활성화된 형태로 상기 반응 구성요소와 결합시켜, 상기 외인성 유전자의 발현 또는 억제가 일어날 수 있도록 한다. 이 메커니즘은 리간드가 EcR 또는 USP와 결합하는 잠재력을 배제하지 않으며, 그 결과로 일어나는 활성 동종이합체(homodimer) 복합체(예컨대, EcR+EcR 또는 USP+USP)의 형성을 배제하지 않는다. 바람직하게는, 상기 수용체 도메인들 중 하나 이상이 변이되어 키메라 유전자 스위치를 생성할 수 있다. 통상적으로, 상기 3 개 도메인들 중 하나 이상이 다른 원천과는 상이한 원천으로부터 선택되어 키메라 수용체가 활성의 전이활성화, 리간드의 상보성 결합 및 특이적 반응 구성요소의 인식을 위하여 선택된 숙주 세포 또는 유기체 내에서 최적화될 수 있다. 또한, 상기 반응 구성요소 그 자체는 변형되거나 효모(Sadowski et al ., Nature 335:563-564 (1988))로부터 GAL-4 단백질 또는 대장균(E. coli)로부터 LexA 단백질(Brent et al., Cell 43:729-736 (1985))과 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인용 반응 구성요소로 치환되어 키메라 엑디손 수용체 복합체를 수용할 수 있다. 키메라 시스템의 다른 장점은 이들이 원하는 목적 결과에 따라 사용된 프로모터의 선택으로 상기 외인성 유전자를 구동할 수 있게 한다는 것이다. 상기 이중 제어는 특히, 세포독성 단백질이 생성되는 경우, 발현이 일어나는 세포뿐만 아니라 발현의 시기 양쪽 모두가 제어될 수 있기 때문에 유전자 요법의 영역에서 특히, 중요할 수 있다. 적당한 프로모터에 작동가능하게 연결된 외인성 유전자가 피검자의 세포로 도입되는 경우에, 상기 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 리간드의 존재에 의하여 제어된다. 프로모터는 항시적으로(constitutively) 또는 유도성으로 조절될 수 있거나 조직-특이적(즉, 특정 유형의 세포에서만 발현되는) 또는 유기체의 특정 발달 단계에 특이적일 수 있다.
다양한 폴리펩티드를 코딩하는 수많은 게놈 및 cDNA 핵산 서열은 업계에 공지되어 있다. 본 발명의 리간드와 함께 유용한 외인성 유전 물질은 예를 들면, 세포로부터 방출될 수 있는 분비 단백질; 독성 물질로부터 비-독성 물질로 또는 비활성 물질로부터 활성 물질로 기질을 대사시킬 수 있는 효; 조절 단백질; 세포 표면 수용체; 및 기타와 같은 관심대상인 생물학적으로 활성인 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 또한, 유용한 유전자는 혈액 응고 인자, 인슐린, 부갑상선 호르몬, 황체형성 호르몬 방출 인자, 알파 및 베타 정액 억제호르몬(seminal inhibins) 및 인간 성장 호르몬; 효소와 같은 단백질로서, 이것이 존재하지 않으면 비정상 상태의 발생으로 이어지는 단백질을 인코딩하는 유전자; 인터페론, 과립구 대식세포 집락 자극 인자, 집락 자극 인자-1, 종양 괴사 인자 및 적혈구생성소(erythropoietin)와 같은 시토카인 또는 림포카인을 인코딩하는 유전자; 알파1-항트립신과 같은 억제제 물질을 인코딩하는 유전자, 디프테리아 및 콜레라 독소와 같은 약물로서 기능하는 물질을 인코딩하는 유전자; 및 기타를 포함한다. 또한, 유용한 유전자는 암 요법에 유용하며 유전 질환을 치료하기 위한 유전자를 포함한다. 당업자는 거의 모든 공지된 유전자에 관한 핵산 서열 정보에 접속을 하며, 공개 디렉토리(public depository), 즉 서열을 공개하는 기관으로부터 직접 핵산 분자를 획득하거나 분자를 제조하는 일상적인 방법을 채용할 수 있다.
일 실시예에서, 외인성 유전자는 자가 수상돌기 세포 속으로 아데노바이러스를 이용하여 체외에서 핵산전달감염된 RheoSwitchTM Therapeutic System(RTS)의 제어하에 있는 hIL-12 유전자이다.
유전자 요법 사용을 위해, 본 명세서에 기술된 리간드는 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 약학적 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 연고, 엘릭서제 또는 주사제 조성물의 형태이다.
약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들면, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 및/또는 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제뿐만 아니라 예를 들면, 젖당 또는 설탕, 마니톨 또는 소르비톨, 셀룰로오스 제제와 같은 다당류 및/또는 예를 들면, 인산 삼칼슘 또는 수소 인산 칼슘과 같은 인산 칼슘류와 같은 충진제를 포함한다. 원한다면, 상기-언급된 전분 및 카르복시메틸-전분, 카르복시메틸-전분, 교차결합된(cross-linked) 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 그 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다. 보조제(auxiliaries)는 유동조절제(flow-regulating agents) 및 예를 들면, 실리카, 활석, 스테아르산 또는 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산 칼슘과 같은 그 염류 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제이다. 일 실시예에서, 필요하다면 위액에 저항하는 적당한 코팅을 갖는 당의정이 제공된다. 본 목적을 위하여, 선택적으로 아라비아 껌, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액 및 적당한 유기 용매 또는 용매 화합물을 함유할 수 있는 농축 당질 용액이 사용될 수 있다. 위액에 저항하는 코팅을 생성하기 위하여, 아세틸셀룰로오스 프탈레이트(acetylcellulose phthalate) 또는 히드록시프로필메틸-셀룰로오스 프탈레이트(hydroxypropylmethyl-cellulose phthalate)와 같은 적당한 셀룰로오스 제제의 용액이 사용된다. 예를 들면, 확인을 위하여 또는 활성 화합물 복용량의 조합을 특징짓기 위하여, 염료 또는 안료가 상기 정제 또는 당의정에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 다른 약학적 제제는 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제로 만든 연질의 밀봉된 캡슐뿐만 아니라 젤라틴으로 만든 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐을 포함한다. 상기 푸쉬-피트 캡슐은 젖당과 같은 충진제, 전분과 같은 결합제 및/또는 활석 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제 및 선택적으로는 안정화제와 선택적으로 혼합될 수 있는 과립 또는 나노입자의 형태로 활성 화합물을 함유할 수 있다. 일 실시예에서, 이는 지방유 또는 액체 파라핀과 같은 적당한 액체에 선택적으로 안정화제를 이용하여 용해되거나 현탁된다.
지방유는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있다. 모노글리세리드, 디글리세리드 및 트리글리세리드는 C6, C8, C10, C12, C14, C16, C18, C20 및 C22 산으로부터 유래된 것을 포함한다. 예시적인 디글리세리드는 특히, 디올레인(diolein), 디팔미톨레인(dipalmitolein) 및 혼합된 카프릴린-카프린 디글리세리드(caprylin-caprin diglycerides)를 포함한다. 바람직한 트리글리세리드는 식물성 기름, 어유, 동물 지방, 수소화 식물성 기름, 부분적으로 수소화 식물성 기름, 합성 트리글리세리드, 변형된 트리글리세리드, 분별된 트리글리세리드, 중간 사슬 및 긴 사슬(medium and long-chain) 트리글리세리드, 구조 트리글리세리드 및 그 혼합물을 포함한다. 예시적인 트리글리세리드는 아몬드 기름; 바바수(babassu) 기름; 서양지치씨(borage) 기름; 건포도종자(blackcurrant seed) 기름; 카놀라 기름; 피마자 기름; 코코넛 기름; 옥수수 기름; 목화씨 기름; 달맞이꽃 기름; 포도씨 기름; 땅콩 기름; 겨자씨 기름; 올리브 기름; 팜유; 팜핵유; 낙화생 기름; 유채(rapeseed) 기름; 홍화씨(safflower) 기름; 참기름; 상어 간유; 대두유; 해바라기 기름; 수소화 피마자 기름; 수소화 코코넛 기름; 수소화 팜유; 수소화 대두유; 수소화 식물성 기름; 수소화 목화씨 및 피마자 기름; 부분적 수소화 대두유; 부분적 대두 및 목화씨 기름; 글리세릴 트리카프로에이트(glyceryl tricaproate); 글리세릴 트리카프릴레이트(glyceryl tricaprylate); 글리세릴 트리카프레이트(glyceryl tricaprate); 글리세릴 트리운데카노에이트(glyceryl triundecanoate); 글리세릴 트리라우레이트(glyceryl trilaurate); 글리세릴 트리올레에이트(glyceryl trioleate); 글리세릴 트리리놀레에이트(glyceryl trilinoleate); 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트(glyceryl tricaprylate/caprate); 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/라우레이트; 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/리놀레에이트; 및 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/스테아레이트를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 트리글리세리드는 LABRAFAC CC라는 상표명으로 시판되는 중간 사슬 트리글리세리드이다. 다른 트리글리세리드는 중성 기름, 예컨대, 중성 식물 기름, 특히, 공지되어 있으며 MIGLYOL 810; MIGLYOL 812; MIGLYOL 818; 및 CAPTEX 355 제품을 포함하는 MIGLYOL이라는 상표명으로 시판되는 분별된 코코넛 오일을 포함한다. 다른 트리글리세리드는 공지되어 있으며 MYRITOL 813 제품을 포함하는 MYRITOL이라는 상표명으로 시판되는 것과 같은 카프릴릭-카프릭 산 트리글리세리드(caprylic-capric acid triglycerides)이다. 이와 같은 종류의 다른 트리글리세리드는 CAPMUL MCT, CAPTEX 200, CAPTEX 300, CAPTEX 800, NEOBEE M5 및 MAZOL 1400이다.
트리글리세리드를 포함하는 약학적 조성물은 수용성 용매를 사용하여 용해시에 맑은 용액을 형성할 수 있는 친유성 및/또는 친수성 계면활성제를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제 중의 하나는 토코페릴 폴리에틸렌 글리콜(tocopheryl polyethylene glycol) 1000 숙신산염(비타민 E TPGS)이다. 상기 조성물의 예는 미국 특허 6,267,985에 기술되어 있다.
다른 실시예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 PEG-8 카프릴릭/카프릭 글리세리드인 LABRASOL(가테포세(Gattefosse) SA)을 포함한다. 다른 실시예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 PL90G, 비타민 E TPGS 및 Miglyol 812N을 포함한다. 상기 제형의 성분은 표 1에 나타나 있다.
성분 농도
(㎎/㎖)
위약(Placebo) 30 ㎎/㎖
3,5-디메틸-벤조산(R)-N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드 0 ㎎
 30 ㎎
PL90G [포스폴리폰(Phospholipol) 90G] 100 ㎎ 100 ㎎
비타민 E TPGS 100 ㎎ 100 ㎎
BHT [부틸화 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)] 0.1 ㎎ 0.1 ㎎
Miglyol 812N [중간 사슬 트리글리세리드] 적당량 내지 1 ㎖ 적당량 내지 1 ㎖
Li-캡 [경질 젤라틴 캡슐] 1회 복용당 1 1회 복용당 1
직장으로 사용될 수 있는 약학적 제제는 예를 들면, 좌제 기제(suppository base)를 갖는 하나 이상의 리간드의 조합으로 이루어진 좌약을 포함한다. 적당한 좌제 기제는 예를 들면, 천연 또는 합성 트리글리세리드 또는 파라핀 탄화수소이다. 또한, 기제를 갖는 리간드의 조합으로 이루어진 젤라틴 직장 캡슐을 사용하는 것도 가능하다. 기제로 사용가능한 물질은 예를 들면, 액체 트리글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 파라핀 탄화수소를 포함한다.
비경구 투여용으로 적당한 제형은 물에 녹는 형태의 리간드의 수용성 용액, 예를 들면, 수용성 염 및 알칼리 용액을 포함한다. 또한, 적당한 유성 주입 현탁액으로 리간드의 현탁액이 투여될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 운반체는 예를 들면, 참기름과 같은 지방유 또는 예를 들면, 올레인산에틸 또는 트리글리세리드 또는 폴리에틸렌 글리콜-400과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 상기 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있는 수용성 주사 현탁액은 예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함한다. 선택적으로, 상기 현탁액은 안정화제도 함유할 수 있다.
국소 조성물은 적절한 담체의 선택에 의하여 기름, 크림, 로션, 연고 등으로 제형될 수 있다. 적당한 담체는 식물성 기름 또는 광물유, 백색 피트롤라툼(백색 연질 파라핀), 측쇄 지방 또는 기름, 동물성 지방 및 고분자량 알코올(C12보다 큼)을 포함한다. 필요하다면 색채 또는 방향을 주는 작용제뿐만 아니라 유화제, 안정화제, 보습제 및 항산화제도 포함될 수 있다. 또한, 경피 투과 인헨서는 상기 국소 제형에 채용될 수 있다. 상기 인헨서의 예는 미국 특허 번호 3,989,816 및 4,444,762에서 찾을 수 있다.
크림은 광물유, 소량의 아몬드 기름과 같은 기름에 용해된 리간드가 첨가혼합되어 있는 자가-유화 밀랍 및 물의 혼합물로부터 제형될 수 있다. 상기 크림의 통상적인 예는 약 40 부분(parts)의 물, 약 20 부분의 밀랍, 약 40 부분의 광물유 및 약 1 부분의 아몬드 기름을 포함하는 크림이다.
연고는 아몬드 기름과 같은 식물성 기름에 리간드의 현탁액을 따뜻한 연질 파라핀으로 혼합하여 상기 혼합물을 냉각시켜 제형될 수 있다. 연고의 통상적인 예는 중량비 약 30%의 아몬드 기름 및 약 70%의 백색 연질 파라핀을 포함하는 연고이다.
로션은 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 고분자량 알코올에 리간드의 현탁액을 제조하여 용이하게 제조될 수 있다.
약학적 조성물에 첨가될 수 있는 항산화제의 예는 BHA 및 BHT를 포함한다.
일 실시예에서, 약학적 조성물은 고체 젤라틴 캡슐 내에 LABRASOL 1 ㎖당 리간드 30 ㎎을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 캡슐은 리간드 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ㎎을 함유한다.
약학적 조성물은 리간드의 중량비 0.01% 내지 99%를 함유할 수 있다. 조성물은 단일 또는 다중 투여량 형태일 수 있다. 임의의 특정 약학적 조성물 내의 리간드의 양은 유효 투여량, 즉, 원하는 유전자 발현 또는 억제를 도출하는데 필요한 투여량에 의존할 것이다. 일 실시예에서, 0.1 내지 7.5 ㎎/㎏이 피검자에게 투여된다. 다른 실시예에서, 0.1 내지 3 ㎎/㎏이 피검자에게 투여된다. 다른 실시예에서, 0.1 내지 3 ㎎/㎏이 투여된다.
약학적 조성물을 투여하는 적당한 경로는 경구, 직장, 국소(진피, 협부(buccal), 설하 포함), 질, 비경구(경피, 근육내, 정맥내, 피내(intradermal), 척수강내, 종양내(intra-tumoral) 및 경막외 포함) 및 비위관에 의한 경로를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 치료되는 질병상태에 의존하고 이의 수용자(recipient)의 질병상태와 같은 인자에 따라 변할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 약학적 조성물은 매일 1 회 이상 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 약학적 조성물은 엑디손 수용체 복합체 및 DNA 결합 서열을 함유하는 세포의 투여 이전 24 시간에 시작하여 매일 투여된다.
또한, 본 명세서에 기술된 본 발명의 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드는 다른 약학적 활성 화합물과 연계하여 투여될 수 있다. 본 명세서에 기술된 리간드와 병용하여 사용될 약학적 활성 화합물은 상기 수용자에 미치는 부작용 또는 화합물 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 피하기 위하여 선택될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 리간드와 병용하여 사용될 수 있는 다른 약학적 활성 화합물의 예는 예를 들면, AIDS 화학요법제, 아미노산 유도체, 진통제, 마취제, 항문직장 제품, 제산제 및 항팽만제, 항생제, 항응고제, 해독제, 항섬유소 용해제(antifibrinolytic agents), 항히스타민, 소염제, 항신생물제(antineoplastics), 구충제, 항원충제(antiprotozoal), 해열제, 방부제, 진경제(antispasmodics) 및 항콜린작용제(anticholinergics), 항바이러스물질(antivirals), 식욕 억제제, 관절염 약(arthritis medications), 생물학적 반응 조절물질(biological response modifiers), 골 대사 조절제(bone metabolism regulators), 창자 하제(bowel evacuants), 심혈관제, 중추신경계 자극제, 뇌대사 촉진제(cerebral metabolic enhancers), 귀지용해제(cerumenolytics), 콜린에스테라제 억제제, 기침 감기 제제(cold and cough preparations), 집락 자극 인자, 피임약, 세포보호제, 치아 제제(dental preprations), 방취제, 피부 용제(dermatologicals), 해독 제제(detoxifying agents), 당뇨병제(diabetes agents), 진단제, 설사약(diarrhea medications), 도파민 수용체 효현제(dopamine receptor agonists), 전해질, 효소 및 소화제, 맥각 제제(ergot preparations), 가임제(fertility agents), 섬유질 보충제(fiber supplements), 항진균약(antifungal agents), 유즙분비과다 억제제(galactorrhea inhibitors), 위산 분비 억제제, 위장관 운동 촉진제(gastrointestinal prokinetic agents), 성선자극호르몬 억제제(gonadotropin inhibitors), 모발 성장 자극제(hair growth stimulants), 조혈제, 혈액순환개선제(hemorrheologic agents), 지혈제(hemostatics), 히스타민 H2 수용체 길항제(histamine H2 receptor antagonists), 호르몬, 혈당강하제(hyperglycemic agents), 저지혈증제(hypolipidemics), 면역억제제, 설사제, 정라약(leprostatics), 백혈구 성분채집술 보조제(leukapheresis adjuncts), 폐 계면활성제(lung surfactants), 편두통 제제, 점액용해제(mucolytics), 근 이완제 길항제, 근 이완제, 마약 길항제(narcotic antagonists), 비강 분무제, 구토제 뉴클레오시드 유사체(nausea medications nucleoside analogues), 영양 보충제, 골다공증 제제, 자궁수축제(oxytocics), 부교감신경 차단제(parasympatholytics), 부교감신경 흥분제(parasympathomimetics), 파킨슨씨병 약, 페니실린 보조제, 인지질, 혈소판 억제제, 포르피린증 작용제(porphyria agents), 프로스타글란딘 유사체(prostaglandin analogues), 프로스타글란딘, 양성자 펌프 억제제, 소양증약 향정신약(pruritus medications psychotropics), 퀴놀론, 호흡 자극제(respiratory stimulants), 타액 자극제(saliva stimulants), 염 대체제, 경화제(sclerosing agents), 피부 상처 제제(skin wound preparations), 금연 조력제(smoking cessation aids), 술폰아미드류, 교감신경 차단제(sympatholytics), 혈전융해제, 투렛 증후근 작용제(Tourette's syndrome agents), 진전 제제(tremor preparations), 결핵 제제, 요산배설제(uricosuric agents), 요로 작용제, 자궁 수축제(uterine contractants), 자궁 이완제(uterine relaxants), 질 제제, 현기증 작용제(vertigo agents), 비타민 D 유사체, 비타민 및 의료 영상 조영제(medical imaging contrast media)를 포함한다. 일부 경우에, 리간드는 예를 들면, 특정 약물을 대사하는 효소를 생성하는 유전자를 "잠재우는(turn off)" 약물 요법에 대한 보조제로서 유용할 수 있다.
상술한 응용에 더하여 농업 응용을 위하여, 본 발명의 리간드는 바실러스 츄리기엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt) 독소와 같은 살충성 단백질의 발현을 제어하는데 사용될 수도 있다. 상기 발현은 조직 또는 식물 특이적일 수 있다. 또한, 식물 병해충의 제어가 특히 필요한 경우에, 하나 이상의 살충제가 본 명세서에 기술된 리간드와 혼합되어 살충제가 각각 따로 사용되는 경우보다는 전체 응용으로는 적은 응용을 포함하여 다른 장점 및 효과를 제공할 수 있다. 살충제들과의 혼합이 채용되는 경우, 조성물 내에서 각 성분의 상대적 비율은 상대적 치료효능 및 처리되는 작물, 병충해 및/또는 잡초에 대한 각각의 살충제의 원하는 응용 비율에 의존하게 될 것이다. 당업자는 하나의 살충제만 사용되는 것보다 더 넓은 활성 스펙트럼과 같은 장점을 제공할 수 있다. 본 명세서에 기술된 리간드와 함께 조성물 내에서 조합될 수 있는 살충제의 예는 살진균제, 제초제, 살충제(insecticides), 살비제(miticides) 및 살균제를 포함한다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드는 종래 고-리터(high-liter)의 유압 스프레이, 저-리터(low-liter) 스프레이, 공기분사 및 공중 스프레이와 같이, 흔히 채용되는 방법에 의하여 수용성 스프레이로서 식물 잎에 적용될 수 있다. 희석 및 응용 속도(rate of application)는 채용된 장비 유형, 원하는 응용 방법 및 빈도 및 리간드 응용 속도(ligand application rate)에 의존할 것이다. 스프레이 탱크에 다른 보조제를 포함하는 것은 바람직할 수 있다. 상기 보조제는 계면활성제, 분산제, 도포기(spreaders), 점착물(stickers), 거품방지제, 유화제 및 MctCutcheon Division of MC Publishing Company(뉴저지)가 매년 모두 발간하는 McCutcheon's Emulsifiers and Detergents , McCutcheeon's Emulsifiers and Detergents/Functional Materials , and McCutcheon's Functional Materials에 기술된 다른 유사한 물질을 포함한다. 또한, 이 리간드는 이를 사용하기 전에 비료 또는 비옥성 물질과 함께 혼합될 수 있다. 또한, 이 리간드 및 고체 비옥성 물질은 혼합 또는 조합 장비에서 첨가혼합될 수 있다. 처리되는 작물 및 잡초에 적당한 임의의 비료의 상대적 비율이 이용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 리간드는 흔히 비료 조성물의 5% 내지 50%를 포함할 것이다. 이 조성물은 원하는 식물의 급속한 성장을 촉진시키고 동시에 유전자 발현을 제어하는 비옥성 물질을 제공한다.
숙주 세포 및 비-인간 유기체
상술한 바와 같이, 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드는 숙주 세포에서 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 형질전환 숙주 세포 내의 발현은 다양한 관심대상 유전자의 발현에 유용할 수 있다. 본 발명은 원핵 및 진핵 숙주 세포에서 유전자 발현의 조절을 위한 리간드를 제공한다.
형질전환 숙주 세포에서의 발현은 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 다양한 관심대상 폴리펩티드의 발현에 유용하다: 백신으로서 식물 내에 생성되는 항원; 효소 유사 알파-아밀라제, 피타아제, 글루칸; 식물에서의 곤충, 선충, 진균, 박테리아, 바이러스 및 무생물 스트레스에 대한 내성 유전자; 기능 식품; 제약; 비타민; 아미노산 함량, 제초제 내성, 추위, 가뭄 및 열 내성을 변형하는 유전자; 산업용 제품; 오일, 단백질, 탄수화물; 항산화제; 웅성 불임 식물(male sterile plants); 화초; 연료; 다른 출력 형질(output traits); 단일클론성 항체, 효소, 프로테아제, 시토카인, 인터페론, 인슐린, 적혈구생성소, 응고 인자, 다른 혈액 인자 또는 성분과 같이, 질병상태(condition), 질병, 질환, 이상 또는 유전적 결함을 치료하는데 사용될 수 있는 치료용 폴리펩티드 또는 제품; 유전자 치료용 바이러스성 벡터; 백신용 바이러스; 약물 발견, 기능적 유전체학, 및 단백질체학 분석 및 응용을 위한 표적; 숙주에 이미 존재하는 경로의 조절을 위한 경로 중간물; 숙주를 사용하여 지금까지는 가능하지 않았던 새로운 제품의 합성을 위한 합성 중간물; 세포 계열 검정; 기능적 유전체학 검정; 단백질체학 검정 등. 또한, 유전자 제품은 숙주의 더 높은 성장 수율을 부여하거나 다른 성장 모드를 활용하게 하는데 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 분리된 숙주 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위하여 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 제공한다. 일 실시예에서, 상기 분리된 숙주 세포는 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포이다. 다른 실시예에서, 상기 분리된 숙주 세포는 무척추동물 숙주 세포 또는 척추동물 숙주 세포이다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 선충 세포, 곤충 세포, 어류 세포, 식물 세포, 조류 세포, 동물 세포 및 포유류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 효모 세포, 선충 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 제브라피쉬(zebrafish) 세포, 닭 세포, 햄스터 세포, 마우스 세포, 생쥐 세포, 토끼 세포, 고양이 세포, 개 세포, 소 세포, 염소 세포, 암소 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 유인원 세포, 원숭이 세포, 침팬지 세포 또는 인간 세포이다. 숙주 세포의 예는 아스페르길러스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피히아(Pichia), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula)와 같은 진균 또는 효모 종 또는 시네코시스티스(Synechocystis), 시네코콕카스(Synechococcus), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 아시네토박터(Acinetobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 에스케리치아(Escherichia), 수도모나스(Pseudomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes), 아나베나(Anabaena), 티오바실러스(Thiobacillus), 메타노박테리움(Methanobacterium) 및 클레브시엘라(Klebsiella) 속에서와 같은 박테리아 종; 사과, 애기장대(Arabidopsis), 바즈라(bajra), 바나나, 보리, 콩, 사탕무, 블랙그램(blackgram), 이집트콩(chickpea), 칠리고추(chili), 오이, 가지, 잠두콩(fava bean), 옥수수(maize), 멜론, 기장, 녹두, 귀리, 오크라(okra), 기장(Panicum), 파파야(papaya), 낙화생, 완두, 후추, 피존콩(pigeonpea), 파인애플, 강낭콩(Phaseolus), 감자, 호박, 쌀, 사탕수수, 대두, 애호박, 사탕수수(sugarcane), 사탕무, 해바라기, 고구마, 차, 토마토, 담배, 수박 및 밀로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물종; 및 포유류 숙주 세포를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
다른 실시예에서, 상기 숙주 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피히아(Pichia) 및 칸디다(Candida) 숙주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효모 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 숙주 세포는 예쁜꼬마 선충(Caenorhabditis elegans nematode) 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 세포는 곤충 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 숙주 세포는 사과, 애기장대, 바즈라, 바나나, 보리, 콩, 사탕무, 블랙그램, 이집트콩, 칠리고추, 오이, 가지, 잠두콩, 옥수수, 멜론, 기장, 녹두, 귀리, 오크라, 기장, 파파야, 낙화생, 완두, 후추, 피존콩, 파인애플, 강낭콩, 감자, 호박, 쌀, 사탕수수, 대두, 애호박, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 고구마, 차, 토마토, 담배, 수박 및 밀 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 숙주 세포는 제브라피쉬 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 숙주 세포는 닭 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 숙주 세포는 햄스터 세포, 마우스 세포, 생쥐 세포, 토끼 세포, 고양이 세포, 개 세포, 소 세포, 염소 세포, 암소 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 원숭이 세포, 침팬지 세포 및 인간 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유류 세포이다.
숙주 세포 형질전환은 업계에 공지되어 있으며, 전기천공법, 바이러스성 감염, 플라스미드/벡터 핵산전달감염, 비-바이러스성 벡터 매개 핵산전달감염, 아그로박테리움-매개 형질전환, 입자 충격 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 다양한 방법에 의하여 달성될 수 있다. 원하는 유전자 제품의 발현은 적절한 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 형질전환된 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 원핵 및 진핵 세포에서의 배양 조건 및 유전자 발현 프로토콜은 업계에 공지되어 있다. 세포는 채집되고(collected) 유전자 생성물은 유전자 생성물에 특이적인 프로토콜에 따라 분리될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 선택되어 삽입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하거나 원하는 특이적인 방식으로 폴리펩티드 생성물을 변형시키고 처리할 수 있다. 다른 숙주 세포는 단백질의 번역 및 번역 후 가공 및 변형(예컨대, 당부가, 절단(cleavage)(예컨대, 신호 서열의))에 대한 특징 및 특이적인 메커니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택되어 발현되는 외래 단백질의 원하는 변형 및 가공을 이룰 수 있다. 예를 들면, 박테리아 시스템에서의 발현은 비-당부가된 핵심 단백질 생성물을 생성하는데 이용될 수 있다. 그러나, 박테리아 내에서 발현되는 폴리펩티드는 적절하게 접혀지지 않을 수 있다. 효모에서의 발현은 당부가된 생성물을 생성할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 이종 단백질의 "자연적인" 당부가 및 접힘의 가능성을 증가시킬 수 있다. 또한, 포유류 세포에서의 발현은 상기 폴리펩티드의 활성의 재구성 또는 구성을 위한 도구를 제공할 수 있다. 또한, 다른 벡터/숙주 발현 시스템은 단백질 절단과 같은 가공 반응을 다른 정도로 영향을 줄 수 있다. 본 발명의 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드는 분리된 숙주 세포를 포함하는 비-인간 유기체에서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 비-인간 유기체는 원핵 유기체 또는 진핵 유기체이다. 다른 실시예에서, 상기 비-인간 유기체는 무척추동물 유기체 또는 척추동물 유기체이다.
바람직하게는, 상기 비-인간 유기체는 박테리움, 진균, 효모, 선충, 곤충, 어류, 식물, 새, 동물 및 포유류로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 비-인간 유기체는 효모, 선충, 곤충, 식물, 제브라피쉬, 닭, 햄스터, 마우스, 생쥐, 토끼, 고양이, 개, 소, 염소, 암소, 개, 말, 양, 유인원, 원숭이 또는 침팬지이다.
다른 실시예에서, 상기 비-인간 유기체는 사카로마이세스, 피히아 및 칸디다로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효모이다.
다른 실시예에서, 상기 비-인간 유기체는 예쁜꼬마 선충(Caenorhabditis elegans nematode)이다.
다른 실시예에서, 상기 비-인간 유기체는 사과, 애기장대, 바즈라, 바나나, 보리, 콩, 사탕무, 블랙그램, 이집트콩, 칠리고추, 오이, 가지, 잠두콩, 옥수수, 멜론, 기장, 녹두, 귀리, 오크라, 기장, 파파야, 낙화생, 완두, 후추, 피존콩, 파인애플, 강낭콩, 감자, 호박, 쌀, 사탕수수, 대두, 애호박, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 고구마, 차, 토마토, 담배, 수박 및 밀로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물이다.
다른 실시예에서, 상기 비-인간 유기체는 생쥐(Mus musculus) 마우스이다.
유전자 발현 조절 시스템
본 발명은 엑디손 수용체-계열 유도성 유전자 발현 시스템에서 유용한 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드에 관한 것이다. 상기 디아실히드라진 리간드는 원핵 및 진핵 숙주 세포 양쪽 모두에서 향상된 유도성 유전자 발현 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명은 유전자의 발현을 조절하는데 유용한 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 디아실히드라진 리간드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에서 발현될 수 있는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 포함하는 유전자 발현 조절 시스템을 전위활성화시킬 능력을 갖는 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드에 관한 것이다. 일 실시예에서, 상기 그룹 H 수용체 리간드 결합은 엑디손 수용체, 유비퀴터스 수용체, 고아 수용체(orphan receptor), NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파네소이드(farnesoid) X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14 또는 파네솔 수용체로부터 유래한다. 다른 실시예에서, 상기 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체로부터 유래한다.
다른 실시예에서, 유전자 발현 조절 시스템은 그 발현이 조절될 유전자와 연관된 반응 구성요소를 인식하는 DNA-결합 도메인인 전이활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함한다. 상기 유전자 발현 조절 시스템은 i) 제1 유전자 발현 카세트의 인코딩된 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의하여 인식된 반응 구성요소; ii) 제1 유전자 발현 카세트의 인코딩된 폴리펩티드의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및 iii) 그 발현이 조절될 유전자:를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 더 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 유전자 발현 조절 시스템은 a) 그 발현이 조절될 유전자와 연관된 반응 구성요소를 인식하는 DNA-결합 도메인인 전이활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 및 b) 척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인 및 두 개의 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 리간드 결합 도메인으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하며, 제1 폴리펩티드 단편은 척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인 또는 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인으로부터 유래하고, 제2 폴리펩티드 단편은 다른 척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인 또는 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 상기 유전자 발현 조절 시스템은 i) 제1 유전자 발현 카세트의 인코딩된 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의하여 인식되는 반응 구성요소; ii) 제1 유전자 발현 카세트의 인코딩된 폴리펩티드의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및 iii) 그 발현이 조절될 유전자:를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 더 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 유전자 발현 조절 시스템은 그 발현이 조절될 유전자와 연관된 반응 구성요소를 인식하는 DNA-결합 도메인 및 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트, 및 전이활성화 도메인 및 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 포함하며, 상기 핵 수용체 리간드 결합 도메인들 중 하나는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인이다. 일 실시예에서, 상기 제1 폴리펩티드는 전이활성화 도메인이 실질적으로 없으며 상기 제2 폴리펩티드는 DNA 결합 도메인이 실질적으로 없다. 본 발명의 목적을 위하여, "실질적으로 없는"은 논의중인 단백질이 활성화 또는 결합 활성을 제공하는 논의중인 도메인 서열을 충분히 함유하지 않음을 의미한다. 상기 유전자 조절 시스템은 i) 상기 제1 유전자 발현 카세트의 제1 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의하여 인식되는 반응 구성요소; ii) 상기 제2 유전자 발현 카세트의 제2 폴리펩티드의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및 iii) 그 발현이 조절될 유전자:를 포함하는 제3 발현 카세트를 더 포함할 수 있다.
하나의 핵 수용체 리간드 결합 도메인만이 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 리간드 결합 도메인인 경우, 나머지 다른 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 상기 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 리간드 결합 도메인을 갖는 이합체(dimer)를 형성하는 임의의 다른 핵 수용체로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인이 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인인 경우, 나머지 다른 핵 수용체 리간드 결합 도메인("파트너")는 엑디손 수용체, 척추동물 레티노이드 X 수용체(RXR), 무척추동물 RXR, 울트라스피라클 단백질(USP), 또는 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR 및 USP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 두 개의 다른 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체로부터 유래할 수 있다(본 명세서에 그대로 참고로 포함되어 있는 WO 01/70816 A2, 국제 특허 출원 번호. PCT/US02/05235 및 US 2004/0096942 A1 참조). 상기 "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 절단 돌연변이(truncation mutation), 결실 돌연변이, 치환 돌연변이 또는 다른 변형을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 척추동물 RXR 결합 도메인은 인간 (Homo sapiens), 마우스 (Mus musculus), 생쥐 (Rattus norvegicus), 닭 (Gallus gallus), 돼지 (Sus scrofa domestica), 개구리 (Xenopus Iaevis), 제브라피쉬 (Danio rerio), 피낭동물(tunicate) (Polyandrocarpa misakiensis) 또는 해파리 (Tripedalia cysophora RXR)로부터 유래한다.
일 실시예에서, 상기 무척추동물 RXR 결합 도메인은 메뚜기 (Locust migratoria) 울트라스피라클 폴리펩티드("LmUSP"), 참진드기 (Amblyomma americanum) RXR 상동체 1("AmaRXR1"), 참진드기 (Amblyomma americanum ) RXR 상동체 2("AmaRXR2"), 농게 (Celuca pgilator) RXR 상동체("CpRXR"), 딱정벌레 (Tenebrio molitor) RXR 상동체("TmRXR"), 꿀벌 (Apis mellifera) RXR 상동체("AmRXR"), 진디 (Myzus persicae) RXR 상동체("MpRXR") 또는 비-쌍시류(non-Dipteran)/비-인시류(non-Lepidopteran) RXR 상동체로부터 유래한다.
일 실시예에서, 상기 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편, 무척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편 및 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RXR 상동체 폴리펩티드 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 두 개의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 본 발명에 사용 목적을 위한 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 두 종의 RXR 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있거나, 상기 종이 동일한 경우, 둘 이상의 폴리펩티드 단편은 상기 종 RXR 폴피펩티드 단편의 둘 이상의 다른 동형(isoforms)으로부터 유래할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편 및 하나의 무척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편을 포함한다.
다른 실시예에서, 상기 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편 및 하나의 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RXR 상동체 폴리펩티드 단편을 포함한다.
다른 실시예에서, 상기 그 발현이 조절될 유전자는 숙주 세포에 대하여 상동 유전자이다. 다른 실시예에서, 상기 그 발현이 조절될 유전자는 숙주 세포에 대하여 이종 유전자이다.
하기에 기술된 바와 같이 본 발명에 사용을 위한 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드는 유전자에 연결된 반응 구성요소와 차례로 결합된 핵 수용체(들)의 리간드 결합 도메인과 조합되는 경우, 상기 리간드들은 유전자 발현의 외부 일시적 조절을 위한 수단을 제공한다. 본 발명의 다양한 성분들이 서로서로 결합하는 결합 메커니즘 또는 순서, 즉, 예를 들면, 리간드 대 리간드 결합 도메인, DNA-결합 도메인 대 반응 구성요소, 전이활성화 도메인 대 프로모터 등은 중요하지 않다.
상기 엑디손 수용체는 핵 수용체 상과의 부재(member)이며 상과 1, 그룹 H(본 명세서에 "그룹 H 핵 수용체"라 칭함)로 분류된다. 각각의 그룹의 부재들은 E(리간드 결합) 도메인에서 40 내지 60% 아미노산 동일성을 공유한다(Laudet et al., Cell 97:161-163 (1999)). 상기 엑디손 수용체에 더하여, 이 수용체 상과1, 그룹 H의 다른 부재는 하기를 포함한다: 유비퀴터스 수용체(UR), 고아 수용체 1(OR-1), 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1(NER-1), 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15(RIP 15), 간 X 수용체 β(LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질(RLD-1), 간 X 수용체(LXR), 간 X 수용체 α(LXRα), 파네소이드 X 수용체(FXR), 수용체 상호작용 단백질 14(RIP-14) 및 파네솔 수용체(HRR-1).
특이적인 일 예에서, 그룹 H 핵 수용체의 리간드 결합 도메인 및 그 핵 수용체 리간드 결합 도메인 파트너와 상기 리간드의 결합으로 인하여 상기 유전자의 발현 또는 억제를 가능하게 한다. 이 메커니즘은 리간드가 상기 그룹 H 핵 수용체(GHNR) 또는 그 파트너와 결합하는 잠재력을 배제하지 않으며, 그 결과로 일어나는 활성 동종이합체 복합체(예컨대, GHNR + GHNR 또는 파트너 + 파트너)의 형성을 배제하지 않는다. 바람직하게는, 수용체 도메인 중 하나 이상은 하이브리드 유전자 스위치를 생성하도록 변하게 된다. DBD, LBD 및 전이활성화 도메인의 3 개 도메인 중 하나 이상은 다른 도메인의 원천과는 다른 원천으로부터 선택되어 상기 하이브리드 유전자 및 그 결과로 발생한 하이브리드 단백질이 활성, 리간드의 상보적 결합 및 특이적인 반응 구성요소의 인식을 전이활성화하기 위하여 선택된 숙주 세포 또는 유기체에서 최적화될 수 있다. 또한, 반응 구성요소 그 자체는 효모로부터 유래한 GAL-4 단백질(Sadowski et al., Nature 335:563-564 (1988)) 또는 대장균(Escherichia coli)로부터 유래한 LexA 단백질(Brent et al., Cell 43:729-736 (1985))과 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인용 반응 구성요소, 또는 상기 특이적 상호작용을 위하여 설계, 변형 및 선택된 단백질과의 표적된 상호작용(예를 들면, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616-3620 (1997) 참조)에 특이적인 합성 반응 구성요소로 변형되거나 치환되어 하이브리드 수용체를 수용할 수 있다. 2-하이브리드 시스템의 다른 장점은 이로 인하여 사용된 프로모터의 선택으로 원하는 목적 결과에 따른 유전자 발현을 구동시키게 한다는 것이다. 상기 이중 제어는 특히, 세포독성 단백질이 생성되는 경우, 발현이 일어나는 세포뿐만 아니라 발현의 시기 양쪽 모두가 제어될 수 있기 때문에 유전자 요법의 영역에서 특히, 중요할 수 있다. 적당한 프로모터에 작동가능하게 유전자가 피검자의 세포로 도입되는 경우에, 상기 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 시스템의 존재에 의하여 제어된다. 프로모터는 항시적으로 또는 유도성으로 조절될 수 있거나 조직-특이적(즉, 특정 유형의 세포에서만 발현되는) 또는 유기체의 특정 발달 단계에 특이적일 수 있다.
특히, 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 유전자 발현 조절 시스템에 유용한 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드가 본 명세서에 기술된다. 이 유전자 발현 시스템은 전이활성화 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드 결합 도메인이 하나의 인코딩된 폴리펩티드 상에 있는 "단일 스위치"-계열 유전자 발현 시스템일 수 있다. 또한, 상기 유전자 발현 조절 시스템은 전이활성화 도메인 및 DNA-결합 도메인이 두 개의 다른 인코딩된 폴리펩티드 상에 위치되어 있는 "이중 스위치"- 또는 "2-하이브리드"-계열 유전자 발현 조절일 수 있다.
본 발명에의 사용을 위한 엑디손 수용체-계열 유전자 발현 조절 시스템은 이종이합체 또는 동종이합체일 수 있다. 기능적 EcR 복합체는 상기 스테로이드 수용체 계열, 다양한 곤충으로부터 얻어진 엑디손 수용체 단백질 및 울트라스피라클(USP) 단백질 또는 USP, 레티노이드 X 수용체 단백질의 척추동물 상동체의 2 가지 요소로 이루어진 이종이합체 단백질 복합체를 가리킨다(Yao et al., Nature 366:476-479 (1993) 및 Yao et al., Cell 71: 63-72 (1992) 참조). 그러나, 상기 복합체는 하기에 기술된 바와 같이 동종이합체일 수 있다. 또한, 상기 기능적 엑디스테로이드 수용체 복합체는 이뮤노필린과 같은 다른 단백질(들)을 포함할 수 있다. 전사 인자(DHR38 또는 베타FTZ-1과 같은)로 알려진 단백질의 스테로이드 수용체 계열의 다른 요소는 EcR, USP 및/또는 RXR에 대한 리간드 의존성 또는 독립성일 수 있다. 또한, 공동활성체(coactivators)(또는 어댑터(adapters) 또는 매개체(mediator)로 칭해짐)로 일반적으로 알려진 단백질과 같은 다른 공통인자(cofactors)가 필요할 수 있다. 이러한 단백질은 DNA와 서열-특이적으로 결합하지 않으며, 기본적 전사에 관여되지 않는다. 이 단백질은 활성체의 DNA-결합의 자극, 염색질 구조에 영향을 주거나, 활성체-개시 복합체 상호작용의 매개를 포함하는 다양한 메커니즘을 통하여 전이 활성화에 효과를 발휘할 수 있다. 상기 공동활성체의 예는 무차별 공동활성체 C 반응 구성요소 B 결합 단백질인 CBP/p300 뿐만 아니라 RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP를 포함한다(검토를 위해, Glass et al ., Curr . Opin . Cell Biol. 9:222-232 (1997) 참조). 또한, 보조억제인자(또는 리프레서(repressors), 사일렌서(silencers), 또는 사일렌싱 매개체로도 알려진)로 일반적으로 알려진 단백질 공통인자는 리간드가 부재하는 경우에 전사 활성화를 효과적으로 억제하는데 필요할 수 있다. 이러한 보조억제인자는 리간드되지 않은(unliganded) 엑디손 수용체와 상호작용하여 반응 구성요소에서의 활성을 침묵하게 할 수 있다. 현재 드러난 증거로는 리간드의 결합이 수용체의 형상을 변화시켜 이로 인해 상기 보조억제인자의 방출 및 상술한 공동활성체의 보강(recruitment)을 발생시켜, 침묵 활성을 제거하게 된다는 것을 암시한다. 보조억제인자의 예는 N-CoR 및 SMRT를 포함한다(검토를 위해, Horwitz et al ., Mol Endocrinol. 10: 1167-1177 (1996)). 이러한 공통인자는 세포 또는 유기체 내에서 내인성일 수 있거나, 조절된 방식으로 또는 비조절된 방식으로 발현되는 형질전환유전자로서 외인성으로 첨가될 수 있다. 또한, 엑디손 수용체 단백질, USP 또는 RXR의 동종이합체 복합체는 일부 상황 하에서 기능적일 수 있다.
통상적으로, 상기 엑디손 수용체 복합체는 모든 부재가 일반적으로 아미노-말단 전이활성화 도메인, DNA 결합 도메인("DBD") 및 힌지 영역에 의하여 상기 DBD로부터 분리된 리간드 결합 도메인("LBD")의 존재에 의하여 특징되는 핵 수용체 상과의 부재인 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "DNA 결합 도메인"이라는 용어는 상기 DNA 결합 도메인이 특정 반응 구성요소와 연관하는 기능만 있기만 하면, DNA 결합 단백질의 최소 폴리펩티드 서열을 최대 DNA 결합 단백질의 전체 길이까지 포함한다. 또한, 상기 핵 수용체 상과의 부재는 하기 4 개 또는 5 개 도메인의 존재에 의하여 특징된다: A/B, C, D, E 및 일부 부재에서 F(US 4,981,784 및 Evans, Science 240:889-895 (1988) 참조). 상기 A/B 도메인은 전이활성화 도메인에 해당하고, "C"는 DNA 결합 도메인에 해당하고, "D"는 힌지 영역에 해당하며, "E"는 리간드 결합 도메인에 해당한다. 또한, 상기 계열의 일부 부재는 "F"에 해당하는 LBD의 카르복시-말단 측면 상에 다른 전이활성화 도메인을 가질 수 있다.
상기 DBD는 엑디손 반응 구성요소에 특이성을 부여하는 P-박스 및 D-박스인 두 개의 아미노산 모티프인 두 개의 시스테인 아연 손가락(zinc fingers)의 존재에 의하여 특징된다. 상기 도메인은 자연적, 변형된 이종 수용체 단백질이거나 이종 수용체 단백질의 다른 도메인의 키메라일 수 있다. 또한, 스테로이드 수용체 계열의 서브셋과 같이 EcR 수용체는 이종이합체화 특성을 담당하는 잘 정의되지 않은 영역을 갖는다. 핵 수용체의 도메인은 특성상 모듈형이기 때문에, 상기 LBD, DBD 및 전이활성화 도메인은 상호교환될 수 있다.
유전자 스위치 시스템은 상기 엑디손 수용체 복합체 유래 성분을 통합하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 이러한 공지된 시스템에서, EcR이 사용되면 언제나 EcR은 동일한 분자 상에서 자연적 또는 변형된 DNA 결합 도메인 및 전이활성화 도메인과 연관되어 있다. USP 또는 RXR은 통상적으로 침묵 파트너로서 사용된다. DNA 결합 도메인 및 전이활성화 도메인이 동일한 분자 상에 있는 경우, 리간드 부재시의 배경 활성은 높으며, DNA 결합 도메인 및 전이활성화 도메인이 다른 분자 상, 즉, 이종이합체 또는 동종이합체 복합체의 두 파트너 각각 상에 있는 경우, 상기 활성은 극적으로 감소된다는 것을 이전에 알게 되었다(PCT/US01/09050 참조).
유전자 발현 조절 방법
또한, 본 발명은 유전자 발현 조절 시스템 및 본 발명의 리간드를 사용한 숙주 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 숙주 세포에 유전자의 발현을 조절하는 방법에 있어서, a) 상기 숙주 세포 속으로 유전자 발현 조절 시스템을 도입하는 단계; 및 b) 상기 숙주 세포 속으로 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 조절되는 유전자는 i) 상기 유전자 발현 시스템의 DNA 결합 도메인에 의하여 인식되는 도메인을 포함하는 반응 구성요소; ii) 상기 유전자 발현 시스템의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및 iii) 그 발현이 조절될 유전자로서, 이에 의하여 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 상기 숙주 세포 속으로 도입시에 상기 유전자의 발현이 조절되는 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트의 성분인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 숙주 세포에 유전자의 발현을 조절하는 방법에 있어서, a) 상기 숙주 세포 속으로 유전자 발현 조절 시스템을 도입하는 단계; b) 상기 숙주 세포 속으로 유전자 발현 카세트를 도입하며, 상기 유전자 발현 카세트는 i) 상기 유전자 발현 시스템으로부터 유래한 DNA 결합 도메인에 의하여 인식된 도메인을 포함하는 반응 구성요소; ii) 상기 유전자 발현 시스템의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및 iii) 그 발현이 조절될 유전자인 단계; 및 c) 상기 숙주 세포 속으로 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 도입하여, 이에 의하여 상기 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 상기 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드가 상기 숙주 세포 속으로 도입시 상기 유전자의 발현이 조절되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유전자 발현 조절 시스템의 제1 하이브리드 폴리펩티드로부터 유래한 DNA 결합 도메인이 결합하는 도메인을 포함하는 반응 구성요소; 상기 유전자 발현 조절 시스템의 제2 하이브리드 폴리펩티드의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및 그 발현이 조절될 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포에 유전자의 발현을 조절하는 방법에 있어서; a) 상기 숙주 세포 속으로 유전자 발현 조절 시스템을 도입하는 단계; 및 b) 상기 숙주 세포 속으로 화학식 I의 디아실히드라진 리간드 또는 화학식 II 또는 III의 카이랄 디아실히드라진 리간드를 도입하여, 상기 리간드의 상기 숙주로의 도입시 상기 유전자의 발현이 조절되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 개시된 방법을 이용한 숙주 세포에서의 발현을 위한 관심대상의 유전자는 내인성 유전자 또는 이종 유전자일 수 있다. 원하는 유전자 또는 단백질에 대한 핵산 또는 아미노산 서열 정보는 예를 들면, 유전자은행(GENBANK), EMBL, Swiss-Prot 및 PIR과 같은 수많은 공중 접근 데이터베이스 중 하나에서 또는 수많은 생물학 관련 저널 발간물에서 찾을 수 있다. 따라서, 당업자는 거의 모든 공지된 유전자에 대한 핵산 서열 정보에 대하여 접근한다. 상기 정보는 이후 본 명세서에 기술된 방법에 사용되는 유전자 발현 카세트 내에서 관심대상 유전자의 삽입을 위한 원하는 구조체 제조하는데 사용될 수 있다.
유전자 발현/전사 측정
본 발명의 방법을 측정하는 유용한 하나의 측정은 RNA, 바람직하게는 mRNA 종의 동일성(identities) 및 과다(abundances)를 포함하여 세포의 전사 상태의 측정이다. 상기 측정은 일부 기존 유전자 발현 기술 중 임의의 것에 의한 cDNA 과다를 측정하여 용이하게 수행된다.
핵산 어레이(array) 기술은 시차(differential) mRNA 발현을 결정하는 유용한 기법이다. 상기 기술은 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 칩 및 DNA 마이크로어레이를 포함한다. 이 기법은 고체 지지체 상에 고정되고 세포, 조직 또는 전체 유기체로부터 추출된 전체 mRNA 풀(pools)로부터 제조된 프로브로 혼성화되여 cDNA로 변환되는 다른 유전자 또는 cDNA에 해당하는 DNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드에 의존한다. 올리고뉴클레오티드 칩은 포토리소그래피 기법을 이용한 기판 상에 합성된 올리고뉴클레오티드의 어레이(arrays)이다. 칩은 최대 1700 개 유전자의 분석에 사용될 수 있도록 생성되었다. DNA 마이크로어레이는 현미경 슬라이드 상으로 로봇으로 프린트되는 DNA 표본, 통상적으로 PCR 산물의 어레이이다. 각각의 유전자는 전장 또는 부분-길이 표적 DNA 서열에 의하여 분석된다. 최대 10,000 개의 유전자로 제작된 마이크로어레이는 현재 통상 상업적으로 제조된다. 이 두 기법 사이의 주된 차이는 올리고뉴클레오티드 칩이 통상적으로 짧은 DNA 분자의 분별(fractionation)을 가능하게 25-단위체(25-mer) 올리고뉴클레오티드를 활용하는 반면에, 대략 1000 개의 염기쌍인 마이크로어레이의 더 큰 DNA 표적은 복합 DNA 혼합물을 분별하는데 더 나은 민감도를 제공할 수 있다는 것이다.
본 발명의 방법을 측정하는 다른 유용한 측정은 공지된 공정을 이용하여 세포에 존재하는 구성 단백질 종의 과다를 평가하여 세포의 번역 상태를 결정하는 측정이다.
다양한 생리학적 기능과 연관된 유전자의 확인이 필요한 곳에서, 세포 성장, 세포자살, 노화, 분화, 부착, 특정 분자와의 결합, 다른 세포와의 결합, 세포 조직화, 기관형성, 세포내 수송, 수송 지원(transport facilitation), 에너지 변환, 대사작용, 근형성(myogenesis), 신경형성 및/또는 조혈과 같은 기능에서의 변화가 측정되는 시험이 채용될 수 있다.
또한, 선택 표지 또는 리포터 유전자 발현은 본 발명을 이용한 유전자 발현 조절을 측정하는데 사용될 수 있다.
유전자 발현의 생성물을 검출하는 다른 방법은 업계에 공지되어 있으며 서던 블랏(DNA 검출), 도트 또는 슬롯 블랏(DNA, RNA), 노던 블랏(RNA), RT-PCR(RNA), 웨스턴 블랏(폴리펩티드 검출) 및 ELISA(폴리펩티드) 분석을 포함한다. 바람직한 것은 아니지만, 라벨링된 단백질은 단백질이 혼성화하는 특정 핵산 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 핵산 서열의 양을 증폭시키는데 필요하다. 이는 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응("PCR"), 리가아제 연쇄 반응("LCR"), 가닥 변위 증폭(strand displacement amplification: "SDA"), 전사-계열 증폭(transcription-based amplification) 등을 포함하는 수많은 적당한 방법들 중 하나 이상을 이용하여 수행될 수 있다. PCR은 예를 들면, 검출되는 하나의 특이적인 서열의 가닥(주형)과 혼성화하는 하나의 프라이머인 올리고뉴클레오티드 프라이머 한 쌍을 이용한 혼성화 조건 하에서 열 안정성 DNA 중합효소의 존재하에 핵산 표본이 처리되는 공지된 기술에 따라 수행된다. 상기 프라이머는 함께 혼성화하려는 특이적인 서열의 각각의 주형 가닥에 충분히 상보적이다. 각각의 프라이머의 연장 생성물(extension product)은 합성되고 상기 생성물이 혼성화하는 핵산 주형 가닥과 상보적이다. 각각의 프라이머로부터 합성된 상기 연장 생성물 동일한 프라이머를 사용하는 연장 생성물의 다른 합성을 위한 주형으로서 역할할 수 있다. 충분한 횟수의 연장 생성물의 합성 이후에, 표본은 상술한 바와 같이 분석되어 검출되는 서열 또는 서열들이 존재하는지의 여부를 평가할 수 있다.
일반 방법
본 명세서에 사용된 표분 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법은 업계에 공지되어 있으며, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) (Maniatis) and by T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) 및 by Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기술되어 있다.
박테리아 배양의 유지 및 성장에 적합한 물질 및 방법은 업계에 공지되어 있다. 하기 예에서 사용에 적합한 기법은 문헌[Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994))]에서 또는 문헌[Thomas D. Brock에 의한 Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)]에서 설명된 바와 같이 찾을 수 있다. 숙주 세포의 성장 및 유지에 사용되는 모든 시약, 제한 효소 및 물질은 달리 명시되지 않으면 Aldrich Chemicals(Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories(Detroit, MI), GIBCO/BRL(Gaithersburg, MD) 또는 Sigma Chemical Company(St. Louis, MO)으로부터 입수하였다.
유전 서열의 조작은 Genetic Computer Group Inc.(위스콘신 패키지 버젼 9.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, WI)로부터 구입가능한 프로그램의 스위트를 사용하여 수행될 수 있다. "파일업(Pileup)" GCG 프로그램이 사용되는 곳에서는 12의 갭 생성 디폴트 값(gap creation default value) 및 4의 갭 연장 디폴트 값(gap extension default value)이 사용될 수 있다. CGC "갭(Gap)" 또는 베스트핏(Bestfit)" 프로그램이 사용되는 곳에서는 50의 디폴트 갭 생성 패널티 및 3의 디폴트 갭 연장 패널티가 사용될 수 있다. GCG 프로그램 매개변수가 이 프로그램 또는 임의의 다른 GCG 프로그램에서 프롬프트(prompt)되지 않는 경우에, 디폴트값이 사용될 수 있다.
녹는점은 Electrocthermal
Figure 112009080717400-pct00037
기기를 갖는 유리 모세관에서 측정되며 보정되지 않는다. 광학 회전([α]25589)은 Perkin Elmer Model 341 편광계를 사용한 10 ㎝ 길이 쿼츠 셀(quartz cell)의 상온에서 측정되었다. 농도는 g/100 ㎖로 주어졌다. 1H NMR 스펙트럼은 브룩커(Bruker) NMR을 사용하여 300 MHz 또는 400.13 MHz에서 기록되었다. 달리 언급되지 않으면, 내부 기준(nternal reference)은 용매였다. 13C NMR 스펙트럼은 브룩커 NMR을 사용하여 100.6에서 기록되었다. 달리 언급되지 않으면, 내부 기준은 용매였다. LC-MS 분석은 Agilent 단일 쿼드 질량 분석계(single quad mass spectrometer)와 커플링된 Agilent 1100 LC 스택(stack)을 사용하여 수행되었다. 용매는 75 ㎜ x 2.1 ㎜ C18 칼럼 상에서 유속 = 0.2 ㎖/min로 20 분의 중단 시간(stop time) 및 T=0.15% B 내지 T=10.98% B의 기울기인 (A) H2O/0.1% 포름산 및 (B) ACN/0.1% 포름산이었다. 정확한 질량 분석은 Agilent ESI/TOF 질량 분석계 속으로 직접 주사하여 수행되었다. X-선 크리스탈 구조 결정은 브룩커 SMART6000을 사용하여 수행되었다. 기초 분석은 Perkin Elmer 2400 CHN 분석기 상에서 수행되었다. 분석 박막 크로마토그래피 또는 TLC는 Macherey-Nagel Polygram
Figure 112009080717400-pct00038
Sil G/UV254 0.2 ㎜ 플레이트를 사용하여 수행되었다. 대부분의 플레이트는 자외선으로 시각화되었다. 일부는 요오드 또는 포스포몰리브드산을 사용하여 전개되었다. 실리카 겔 크로마토그래피는 약 30 psi의 N2 또는 아르곤 수두압(head pressure) 하의 유리 칼럼 내의 Aldrich 실리카 겔(230 내지 400 메쉬, 60 Å)을 사용하여 수행되었다. 분석 HPLC는 811C 동적 믹서(dynamic mixer), 306 UV/VIS 155 검출기 및 215 액체 조정기(liquid handler)로 장비된 Gilson HPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 자외선 흡광도(UV absorbance)는 220 ㎚ 및 254 ㎚에서 측정되었으며, 적분(integration)은 254 ㎚에서 수행되었다. 유속은 통상적으로 1 ㎖/min에서 고정되었다. 정상 상태(normal phase) 크로마토그래피는 Alltech Adsorbosphere 5 마이크론, 4.6 ㎜ x 25 ㎝ C18 칼럼을 사용하여 수행되었다. 카이랄 HPLC는 CHIRALCEL
Figure 112009080717400-pct00039
5 마이크론, 4.6 ㎜ x 25 ㎝ OD-H 칼럼, CHIRAKPAK
Figure 112009080717400-pct00040
5 마이크로, 4.6 ㎜ x 25 ㎝ AD-H 칼럼 또는 5 마이크론, 100 Å, 4.6 ㎜ x 25 ㎝ Regis Rexchrom (S,S) ULMO 칼럼을 사용하여 수행되었다. 용매는 달리 언급되지 않으면 시약급이었다. 무수 용매는 구입한 바와 같이 사용되었다.
일반 합성법
화학식 II 또는 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물로서, A, B 및 R2는 상기에 정의된 바와 같고 R1은 알케닐인 화합물은 일반 모식도 1에 기술된 바와 같이 비대칭 합성을 통해 제조될 수 있다.
일반 모식도 1
Figure 112009080717400-pct00041
보호된 히드라진 1(예컨대; 벤질 카르바제이트(benzyl carbazate) 또는 t-부틸 카르바제이트(t-butyl carbazate))을 알데히드(R2CHO)와 반응시키면 2가 생성된다. 2의 비대칭 알릴화로 인하여 특히, 카이랄 시약 및 R2의 선택에 따라, 거울상이성질체적으로 농축된 형태의 3 또는 4를 제공한다. 비대칭 알릴화 반응을 수행하는 방법은 업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 화합물을 제조하는데 활용될 수 있다. 비대칭 알릴화 반응에 특히 유용한 카이랄 시약의 합성은 Leighton et al., J. Am. Chem. Soc. 125:9596(2003) 및 WO 03/074534에 기술되어 있다. 3과 염화 카르복실산(B-COCl)과 반응하면 5가 생성된다. 도한, 카르복실산(B-CO2H)은 3과 커플링되어 5를 제공할 수 있다. 보호기 5를 제거하면 6이 생성된다. 당업자는 상기 보호기의 특성에 의존하여, 다양한 히드라진을 탈보호하는 방법이 있음을 알 것이다. 적당한 보호/탈보호 전략은 "T.W. green 및 P. G. M. Wuts(1999)dml "유기 합성에서의 보호기)에 다뤄져 있다. 7을 염화 카복실산(A-COCl) 또흔 카르복실산(A-CO2H)과 반응시키면 화학식 II의 화합물, 8이 생성된다. 마찬가지로, 4의 반응으로 화학식 III의 화합물이 생성된다.
화학식 II 또는 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물로서, A, B, R1 및 R2는 상기에 정의된 바와 같은 화합물은 일반 모식도 2에 기술된 바와 같이 비대칭 환원을 통해 제조될 수 있다.
일반 모식도 2
Figure 112009080717400-pct00042
아실 히드라진 1을 케톤(R1COR2)과 반응시키면 히드라존 2를 제공한다. 2의 비대칭 환원으로 인하여 특히, 환원제 R1 및 R2의 선택에 따라, 거울상이성질체적으로 농축된 형태의 3 또는 4를 제공한다. US 5,250,731은 카이랄 포스포레인(chiral phospholane) 촉매 복합체의 존재하에 광학적으로 활성인 아실 히드라진을 생성하는 아실 히드라존의 비대칭 촉매 수소화를 기술한다. 당업자는 다른 카이랄 리간드도 사용될 수 있음을 알 것이다. 또한, 당업자는 다른 비대칭 환원법이 채용될 수 있음을 알 것이다. 본 예에서, 3을 BCOCl과 반응시키면 화학식 II의 화합물 5가 생성된다. 마찬가지로, 4의 반응으로 화학식 III의 화합물이 생성된다.
또한, 화학식 II 또는 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물은 카이랄 분별(chiral resoultion) 또는 비대칭 합성 및 카이랄 분별의 조합 또는 비대칭 수소화 및 카이랄 분별의 조합을 통하여 제조될 수 있다. 일반 모식도 3에 기술된 바와 같이, 라세미체 디아실히드라진을 카이랄 HPLC 크로마토그래피를 거치게 하면 화학식 II 또는 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물을 제공한다. 카이랄 분별에 사용되는 적당한 카이랄 칼럼은 예를 들면, 다이셀(Daicel) CHIRALCEL
Figure 112009080717400-pct00043
OD-H, 다이셀 CHIRAKPAK
Figure 112009080717400-pct00044
AD-H 및 Rgis Technologies ULMO 카이랄 칼럼을 포함한다. 다른 카이랄 분별 방법도 가능하다. 카이랄 분별 공정에 사용되는 라세미체 디아실히드라진은 US 2005/0209283 A1 및 US 2006/0020146 A1에 기술된 방법론을 이용하여 제조될 수 있다.
일반 모식도 3
Figure 112009080717400-pct00045
화학식 II 또는 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물로서, R1이 알케닐인 화합물은 표준 화학적 변환(transformations)을 이용하여 더 정교해질 수 있다. 화학식 III의 거울상이성질체적으로 농축된 화합물에 대하여 일반 모식도 4에 기술된 바와 같이, 알케닐은 알킬, 히드록시알킬, 사이클로알킬로 선택적으로 치환된 알킬, 헤테로사이클로 선택적으로 치환된 알킬, 알콕시로 치환된 알킬, 할로알킬 및 다른 선택적으로 치환된 알킬기로 변환될 수 있다. 당업자는 알켄을 본 발명의 다른 작용기로 변환하는데 사용될 수 있는 단일 또는 다중-단계 화학적 변화의 조합(assortment)을 알 것이다.
일반 모식도 4
Figure 112009080717400-pct00046
도 1: 스위치 구조체 CVBE 및 리포터 구조체 6XEcRE Lac Z의 개략도. 양쪽 구조체의 플랭킹(flanking)은 장형반복말단(long terminal repeats)이고, G418 및 퓨로마이신은 선택 표지이고, CMV는 사이토메갈로바이러스 프로모터(cytomegalovirus promoter)이고, VBE는 VP16 전이활성화 도메인의 누에나방(Bombyx mori) EcR(BmEcR) 삽입된 하류(downstream)로부터 아미노산 26 내지 546에 대한 코딩 서열이고, 6X EcRE는 엑디손 반응 구성요소의 6 개 카피이며, lacZ는 리포터 효소 β-갈락토시다제(galactosidase)를 인코딩한다.
도 2A 내지 2C: (A) rac-, (B) (R)- 및 (C) (S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터 트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-dichloro-benzoyl)-hydrazide)의 카이랄 HPLC 비교.
도 3: 마우스에서 RheoSwitch
Figure 112009080717400-pct00047
Therapeutic System 유전자 발현의 유도에 관한 rac-, (R)- 및 (S)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 체내(in vivo) 비교를 도시하는 그래프. 채워진 원(solid circle)은 S 거울상이성질체(enantiomer), 채워진 삼각형은 라세미체(Racemate) 및 열려진 원은 R 거울상이성질체이다.
도 4: 표본 로트 또는 라세미체 및 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체의 표. 메탄올/물 또는 톨루엔/헵탄(heptane)으로부터 급속한 결정화/침전에 의하여 얻어진 R 거울상이성질체의 표본은 CH3OH 결정화(165.1 내지 166.5℃)로부터 얻은 표준과 서로 비교하여 동일한 분말 X-선 회절 패턴(데이터 미도시)를 생성하였으며 본질적으로 동일한 녹는점([톨루엔/헵탄]166.2 내지 167.1℃, [CH3OH/H2O]166.5 내지 167.4℃)을 가졌다. 메탄올 증발에 의하여 얻어진 라세미체를 달리 제조한 2개의 제조물의 표본은 실험 오류 내에서 순도에서 약간의 변화가 있을 뿐 동일한 녹는점을 나타냈다(170 내지 171℃, 169 내지 170℃).
도 5: 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 미소화(micronized) R 거울상이성질체의 입자 크기 분포를 보 여주는 표.
도 6: 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 미소화 라세미체의 입자 크기 분포를 보여주는 표.
도 7: 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 미소화 라세미체 및 R 거울상이성질체의 벌크(bulk) 및 태핑된 밀도 분석을 보여주는 표.
도 8: 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 미소화 라세미체 및 R 거울상이성질체의 열 중량 분석/시차열 분석(TGA/DTA) 분석(열 플랏(thermal plot))은 다른 결정성 형태를 보여준다. 로트 번호: REH-28-9-1 및 REH-28-4-2; 표본 중량 7.71994 ㎎. 표본 ㎎당 uV의 단위로 나온 신호 출력(uV/㎎); 표본의 열 중량 측정-백분율 중량 변화(TG%). 양쪽 물질은 DTA 프로파일에 관하여 흡열 과정을 보였다. 상기 R 거울상이성질체에 대한 개시 온도(onset temperature)(163.6℃)는 상기 라세미체(171.2℃)의 것보다 약간 낮았다. 상기 R 거울상이성질체에 대한 융해열(59.8 uv.s/㎎)도 상기 라세미체(80.8 uv.s/㎎)의 것보다 약간 낮았다.
도 9: 약학적 부형제 내의 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 정성 비교 용해도 시험을 보여주는 표.
도 10: 열역학 평형 시험(5 분 또는 지시된 시간 동안 90℃; 처리 2) 분석 후에 상온으로 냉각시켜 약학적 부형제 내의 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트- 부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 종정(seeding)의 결과를 보여주는 표. 처리 1은 2.5 시간 이하 동안 상온에서의 교반 결과이다.
도 11: 증류수, pH 7.0에 용해된 20% PEG 1000 내의 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 용해도(μM)를 보여주는 표.
도 12: 수용성 폴리소르베이트(polysorbate) 80 내의 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 용해도를 보여주는 표.
도 13: 카코-2 셀 모노레이어(Caco-2 Cell Monolayers)를 통한 2--에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 양방향 투과율을 보여주는 표. a투과율 분류: (파프(Papp) A→B) < 1.0 X 10 내지 6 ㎝/s = 낮음(LOW); (파프 A→B) > 1.0 X 10 내지 6 ㎝/s = 높음(HIGH); b상당한 유출: 유출 > 3.0 및 (파프 B→A) > 1.0 X 10 내지 6 ㎝/s
도 14: MDR1-MDCK 세포들 내의 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드 라세미체 및 R 거울상이성질체의 투과율을 보여주는 표. 분류: A-B 파프 > 3.0 및 유출률 < 3.0: 높음. A-B 파프 > 3.0 및 10 > 유출율 > 3.0: 중간. A-B 파프 > 3.0 및 유출율 > 10: 낮음 A-B 파프 < 3.0: 낮음.
도 15: 인간 간 마이크로솜 내의 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 안정성을 보여주는 표.
도 16: C57BL/6N:Crl 마우스에서의 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드/라브라졸(Labrasol) 제제의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 투여 일정을 보여주는 표. 9 일(그룹당 제1 18 마리 암컷) 또는 12 일(그룹당 제2 18 마리 암컷) 동안 용량 투여a; 가능한 대체물로서 포함됨b.
도 17: 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체의 비-미소화 및 미소화 표본의 마이크로그래프들. 50 마이크론 기준 축척 주의.
도 18: 라브라졸 내에 4 개의 투여량(3, 10, 30 및 50 ㎎/㎏/일)으로 투여된 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 약물 투여 9 일 후 및 일일 용량 후 일정 시간의 혈청 레벨을 보여주는 표.
도 19: 라브라졸 내에 4 개의 투여량(3, 10, 30 및 50 ㎎/㎏/일)으로 투여된 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 약물 투여 12 일 후 및 일일 용량 후 일정 시간의 혈청 레벨을 보여주는 표.
도 20: pCMV/GEVY(DEF) 플라스미드의 도해적 재현(diagrammatic representation). 상기 pCMV/GEVY(DEF)는 효모 GAL4-DBD(aa 1 내지 147)의 돌연변이체 V390I/Y410E/E274 융합 하류를 보유한 가문비나무잎말이나방(Choristoneura fumiferana) EcR로부터 나오고 pBIND 벡터(Promega Corporation, Madison, WI, 미국) 내에서 상기 CMV 프로모터 및 하류 SV40 폴리아데닐화 신호의 조절하에 놓여있는 D, E 및 F 도메인으로 이루어져 있다. 도시된 EcR들의 DEF 도메인들은 5' 및 3' 말단에서 20 내지 25 nt 서열을 바탕으로 설계된 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 제한 효소 부위 BamH 및 XbaI는 5' 및 3' 프라이머에 각각 첨가되었다. PCR 산물은 적절한 제한 효소로 소화되었으며 pBIND 벡터로 클로닝되었다.
도 21: pCMV/VP16-Hs-LmRXR 벡터의 도해적 재현. 상기 pCMV/VP16-Hs-LmRXR 벡터는 VP16-활성화 도메인의 하류와 융합되고 pBIND 벡터에서 CMV 프로모터의 조절하에 놓여있는 호모 사피엔스(Homo sapiens) RXRβ(E 도메인의 나선 1 내지 8) 및 풀무치(Locusta migratoria) RXR(E 도메인의 나선 9 내지 12)로부터 나온 키메라 RXR을 함유한다.
도 22: p6xGAL4RE-TTR-SEAP 리포터 벡터의 도해적 재현. 상기 유도성 SEAP 리포터 벡터 p6xGAL4RE-TTR-SEAP은 트랜스사이레틴(transthyretin: TTR) 프로모터의 Gal4 반응 구성요소 상류의 6 개 카피들로 이루어진 유도성 프로모터의 조절하에 놓여있는 인간 분비 알칼리성 포스파타제 리포터 유전자를 함유한다.
도 23: E1 및 E3 영역은 결실되었고 RTS-IL12 성분은 E1 영역을 교체하는 Ad-RTS-hIL-12의 도해적 재현.
도 24: Ad.RheoSP1-mIL12 플라스미드로 감염된 B16 세포의 주사 및 디아실히드라진의 R-거울상이성질체 또는 라세미체의 0, 3, 10, 30, 50 ㎎/㎏/일의 투여량으로 투여 이후 종양 및 혈청에서의 mIL12p70의 발현을 보여주는 그래프들. 제어: 50 ㎎/㎏/일에서만 3일 동안 리간드(Ligand50)를 받은 혈질도입되지 않은 B-16 보유 마우스 및 미처리(리간드 없음) 종양-보유 마우스(TuControl). "L3d then discont. 3d": 3 일 동안 리간드로 처리되고 이후 그 다음 3 일 동안 리간드는 제공되지 않은 마우스.
도 25: Ad.RheoSP1-mIL12 플라스미드로 감염된 B16 세포의 주사 및 디아실히드라진의 R-거울상이성질체 또는 라세미체의 0, 3, 10, 30, 50 ㎎/㎏/일의 투여량으로 투여 이후 종양 및 혈청에서의 mIFN-γ의 발현을 보여주는 그래프들. 제어: 50 ㎎/㎏/일에서만 3일 동안 리간드(Ligand50)를 받은 혈질도입되지 않은 B-16 보유 마우스 및 미처리(리간드 없음) 종양-보유 마우스(TuControl). "L3d then discont. 3d": 3 일 동안 리간드로 처리되고 이후 그 다음 3 일 동안 리간드는 제공되지 않은 마우스.
본 발명은 상기에 제공된 일반 합성법 및 하기에 제공된 비-한정 실시예를 하기와 같이 참조하면 더 잘 이해될 것이다.
실시예 1
Figure 112009080717400-pct00048
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide)
합성
Figure 112009080717400-pct00049
화합물 1: 벤질 카르바제이트는 상용 구입가능하다.
화합물 2: 벤질 카르바제이트(300 g, 1.91 몰)는 환류 응축기, 온도계, 자석 교반장치(magnetic stirring) 및 500 ㎖ 첨가 깔대기로 장비된 3 ℓ 4-구(4-neck) 플라스크 내의 메틸 알코올 1.2 ℓ에 용해되었다. 빙초산(5 ㎖)을 상기 혼합물에 첨가 한 후 45℃가 되도록 하였다. 피발데히드(Pivaldehyde: t-부탄올에서 용액 248.4 g, 2.17 몰, 약 75%)를 30 분에 걸쳐서 부분적으로 첨가하였다. 상기 반응은 TLC에 의하여 모니터링 하면서 30 분 동안 환류 가열되었다. 상기 혼합물은 거의 상온으로 냉각되도록 하였으며 회전 농축기(rotary evaporator) 상에서 약 700 ㎖의 총 부피로 농축되었다. 약 7 g의 활성탄이 약 30℃에서 첨가되었다. 상기 혼합물은 하룻밤동안 교반되었으며, 공극 크기(pore size) "C" 급 유리 융해된(fritted) 부흐너 깔대기 내에서 셀라이트(Cellite)의 패드를 통해 여과되었다. 용매는 진공 상태에서 제거되어 결정화 접시로 부어져 스패튤라(spatula)를 사용하여 다뤄져서 결정화하도록 유도되었으며, 연한 황색 오일을 남겨두었다. 상기 물질은 과립화되었으며, 잔존 용매는 상온 공기 중에 며칠간 증발되도록하여, 정제되지 않은 생성물 420.4 g를 남겨 두었다. 300 ㎖ 아세트산 에틸 및 1 ℓ 헥산의 최초 비등하는 혼합물로부터 상온 재결정화로 인하여 황색이 도는 백색(off-white) 고체로서 (E)-N'-(2,2-디메틸-프로필리덴)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르((E)-N'-(2,2-dimethyl-propylidene)-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester 363.2 g을 생성하였다. 동일한 녹는점를 갖는 43.1 g의 제2 수확물(crop)은 약 150 ㎖ 헥산 및 45 ㎖ 아세트산 에틸의 혼합물로부터 구해졌다. 총 수율: 96.1%, Rf = 0.32(2:1 헥산:아세트산 에틸); 녹는점 = 74 내지 74.5℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 8.0 (1H, br s), 7.4-7.3 (5H, m), 7.1 (1H, s), 5.20 (2H, s), 1.1 (9H, s).
화합물 3: (S,S)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘((S,S)-2-Allyl-2-chloro-3,4-dimethyl-5-phenyl-[1,3,2]oxazasilolidine)은 Leighton et al., J. Am. Chem. Soc. 125:9596 (2003) 및 WO 03/074534의 변형된 절차를 이용하여 제조되었다. 전체 절차는 대기중에 최소한으로 잠깐 동안 노출한 무수 폐쇄 시스템 하에서 수행되었다. 기체 입구, 오버헤드 교반장치 및 첨가 깔대기가 있는 오븐-건조 5 ℓ 4구 플라스크는 우선 알릴트리클로로실란(allyltrichlorosilane: 419.5 g, 2.39 몰) 채우고 이후 2 ℓ 무수 CH2Cl2로 채웠다. 상기 용액은 얼음/염 수조에서 아르곤 하에서 0℃로 냉각되었다. 트리에틸아민(485 g, 4.79 몰)은 온도를 0℃에서 유지하며, 첨가 깔대기를 통하여 첨가되었다. 이 지점에서 상기 반응은 투명한 호박색이었다. S,S-수도에페트린(S,S-pseudoephedrine: 359 g, 2.17 몰)는 내부 온도를 15℃ 미만으로 유지하며 2 시간의 기간에 걸쳐서 고체 첨가 깔대기를 사용하여 부분적으로 첨가되었다. 상기 첨가 깔대기는 200 ㎖ CH2CH2로 씻어내려 반응시켰다. 시간이 지남에 따라, 풀 반죽(paste) 같은 반-과립(semi-granular) 고체가 형성되었다(Et3NCl). 연한 갈색 점성 슬러리는 얼음 상에서 약 2 시간 동안 교반되었으며, 이후 상기 얼음 수조는 제 거되어 상기 반응을 몇 시간에 걸쳐서 상온에 이르게 하였다. 약 12 시간 후에, 상기 CH2Cl2의 대부분은 상기 시스템을 아르곤 하에서 유지하면서 증류에 의하여 제거되었다. 무수 헥산 1 ℓ이 첨가되며, 용매는 다시 증류되었다. 무수 펜탄 1 ℓ가 이후 첨가되어 혼합물은 상온의 아르곤 하에서 약 1 시간 동안 교반되었다. 상기 CH2Cl2에서 최초로 형성된 풀반죽 같은 슬러지는 처음에는 헥산 첨가하고 이후 특히, 펜탄 첨가 후에 더 과립형이 되었다. 상기 용액은 연한 호박 갈색이었다. 부분적으로, 그리고 아르곤 압력을 약하게 이용하여 펜탄 및 가용성 생성물은 반응 플라스크로부터 유리 섬유 필터 및 PFA 관을 통하여 증류 헤드 및 자석 교반장치로 장비된 제2 건조 1ℓ, 3구 둥근 바닥 플라스크로 옮겨졌다. 용액 운반 교대시에, 펜탄은 상기 제2 플라스크로부터 증류되어 농축된 유성 생성물을 남겨놓았다. 상기 Et3NCl 잔류물을 500 ㎖ 펜탄으로 각각 2회 세척하고, 상기 세척물을 아르곤 대기 하에서 상기 제2 플라스크로 운반하는 이 공정은 반복되었다. 상기 생성물은 약 10 torr의 진공 하에서 분별 증류에 의해 채집되었다. 약 56.3 g(9.7%)은 최대 약 3% 알릴트리클로로실란을 함유한 예비가동(forerun)에서 채집되었다. 주된 분별인 정제된 (S,S)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘((S,S)-2-allyl-2-chloro-3,4-dimethyl-5-phenyl-[1,3,2]oxazasilolidine)은 채집시에 약간 점성인 액체의 연한 황색이지만, 냉장하에서 타이트한(tight) 셉텀(septum)/파라필름(parafilm) 밀봉하에서 며칠간에 걸쳐서 오렌지색이 되는 액체가 bp = 140-144, 10 torr에서 413.3 g(71%)의 양으로 얻어졌다. 상기 물질은 냉장 하에서 저장되며, 특징되지 않으며, 이후 알릴화 반응에서 정제를 더 하지 않고 사용되었다.
화합물 4: 온도계 및 자석 교반장치로 장비된 5 ℓ, 4구 플라스크는 오븐에서 건조되었으며, 2 ℓ 무수 CH2Cl2가 첨가되며 이후 N'-(2,2-디메틸-프로필리덴)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르(220 g, 939 mmol)가 첨가되면서 아르곤 하에서 유지되었다. 상기 혼합물은 냉각되어 2 내지 3℃의 대형 10 갤론 얼음/식염수 수조에서 교반되었다. (S,S)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘(363 g, 1.355 몰)은 삽관 및 적당한 아르곤 압력의 조력을 이용하여 약 30 분에 걸쳐서 상기 플라스크에 첨가되었다. 상기 최초 연한 황색 용액은 온도를 2 내지 3℃에서 유지하면서, 투명한 연한 오렌지 색이 되었다. 상기 반응은 저절로 상온이 되도록 하였으며, CH3OH에서 소량의 분취량을 억제시키고(quenching) TLC(2:1 헥산:EtOAc)로 분석하여 모니터링되었다. 개시 후 36 시간에 TLC 분석은 약 90% 완료를 나타내었다. 상기 혼합물은 5℃로 냉각되었고, 옥사자실로리딘 48 g(0.179 mmol)을 더 첨가하며, 상기 혼합물이 상온이 되도록 하였다. 약 8 시간 후에 상기 반응은 다시 5℃로 냉각되었으며 약 1 시간의 기간에 걸쳐서 100 ㎖ 탈이온수에서 100 g K2CO3의 사전 냉각된 용액을 사용하여 억제되었다. 상기 억제를 하는 동안에, 방열 곡선(exotherm)은 온도를 17℃만큼 상승시켰다. 약 100 ㎖ 탈이온수가 더 첨가되었다. 상기 용액은 육안으로 투명한 청녹색이 되었다. 상기 반응 또는 억제를 하는 동안에 어느 때에도 기체가 명백히 전개되는 적은 없었다. 상온에서 4 일간 교반한 이후에, 상기 용액은 색깔이 연한 황색이었으며, 5 일 후에는 상기 유기상 이 겔이 되었지만, 색깔은 연한 황색을 유지하였다. 상기 혼합물은 약 15℃로 냉각되었고(이후 이는 필요하지 않다는 것이 명백하다), 약 1.25 ℓ 헥산이 첨가되었으며 상기 겔은 부분적으로 붕괴되어 오버헤드 교반으로 쪼개졌다. 상기 플라스크에 남아있는 백색 겔에 약 1 ℓ부분을 더 첨가하면서 상청액이 유리 섬유로 빨아들여 여과되었다. 또한, 헥산을 상기 상청액에 더 첨가하여 백색 고체로서 수도에페드린를 침전시키고 임의의 남아있는 겔을 붕괴시켰다. 헥산 추출물이 혼합되고 용매는 진공에서 제거되었다. 전체적으로, 겔의 추출, 수도에페드린의 헥산-유도 침전 및 유리 섬유 및 유리-융해된 부흐너 깔대기를 통한 여과를 통하여 약 5 내지 6 ℓ의 헥산이 사용되어 정제되지 않은 황색 오일로서 알릴 히드라진을 얻었다. 배치에서는, 이 정제되지 않은 물질은 약 3 부피(volume)의 헥산으로 처리되어 상온에서 두고, 침전된 수도에페드린으로부터 옮겨 부어지며 분별 깔대기로 옮겨졌다. 생성물 용액은 각각 1.4 N HCl(색깔이 많이 제거됨) 약 25 ㎖로 3 회 세척하고 이후 10% K2CO3 및 식염수로 세척하여 잔류 수도에페드린으로부터 분리되었다. 정제되지 않은 생성물의 섹산 용액은 고체 무수 Na2SO4 상에서 건조되었으며, 용매는 진공 상태에서 제거되어 연한 황색의 점성있는 오일을 생성하였다. TLC (2:1 헥산:EtOAc)는 Rf=0.4의 원하는 생성물; 0.25 및 0.31(5 내지 10%, 이들 중 하나는 아마도 출발 물질이다)에서 두 개의 불순물 및 Rf=0.4를 초과하는 두드러지지 않은 일부 불순물을 보여주었다. 총 196.8 g(75.8%)의 (R)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르는 진공 펌프 상에서 미량의 용매를 제거한 후에 호박색 오일 로서 분리되었다. 이제 어느 정도 응축되고 과립형의 최초의(original) 겔은 약 2 ℓ의 끓는 헥산으로 추출되었다. 고체는 여과되고, 헥산은 스트립되어(stripped) 상기 오일은 침전된 수도에페드린으로부터 옮겨 부어져서 약 18 g이 되었다. 이 물질은 상기 일차 생성물 배치(약 3 내지 4 g)로부터 나온 잔류물과 혼합되어 이전과 같이 1.4 N HCl, 수용성 K2CO3 및 식염수로 세척되었다. 상기 헥산은 스트립되어 TLC에 의하여 상기 제1 배치와 동일해 보이는 호박색 오일로서 20.6 그램을 더 생성하였다. (R)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르의 10.1 g 부분은 실리카 겔 상에서 정량적으로 크로마토그래피되어 맑은 황색빛이 도는 백색 오일로서 순수한 생성물 8.88 g(크로마토그래피에 대하여 88% 수율)를 생성하였다. Rf = 0.43(2:1 헥산:아세트산 에틸); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.4 (5H, br s), 6.2 (1H, br s), 6.0 (1H, br s), 5.15 (2H, s), 5.1 (2H, s), 4.1 (1H, br), 2.7 (1H, m), 2.4 (1H, br d), 2.0 (1H, m), 0.95 (9H, s); ee = 98.1%, AD-H 칼럼; [α]25589 -42.5°(c 2.18, CH3OH).
화합물 5: (R)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르(110 g, 398 mmol) 및 염화 메틸렌(methylene chloride) 500 ㎖가 온도계 및 자석 교반기(magnetic stirrer)가 장비된 2 ℓ 둥근 플라스크에 첨가되었다. K2CO3 용액(82.51 g, 탈이온수 200 ㎖에 597 mmol)이 이후 첨가되었으며, 상기 플라스크는 약 10℃로 냉각되었다. 순수한 3,5-디메틸 벤조일 클로라이드(3,5-dimethyl benzoyl chloride: 73.82 g, 437.8 mmol)가 이후 20 분의 기간에 걸쳐서 천천히 첨가되었다. 1 ℓ 염화 메틸렌은 잔류 산 염화물을 플라스크로 헹궈 놓고 반응 혼합물을 희석시키는데 사용되었다. 온도는 상기 첨가하는 동안에 15℃를 초과하지 않도록 하였다. 상기 반응은 하룻밤동안 처음에는 얼음 수조에서 이후 상온에서 교반되었다. 약 16 시간의 TLC 분석으로 상기 혼합물은 약 40 시간의 전체 시간 동안 교반되어 상기 반응이 잔류 산 염화물로 완료되었음을 나타내었다. 상기 반응 혼합물은 2 ℓ 분별 깔대기에 부어졌다. 유기층은 채집되어 수층(aqueous layer)의 소량 CH2Cl2 후류(backwash)와 혼합되었다. 상기 유기상은 10% K2CO3로 1회 더 세척되며, 식염수로 세척되었으며, 이후 고체 MgSO4/Na2SO4 상에서 건조되었다. 상기 혼합물은 염으로부터 여과되었으며, 용매는 진공상태에서 제거되어 과립형의 연한 베이지색 고체를 얻었다. 정제되지 않은 생성물은 현탁되고, 헥산:에테르 2:1의 300 ㎖에서 교반되고, 부흐너 깔대기 상에서 여과되어 잔류 3,5-디메틸벤조일 클로라이드를 실질적으로 제거하였다. 상기 채집된 고체는 헥산:에테르 2:1 약 1200 ㎖의 혼합물을 사용하여 세척되어 백색의 과립형 고체를 제공하게 되었다. 생성물은 채집되어 공기 중에 건조되어 (R)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르, 144.55 g, 수율 = 88.9%를 생성하였다. 표본 30 g이 끓는 메탄올 205 ㎖에 용해되어 상온에서 결정화되도록 하였다. 이로 인해 생성된 엉김제 물질은 50 ㎖ CH3OH를 사용하여 부흐너에서 세척되어 22.2 g, mp = 146℃, (ee>99.9%)를 생성하였다. (R)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-N'-(3,5-디 메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르의 분석 표본은 끓는 CH3OH로부터 이 물질을 2 회 재결정하고 이후 Kugelrohr 단형(short-path) 증류하고 고체로 채집하여 순수한 백색 물질: mp = 145.5-147℃, Rf = 0.12 (10:1 헥산:아세트산 에틸); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.5-7.2 (m, 9H, φ+NH), 7.2-6.8 (m), 6.4 (S), 6.3 (S), 6.3 (S), 5.95 (br, 5H, benzylic + C=C), 5.4-4.6 (m, 9H, allylic N-CH, φ-CH3), 3.65 (br), 2.5 (m), 2.35 (S), 2.3 (S), 1.2-0.8 (m, 9H, -C(CH3)3); [α]25589-12,8°(c 2.01,CHCl3)을 생성함으로서 얻게 되었다.
화합물 6 (R)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르(13.5 g, 33 mmol)은 상온에서 100 ㎖ 빙초산에 현탁되었다. 챠콜(0.24 g) 상에서 10% 팔라듐이 슬러리로서 아세트산 4.4 g에 첨가되었다. 회색 현탁액이 Parr 수소첨가기 상에서 10 내지 30 psi으로 90 분 동안 교반되어 TLC에 의하여 반응을 모니터링하였다. 촉매는 가라앉혀졌으며 반응 용매는 피펫을 사용하여 제거되어 플루트된(fluted) 여과지(Schleicher & Schuell 597 1/2, 125 ㎜ 직경)를 통과하였다. 촉매 잔류물은 아세트산으로 세척하였으며, 세척물은 여과지를 통과하여 아세트산 및 생성물 156 g의 혼합된 전체 질량을 생성하였다. 상기 혼합물은 얼음 상에서 냉각되었으며 약 600 ㎖ 탈이온수가 첨가되었다. 30 분의 기간에 걸쳐서, 생성물의 오일이 제거되고 이후 결정화되었다. 이는 여과지를 통해 여과되고, 공기 중에 건조되어 여과지 상에 채집되어 7.9 g의 연한 황색 고체 를 생성하였다. 몇 시간에 걸쳐서, 상기 여과액에서 0.52 g 생성물이 더 침전되어 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드 8.42 g (92.2%)의 총 수율을 생성하였다; Rf = 0.5 (1:1 헥산:아세트산 에틸); [α]25589 + 7.63 (c 1.98, CH3OH), 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.05 (1H, s), 7.02 (2H, s), 4.6+3.5 (1H, 2d), 4.1 (2H, s, NH2), 2.38+2.37 (6H, 2s), 1.1-2.1 (4H, m), 1.0+0.9 (9H, 2s), 1.0+0.98 (3H, 2t), 2 개의 다른 형태 이성질체(conformers).
화합물 7 (표제 화합물): (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드(35 g, 126.6 mmol)이 자석 교반장치로 장비된 500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크 내의 염화 메틸렌 100 ㎖에 용해되었다. 수용성 K2CO3 (26.25 g, 189.9 mmol, 75 ㎖ 탈이온수의 용액)가 첨가되어 상기 혼합물이 얼음 상에서 교반되었다. 고체 2-에틸-3-메톡시벤조일 클로라이드(2-ethyl-3-methoxybenzoyl chloride: 27.67 g, 139.3 mmol)이 첨가되었으며 25 ㎖ CH2Cl2를 사용하여 플라스크 속으로 헹궈졌다. 상기 혼합물은 얼음 상에서 약 40 시간 동안 교반되어, 수조를 상온으로 올렸다. 염화 메틸렌 및 물을 필요한 만큼 더 첨가하여 조작을 도왔다. 유기층이 분리되었으며 MgSO4 상에서 건조되었다. 약 5 g의 활성탄이 첨가되었으며 상기 염 및 탄소는 여과지를 통해 여과하여 제거되었다. 상기 용매는 우선 회전 농축기 상에서 그리고 이후 고 진공 하에서 증발되어, CH2Cl2 미량을 함유하는 57.8 g의 정제되지 않은 생성 물을 제공하였다. 상기 정제되지 않은 물질은 에테르(2% 에탄올)의 3 x 100 ㎖ 부분으로 그리고 이후 융해된 유리 부흐너 깔대기(공극 크기 ASTM 40-60 C, Pyrex)에서 헥산:에테르 1:1의 1 x 100 ㎖ 부분으로 저작되었다(triturated). 상기 생성물은 이후 2 x 200 ㎖ 탈이온수로 세척하여 철저히 혼합하고 공기 중에 건조시켰다. (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드(또는 (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드라고도 함)는 밝은 백색 분말 고체(36.51 g, 65.7% 수율, HPLC 및 카이랄 HPLC에 의하여 상당히 순수하며 매우 높은 ee, TLC에 의한 1 점, 헥산:에테르 1:1)로서 채집되었다. 혼합된 유기 세척물의 증발로 인하여 약 20 g의 물질을 생성하였는데, 우선 헥산:에테르 2:1 200 ㎖로 그리고 융해된 유리 부흐너, 공극 크기 ASTM 40-60 C에서 헥산:에테르 2:1 2 x 100 ㎖으로 저작되었다. 상기 물질은 3 x 100 ㎖ 탈이온수로 세척하여 철저히 혼합하고 공기 중에 건조시켰다. 제2 수확물은 백색 분말(12.98 g, HPLC 및 카이랄 HPLC에 의하여 상당히 순수하며 매우 높은 ee)로서 채집되었다. 제3 수확물은 황색 빛이 도는 백색 고체(1.52 g, 2.7%, 98% 순수, 99% 초과 ee)로서 유사한 방식으로 구해졌다. 최종 표본은 온화한 메탄올에서 용해하고 0.45 마이크론 시린지 필터(syringe filter)를 통해 대형 결정화 접시 속으로 여과시켜 제조되었다. 상기 물질은 채집되어, 스패튤라로 분쇄되고 거의 일정한 중량이 될 때까지 진공 속의 50 내지 58℃에서 가열되었다. HPLC 분석으로 하기와 같이 나타내었다 99.3% 화학적 순도 및 99.9% 초과 ee Rf = 0.28 (헥산: 아세트산 에틸 1:1); mp = 162.2-162.8℃; [α]25589 + 12.9 (c 2.04, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CD3OD)δ 7.0-7.1 (4H, m), 6.9 (1H, d), 6.1-6.4 (1H, 2d), 4.5-4.7 (1H, 2d), 3.78 (3H, s), 2.3 (6H, s), 2.3 (1H, m), 1.9 (2H, m), 1.55 (3H, m), 1.1-1.15 (9H, 2s), 0.9-1.0 (6H, m).
실시예 2 내지 29는 실시예 1에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 거울상이성질체 잉여(ee) 퍼센트는 카이랄 HPLC에 의하여 결정되었다. 표 2는 실시예 2 내지 29에 대한 분석 데이터를 제공한다.
실시예 구조 ee; % 명칭






2
Figure 112009080717400-pct00050





>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-벤조일-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-benzoyl-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide)






3
Figure 112009080717400-pct00051





>99



(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methyl-benzoyl)-hydrazide)






4
Figure 112009080717400-pct00052





>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methoxy-benzoyl)-hydrazide)






5
Figure 112009080717400-pct00053





>98


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-fluoro-benzoyl)-hydrazide)






6
Figure 112009080717400-pct00054





>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-benzoyl)-hydrazide)






7
Figure 112009080717400-pct00055





>99



(R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(2-브로모-벤조일)-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-(2-bromo-benzoyl)-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide)





8
Figure 112009080717400-pct00056




>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methyl-benzoyl)-hydrazide)





9
Figure 112009080717400-pct00057




>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-benzoyl)-hydrazide)





10
Figure 112009080717400-pct00058




>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-chloro-benzoyl)-hydrazide)





11
Figure 112009080717400-pct00059




>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzoyl)-hydrazide)





12
Figure 112009080717400-pct00060




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-ethyl-benzoyl)-hydrazide)





13
Figure 112009080717400-pct00061




>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methoxy-benzoyl)-hydrazide)





14
Figure 112009080717400-pct00062




>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-chloro-benzoyl)-hydrazide)






15
Figure 112009080717400-pct00063





>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-difluoro-benzoyl)-hydrazide)






16
Figure 112009080717400-pct00064





>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-dichloro-benzoyl)-hydrazide)





17
Figure 112009080717400-pct00065




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,4-디메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,4-dimethoxy-benzoyl)-hydrazide)





18
Figure 112009080717400-pct00066




>98


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,5-difluoro-benzoyl)-hydrazide)





19
Figure 112009080717400-pct00067




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethoxy-4-methyl-benzoyl)-hydrazide)





20
Figure 112009080717400-pct00068




97

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메틸-벤조[1,3]디옥솔-5-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzo[1,3]dioxole-5-carbonyl)-hydrazide)





21
Figure 112009080717400-pct00069




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(5-메틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥손-6-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(5-methyl-2,3-dihydro-benzo[1,4]dioxone-6-carbonyl)-hydrazide)





22
Figure 112009080717400-pct00070




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥손-6-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(5-ethyl-2,3-dihydro-benzo[1,4]dioxone-6-carbonyl)-hydrazide)





23
Figure 112009080717400-pct00071




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(나프탈렌-1-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(naphthalene-1-carbonyl)-hydrazide)





24
Figure 112009080717400-pct00072




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(나프탈렌-2-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(naphthalene-2-carbonyl)-hydrazide)






25
Figure 112009080717400-pct00073





>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(티오펜-2-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(thiophene-2-carbonyl)-hydrazide)






26
Figure 112009080717400-pct00074





>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,5-디메틸-퓨란-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,5-dimethyl-furan-3-carbonyl)-hydrazide)






27
Figure 112009080717400-pct00075





>99


(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide)





28
Figure 112009080717400-pct00076




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(6-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide)





29
Figure 112009080717400-pct00077




>99

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide)
분석 데이터
실시예 1 H NMR (용매) MS MP ; ℃


2		 (CDCl3)δ 7.88-7.0 (m, 8H), 4.75+3.69 (2d, 1H), 2.4+2.28 (2s, 6H), 2.0-1.3 (mm, 4H), 1.15+1.02 (2s, 9H), 0.94 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 381.2533,
[M+Na]+ 403.2351

66-68


3		 (CDCl3)δ 7.62-6.77 (m, 7H), 4.75+3.72 (2d, 1H), 2.34+2.33 (2s, 6H), 2.02 (s, 3H), 1.85-1.42 (mm, 4H), 1.19+1.14 (2s, 9H), 1.01 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 395.2685,
[M+Na]+ 417.2507

137-138


4		 (DMSO-d6)δ 10.07+9.98 (2s, NH), 7.73-6.63 (m, 7H), 4.54+4.39 (2d, 1H), 3.91+3.77 (2s, 3H), 2.36+2.28 (2s, 6H), 1.77-1.25 (mm, 4H), 1.1+0.98 (2s, 9H), 0.87 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 411.2637,
[M+Na]+ 433.2459


5
 (DMSO-d6)δ 10.48+10.35 (2s, NH), 7.61-6.68 (m, 7H), 4.52+4.37 (2d, 1H), 2.25 (s, 6H), 1.76-1.19 (mm, 4H), 1.02+0.83 (m, 12H) ppm
[M+H]+ 399.2436,
[M+Na]+ 421.2253

114-116


6		 (CDCl3)δ 7.84-6.6 (m, 7H), 4.74+3.72 (2d, 1H), 2.4+2.34 (2s, 6H), 1.97-1.44 (mm, 4H), 1.18+1.13 (2s, 9H), 0.99 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 415.2146,
[M+Na]+ 437.1962

138-140


7		 (DMSO-d6)δ 10.47+10.37 (2s, NH), 7.62-6.13 (m, 7H), 4.52+4.35 (2d, 1H), 2.28+2.26 (2s, 6H), 1.79-1.38 (mm, 4H), 1.07+0.85 (m, 12H) ppm
[M+H]+ 459.1637,
[M+Na]+ 481.1453

145-147


8		 (CDCl3)δ 7.72-7.09 (m, 7H), 4.74+3.68 (2d, 1H), 2.4+2.38 (2s, 6H), 2.29 (s, 3H), 2.0-1.45 (mm, 4H), 1.31+1.15 (2s, 9H), 1.02 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 395.2685,
[M+Na]+ 417.2503

158-159


9		 (DMSO-d6)δ 10.3+10.12 (2s, NH), 7.48-6.8 (m, 7H), 4.57+4.41 (2d, 1H), 3.86+3.77 (2s, 3H), 2.35+2.25 (2s, 6H), 1.78-1.29 (mm, 4H), 1.08+1.04 (2s, 9H), 0.98-0.88 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 411.2637,
[M+Na]+ 433.2456

110-111


10		 (CDCl3)δ 7.83-7.07 (m, 7H), 4.74+3.69 (2d, 1H), 2.4+2.31 (2s, 6H), 2.0-1.45 (mm, 4H), 1.15+1.09 (2s, 9H), 1.02-0.94 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 415.2148,
[M+Na]+ 437.1963

163-164


11		 (CDCl3)δ 8.08-7.08 (m, 7H), 4.74+3.68 (2d, 1H), 2.46+2.40 (2s, 6H), 2.29+2.28 (s, 3H), 1.74-1.31 (mm, 4H), 1.15+1.02 (2s, 9H), 0.95 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 395.2687,
[M+Na]+ 417.2511

60-62


12		 (DMSO-d6)δ 10.21+10.04 (NH, 2s) d 7.78-6.93 (m, 7H), 4.54+4.39 (2d, 1H), 2.60 (m, 2H), 2.32+2.21 (2s, 6H), 1.84-1.21 (mm, 4H), 1.15 (t, 3H), 1.05-0.84 (m, 12H) ppm
[M+H]+ 409.2844,
[M+Na]+ 431.2670

111-112



13		 (DMSO-d6)δ 10.16+9.98 (2s, NH), 7.88-6.97 (m, 7H), 4.57+4.41 (2d, 1H), 3.87+3.8 (2s, 3H), 2.35+2.24 (2s, 6H), 2.02-1.21 (mm, 4H), 1.08+1.02 (2s, 9H), 0.93-0.86 (m, 3H) ppm

[M+H]+ 411.2640,
[M+Na]+ 433.2458


65-67


14		 (CDCl3)δ 8.38-7.06 (m, 7H), 4.74+3.7
(2d, 1H), 2.41+2.28 (2s, 6H), 1.65-1.31 (mm, 4H), 1.14+1.02 (2s, 9H), 0.93 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 415.2136,
[M+Na]+ 437.1961

87-89


15		 (DMSO-d6)δ 10.62+10.54 (NH, 2s) d 7.45-6.96 (m, 6H), 4.50+4.35 (2d, 1H), 2.29+2.22 (2s, 6H), 1.70-1.15 (mm, 4H), 1.0-0.80 (m, 12H) ppm
[M+H]+ 417.2335,
[M+Na]+ 439.2160

180-182


16		 (DMSO-d6)δ 10.53 (s, 1H), 7.53-7.35 (m, 3H), 7.08 (s, 2H), 7.03 (s, 1H), 4.64 (d, 1H), 2.31+2.28 (2s, 6H), 1.89-1.42 (mm, 4H), 1.06 (s, 9H), 0.93-0.86 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 449.1730,
[M+Na]+ 471.1546

185-187


17		 (DMSO-d6)δ 10.08+9.89 (NH, 2s) d 7.75-6.87 (m, 6H), 4.53+4.38 (2d, 1H), 3.88+3.72 (m, 6H), 2.32-2.21 (m, 6H), 1.81-1.21 (mm, 4H), 1.05-0.82 (m, 12H) ppm
[M+H]+ 441.2732,
[M+Na]+ 463.2545

121-123


18		 (DMSO-d6)δ 10.40+10.21 (NH, 2s) d 7.57-6.97 (m, 6H), 4.53+4.38 (2d, 1H), 2.31+2.22 (2s, 6H), 1.71-1.24 (m, 4H), 1.03+0.99 (2s, 9H), 0.88-0.76 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 417.2337,
[M+Na]+ 439.2155

192-194



19		 (DMSO-d6)δ 10.16+9.98 (2s, 1H), 7.37-6.51 (m, 5H), 4.58+4.41 (2d, 1H), 3.91+3.86 (2s, 3H), 3.78 (s, 3H), 2.36+2.26+2.13+2.10 (4s, 6H), 2.00 (s, 3H), 1.80+1.30 (m, 4H), 1.09+1.06 (2s, 9H), 0.99+0.89 (2t, 3H) ppm

[M+H]+ 455.2913,
[M+Na]+ 477.2728


20		 (CDCl3)δ 7.26-6.43 (m, 5H), 6.06+5.99 (2s, 2H), 4.72+4.60 (2d, 1H), 2.45-2.32 (m, 6H), 1.88 (s, 3H), 1.99-1.44 (m, 4H), 1.17-0.97 (m, 12H) ppm
[M+H]+ 439.2609,
[M+Na]+ 461.2407



21		 (DMSO-d6)δ 10.25+10.10 (s, 1H), 7.13 (s, 2H), 7.05 (s, 1H), 6.70 (d, 1H), 6.45+6.36 (2d, 1H), 4.56+4.36 (2d, 1H), 4.22-3.53 (mm, 4H), 2.28 (s, 6H), 1.80-1.37 (mm, 4H), 1.65+1.58 (2s, 3H), 1.06 (s, 9H), 0.96+0.88 (2t, 3H) ppm


70


22		 (CDCl3)δ 7.08-6.22 (m, 5H), 4.74+3.69 (2d, 1H), 4.3-4.13 (m, 4H), 2.39+2.34 (2s, 6H), 2.14-1.95 (m, 2H), 1.44-1.29 (mm, 4H), 1.18+1.12 (2s, 9H), 1.0 (m, 6H) ppm
[M+H]+ 467.2905,
[M+Na]+ 489.2721

128-129


23		 (CDCl3)δ 9.2-7.08 (m, 10H), 4.81+3.76 (2d, 1H), 2.42+2.32 (2s, 6H), 2.08-1.45 (mm, 4H), 1.25-1.02 (m, 12H) ppm
[M+H]+ 431.2691,
[M+Na]+ 453.2512

173-174


24		 (CDCl3)δ 8.43-6.94 (m, 10H), 4.78+3.73 (2d, 1H), 2.41+2.29 (2s, 6H), 2.03-1.31 (mm, 4H), 1.18-0.94 (m, 12H) ppm
[M+H]+ 431.2752,
[M+Na]+ 453.2512
91 (유리)
-134


25		 (DMSO-d6)δ 10.25+10.08 (2s, 1H), 7.95-6.91 (m, 6H), 4.58+4.39 (2dd, 1H), 2.31+2.24 (2s, 6H), 1.90-1.25 (m, 4H), 1.08+1.01 (2s, 9H), 0.96-0.84 (m, 3H) ppm
[M+H]+ 387.2104,
[M+Na]+ 409.1923



26		 (DMSO-d6)δ 9.78+9.56, 7.14+7.08 (2s, 1H), 7.03+6.98 (s, 1H), 6.29+2.24 (2s, 1H), 4.53+4.37 (2d, 1H), 2.25 (s, 6H), 2.21+2.17 (2s, 6H), 1.78-1.23 (m, 4H), 1.05+1.00 (2s, 9H), 0.97+0.91 (2t, 3H) ppm

[M+H]+ 399.2644



27		 (DMSO-d6)δ 10.59+10.51 (2s, 1H), 8.48 (dd, 1H), 7.45 (dd, 1H), 7.13 (s, 2H), 7.04 (s, 1H), 6.73 (dd, 1H), 6.62 (dd, 1H), 4.56+4.41 (2d, 1H), 2.30 (s, 6H), 1.79-1.27 (m, 4H), 1.09+1.05 (2s, 9H), 0.97+0.91 (2t, 3H) ppm

[M+H]+ 416.2103,
[M+Na]+ 438.1922


28		 (DMSO-d6)δ 10.54+10.38 (2s, 1H), 8.39-7.00 (m, 6H), 4.58+4.42 (2d, 1H), 2.25 (s, 6H), 1.86-1.30 (m, 4H), 1.08+1.04 (2s, 9H), 1.00+0.89 (2t, 3H) ppm
[M+H]+ 416.2102,
[M+Na]+ 438.1924



29		 (DMSO-d6)δ 10.39+10.22 (2s, NH), 7.16-7.0 (m, 5H), 6.45+6.33 (2d, 1H), 4.57+4.39 (2d, 1H), 3.85+3.78 (2s, 3H), 2.36+2.29 (2s, 6H), 1.80-1.06 (2s, 9H), 0.96-0.89 (m, 3H), 0.96-0.89 (m, 3H) ppm

[M+H]+ 425.2804,
[M+Na]+ 447.2616


141-143
실시예 30
Figure 112009080717400-pct00078
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(S)-[2-(6-메톡시-나프탈렌-2-일)-프로피오닐]-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(S)-[2-(6-methoxy-naphthalen-2-yl)-propionyl]-hydrazide)
합성
Figure 112009080717400-pct00079
화합물 1: (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 2: 화합물 2는 해당 카르복실산으로부터 제조되었다. 염화 티오닐(thionyl chloride: 1.24 g, 10.42 mmol)는 자석 교반장치로 장비된 둥근 바닥 플라스크 내에서 8.2 ㎖ 클로로포름에 용해된 (S)-(+)-2-(6-메톡시-나프탈렌-2-일)-프로피온산((S)-(+)-2-(6-methoxy-naphthalen-2-yl)-propionic acid)(Naproxen, 2 g, 8.69 mmol)의 용액에 첨가되었다. DMF 한 방울이 첨가되며 혼합물은 3 시간 동안 환류되었다. 클로로포름 및 여분의 염화 티오닐은 염화 메틸렌이 첨가되면서 상기 반응 혼합물로부터 증류되었다. 잔류 용매를 증발시키면 (S)-2-(6-메톡시-나프탈렌-2-일)-프로피오닐 클로라이드((S)-2-(6-methoxy-naphthalen-2-yl)-propionyl chloride)(1.1918 g, 수율 88.8 %)를 생성하였다. Rf = 0.2 (1:1 헥산:에틸 에테르). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 9.98 (br, 1H), 7.78 (t, 2H), 7.36 (d, 1H), 7.18 (d, 1H), 7.14 (m, 2H), 4.25 (q, 1H), 3.93 (s, 3H), 1.68 (d, 3H).
화합물 3 (표제 화합물): (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드(전구체 기준으로 > 99%로 측정된 e.e, 1.1 g, 3.98 mmol)는 10 ㎖ 염화 메틸렌에 용해되었다. 수용성 K2CO3 용액(0.907 g, 2.5 ㎖에서 6.57 mmol)은 상기 반응 혼합물에 첨가되었다. (S)-2-(6-메톡시-나트탈렌-2-일)-프로피오닐 클로라이드(1.09 g, 4.38 mmol)가 첨가되고, 상기 반응은 24 시간 동안 교반되어 TLC로 모니터링되었다. 염화 메틸렌 및 물을 필요한 만큼 더 첨가하여 조작을 도왔다. 유기층이 분리되었으며 Na2SO4 상에서 건조되었으며, 용매는 진공상태에서 제거되어 정제되지 않은 생성물: mp = 98℃ (유리)-123℃을 제공하였다. 상기 정제되지 않은 물질은 헥산:에테르 2:1로 3 회 저작되어 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(S)-[2-(6-메톡시-나프탈렌-2-일)-프로피오닐]-히드라자이드, mp = 98℃ (유리)-122℃를 제공하였다. 상기 저작된 물질은 35℃에서 이소프로판올로부터 결정화되어 결정질 생성물을 제공하였다. 3 개 로트 모두의 1H NMR 스펙트럼은 동일하였다. Rf = 0.15 (헥산:에틸 에테르 1:1); mp = 158-160 ℃ (150℃에서 가열 시작); mp = 156-164℃(25℃에서 가열 시작); [α]25 589 +95.8°(c 2.02, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.96+9.82 (NH, 2s), 7.71+7.58 (2H, 2d), 7.63 (1H, 2s), 7.49+7.31 (1H, 2d), 7.26 (1H, s), 7.13+6.77 (1H, 2d), 7.06 (2H, s), 6.68+6.30 (1H, 2s), 4.31 (m, 1H), 3.88+3.85 (3H, 2s), 3.58 (1H, m), 2.30+1.83 (6H, 2s), 1.64-1.03 (4H, ㎜), 1.00 (3H, m), 0.87+0.84 (9H, 2s), 0.63 (3H, t); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ 173.9, 172.2, 157.8, 137.3, 133.7, 130.8, 129.1, 128.8, 127.4, 125.9, 125.8, 123.7, 123.3, 119.2, 119.1, 105.5, 62.7, 55.3, 45.1, 35.0, 28.5, 27.6, 26.9, 21.2, 17.5, 14.2; HRMS (ESI) m/z C31H39N2O3 [M-H]-에 대하여 계산된 487.2966, 실제 487.2949, C31H40ClN2O3 [M+Cl]-에 대하여 계산된 523.2733, 실제 523.2718, C31H40N2O3에 대하여 분석 계산된: C, 76.19; H, 8.25; N, 5.73; O, 9.8; 실제: C, 76.01; H, 8.35; N, 5.70.
실시예 1에서 비대칭 알릴화 반응의 입체화학적 코스를 결정하기 위하여, (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(S)-[2-(6-메톡시-나트탈렌-2-일)-프로피오닐]-히드라자이드의 x-선 결정 구조가 결정되었다. 본 실험은 상기 터트-부틸-부틸기 및 n-프로필기를 보유한 탄소의 절대 구성이 R임을 확증하였다.
실시예 31
Figure 112009080717400-pct00080
(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드
합성
Figure 112009080717400-pct00081
화합물 1: (E)-N'-(2,2-디메틸-프로필리덴)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 2: (R,R)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘은 R,R-수데페드린(pseudephedrine)을 사용한 실시예 1에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다.
화합물 3: (S)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르는 실시예 1에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 분석 데이터: Rf = 0.46 (헥산:아세트산 에틸 2:1); mp = 69-71℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.4 (br s, 5H), 6.2 (br s, 1H), 6.0 (br s, 1H), 5.15 (s, 2H), 5.1 (s, 2H), 4.1 (br, 1H), 2.7 (m, 1H), 2.4 (br d, 1H), 2.0 (m, 1H), 0.95 (s, 9H); ee = 98.2 %, ADH 칼럼; [α]25589 +39.3°(c = 2.03, CHCl3).
화합물 4: (S)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진 카르복실산 벤질 에스테르는 실시예 1에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 분석 데이터: Rf = 0.43 (헥산:아세트산 에틸 2:1); mp = 150-151.5℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.45-6.88 (m, 7H), 6.44 + 6.28 (2s, 1H), 5.96 (br, 1H), 5.38-4.68 (m, 5H), 3.69 (br, 1H), 2.68-2.43 (m, 2H), 2.36 + 2.29 (2s, 6H), 1.13 + 1.02 + 0.94 (3s, 9H); [α]25589 + 12.5°(c=2.01, CHCl3).
화합물 5: (S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드는 실시예 1에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 분석 데이터: Rf = 0.5 (헥산:아세트산 에틸 1:1); mp = 112-112.8℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.05 (s, 1H), 7.02 (s, 2H), 4.6+3.5 (2d, 1H), 2.38+2.37 (2s, 6H), 1.2-2.1 (m, 4H), 1.1+1.0 (2s, 9H), 1.05+0.98 (2t, 3H) 2 개의 다른 형태 이성질체; [α]25589-7.97 (c 2.14, CH3OH).
화합물 6 (표제 화합물): (S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드는 실시예 1에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 분석 데이터: Rf = 0.28 (헥산:아세트산 에틸 1:1); mp = 156.5-157.5 ℃; [α]25589 -13.39°(c 2.05, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.4+10.26 (s, 1H), 7.18-7.14 (m, 3H), 7.08 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.03 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.34 + 6.21 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.57 + 4.38 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.29 (s, 6H), 2.27-2.23 (m, 1H), 1.89-1.79 (m, 2H), 1.59-1.38 (m, 3H), 1.09 + 1.06 (s, 9H), 0.95 + 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ 173.40, 168.24, 157.64, 137.18, 136.98, 136.50, 130.73, 130.20, 126.96, 125.28, 124.83, 119.37, 118.95, 112.41, 62.29, 56.11, 35.45, 28.71, 27.56, 21.24, 20.15, 15.15, 14.68; HRMS (ESI) m/z C27H39N2O3 [M+H]+에 대하여 계산된 439.2955, 실제 439.295, C27H38NaN2O3 [M+Na]+에 대하여 계산된 461.2774, 실제 461.2765; C27H38N2O3에 대하여 분석 계산된: C, 73.94; H, 8.73; N, 6.39; O, 10.94; 실제: C, 73.87; H, 8.94; N, 6.38; ee:>99.9%; Regis (S,S) ULMO, 1 ㎖/min의 유속에서 헥산:메탄올의 98:2 혼합물.
실시예 32 내지 47은 실시예 31에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 거울상이성질체 잉여 퍼센트는 카이랄 HPLC에 의하여 결정되었다.
실시예 구조 % ee 명칭





32
Figure 112009080717400-pct00082




>99


(S)-(3,5-디메틸-벤조산 N'-벤조일-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((S)-(3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-benzoyl-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide)





33
Figure 112009080717400-pct00083




>99


(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-메틸-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methyl-benzoyl)-hydrazide)





34
Figure 112009080717400-pct00084




>99


(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-플루오로-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-fluoro-benzoyl)-hydrazide)





34
Figure 112009080717400-pct00085




>99


(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-benzoyl)-hydrazide)





36
Figure 112009080717400-pct00086




>99


(S)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(2-브로모-벤조일)-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'(2-bromo-benzoyl)-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide)





37
Figure 112009080717400-pct00087




>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메틸-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methyl-benzoyl)-hydrazide)




38
Figure 112009080717400-pct00088



>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메틸-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzoyl)-hydrazide)




39
Figure 112009080717400-pct00089



>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-ethyl-benzoyl)-hydrazide)





40
Figure 112009080717400-pct00090




>99


(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디플루오로-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-difluoro-benzoyl)-hydrazide)





41
Figure 112009080717400-pct00091




>99


(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-dichloro-benzoyl)-hydrazide)





42
Figure 112009080717400-pct00092




>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethoxy-4-methyl-benzoyl)-hydrazide)





43
Figure 112009080717400-pct00093




>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(티오펜-2-카르보닐)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(thiophene-2-carbonyl)-hydrazide)





44
Figure 112009080717400-pct00094




>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,5-디메틸-퓨란-3-카르보닐)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,5-dimethyl-furan-3-carbonyl)-hydrazide)





45
Figure 112009080717400-pct00095




>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide)





46
Figure 112009080717400-pct00096




>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(6-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide)





47
Figure 112009080717400-pct00097




>99

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide)
실시예 48
Figure 112009080717400-pct00098
(S)-N'(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실 터트-부틸 에스테르((S)-N'(1-tert-Butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid tert-butyl ester)
합성
Figure 112009080717400-pct00099
화합물 1: t-부틸 카르바제이트(t-Butyl carbazate)는 상용 구입가능하다.
화합물 2: 피발데히드(t-부탄올에서 52.1 g, 454 mmol, 약 75% 용액)는 환류 응축기, 온도계 및 부가 깔대기가 장비된 1 ℓ 3구 둥근 바닥 플라스크 내에서 메탄올 120 ㎖에 용해되었다. 빙초산(1 ㎖)이 첨가되고 이후 반응열을 제거하지 않고 t-부틸 카르바제이트(50 g, 378 mmol)를 제어하면서 첨가하였다. 상기 혼합물은 TLC에 의하여 모니터링하면서 4 시간 동안 교반되었다. 상기 반응의 완료시에, 상기 용매는 진공상태에서 제거되었고, 잔류물은 펜탄에 흡수되엇으며, 상기 펜탄은 증발되었다. 이로 생성된 오일은 그대로 두어 결정화되어 N'-(2,2-디메틸-프로필리덴)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르(N'-(2,2-dimethyl-propylidene)-hydrazinecarboxylic acid tert-butyl ester: 75.7 g, 93%)를 제공하였다. Rf = 0.42 (헥산:아세트산 에틸 2:1, 1% 아세트산); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.6 (br s, 1H), 7.1 (s, 1H), 1.5 (s, 9H), 1.1 (s, 9H) ppm.
화합물 3: (R,R)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘((R,R)-2-Allyl-2-chloro-3,4-dimethyl-5-phenyl-[1,3,2]oxazasilolidine)은 R,R-수데페린을 사용한 실시예 1에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다.
화합물 4: N'-(2,2-디메틸-프로필리덴)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르(N'-(2,2-Dimethyl-propylidene)-hydrazinecarboxylic acid tert-butyl ester: 12 g, 59.9 mmol)은 온도계, 자석 교반기 및 질소 분위기로 장비된 건조된 3구 1 ℓ 둥근 바닥 플라스크에 채워졌다. 무수 염화 메틸렌(200 ㎖)은 도관을 사용하여 상기 플라스크에 채워졌다. 상기 혼합물은 얼음 수조를 사용하여 0℃로 냉각되었다. (R,R)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]-옥사자실로리딘(24.07 g, 89.87 mmol)이 이후 비활성 조건 하에서 상기 플라스크에 첨가되었다. 수분 내에 최초의 연한 황색 용액이 투명한 짙은 황색으로 변화였다. 상기 반응은 0℃에서 6 시간 동안 교반되었으며, 이후 상온으로 되었으며 TLC에 의하여 모니터링하면서 하룻밤동안 교반되었다. 상기 반응은 약 25 ㎖ 메탄올을 첨가하여 억제되어 색깔이 밝아졌다. 상기 용액은 농축되었으며 잔류물은 아세트산 에틸 100 ㎖ 및 물 100 ㎖를 사용하여 희석되었다. 상들은 분리되었으며 수층은 아세트산 에틸로 2회 추출되었다. 유기상은 혼합되었고, 식염수로 세척되었고, Na2SO4 상에서 건조되었으며, 농축되었다. 이렇게 발생한 오일은 헥산에 용해된 10% 아세트산 에틸을 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제되었다. 정제된 (S)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르는 오일(2.87 g, 수율 24.4%)로 구해졌다. 불순물 분획(impure fraction)은 채집되었다(3.17 g). Rf = 0.44 (헥산:아세트산 에틸 5:1, I2 시각화); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 6.07 (br, 1H, NH), 5.85 (m, 1H), 5.0 (dd, 2H), 2.6 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.3 (m, 1H), 1.4 (s, 9H), 0.9 (s, 9H).
화합물 5: (S)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르((S)-N'-(2-tert-Butyl-but-3-enyl)-hydrazinecarboxylic acid tert-butyl ester: 2.34 g, 9.65 mmol)는 파(Parr) 병 내의 메탄올(50 ㎖)에 용해되었다. 10% Pd/C(70 ㎎)는 물(1.6 ㎖)에 현탁된 슬러리로서 첨가되었으며, 혼합물은 파 수소첨가기 상에서 55 psi의 시작 압력으로 4.5 시간 동안 교반되었다. 압력 상승은 반응 진행의 척도로서 모니터링되는데, 이는 상기 반응이 30 분 후에 완료될 것이라는 것을 시사한다. 촉매는 실질적으로 가라앉혀졌으며, 상청액은 피펫을 사용하여 제거되고 0.45 마이크론 시린지 필터를 통과하였으며 TLC에 의하여 분석되었다. 용매는 진공상태에서 제거되어 옅은 황색 오일로서 (S)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르 2.19 g(92.7%)을 생성하였다. Rf = 0.48 (헥산:아세트산 에틸 5:1, I2 시각화); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 6.0 (br, 1H), 4.0 (br, 1H), 2.5 (d, 1H), 1.5 (s, 9H), 1.1 (m, 2H), 1.6 (br, 2H), 0.94 (s, 9H), 0.94 (t, 3H).
화합물 6 (표제 화합물): (S)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르(1 g, 4.09 mmol)은 바이알 내에서 막대 자석을 사용하여 약 3 ㎖ 염산 메틸렌에 용해되었다. 약 2 ㎖ 물에 용해된 0.8 g K2CO3 (5.79 mmol)의 용액이 첨가되었으며, 이후 0.81 g(4.80 mmol) 3,5-디메틸벤조일 클로라이드(3,5-dimethylbenzoyl chloride)가 첨가되었다. 상기 반응은 우선 얼음 상에서 하룻밤동안 교반되었으며 이후 상온이 되도록 하였다. 이후 수 ㎖의 물 및 염화 에틸렌이 각각 첨가되어 고체 모두를 용해시켰다. 수층이 제거되었으며 유기층은 고체 MgSO4 상에서 건조되었다. TLC는 상기 반응이 약 95% 완료되었음을 가리켰다. 상기 혼합물은 유리 섬유를 통해 여과되어 바이알로 옮겨졌다. 용매는 N2 분위기 흐름으로 증발되었으며, 이후 헥산:에테르 3:1 및 펜탄으로 처리하였다. 잔류물은 스패튤라를 사용하여 다뤄져서 결정화를 개시하였으며, 완전히 고체화된 이후에 작은 융해된 유리 깔대기에서 펜탄 2 내지 3 ㎖를 사용하여 3 회 저작되었다. 공기 중에서 건조시킨 후에, (S)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르 300 ㎎(19.5%)이 얻어졌는데, TLC에 의하여 상당히 순수한 것으로 나타났으며, 카이랄 HPLC에 의하면 e.e = 93.3 %를 나타내었다. 상기 생성물은 녹는점 결정을 위해 50℃의 진공 오븐 내에서 건조되었다. Rf = 0.42(헥산:아세트산 에틸 4:1, UV (강함), I2 (약함) 시각화); mp = 115.5-117.5℃; [α]25589 -30.18 (c 2.02, CH3OH), 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.15-7.03 (m, 3H), 6.07+6.00 (s+d, 1H), 4.52+4.40 (2dd, 1H0, 2.32+2.28+2.23 (3s, 6H), 1.85-0,89 (m, 25H).
실시예 49
Figure 112009080717400-pct00100
(R)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르((R)-N'-(1-tert-Butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid tert-butyl ester)
Figure 112009080717400-pct00101
화합물 1: (R)-N'3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라자이드는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 2 (표제 화합물): THF(10 ㎖)에 용해된 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드(400 mg, 1.44 mmol)의 용액에 t-보크 무수물(boc anhydride: 629 ㎎, 2.88 mmol)이 첨가되었다. 상기 반응은 40 시간 동안 환류되었고, 냉각되고, 에테르(20 ㎖)로 희석되고 H2O로 세척되었으며 무수 Na2SO4 사에서 건조되었다. 상기 용매는 진공상태에서 증발되었으며 잔류물은 플래쉬 크로마토그래피 및 박막 크로마토그래피로 정제되어 백색 고체로서 (R)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르(45.7 ㎎, 4.1 % 수율)를 생성하였다. Rf = 0.39 (EtOAc:n-헥산 1:3); [α]25589 +26.25 (c 2.09, CH3OH), 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.15-7.03 (m, 3H), 6.07+6.00 (2d, 1H), 4.59+4.50 (2dd, 1H), 2.37+2.34 (2s, 6H), 1.85-0.89 (m, 25H) ppm; HRMS (ESI) m/z C22H37N2O3 [M+H]+에 대하여 계산된 377.2804, 실제 377.2795, C22H36N2NaO3 [M+Na]+에 대하여 계산된 399.2624, 실제 399.2618.
실시예 50
Figure 112009080717400-pct00102
(R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-N'-((S)-3,3,3-트리플루오로-2-메톡시-2-페닐-프로피오닐)-히드라자이드((R)-3-Methoxy-2-methyl-benzoic acid N'-(1-tert-butyl-but-3-enyl)-N'-((S)-3,3,3-trifluoro-2-methoxy-2-phenyl-propionyl)-hydrazide)
합성
Figure 112009080717400-pct00103
화합물 1: 3-메톡시-2-메틸-벤조산 히드라자이드(3-Methoxy-2-methyl-benzoic acid hydrazide)는 US 2005/0209283 A1에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다.
화합물 2: 피발데히드(13.45 g, 156 mmoles)은 둥근 바닥 플라스크 내의 300 ㎖ 메탄올에 용해되었다. 3-메톡시-2-메틸-벤조산 히드라자이드(26.6 g, 147.6 mmole) 및 빙초산 150 방울이 첨가되었으며, 본 혼합물은 TLC로 모니터링하면서 약 8 시간 동안 환류 가열되었다. 상기 반응이 완료시에, 상기 용매는 진공상태에서 제거되었으며, 상기 생성물은 냉각된 헥산 내에서 슬러리화되었으며 부흐너 깔대기 상에서 여과되어 3-메톡시-2-메틸-벤조산 (2,2-디메틸-프로필리덴)-히드라자이드를 제공하였다. Rf = 0.19 (헥산:아세트산 에틸 2:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 7.42+7.41 (3s, 1H), 7.1 (t, 1H), 6.9 (d, 1H), 6.82 (d, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.2+2.1 (2s, 3H), 1.07+1.0 (3s, 9H), 다중 형태, 가능하다면 E/Z 혼합물.
화합물 3: (S,S)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]-옥사자실로리딘은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 4: 3-메톡시-2-메틸-벤조산 (2,2-디메틸-프로필리덴)-히드라자이드(10.84 g, 43.31 mmol)은 질소 분위기 하에서 둔 건조한 1 ℓ 둥근 바닥 플라스크에 채워졌다. 350 ㎖ 무수 염화 메틸렌은 도관에 의하여 첨가되었다. 상기 플라스크는 얼음 수조에서 약 5℃으로 냉각되었다. (S,S)-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘(17.4 g, 65 mmol)은 주사기에 의하여 첨가되었다. 수분 내에, 최초의 연한 혼합물은 짙은 투명한 황색으로 변하였으며, 약 5℃의 질소 하에서 교반되었다. 4 시간 후에, TLC는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 상기 반응은 천천히 혼합하면서 약 25 ㎖ 메탄올을 첨가하여 억제되었다. 짙은 색이 흩어져 없어졌다. 상기 용액은 농축되었으며 잔류물은 아세트산 에틸(100 ㎖) 및 물(100 ㎖)로 희석되었다. 상들은 분리되었으며, 수층은 아세트산 에틸로 추출되었다(2 x 100 ㎖). 혼합된 유기층은 식염수로 1 회 세척되었고, MgSO4 상에서 건조되었으며, 농축되어 짙은 황색 오일을 생성하였는데, 놔두면 결정화되었다(13.66 g, 수율 72.4 %). 정제되지 않은 물질은 가능하다면 수도에페드린인 불용성 분말 잔류물로부터 분리하면서 헥산:아세트산 에틸 4:1로부터 결정화되었다. 1 회 결정화 이후에, 정제된 물질은 모셔(Mosher) 분석에 의하여 결정된 바와 같이 R-이성질체를 선호하는 약 80%의 e.e를 나타내었다. 3 회 결정화 이후에, (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라자이드(35.2%)는 결정질 고체로서 수거되었지만, Rf = 0.38(헥산:아세트산 에틸 2:1)에서 더 향상되지 않았다: 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.22 (t, 1H), 7.11 (br s, 1H), 6.95 (d, 1H), 6.15 (m, 1H), 5.2 (d, 1H), 5.15 (d, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.80 (d, 1H), 2.50 (dm, 1H), 2.33(s, 3H), 2.2 (dt, 1H), 1.08 (s, 9H).
화합물 5(표제 화합물): (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라자이드 (100 ㎎, 0.344 mmol) 및 (R)-(+)-알파-메틸--알파-(트리플루오로메틸)-페닐아세틸 클로라이드(104 ㎎, 0.413 mmol)은 바이알 내의 1.5 ㎖ 염화 메틸렌에 용해되었다. 약 0.5 ㎖ 물에 용해된 K2CO3 (95 ㎎, 0.69 mmole)의 용액이 첨가되었고, 반응 혼합물은 상온에서 하룻밤동안 교반되었으며, TLC에 의하여 모니터링되었다. 상들은 분리되었으며, 염화 에틸렌 및/또는 물을 원하는 만큼 첨가하여 조작을 도왔다. 염화 메틸렌층은 MgSO4 또는 Na2SO4 상에서 건조되었으며, 용매는 진공상태에서 제거되어 오일 고체로서 정제되지 않은 생성물을 제공하였다. 본 잔류물은 헥산/에테르를 사용하여 저작되었으며, 본 헥산/에테르 상에서 결정화가 개시되었다. 결정화는 더 교란하지 않으면서 진행하도록 하였다. 모액으로부터 분리하여 X-선 결정 구조를 얻은 결정질 (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-N'-((S)-3,3,3,-트리플루오로-2-메톡시-2-페닐-프로피오닐)-히드라자이드((R)-3-methoxy-2-methyl-benzoic N'-(1-tert-butyl-but-3-enyl)-N'-((S)-3,3,3,-trifluoro-2-methoxy-2-phenyl-propionyl)-hydrazide 83 ㎎(16.4%)을 제공하였다. Mp = 128-129℃; [α]25589 +66.4°(c 2.00, CH3OH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.5 (d, 2H0, 7.2-7.3 (m, 4H), 7.07 (m, 1H), 6.9 (d, 1H), 6.6+6.2 (br, 1H), 5.2 (d, 1H), 5.1 (d, 1H), 4.8 (1H, br), 3.85 (s, 3H), 3.8 (s, 3H), 2.55 (br, 1H), 2.35 (br, 2H), 1.5 (3H), 1.05 (br s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)α 168.1, 158.3, 138.7, 134.0, 129.4, 128.0, 126.5, 126.4, 126.3, 124.9, 122.1, 118.0, 117.0, 112.2, 57.3, 55.7, 35.8, 32.0, 28.1, 12.3; HRMS (ESI) m/z C27H34F3N2O4 [M+H]+에 대하여 계산된 507.2471, 실제 507.2463, m/z C27H33F3N2NaO4 [M+H]+에 대하여 계산된 529.2290, 실제 529.2284. C27H33F3N2O4에 대하여 분석 계산된: C, 64.02; H, 6.57; F, 11.25; N, 5.53; O, 12.63. 실제: C, 63.87; H, 6.71; N, 5.52.
실시예 50의 비대칭 알릴화 반응의 입체화학적 정도를 결정하기 위하여, (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-N'-((S)-3,3,3-트리플루오로-2-메톡시-2-페닐-프로피오닐)-히드라자이드((R)-3-methoxy-2-methyl-benzoic acid N'-(1-tert-butyl-but-3-enyl)-N'-((S)-3,3,3-trifluoro-2-methoxy-2-phenyl-propionyl)-hydrazide)의 x-선 결정 구조가 결정되었다. 본 실험은 상기 터트-부틸기 및 n-프로필기를 보유한 탄소의 절대 배열은 R이라는 것을 확증하였다.
실시예 51
Figure 112009080717400-pct00104
(R)-3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethoxy-4-methyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide)
합성
Figure 112009080717400-pct00105
화합물 1: (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라자이드는 실시예 50에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 2: (R)-3-메톡시-2-메틸 벤조산 N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-히드라자이드(3.05 g, 10.5 mmol)은 메탄올 100 ㎖에 용해되었다. 차코올(charcoal) 상에 담긴 팔라듐이 조심스럽게 첨가되었으며, 상기 혼합물은 파 수소첨가기 상에서 55 psi 시작 압력으로 2.5 시간 동안 요동되었다. 압력 감소는 반응 진행의 척도로서 모니터링되었다; 1.5 시간 이후에, 수소 섭취가 중단되었다. 상기 혼합물은 셀라이트(Celite) 패드를 통해 여과되었으며, 용매는 진공상태에서 제거되었다. 일부 용매를 사용하는 TLC에 의한 분석은 헥산:아세트산 에틸 3:1(Rf = 0.28)이 비록 소량으로는 성공적이라고는 하지만, 2 개의 히드라자이드 지점 간을 구별하는데 전체적으로는 성공적이지는 않았다. 정제되지 않은 생성물은 펜탄:헥산 2:1로부터 2 회 결정화되어 0.6 g을 초과하는 (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.05 (t, 1H), 6.79 (d, 1H), 6.76 (d, 1H), 3.7 (s, 3H), 2.37 (m, 1H), 2.12 (s, 3H), 1.7-1.1 (m, 4H), 0.90 (s, 9H), 0.82 (t, 3H).
화합물 3 (표제 화합물): (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드(100 ㎎, 0.34 mmol) 및 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일 클로라이드(90 ㎎, 0.41 mmol)은 염화 메틸렌 1 ㎖에 용해되었다. 약 25% K2CO3의 1.5 당량이 첨가되었으며, 상기 반응 혼합물은 상온에서 교반되었으며 TLC에 의하여 모니터링되었다. 완료시에, 상들은 분리되었으며, CH2Cl2 및/또는 물을 원하는 만큼 더 첨가하여 조작을 도왔다. 상기 CH2Cl2 상은 MgSO4 또는 Na2SO4 상에서 건조되었으며, 용매는 진공상태에서 제거되어 유성 고체를 제공하였다. 이 고체는 헥산:에테르 1:1로 저작되었으며 공기 중에 건조시켜 (R)-3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드를 생성하였다. Rf = 0.29 (헥산:아세트산 에틸 2:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.1 (t, 1H), 7.0 (s, NH 1H), 6.9 (d, 1H), 6.7 (s, 2H), 6.3 (d, 1H), 4.78 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.85 (2s, 6H), 2.2 (s, 3H), 2.05 (m, 1H), 1.95 (s, 3H), 1.8 (m, 1H), 1.6 (m, 2H), 1.2+1.1+1.05 (3s, 9H), 1.05 (m, 3H); HRMS (ESI) m/z C27H39N2O5 [M+H]+에 대하여 계산된 471.2859, 실제 471.2850, C27H38Na2O5 [M+Na]+에 대하여 계산된 493.2678, 실제 493.2678.
실시예 52
Figure 112009080717400-pct00106
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide)
합성
Figure 112009080717400-pct00107
화합물 1: 벤질 카르바제이트는 상업적으로 이용가능하다.
화합물 2: 벤질 카르바제이트(25 g, 150.44 mmol)는 자석 교반장치로 장비된 둥근 바닥 플라스크 내에서 질소 분위기 하의 에탄올 200 ㎖에 용해되었다. 사이클로헥산카르발데히드(cyclohexanecarbaldehyde: 17.7 g, 158 mmole) 및 아세트산(1 ㎖)이 상기 용액에 첨가되었으며 상기 혼합물은 상온에서 8 시간 동안 교반되었다. 이로 인하여 생성된 고체 침전은 여과되고, 헥산으로 세척되고, 아세트산 에틸로부터 결정화되었으며, 개방된 벤치 상에서 하룻밤동안 건조되어 백색 결정질 N'-사이클로헥실메틸렌-히드라진카르복실산 벤질 에스테르 28.87 g (수율 73.7%)을 제공하였다. Rf = 0.67 (헥산:아세트산 에틸 1:3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.8 (1H, br s), 7.4 (5H, m), 7.1 (1H, br s), 5.3 (2H, s), 2.4 (1H, m), 1.7-1.9 (4H, m), 1.3 (6H, m); HRMA (ESI) m/z C15H21N2O2 [M+H]+에 대하여 계산된 261.1603, 실제 261.1592, C15H20N2O2 [M+Na]+에 대하여 계산된 283.1426, 실제 283.1417.
화합물 3: (S,S)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 4: 자석 교반장치 및 N2 분위기로 장비된 둥근 바닥 플라스크는 무수 CHCl3 75 ㎖에 용해시킨 N'-사이클로헥실메틸렌-히드라진카르복실산 벤질 에스테르(N'-cyclohexylmethylene-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester) 5 g(19.21 mmole)로 채웠다. 상기 혼합물은 0℃로 냉각되었으며, (S,S)-옥사자실로리딘(5.66 g, 21.1 mmole)은 주사기를 사용하여 상기 용액에 첨가되었다. 얼음 수조는 약 30 분 후에 제거되었으며 상기 반응은 상온에서 하룻밤동안 교반되었다. 상기 반응은 수용성 Na2CO3로 억제되었다. 유기층은 제거되었으며 수용성 상은 CHCl3로 추출되었다. 혼합된 유기상은 물로 수회 후류되었고, 무수 Na2SO4 상에서 건조되엇으며, 회전 농축기를 사용하여 용매를 제거하였다. 이로 인하여 생성된 정제되지 않은 생성물은 칼럼 크로마토그래피로 정제되어 2.31 g, 수율 39.8%인 연한 황색 점성 오일로서 (R)-N'-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르를 제공하였다. Rf = 0.41 (헥산:아세트산 에틸 3:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.4 (5H, m), 6.3 (1H, br), 5.9 (1H, br s), 5.25 (2H, s), 5.2 (2H, br s), 2.95 (1H, br s), 2.35 (1H, br d), 2.17 (1H, br m), 1.8 (2H, br m), 1.75 (2H, br d), 1.55 (1H, br t), 1.0-1.4 (6H, m) ppm; HRMS (ESI) m/z C18H27N2O2 [M+H]+에 대하여 계산된 303.2072, 실제 303.2079, C18H26NaN2O2 [M+Na]+에 대하여 계산된 325.1892, 실제 325.1899.
화합물 5: R-N'-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르(2.20 g, 7.27 mmole)은 자석 교반장치가 장비된 바이알 내의 염화 메틸렌 2 ㎖에 용해되었다. 수용성 K2CO3 용액(1.51 g, 4 ㎖에 10.91 mmole)이 첨가되었으며 상기 혼합물은 얼음 상에서 냉각되었다. 순 산염화물은 천천히 첨가되었으며 추적 및 헹구는데 염화 메틸렌 약 1 ㎖이 사용되었다. 상기 혼합물은 우선 얼음 상에서 그후 상온에서 하룻밤동안 TLC로 모니터링하면서 교반되었다. 물 및/또는 CH2Cl2는 상기 반응 혼합물에 첨가되어 조작을 도왔으며, 유기층은 채집되었다. 수층은 CH2Cl2로 1 회 추출되었으며, 상기 유기층은 혼합되어 고체 Na2SO4 상에서 건조되었다. 용매는 진공상태에서 제거되었으며, 잔류물은 헥산:에테르 2:1로 저작되어 백색 고체의 (R)-N'-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르 2.93 g(92.7%)를 생성하였다. Rf = 0.33 (헥산:아세트산 에틸 3:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 9.8+9.65 (0.5H, NH, 2s), 7.1-7.5 (3.5H, m), 6.9-7.1 (5H, m), 6.05 (0.5H, m), 5.9 (0.5H, m), 5.2 (1H, m), 5.0 (2H, m), 4.8 (1H, m), 4.35 (1H, m), 2.35 (2H, br m), 2.25 (6H, s), 0.8-2.0 (11H, m); HMS (ESI) m/z C27H35N2O3 [M+H]+에 대하여 계산된 423.2657, 실제 435.2659, C27H34NaN2O3 [M+Na]+에 대하여 계산된 457.2467, 실제 457.2470.
화합물 6: (R)-N'-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진 카르복실산 벤질 에스테르(2.91 g, 6.7 mmole)은 약 50 ㎖의 빙초산에 현탁되었다. 차코올 상에 담긴 10% 팔라듐 102 ㎎이 아세트산 수 ㎖ 내에서 슬러리로서 첨가되었다. 상기 혼합물은 아세트산을 사용하여 75 ㎖로 희석되었으며, 20 내지 30 psi의 파 수소첨가기 상에서 90 분 동안 요동되었다. 상기 현탁액은 이틀 동안 두어 탄소가 가라앉도록 하였다. 상청액은 0.45 마이크론 시린지 필터를 통과하여 재결정화 접시 속으로 옮겨졌으며 용매는 증발되어 붉은색이 도는 갈색 점성 오일로서 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-히드라자이드 2.06 g(102% 매스 밸런스(mass balance))을 생성하였다. Rf = 0.24 (헥산:아세트산 에틸 2:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.05 (1H, s), 7.0 (2H, s), 4.55+3.35 (1H, 2t), 2.4 (6H, s), 0.8-1.9 (15H, m), 0.9 (3H, t); HRMS (ESI) m/z C19H31N2O [M+H]+에 대하여 계산된 303.2436, 실제 303.2441, C19H30N2NaO [M+Na]+에 대하여 계산된 325.2256, 실제 325.2262.
화합물 7 (표제 화합물): (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-히드라자이드(0.14 g, 0.46 mmole)은 교반장치로 장비된 바이알 내의 염화 메틸렌 1 ㎖에 용해되었다. 수용성 K2CO3 용액(0.1 g, 0.69 mmole, 2.77 ㎖)가 첨가되었다. 플라스크는 얼음 상에서 냉각되었으며, 순 산염화물이 첨가되었다. 추적 및 헹구는데 염화 메틸렌 약 0.8 ㎖가 더 사용되었다. 상기 혼합물은 우선 얼음 상에서 그후 상온에서 하룻밤동안 TLC로 상기 반응을 모니터링하면서 교반되었다. 물 및 CH2Cl2는 상기 반응 혼합물에 첨가되어 조작을 도왔으며, 수층은 CH2Cl2로 1 회 추출되었다. 유기층은 혼합되었으며 고체 Na2SO4 상에서 건조되었다. 용매는 진공상태에서 제거되었으며, 정제되지 않은 생성물은 크로마토그래피로 정제되어 붉은색이 도는 갈색 점성 오일인 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드 143 ㎎(수율 67.9%)를 생성하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 10.4 (1H, 2s), 7.0-7.25 (5H, m), 6.2 (1H, m), 4.45 (1H, m), 3.8 (3H, s), 2.35 (6H, s), 2.0-2.2 (2H, m), 0.9-2.0 (15H, m), 0.9 (6H, m).
실시예 53 내지 55는 실시예 52에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 퍼센트 거울상이성질체 잉여(ee)는 카이랄 HPLC에 의하여 결정되었다.
실시예 구조 % ee 명칭




53
Figure 112009080717400-pct00108



62.4

(R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-벤조일-N-(1-사이클로헥실-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-benzoyl-N-(1-cyclohexyl-butyl)-hydrazide)




54
Figure 112009080717400-pct00109



59.1
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(3-methoxy-benzoyl)-hydrazide)




55
Figure 112009080717400-pct00110



58.1
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(4-ethyl-benzoyl)-hydrazide)
실시예 56
Figure 112009080717400-pct00111
(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide)
합성
Figure 112009080717400-pct00112
화합물 1: N'-사이클로헥실메틸렌-히드라진카르복실산 벤질 에스테르(N'-Cyclohexylmethylene-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester)는 실시예 52에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 2: (R,R)-2-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘은 R,R-수데페린을 사용한 실시예 1에서 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다.
화합물 3: (S)-N'-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르는 실시예 52에 기술된 방법론을 이용하여 연한 황색 점성 오일로서 수율 69%로 제조되었다. 분석 데이터: Rf = 0.1 (헥산:아세트산 에틸 3:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 8.65 (1H, br s), 7.4 (5H, m), 5.85 (1H, br), 5.1(4H, m), 4.2 (1H, s), 2.7 (1H, br s), 2.1 (1H, br m), 2.0 (1H, br m), 1.8 (2H, br m), 1.65 (2H, br m), 1.45 (1H, br m) 1.0-1.2 (6H, br m); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.4 (5H, m), 6.3 (1H, br), 5.9 (1H, br s), 5.25 (2H, s), 5.2 (2H, br s), 2.95 (1H, br s), 2.35 (1H, br d), 1.17 (1H, br m), 1.8 (2H, br m), 1.75 (2H, br d), 1.55 (1H, br t), 1.0-1.4 (6H, m); HRMS (ESI) m/z C18H27N2O2 [M+H}+에 대하여 계산된 303.2072, 실제 303.2057, C18H26NaN2O2 [M+Na]+에 대하여 계산된 325.1892, 실제 325.1873.
화합물 4: (S)-N'-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진 카르복실산 벤질 에스테르는 실시예 52에 기술된 방법론을 이용하여 백색 고체로서 수율 84.8%로 제조되었다. 분석 데이터: ee ≥ 80%. Rf = 0.34 (헥산:아세트산 에틸 3:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 9.8+9.65 (0.5H, NH, 2s), 7.1-7.5 (3.5H, m), 6.9-71 (5H, m), 6.05 (0.5H, m), 5.9 (0.5H, m), 5.2 (1H, m), 5.0 (2H, m), 4.8 (1H, m), 4.35 (1H, m), 2.35 (2H, br m), 2.25 (6H, s), 0.8-2.0 (11H, m); HRMS (ESI) m/z C27H35N2O3 [M+H]+에 대하여 계산된 435.2647, 실제 435.2655, C27H34NaN2O3 [M+Na]+에 대하여 계산된 457.2467, 실제 457.2469.
화합물 5: (S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-히드라자이드는 실시예 52에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 분석 데이터: Rf = 0.24 (헥산:아세트산 에틸 2:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 7.05+6.95 (1H, s), 7.0+6.85 (2H, 2s), 4.55+4.05 (2H, 2s), 4.3+3.15 (1H, 2t), 2.3 (6H, 2s), 0.6-1.9 (15H, m), 0.9+0.8 (3H, 2t); (400 MHz, CDCl3)δ 7.05 (1H, s), 7.0 (2H, s), 4.55+3.35 (1H, 2t), 2.4 (6H, s), 0.8-1.9 (15H, m), 0.9 (3H, t); HRMS (ESI) m/z C19H31N2O [M+H]+에 대하여 계산된 303.2436, 실제 303.2440, C19H30N2NaO [M+Na]+에 대하여 계산된 325.2256, 실제 325.2260.
화합물 6 (표제 화합물): (S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드는 실시예 52에 기술된 방법론을 이용하여 37% ee로 제조되었다.
실시예 57 내지 59는 실시예 56에 기술된 방법론을 이용하여 제조되었다. 퍼센트 거울상이성질체 잉여 (ee)는 카이랄 HPLC에 의하여 측정되었다. 표 3은 실시예 57 내지 59에 대한 분석 데이터를 제공한다.
실시예 구조 % ee 명칭





57
Figure 112009080717400-pct00113




87.7

(S)-3,5-디메틸-벤조산 N'-벤조일-N-(1-사이클로헥실-부틸)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-benzoyl-N-(1-cyclohexyl-butyl)-hydrazide)




58
Figure 112009080717400-pct00114



86.7
(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(3-methoxy-benzoyl)-hydrazide)




59
Figure 112009080717400-pct00115



99
(S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라자이드((S)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-butyl)-N'-(4-ethyl-benzoyl)-hydrazide)
실시예 1H NMR (용매) MS


57		 (CDCl3)δ 8.0 (1H, NH, br s), 7.0-7.8 (8H, m), 4.6+3.6 (1H, 2 br s), 2.3-2.4 (6H, 2 br s), 1.4-2.0 (10H, br m), 1.1-1.4 (4H, 2 br s), 0.9-1.1 (4H, 2 br s) ppm
[M+H+] 407.2695
[M+Na+] 429.2513


58		 (CDCl3)δ 6.9-7.6 (7H+1NH, m), 4.6+3.6 (1H, 2br s), 3.85 (3H, 2 br s), 2.4 (6H, 2 br s), 1.4-2.0 (10H, br m), 1.1-1.4 (4H, br m), 0.9-1.3 (4H, 2 br s) ppm
[M+H+] 437.2799
[M+Na+] 459.2616


59		 (CDCl3)δ 7.9 (1H, NH, br s), 6.9-7.6 (7H, m), 3.6+4.6 (1H, 2 br s), 2.75 (2H, br s), 2.4 (6H, 2 br s), 1.5-2.0 (9H, br m), 1.1-1.4 (8H, br m), 1.0 (4H, 2 br s) ppm
[M+H+] 435.3016
[M+Na+] 457.2827
실시예 60
Figure 112009080717400-pct00116
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-N'-(3-메톡시-2-메톡시-벤질)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-but-3-enyl)-N'-(3-methoxy-2-methoxy-benzyl)-hydrazide)
Figure 112009080717400-pct00117
화합물 1: 3-메톡시-2-메틸-벤조산 히드라자이드(3-Methoxy-2-methyl-benzoic acid hydazide)는 실시예 50에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 2: 3-메톡시-2-메틸-벤조산 히드라자이드 10.0 g(55.5 mmol)은 절대 에틸 알코올 200 ㎖에 용해되었다. 사이클로헥산카르발데히드(6.85 g, 61.0 mmol) 및 빙초산(3 ㎖)가 첨가되었으며, 반응 혼합물은 TLC로 모니터링하면서 18 시간 동안 교반되었다. 침전은 여과에 의하여 체집되었으며 헥산으로 세척되었다. 생성물 3-메톡시-2-메틸-벤조산 사이클로헥실메틸렌-히드라자이드는 백색 고체(9.36 g, 수율 61%)로 구해졌다: Rf = 0.20(EtOAc:n-헥산 3:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 11.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.50 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.25 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 6.99 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 1.92-1.62 (m, 5H), 1.38-1.14 (m, 6H); HRMS (ESI) m/z C16H23N2O2 [M+H]+에 대하여 계산된 275.1760, 실제 275.1752, C16H22N2NaO2 [M+Na]+에 대하여 계산된 297.1579, 실제 297.1568.
화합물 3: (S,S)-알릴-2-클로로-3,4-디메틸-5-페닐-[1,3,2]옥사자실로리딘은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 4: 교반장치 및 질소 입구가 있는 둥근 바닥 플라스크에 3-메톡시-2-메틸-벤조산 사이클로헥실메틸렌-히드라자이드(3-methoxy-2-methyl-benzoic acid cyclohexylmethylene-hydrazide: 2.8 g, 10.2 mmol) 및 건조한 CHCl3 (50 ㎖)이 첨가되었다. (S,S0-옥사자실로리딘(3.28 g, 12.20 mmol)은 한방울씩 첨가되었다. 상기 반응은 50℃에서 6 시간 동안 교반되었으며, 이후 상온에서 18 시간 동안 교반되었다. 포화 NaHCO3 용액(30 ㎖)이 첨가되어 상기 반응을 억제하였다. CHCl3 층은 분리되었으며 수층은 CHCl3 (2 x 30 ㎖)로 추출되었다. 상기 CHCl3 용액은 혼합되었으며 무수 Na2SO4 상에서 건조되었다. 상기 용매는 진공상태에서 증발되었으며, 정제되지 않은 혼합물은 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제되어 백색 고체(1.74 g, 수율 54%)인 (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-히드라자이드를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 9.69 (s, 1H), 7.24 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.92 (m, 1H), 5.15 (dd, J = 1.6, 17.2 Hz, 1H), 5.08 (dd, J = 1.6, 10.4 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 3.6, 6.8 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.75 (m, 1H), 2.26-2.22 (m, 1H), 2.16 (s, 3H), 2.14-2.08 (m, 1H), 1.81-1.08 (m, 11H); HRMS (ESI) m/z C19H29N2O2 [M+H]+에 대하여 계산된 317.2229, 실제 317.2221, m/z C19H28N2NaO2 [M+Na]+에 대하여 계산된 339.2048, 실제 339.2037.
화합물 5(표제 화합물): CH2Cl2(5 ㎖)에 용해된 (R)-3-메톡시-2-메틸-벤조산 N'-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-히드라자이드((R)-3-methoxy-2-methyl-benzoic acid N'-(1-cyclohexyl-but-3-enyl)-hydrazide)의 용액에 K2CO3(2.27 g, 16.44 mmol), H2O(5 ㎖) 및 최종적으로 3,5-디메틸벤조일 클로라이드(727 ㎎, 4.31 mmol)이 첨가되었다. 상기 반응은 상온에서 24 시간 동안 교반되었다. CH2Cl2 및 H2O가 더 첨가되어 조작을 도왔고, CH2Cl2 층은 분리되었으며 수층은 CH2Cl2로 추출되었다. 상기 CH2Cl2 용액은 혼합되었으며 무수 Na2SO4 상에서 건조되었다. 상기 용매는 진공상태에서 증발되었으며 플래쉬 크로마토그래피로 정제되어 백색 고체(1.45 g, 수율 78%)의 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일))-히드라자이드를 제공하였다. Rf = 0.21 (EtOAc:n-헥산 3:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 10.47+10.39 (2s, 1H), 7.20-7.01 (m, 5H), 6.37 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.22-5.89 (m, 1H), 5.18 (dd, 1H), 5.02 (dd, 1H), 4.46 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.44-2.34 (m, 2H), 2.29 (s, 3H), 2.02-1.53 (m, 8H), 1.26-1.02 (m, 3H); HRMS (ESI) m/z C28H37N2O3 [M+H]+에 대하여 계산된 449.2804 실제 449.2793, m/z C28H36N2NaO3 [M+Na]+에 대하여 계산된 471.2624, 실제 471.2615.
실시예 61
Figure 112009080717400-pct00118
(R)-4-메톡시-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-4-Methoxy-3,5-dimethyl-benzoic acid N-(1-cyclohexyl-but-3-enyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide)
합성
(R)-4-메톡시-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-사이클로헥실-부트-3-에닐)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드는 실시예 60에 기술된 방법론을 이용하여 수율 71 %로 제조되었다. 분석 데이터: Rf = 0.14 (EtOAc:n-헥산 1:3); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 10.46+10.38 (2s, 1H), 7.21-6.42 (m, 5H), 6.16-5.93 (m, 1H), 5.23 (dd, 1H), 5.01 (dd, 1H), 4.45 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (s, 6H), 2.42-2.28 (m, 2H); 2.04 (s, 3H), 1.88-1.05 (m, 14H); HRMS (ESI) m/z C29H38N2O5 [M+H]+에 대하여 계산된 495.2859, 실제 495.2848, C29H38N2NaO5 [M+Na]+에 대하여 계산된 517.2678, 실제 517.2667.
실시예 62
Figure 112009080717400-pct00119
(R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(4-에틸-벤조일)-N-(1-페네틸-부트-3-에닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-(4-ethyl-benzoyl)-N-(1-phenethyl-but-3-enyl)-hydrazide)
합성
Figure 112009080717400-pct00120
화합물 1: 4-에틸-벤조산 히드라자이드(4-ethyl-benzoic acid hydrazide)는 상용 구입가능하다.
화합물 2: 4-에틸-벤조산 히드라자이드(10 g, 60.9 mmole)은 메탄올 32 ㎖에 용해되었다. 아세트산(1 ㎖)이 첨가되고, 상기 혼합물은 환류되었으며, 히드로시나말데히드(hydrocinnamaldehyde: 5.77 g, 67 mmoles)은 이후 천천히 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 10 시간 동안 환류되었으며 TLC로 모니터링되었다. 침전은 여과를 통하여 채집되었으며 헥산으로 세척되었다. 4-에틸-벤조산 (3-페닐-프로필리덴)-히드라자이드(4-ethyl-benzoic acid (3-phenyl-propylidene)-hydrazide)는 백색 고체(9.34 g, 수율 54.7%)로 얻어졌다. Rf = 0.36 (EtOAc:n-헥산 1:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 8.87 (s, 1H), 7.72-7.24 (m, 10H), 2.87 (t, J = 15.2 Hz, 2H), 2.79-2.57 (m, 4H), 1.24 (t, J = 8 Hz, 3H).
화합물 3: (R)-(+)-메틸 ρ-톨릴 술폭시드(tolyl sulfoxide: 0.5 g, 3.21 mmoles) 및 테트라부틸암모늄 트리페닐-디플루오로실리케이트(tetrabutylammonium triphenyl-difluorosilicate (TBAT): 0.12 g, 0.214 mmoles)은 질소 하에서 자석 교반장치가 장비된 2-메틸-2-부텐(2-methyl-2-butene) 0.038 ㎖ 및 무수 염화 메틸렌 2.4 ㎖에 용해되었다. 알릴트리클로로실란(allyltrichlorosilane: 0.23 ㎖, 1.61 mmoles)은 -78℃에서 첨가되었으며, 상기 반응은 15 분 동안 교반되었다. 4-에틸-벤조산 (1-메틸-3-페닐-프로필리덴)히드라자이드(4-ethyl-benzoic acid (1-methyl-3-phenyl-propylidene)hydrazide: 0.3 g, 1.07 mmoles)은 무수 염화 메틸렌 11.6 ㎖에 용해되었으며 30 분의 기간에 걸쳐서 상기 반응에 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 질소 하에서 5 시간 동안 교반되었고, TLC 모니터링 하면서 -78℃ 내지 -70℃에서 유지되었다. 상기 반응은 -78℃에서 1.5 ㎖ 트리에틸아민(triethylamine) 및 3 ㎖ 무수 메탄올을 사용하여 억제되었다. 이후 식염수가 첨가되었으며, 상기 혼합물은 상온이 되도록 하였다. 유기층은 제거되었고, 염화 메틸렌 추출물로 3 번 혼합되었으며, 황산 나트륨 상에서 건조되었다. 상기 용매는 증발되었으며, 정제되지 않은 혼합물은 펜탄:아세트산 에틸 2:1 및 1:1 단계 기울기를 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제되었다. 정제된 (R)-4-에틸-벤조산 N'-(1-페네틸-부트-3-에닐)-히드라자이드는 맑은 오일로서 얻어졌다(0.145 g, 수율 41.4 %, 키라셀(Chiracel) ADH 상의 카이랄 HPLC에 의하여 57.6% ee). Rf = 0.50 (EtOAc:n-헥산 1:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.64-7.13 (m, 9H), 5.91 (m, 1H), 5.15 (t, J = 28.0 Hz, 2H), 3.12 (m, 1H), 2.76-2.63 (m, 4H), 2.38-2.24 (m, 2H), 1.88-1.74 (m, 2H), 1.23 (t, J = 8.0 Hz, 3H).
화합물 4(표제 화합물): (R)-4-에틸-벤조산 N'-(1-페네틸-부트-3-에닐)-히드라자이드(0.1 g, 0.31 mmoles)은 자석 교반장치로 교반하면서 염화 메틸렌 0.47 ㎖에 용해되었다. 탈이온수 0.7 ㎖에 용해된 중탄산 칼륨(0.064 g, 0.37 mmoles) 및 3,5-디메틸벤조일 클로라이드(3,5-dimethylbenzoyl chloride: 0.063 g, 0.37 mmoles)가 상기 혼합물에 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 우선 얼음 상에서 교반되고 이후 주말에 걸쳐서(over the weekend) TLC에 의하여 모니터링하면서 상온으로 되었다. 유기층은 제거되었으며 수층은 염화 메틸렌으로 3 회 추출되고 황산 나트륨 상에서 건조되었다. 상기 용매는 증발되었으며, 정제되지 않은 혼합물은 헥산:아세트산 에틸 2:1을 용리제로 사용하여, 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제되었다. 정제된 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(4-에틸-벤조일)-N-(1-페네틸-부트-3-에닐)-히드라자이드는 황색 오일로서 얻어졌다(0.102 g, 수율 72.9 %, 키라셀 ADH 상에서 카이랄 HPLC에 의하여 51.2% ee). Rf = 0.34 (헥산:EtOAc 2:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.8-7.02 (m, 12H), 5.99 (br, 1H), 5.22 (d, J = 24.0 Hz, 2H), 2.73 (d, J = 8 Hz, 2H), 2.31 (s, 6H), 2.12-2.03 (m, 2H), 1.87 (s, 1H), 1.61 (s, 2H), 1.29 (t, J = 8.0 Hz, 3H); HRMS (ESI) m/z C30H35N2O2 [M+H]+에 대하여 계산된 455.2699, 실제 455.2685, C30H34N2NaO2 [M+Na]+에 대하여 계산된 477.2518, 실제 477.2505.
실시예 63
Figure 112009080717400-pct00121
(S)-N'-(1-터트-부틸-4-히드록시-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진 카르복실산 벤질 에스테르((S)-N'-(1-tert-Butyl-4-hydroxy-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazine carboxylic acid benzyl ester)
합성
Figure 112009080717400-pct00122
화합물 1: 화합물 1은 실시예 31에 기술된 바와 같이 제조되었다.
화합물 2(표제 화합물): THF(3 ㎖)에 용해된 (S)-N'-(1-터트-부틸-부트-3-에닐)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르((S)-N'-(1-tert-butyl-but-3-enyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester: 200 ㎎, 0.49 mmol)의 용액에 보레인 디메틸 설파이드(borane dimethyl sulfide: THF에 용해된 2 M, 125 ㎕, 0.25 mmol)가 0℃에 첨가되었다. 상기 혼합물은 상온에서 16 시간 동안 교반되었다. 여분의 보레인 및 THF는 진공상태에서 제거되었으며, THF(3 ㎖)가 더 첨가되고 이후 H2O2(61 마이크로리터, 0.54 mmol) 및 3 N NaOH(90 마이크로리터, 0.27 mmol)가 첨가되었다. 50 내지 55℃에서 1 시간 동안 교반한 후에, 상기 혼합물은 에테르로 추출되었으며, 에테르층은 무수 Na2SO4 상에서 건조되었다. 상기 용매는 진공상태에서 제거되었으며 잔류물은 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제되어 백색 고체(128 ㎎, 수율 61%)로서 (S)-N'-(1-터트-부틸-4-히드록시-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에테르를 생성하였다. Rf = 0.30 (EtOAc:n-헥산 1:1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 9.71+9.63 (2s, 1H), 7.44-6.88 (m, 8H0, 5.06 (dd, J = 3.6, 12.8 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 12.4, 25.2 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.28 (t, 5.2 Hz, 1H), 3.47 (m, 2H0, 2.27 (s, 6H), 1.86-1.21 (m, 4H), 1.01 (s, 9H); HRMS (ESI) m/z C25H35N2O4 [M+H]+에 대하여 계산된 427.2597, 실제 427.2587, C25H34N2NaO4 [M+Na]+에 대하여 계산된 449.2416, 실제 449.2407.
실시예 64
Figure 112009080717400-pct00123
(R)-N'-(1-터트-부틸-4-히드록시-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진 카르복실산 벤질 에스테르((R)-N'-(1-tert-Butyl-4-hydroxy-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazine carboxylic acid ester)
합성
(R)-N'-(1-터트-부틸-4-히드록시-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진 카르복실산 벤질 에스테르는 실시예 63에 기술된 방법론을 이용하여 99%를 초과하는 ee로 제조되었다.
실시예 65
본 실시예는 본 발명의 화합물의 거울상이성질체 잉여(ee)를 측정하는데 사용된 분석 방법을 예시한다.
도 2A-C에 도시된 바와 같이, rac-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드(rac-3,5-dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-dichloro-benzoyl)-hydrazine: 실시예 16)인 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드 및 (S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드 (실시예 41)에 대한 카이랄 HPLC 크로마토그램은 거울상이성질체 잉여를 측정하는데 사용된 방법을 예시한다. rac-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드는 상기 R-이성질체(약 16 분에서의 피크 1) 50% 및 상기 S-이성질체(약 19 분에서의 피크 2) 50%를 함유한다. (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드의 거울상이성질체적으로 농축된 표본은 99%를 초과하는 ee를 갖는 상기 S-이성질체가 실질적으로 없다. (S)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드의 거울상이성질체적으로 농축된 표본은 99%를 초과하는 ee를 갖는 상기 R-이성질체가 실질적으로 없다. 본 실험에서, 헥산 용매에 용해된 2% 메탄올 및 20 ㎕의 주사 부피를 사용한 2.0 ㎖/min의 유속으로 4.6 ㎜ x 25 ㎝ Regis Rexchrom (S,S) 울모(ULMO) 칼럼을 사용하여 데이터가 생성되었다. 화학식 II 또는 III의 다른 화합물의 거울상이성질체 잉여는 달리 기록되지 않으면, 유사한 방식으로 결정되었다.
실시예 66
본 실시예는 본 발명의 화합물의 시험관 내 시험을 예시하는 것이다.
유전자 발현 카세트
GAL4 DBD (1-147)-CfEcR(DEF)/VP16AD-βRXREF-LmUSPEF: 가문비나무잎말이나방(spruce budworm) Choristoneura fumiterana EcR로부터 유래한 야생형 D, E 및 F 도메인("CfEcR-DEF"; 서열 ID 번호: 1)은 GAL4 DNA 결합 도메인("Gal4DBD1-147"; 서열 ID 번호: 2)과 융합되고 인산글리세린산염(phosphoglycerate) 키나아제 프로모터("PGK"; 서열 ID 번호:3)의 제어하에 두었다. 인간(Homo sapiens) RXRβ("HsRXRβ-EF"; 서열 ID 번호: 4의 뉴클레오티드 1 내지 465)로부터 유래한 EF 도메인의 1 내지 8 나선 및 풀무치(Locusta migratoria) 울트라스피라클 단백질("LmUSP-EF"; 서열 ID 번호: 5의 뉴클레오티드 403-630)의 EF 도메인의 9 내지 12 나선은 VP16("VP16AD"; 서열 ID 번호: 6)으로부터 유래한 전이활성화 도메인에 융합되어 연장 인자-1α 프로모터("EF-1α"; 서열 ID 번호: 7)의 제어하에 두었다. 5 개의 컨센서스(consensus) GAL4 반응 구성요소 결합 부위("5XGAL4RE"; 서열 ID 번호: 8을 포함하는 GAL4RE의 5 개 카피들을 포함)는 합성 TATA 최소 프로모터(서열 ID 번호: 9)에 융합되었으며 루시페라제 보고자 유전자(서열 ID 번호: 10)의 상류에 두었다.
안정한 세포주
CHO 세포는 단일 플라스미드 상에서 어디에나 있는(ubquitously) 활성 세포 프로모터(각각 PGK 및 EF-1α)에 의하여 제어되는 GAL4 DBD(1-147) CfEcR(DEF) 및 VP16AD βRXREF-LmUSPEF에 대한 전사 카세트로 일시적으로 핵산전달감염되었다. 안정적으로 핵산전달감염된 세포는 제옥틴(Zeoctn) 내성에 의하여 선택되었다. 개별적으로 분리된 CHO 세포 클론은 GAL4 RE-루시페라제 보고자(pFR Luc)로 일시적으로 핵산전달감염되었다. 27-63 클론은 하이그로마이신(Hygromycin)을 사용하여 선택되었다.
카이랄 디아실히드라진 리간드를 사용한 처리
세포는 트립신화되었으며 2.5 x 104 세포 ㎖의 농도로 희석되었다. 세포 현탁액 100 ㎕은 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 놓여지며 37℃의 5% CO2 하에서 24 시간 동안 배양되었다. 리간드 스탁 용액은 DMSO에서 제조되었으며 모든 처리에 대하여 300 배 희석되었다. 용량 반응 검사(dose response testing)는 33 μM 내지 0.01 μM에 이르는 8 개 농도로 구성되었다.
리포터 유전자 검정
루시페라제 리포터 유전자 발현은 Promega사로부터 구한 Bright-GloTM 루시페라제 검정 시스템을 사용하는 세포 처리 이후 48 시간에 측정되었다. 발광은 Dynex MLX 마이크로리터 플레이트 발광시료측정장치를 사용하여 상온에서 검출되었다.
안정한 세포주
Suhr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7999-804 (1998)에 기술된 바와 같이 CVBE 및 6XEcRE를 함유하는 안정하게 형질전환된 세포의 개체군을 얻었다. HEK-293 세포라고도 하는 인간 293 신장 세포는 처음에는 스위치 구조체 CVBE를 인코딩하고, 이후 리포터 구조체 6XEcRE Lac Z를 인코딩하는 레트로바이러스성 벡터로 순차적으로 핵산전달감염되었다. 상기 스위치 구조체는 VP16 전이활성화 도메인(VBE)의 프레임 및 하류에 삽입된 누에나방(Bombyx mori) EcR(BE) (Iatrou)로부터 유래한 아미노산 26-546에 대한 코딩 서열을 함유하였다. 합성 ATG 시작 코돈은 사이토메갈로바이러스(CVBE) 조기 프로모터의 제어하에 두었으며 장형 반복 말단(LTR)에 의하여 플랭킹되었다. 상기 리포터 구조체는 LacZ의 상류에 놓여있으며 LTR 서열(6XEcRE)을 갖는 양쪽 측면 상에서 플랭킹된 엑디손 반응 구성요소(EcRE) 결합 부위의 카피 6 개를 함유하였다.
희석 클로닝을 이용하여 개별 클론들을 분리하였다. 클론들은 450 ug/㎖ G418 및 100 ng/㎖ 퓨로마이신을 사용하여 선택되었다. 개별 클론들은 시험 리간드의 존재 및 부존재 하에 그 반응을 바탕으로 평가되었다. 클론 Z3은 선별 및 SAR 목적을 위하여 선택되었다.
CVBE 및 6XEcRE LacZ로 안정적으로 형질전환된 인간 293 신장 세포는 10% FBS(Life Technologies, 26140-087), 450 검 G418(Mediates, 30-234-CR) 및 100 그놈 프로미싱(gnome promising: Sigma, P-7255)을 함유하는 최소 기본 배지(Mediates, 10-010-CV)에서 5% CO2를 함유하는 분위기의 37℃에서 유지되었으며 이들이 75% 합류점(confluence)에 도달하였을 때 계대배양되었다.
카이랄 디아실히드라진 리간드로 처리
Z3 세포는 웰당 2.5 X 103 세포의 농도에서 96-웰 조직 배양 플레이트에 살포되어 5% CO2의 37℃에서 24 시간 동안 배양되었다. 리간드의 스탁 용액은 DMSO에서 제조되었다. 리간드 스탁 용액은 배지에서 100 배 희석되었으며 이 희석된 리간드 용액(33 μM) 50 ㎕이 세포에 첨가되었다. DMSO의 최종 농도는 대조 그룹 및 처리 그룹 양쪽 모두에서 0.03%로 유지되었다.
리포터 유전자 검정
리포터 유전자 발현은 세포의 처리 이후 48 시간에 평가되었다. β-갈락토시다제 활성은 Tropix 사(GSY1000)로부터 구한 Gal ScreenTM 생물발광 리포터 유전자 검정 시스템을 사용하여 측정되었다. 배율 유도 활성(fold induction activities)은 리간드 처리된 세포에서 상대 광도(relative light units: RLU)를 DMSO 처리된 세포에서의 RLU로 나누어서 계산되었다. 발광은 Dynex MLX 마이크로타이터 플레이트 광도계를 사용하여 상온에서 검출되었다.
스위치 구조체 CVBE 및 리포터 구조체 6XEcRE Lac Z의 모식도가 도 1에 도시되어 있다. 양쪽 구조체의 플랭킹(flanking)은 장형반복말단(long terminal repeats)이고, G418 및 퓨로마이신은 선택 표지이고, CMV는 사이토메갈로바이러스 프로모터(cytomegalovirus promoter)이고, VBE는 VP16 전이활성화 도메인의 누에나방(Bombyx mori) EcR(BmEcR) 삽입된 하류로부터 아미노산 26 내지 546에 대한 코딩 서열이고, 6X EcRE는 엑디손 반응 구성요소의 6 개 카피이며, lacZ는 리포터 효소 β-갈락토시다제를 인코딩한다.
유전자 발현 카세트
GAL4 DBD-CfEcR(DEF)/VP16AD-MmRXRE: 가문비나무잎말이나방 Choristoneura fumiterana EcR로부터 유래한 야생형 D, E 및 F 도메인("CfEcR-DEF"; 서열 ID 번호: 1)은 GAL4 DNA 결합 도메인("Gal4DBD1-147"; 서열 ID 번호: 2)과 융합되고 pM 벡터(PT3119-5, Clontech, Palo Alto, CA)의 SV40e 프로모터의 제어하에 두었다. 생쥐(Mus Musculus) RXR("MmRXR-DE"; 서열 ID 번호: 11)로부터 유래한 D 및 E 도메인은 VP16으로부터 유래한 전이활성화 도메인("VP16AD"; 서열 ID 번호: 6)과 융합되어 pVP16 벡터(PT3127-5, Clontech, Palo Alto, CA)의 SV40e 프로모터의 제어에 놓였다.
안정한 세포주
CHO 세포는 SV40e 프로모터에 의하여 제어되는 GAL4 DBD-CfEcR(DEF) 및 VP16AD-MmRXRE에 대한 전사 카세트로 일시적으로 핵산전달감염되었다. 안정적으로 핵산전달감염된 세포는 하이그로마이신을 사용하여 선택되었다. 개별적으로 분리된 CHO 세포 클론은 GAL4 RE-루시페라제 보고자(pFR Luc, Stratagene, La Jolla, CA)로 일시적으로 핵산전달감염되었다. 13B3 클론은 제오신(Zeocin)을 사용하여 선택되었다.
카이랄 디아실히드라진 리간드를 사용한 처리
세포는 트립신화되었으며 2.5 x 104 세포 ㎖의 농도로 희석되었다. 세포 현탁액 100 ㎕은 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 놓여지며 37℃의 5% CO2 하에서 24 시간 동안 배양되었다. 리간드 스탁 용액은 DMSO에서 제조되었으며 모든 처리에 대하여 300 배 희석되었다. 용량 반응 검사는 33 μM 내지 0.01 μM에 이르는 8 개 농도로 구성되었다.
유전자 스위치 검정-처리된 EcR:USP/PXR 시스템
세포 유전자 스위치 검정은 마우스 배아 섬유아세포(NIH3T3)에서 하기 구조체를 일시적으로 핵산전달감염시켜 수행되었다. 가문비나무잎말이나방(Choristoneura fumiferana ) EcR 또는 그 V390I/Y410E/E274 돌연변이로부터 유래한 야생형 D, E 및 F 도메인은 GAL4-DBD와 융합되었으며 pBIND 벡터(Promega Corporation, Madison, WI, USA)에서 CMV 프로모터의 제어하에 놓였다. 주어진 EcR의 DEF 도메인은 5' 및 3' 말단에서 20 내지 25 nt 서열을 바탕으로 설계된 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 제한 효소 부위 EcoR I/BamH I 및 Xba I는 각각 5' 및 3' 프라이머에 첨가되었다. PCR 생성물은 적당한 제한 효소로 소화되었으며 pBIND 벡터 속으로 클로닝되었다. pBIND 벡터 속으로 클로닝된 EcR LBD는 서열분석에 의하여 검증되었다. VP16-AD에 융합되고 SV40e 프로모터의 제어하에 놓여있는 인간(Homo sapiens) RXRβ 및 풀무치(Locusta migratoria) RXR로부터 유래된 키메라 RXR은 이전에 기술된 바와 같이 제작되었다(Kumar P & Katakam A in Gene Transfer, Friedmann T and Rossi J, eds, pp. 643-651 (2007), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 유도성 루시페라제 리포터 플라스미드 pFRLuc(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA)는 GAL4 반응 구성요소 및 합성 최소 프로모터의 카피 5 개를 함유한다.
NIH3T3 세포는 모두 Mediatech Inc., Manassas, VA로부터 구입한 10% 송아지 혈청으로 보충된 Dulbecco's 변형 이글 배지(DMEM) 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지되었다. 세포는 성장 배지 50 ㎕에서 웰당 2,500 세포의 밀도로 96-웰 플레이트 내에 이식되었다. 다음날 세포는 우선 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide(DMSO); 대조 그룹) 또는 리간드를 함유하는 DMSO 용액을 함유하는 무혈청 DMEM 35 ㎕로 처리되었다. 이후 세포는 제작자 지시사항에 따라 SuperFectTM 핵산전달감염 시약(Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 사용하여, 웰당 EcR 구조체 0.04 ㎍, RXR 구조체 0.04 ug 및 루시페라제 보고자 구조체 0.16 ㎍를 함유하는 무혈청 DMEM 15 ㎕로 핵산전달감염되었다. 리간드는 0.01 내지 33 μM의 8 개 용량에서 시험되었으며, 최종 DMSO 농도는 대조 및 처리 웰 양쪽 모두에서 0.33%였다. 48 시간 후-처리 및 핵산전달감염 배양 이후에, 상기 세포는 제조자 지시사항에 따라 Bright-GloTM 루시페라제 검정 시스템(Promega사, Madison, WI, USA)을 이용하여 루시페라제 활성에 대하여 검정되었다. EC50 수치는 최소한 두 벌씩 측정되었다.
리포터 유전자 검정
루시페라제 리포터 유전자 발현은 Promega(E2650)사로부터 구입한 Bright-GloTM 루시페라제 검정 시스템을 사용한 세포 처리 이후 48 시간에 측정되었다. 발광은 Dynex MLX 마이크로리터 플레이트 광도계를 사용하여 상온에서 검출되었다.
각각의 검정은 2 개의 다른 웰에서 수행되었으며, 상기 두 수치는 평균되었다. 배율 유도는 리간드 처리된 세포에서 상대 광도("RLU")를 DMSO 처리된 세포에서의 RLU로 나누어서 계산되었다. EC50은 3개 매개변수 로지스틱 모델을 사용한 용량 반응 데이터로부터 계산되었다. 상대 Max FI는 임의의 농도에서 관찰된 GSTM-E 리간드(3,5-디메틸-벤조산 N-터트-부틸-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드)의 최대 배율 유도에 대하여 임의의 농도에서 관찰된 시험된 리간드(본 발명의 실시예)의 최대 배율 유도로서 측정되었다.
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실시예 67
본 실시예는 본 발명의 화합물의 시험관 내 시험을 예시하는 것이다. 본 발명의 키랄 디아실히드라진 리간드로 보고자 효소의 시험관 내 유도는 유전자 스위치를 함유하는 C57BL/6 마우스 모델 시스템 내에서 평가되었다.
유전자 발현 카세트
가문비나무잎말이나방 Choristoneura fumiterana EcR로부터 유래한 야생형 D, E 및 F 도메인("CfEcR-DEF"; 서열 ID 번호: 1)은 돌연변이 [V107(gtt) → I107(att) 및 Y127(tac) → E127(gag)] 되었으며 GAL4 DNA 결합 도메인("Gal4DBD1-147"; 서열 ID 번호: 2)과 융합되었다. 인간(Homo sapiens) RXRβ("HsRXRβ-EF"; 서열 ID 번호: 4의 뉴클레오티드 1 내지 465)로부터 유래한 EF 도메인의 1 내지 8 나선 및 풀무치(Locusta migratoria) 울트라스피라클 단백질("LmUSP-EF"; 서열 ID 번호: 5의 뉴클레오티드 403-630)의 EF 도메인의 9 내지 12 나선은 6xGAL4 반응 구성요소(서열 ID 번호: 13) 및 트랜스사이레틴(transthyretin) 프로모터(서열 ID 번호: 14)의 제어하에 놓여진 리포터 유전자 인간 분비 알칼리 인산가수분해효소를 조절하는 VP16("VP16AD"; 서열 ID 번호: 6)로부터 유래한 전이활성화 도메인에 융합되었다. 상기 유전자 스위치의 각 구성요소는 개별 플라스미드 상에 존재하였다. 수용체 발현은 CMV 프로모터(서열 ID 번호: 15)의 제어하에 있었다. 유도는 리간드가 존재시에 발현되는 리포터 단백질의 양에 의하여 평가되었다.
유전자 스위치의 천공법
마우스의 혈청에의 SEAP 발현은 마우스 사두근(quadriceps) 속으로 유전자 스위치의 천공 이후에 평가되었다. 마우스는 케타민(ketamine: 100 ㎎/㎖) 및 자일라진(xylazine: 20 ㎎/㎖)의 혼합물 2 ㎕/g을 사용하여 마취되었다. 이후 동물의 털을 깎고, DNA 벡터는 2 x 50 ㎕ 폴리글루탐산(12 ㎎/㎖ 물)의 부피로 근육에 주사되었으며, 전극 전도도 겔이 가해졌으며, 전극 캘리버(electrode caliber: 1 ㎝ x 1 ㎝; 모델 384)은 뒷다리에 두었다. 상기 근육은 1 초의 시간 간격으로 20 msec/pulse에서 200 V/㎝로 8 회 전기천공되었다. 횡단 전기장 방향은 상기 동물이 펄스의 절반을 받은 이후에 역전되었다. 전기천공은 BTX Molecular Delivery Systems로부터 구입한 ECM 830 전기천공기를 사용하여 수행되었다.
카이랄 디아실히드라진 리간드를 사용한 처리
일부 실험에서, 마우스는 유전자 스위치의 전기천공 이후 3 일에 DMSO 50 ㎕에 용해된 리간드 2.6 μmol을 복막내로 주사(IP)받았다. 다른 실험에서, 리간드의 농도는 마우스당 DMSO가 26 mmol/50 ㎕로 감소되었다. SEAP 발현은 리간드 투여 이후 2 내지 11 일에 평가되었다. 다른 실험에서, 리간드는 설치류 사료(chow)에 투여되었다. 상기 음식은 아세톤 20 ㎖에 리간드 2 g을 용해시키고 이를 Purina Mills로부터 구한 LabDiet 5010 증기멸균(autoclavable) 사료에 첨가하여 제조되었다. 이를 호바트(Hobart) 혼합기에 철저히 혼합하고 크로스 블렌드(Cross Blend) 혼합기에서 15 분 더 혼합하였다. 동물은 1, 2 및 3 일 동안 임의로(ad libitum) 사료를 섭취하였다. 모든 수치는 4 마리 동물로부터 나온 평균이다. 리간드 첨가 없이 벡터만으로 처리된 동물로부터 나온 혈청에서의 배경 SEAP는 혈청 1 ㎖당 0 내지 11 ng였다.
리포터 검정
마우스 혈청은 작은 유리 모세관으로 안와후방 채혈(retroorbital bleeding)에 의하여 획득한 혈액을 원심분리하여 얻었다. SEAP 정량화는 Clontech Great Escape 화학발광 키트를 사용하고 Clontech SEAP 표준과 비교하여 측정되었다.
RheoSwitch
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Therapeutic System(RTS) 유전자 발현을 유도하는 (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드(실시예 1)의 상대적 체내 유효성을 평가하기 위하여, 12 마리의 C57BL6 마우스가 하기 플라스미드를 사용하여 전기천공되었다: pCMV/GEVY(DEF), pCMV/VP16-Hs-LmRXR 및 p6XGAL4RE-TTR-SEAP. 상기 플라스미드 pCMV/GEVY(DEF)는 효모 GAL4-DBD(aa 1-147)의 하류 융합된 돌연변이 V390I/Y410E/E274V를 보유한 가문비나무잎말이나방 Choristoneura fumiterana EcR로부터 유래하며 CMV 프로모터 및 pBIND 벡터(Promega사, Madison, WI, USA)에서 하류 SV40 폴리아데닐화 신호의 제어하에 놓여있는 야생형 D, E 및 F 도메인으로 구성되어 있다. 제시된 EcR의 DEF 도메인은 5' 및 3' 말단에서 20 내지 25 nt 서열을 바탕으로 설계된 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 제한 효소 부위 BamH 및 Xba I는 각각 5' 및 3' 프라이머에 첨가되었다. PCR 생성물은 적절한 제한 효소로 소화되어 pBIND 벡터 속으로 클로닝되었다(도 20). 상기 벡터 pCMV/VP16-Hs-LmRXR은 VP16-활성화 도메인의 하류 융합되어 있으며 pBIND 벡터에서 CMV 프로모터의 제어하에 놓여있는 인간(Homo sapiens) RXRβ(E 도메인의 나선 1 내지 8) 및 풀무치(Locusta migratoria) RXR(E 도메인의 나선 9 내지 12)로부터 유래한 키메라 RXR을 함유한다(도 21). 유도성 SEAP 리포터 벡터 p6xGAL4RE-TTR-SEAP은 트랜스사이레틴(TTR) 프로모터의 Gal4 반응 구성요소 상류의 카피 6 개로 이루어진 유도성 프로모터의 제어하에 놓여있는 인간 분비 알칼리 인산가수분해효소를 포함한다(도 22). 마우스의 사두근 속으로 플라스미드 DNA의 전기천공을 한 후 3 일째 되는 날에, 3 개의 리간드 제제가 26 nmol/마우스(11.4 ㎍/마우스, 약 570 ㎍/㎏)의 속도로 복강내 주사에 의하여 마우스에게 투여되었다. 마우스 혈청에서 인간 분비 알칼리 인산가수분해효소(SEAP) 발현은 리간드 투여 이후 17 일 동안 모니터링되었다. (S)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드(실시예 31) 및 rac-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 상대적 체내 유효성은 비교를 위해 평가되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, (S)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드(●-●)는 RTS 유전자 리포터 발현을 유도하지 않는다. rac-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드는 적당한 정도의 RTS 유전자 리포트 발현(▲--▲)을 유도한다. (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드(○-○)는 실질적인 RTS 유전자 리포터 발현을 유도한다.
실시예 68
2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 및 라세메이트의 물리적 특성:
체형(Morphic Form): 고체 표본 로트는 도 4에 보고되어 있다. R 거울상이성질체에 대하여, 메탄올/물 또는 톨루엔/헵탄 중 어느 하나로부터 급속 결정화/침전에 의하여 얻어진 표본은 동일한 분말 X-선 회절 패턴(데이터 미도시)를 생성하며, 서로 비교하고 CH3OH 결정화로부터 얻은 표준(165.1 내지 166.5℃)과 비교해 보건대, 필수적으로 동일한 녹는점([톨루엔/헵탄]166.2 내지 167.1℃, [CH3OH/H2O]166.5-167.4℃)을 갖는다. 라세미체에 대하여, 메탄올 증발에 의하여 얻어진 두 개의 다른 제제는 순도에서 실험 오차 및 약간의 변이 내의 동일한 녹는점(170 내지 171℃, 169 내지 170℃)을 보였다. 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 체형은 가장 통상적인 것으로 보인다.
마이크로화 및 입자 크기: 입자 크기를 정규화하기 위하여, 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 및 라세미체는 20 메쉬(mesh)를 통하여 예비선별되고 마이크로화되었다. 입자 크기는 시험 물질 약 20 ㎎을 15 ㎎ 팔콘(Falcon) 튜브 속으로 실측하여 측정되었다. 탈이온수 10 ㎖는 분말에 첨가되었다. 현탁액이 혼합되어 20 분 동안 초음파 분해되었으며, 이후 맬번 마스터사이저(Malvern Mastersizer) 장치를 사용하여 레이저 광 산란에 의하여 입자 크기에 대해 즉시 분석되었다. 입자 분포는 도 5 및 6에 제시되어 있다. 라세미체가 전체적으로 R 거울상이성질체보다 약간 더 큰 입자 크기를 가지는 것처럼 보이지만, 상기 두 표본은 상당히 유사하다.
벌크 및 태핑된 밀도 분석( Bulk and tapped density analysis ): 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 마이크로화된 R 거울상이성질체 및 라세미체의 벌크 밀도는 10 ㎖의 눈금을 새긴 실린더 내의 측정된 중량 및 부피를 사용하여 계산되었다. 마이크로화된 물질의 태핑된 밀도는 상기 물질의 중량 및 태핑된 부피를 사용하여 계산되었다. 상기 태핑된 부피는 탭 밀도 분석기(모델: 스탬프 체적계(Stampvolumeter), JEL에 의한 STAV2003)를 사용하여 계산되었으며, 상기 태핑된 부피가 일정해지는 경우에 기록되었다(도 7). 상기 R 거울상이성질체는 약간 더 낮은 벌크 밀도 및 태핑된 밀도를 가진다. 양쪽 물질 모두 유모성(낮은 벌크 밀도)이다.
열중량 분석/ 시차열 분석( TGA / DTA ) 분석: 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 마이크로화된 R 거울상이성질체 및 라세미체는 열중량 분석/시차열 분석에 의하여 분석되었다. 상기 열중량분석 플롯은 도 8에 제시되어 있다. 양쪽 물질은 DTA 프로파일 상에 흡열 과정을 보였다. 상기 R 거울상이성질체에 대한 개시 온도(163.6℃)는 라세미체의 개시 온도(171.2℃)보다 상당히 더 낮았다. 상기 R 거울상이성질체에 대한 융해열(59.8 uv.s/㎎)도 상기 라세미체의 융해열(80.8 uv.s/㎎)보다 상당히 더 낮았다. 이는 상기 두 물질이 다른 결정질 형태라는 것을 예시하는 것이다. 상기 R 거울상이성질체에 대한 더 낮은 녹는점 및 더 낮은 융해열은 다른 용해도 특성에서 반영되어 있다.
150℃를 초과하여 가열시에, R 거울상이성질체는 총중량의 0.4%를 상기 라세미체는 총중량의 0.8%를 상실한다(도 8). 상기 두 물질에서의 수분 함량(열-제거가능 수분)은 약간 다르다.
동적 증기 흡착 분석: 상기 라세미체는 건조제 조건(20% 상대 습도)에 노출되는 경우에 상당한 중량 손실을 보이지 않은 반면에, 상기 R 거울상이성질체는 표본 운반 또는 저장 동안에 얻은 어느 정도 연관된 수분에 해당할 수 있는 총 중량의 0.9%(데이터 미도시)를 상실하였다. 건조제 조건 하에서 탈수한 이후에, 상기 두 물질은 저(30 내지 40% 상대 습도), 중(50 내지 60% 상대 습도) 및 고(70 내지 80% 상대 습도) 습도에 노출시에 비교할 만한 중량 증가를 보였다. 70% 상대 습도에서, 상기 R 거울상이성질체에 대하여는 중량 증가가 6.3%이며 상기 라세미체에 대하여는 6.2%였는데(데이터 미도시), 이는 양쪽 물질에 대한 중간정도의 흡습성(hygroscopicity)을 의미하는 것이다.
약학적 부형제 내의 용해도: 검정 1: 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 마이크로화된 R 거울상이성질체 및 라세미체의 용해도는 시판되는 부형제 내에서 정성적으로 검정되었다(도 9). 유리 바이알 내에서 10 ㎎/g(시험체/부형제)의 초기 용액/현탁액은 30 초 동안 5 분 간격으로 휘저으면서 상온에서 15 분 동안 초음파분해한 이후에 30 초 동안 3 분 간격으로 휘저으면서 50℃에서 12 분 동안 알루미늄 블록 내에서 가열하여 제조되었다. 이 최초 10 ㎎/g 부형제 표본의 출현을 바탕으로, 2 내지 4 점 농도 연속체(continuum)는 하기 지점들 중 일부에서 상향 또는 하향 표본추출(up or down sampling)에 의하여 스캐닝되었다; 5, 10, 15, 20, 30, 50 ㎎/g(시험체/부형제). 상기 R 거울상이성질체는 상기 R 거울상이성질체 및 상기 라세미체가 비교될 만큼 가용성인 것처럼 보이는 순 폴리소르베이트(polysorbate) 80에 대하여는 제외하고 모든 시험된 약학적 부형제 내에서 라세미체보다 더 가용성이었다(도 9). 상기 표본들 중의 임의의 것에 대하여 색깔에서는 아무런 변화도 관찰되지 않았다. 투명한 유리 바이알에서 일부 제제의 사진이 촬영되었다(미도시).
검정 2: 각각의 부형제에 대하여, 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 또는 라세미체가 도 9 검정에서 불용성인 최저 농도가 확인되었다. 이 동일한 농도에서 양쪽 물질의 현탁액은 바이알에서 제조되었다. 각각의 표본은 상온에서 2.5 시간 이하로 교반되었다(처리 1). 다른 실험으로서, 시험체/부형제 조합은 90℃에서 5 분 동안 또는 필요한 만큼 더 오랜 시간 동안 알루미늄 블록 내에서 가열되었고; 도 10에 표시되어 있고, 상온으로 냉각되며, 소량의 동일한 마이크로화된 물질을 사용하여 살포되었다(처리 2). 물리적 외양은 72 시간 또는 표시된 시간에 기록되었다(도 10). 모든 경우에, 색깔 변화는 관찰되지 않았다. 이 용해도 검정은 최초 입자 크기 및 체형이 무관한 충분히 용해된 조건으로부터 작동한다. R 거울상이성질체는 충분히 용해되어 있는 채를(특히, 가열하지 않고) 유지하며 과포화된 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드 라세미체 용액을 결정질 라세미체의 임의의 체형과 함께 살포시에 침전/결정화를 관찰하면 상기 시험 농도에서 상기 라세미체 및 상기 R 거울상이성질체 사이의 용해도 시차를 알 수 있다. 투명한 유리 바이알에 담긴 제제를 사진 촬영하였다(90℃로 가열하지 않고 검정 1의 조건 하의 R 거울상이성질체 및 90℃ 처리, 냉각 및 살포 이후의 라세미체, 미도시).
검정 3: 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 및 라세미체는 pH 7.0의 증류수에 20% PEG를 ㎖당 분말 1 내지 2 ㎎과 혼합되었다. 상기 혼합물은 37℃에서 배양되었고, 상온에서 약 2 시간 동안 와류시키켰으며, 상온에서 12 시간 더 두었다. 상기 용액은 여과 또는 원심분리되었으며, 농도는 최소 4 점 보정 곡선을 사용한 일반 LC/MS/MS 방법을 이용하여 LC/MS/MS 주사를 2 벌씩 실시하여 정량화되었다(도 11). Loebenberg, R, et al, Solubility as a limiting factor to drug absorption, In: Oral Drug Absorption, J.B. Dressman (Ed), Marcel Dekker, NY, 2000 and Mader WJ, Grady LT, Determination of solubility, Chapter 5 in Techniques of Chemistry, Physical Methods in Chemistry, Vol. 1, Part V, Weisseberger, V.A. Rossiter, B.W., Eds., Wiley, New York, 1971 참조.
검정 4: 용해의 동역학도 생체이용도(bioavailability)를 측정하는데 제한 인자일 수 있지만, 제형 부형제 및 생체액 내에서의 평형 용해도는 약물 생체이용도에 영향을 미친다. 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 및 라세미체의 용해도가 약학적 계면활성제 폴리소르베이트 80의 수용성 제제 내에서 정량적으로 수립되며 이후 밀집된 시험 물질의 고유 용해 속도가 관찰되었다. 0.5%, 1% 및 1.5% 폴리소르베이트 80 용액에서의 라세미체 및 R 거울상이성질체의 혼합물은 2 ㎖ 에펜도르프(Eppendorf) 바이알 내에서 시험 물질 20 +/- 1 ㎎를 더 첨가하고 이후 500 ㎎ 폴리소르베이트 용액을 첨가하여 제조되었다. 상기 혼합물은 120 초 동안 비드로 휘저어졌으며(bead-beaten), 25℃에서 16 내지 24 시간 동안 요동되었으며 Spin-X(0.2 μM)를 사용하여 여과되었다. 상기 여과액의 pH는 기록되었다. 상기 여과액에서의 시험 물질의 농도는 정량 HPLC 분석에 의하여 측정되었다(도 12). 상기 R 거울상이성질체는 1.0 및 1.5% 폴리소르베이트 80 용액에서 2 내지 3배 더 가용성이다. 탈이온수 및 0.5% 폴리소르베이트 80 내에서, 라세미체 및 R 거울상이성질체의 용해도는 비교할 만하다.
다음으로, 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 및 라세미체의 고유 용해 프로파일은 하기 시험 조건에 따라 37℃에서 탈이온수에 용해된 1% 폴리소르베이트 80에 담긴 압축된 펠릿(7 ㎜ 직경, 100 ㎎)을 사용하여 측정되었다:
용기: 1000 ㎖
배지: 탈이온수(0.8 μM 필터를 통해 여과된 진공)에 용해된 1% 폴리소르베이트 80
배지 부피: 1000 ㎖
속력: 100 RPM
온도: 37℃
표본 추출점: 15, 30, 45, 60, 90 및 120 분
표본 추출 부피: 1 ㎖(30 마이크론을 통해 여과된)
분석: HPLC(각각의 로트로부터 표준 시약을 제조
표본 크기: n = 2 펠릿/시험 물질
라세미체 및 R 거울상이성질체의 방출은 최대 120 분의 HPLC에 의한 검출 한계 하에 있다. 120 분 이후에, 양쪽 물질에 대한 펠릿은 상기 매질에서 온전한 채 유지되는 것으로 관찰되었다.
실시예 69
2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 및 라세미체의 세포막 투과 특성:
Caco -2 세포 단일층을 통한 2 방향 투과율(Sambuy Y, et al., The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 2005 Jan; 21(1):1-26 and Artursson P, et al., Caco-2 monolayers in experimetnal and theoretical predictions of drug transport 참조. Adv Drug Deliv Rev. 2001 Mar 1; 46(1-3):27-43):
데이터는 도 13에 도시되어 있다. 상기 시험 화합물은 1% 미만의 최대 DMSO 농도를 갖는 HBSSg 내에서의 5 μM로서 제조되었다. 21 내지 28 일령의 Caco-2 세포의 합류(confluent) 단일층이 제조되었다. 리시버 웰(receiver well)은 변형된 Hanks 완충액 HBSSg에 용해된 1% BSA를 사용하여 제조되었으며 Caco-2의 첨부(apical) 및 기저외측(basolateral) 면은 pH 7.4±0.2에서 유지되었다. 2 개의 단일층은 각 방향으로 투여되었다(N = 2): 상기 첨부면은 (A→B) 평가를 위해 투여되었으며, 상기 기저외측 면은 (B→A) 평가를 위해 투여되었다. 상기 시험 화합물 농도는 최소 4 점 보정 곡선을 사용한 일반적인 LC/MS/MS 방법을 이용하여 120 분의 시점에서 첨부 및 기저외측 면 양쪽 모두에 대하여 측정되었다. 도 13의 수치는 하기와 같다: Caco-2 세포 단일층을 함유하는 Transwell
Figure 112009080717400-pct00132
웰들로부터 시험 화합물의 퍼센트 수거; 양쪽 방향으로의 겉보기 투과율(Paap); 유출량(efflux) 비(Papp B→A)/(Papp A→B); 저(Low) 또는 고(High)로 분류된 시험 화합물의 흡수 잠재력; 유출량 ≥ 및 Paa(B→A) ≥ 1.0 x 10-6 ㎝/s인 경우 유출량 분류는 상당하다. 상기 R 거울상이성질체는 양쪽 방향 모두에서 상기 라세미체보다 투과율이 더 높다. 또한, 상기 R 거울상이성질체에 대한 유출량 속도는 더 낮다.
MDR1 - MDCK 세포를 사용한 혈관 뇌장벽 투과도 잠재력 측정(Taub ME, et al., Functional assessment of multiple P-glycoprotein (P-gp) probe substrates: Influence of cell line and modulator concentration on P-gp activity. Drug Metab Dispos. 2005 Nov; 33(11): 1679-87 and Wang Q, et al., Evaluation of the MDR-MDCK cell line as a permeablity screen for the blood-brain barrier. Int J Pharm. 2005 Jan 20; 288(2):349-59. (Absorption Systems Inc. 회보에서 수정됨):
데이터는 도 14에 도시되어 있다. 상기 시험 화합물은 1% 미만의 최대 DMSO 농도를 갖는 HBSSg 내에서의 5 μM로서 제조되었다. 7 내지 11 일령의 MDR1-MDCK 세포의 합류 단일층이 제조되었다. 리시버 웰은 변형된 Hanks 완충액(HBSSg)에 용해된 1% BSA를 사용하여 제조되었으며 첨부 및 기저외측 면은 pH 7.4±0.2에서 유지되었다. 2 개의 단일층은 각 방향으로 투여되었다(N = 2): 상기 첨부면은 (A→B) 평가를 위해 투여되었으며, 상기 기저외측 면은 (B→A) 평가를 위해 투여되었다. 시험 화합물 농도는 최소 4 점 보정 곡선을 사용한 일반적인 LC/MS/MS 방법을 이용하여 120 분의 시점에서 첨부 및 기저외측 면 양쪽 모두에 대하여 측정되었다. 도 14의 보고된 수치는 하기와 같다: MDR1-MDCK 세포 단일층을 함유하는 Transwell
Figure 112009080717400-pct00133
웰들로부터 시험 화합물의 퍼센트 수거; 양쪽 방향으로의 겉보기 투과율(Paap); 유출량 비(Papp B→A)/(Papp A→B);및 혈관-뇌장벽 투과 잠재력 분류. 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체는 A→B 및 B→A 방향 양쪽 모두에서 라세미체보다 투과율이 더 높다. 또한, R 거울상이성질체는 유출량이 더 적다. 상기 R 거울상이성질체는 상기 뇌장벽을 중간 정도로 투과하는 것으로 분류된 반면에, 라세미체는 저(low)로 분류되었다. 혈관-뇌장벽 투과가 높으면 높을수록 중추신경계(CNS) 투과가 요구되는 의료적 표시에 대하여 상당한 장점이 된다.
실시예 70
2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 마이크로솜 대사(P, et al., Utility of metabolic stability screening: comparison of in vitro and in vivo clearance. Xenobiotica. 2001 Aug-Sep; 31(8-9):591-8 and Lin JH, et al., Role of pharmacokinetics and metabolism in drug discovery and development. Pharmacol Rev. 1997 Dec; 49(4):403-49 참조)
상기 시험 화합물은 DMSO(0.25% 미만 농도), 메탄올 또는 아세토니트릴의 5 μM 용액으로 제조되었다. 혼성 인간 간 마이크로솜은 10 이상의 제공자로부터 혼주(pooled)되었으며, 1 mM NADPH를 사용하여 배양되었다. 상기 시험 화합물은 1 mM NADPH를 사용한 마이크로솜 단백질 1.0 ㎎/㎖를 함유하는 완충액 내의 37℃에서 배양되었다. 0 분 및 60 분에서, 상기 혼합물이 표본추출되었으며 10 내지 100%의 범위로 상기 시험 화합물에 따른 피크 영역 여부를 위해 LC/MS/MS에 의하여 모니터링되었다. 상기 검정은 2 벌씩 수행되었다(N = 2 개별 배양). 도 15에 보고된 데이터는 테스토스테론(testosterone) 표준의 잔여 퍼센트 및 상기 화합물의 잔여 퍼센트이다. R 거울상이성질체는 라세미체보다 인간 간 마이크로솜에서 대사에 대해 약간 더 안정적이다.
실시예 71
2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 및 라세미체의 생체이용도
라브라졸 내의 화합물이 의도된 인간의 투여 경로인 경구 가바즈(gavage)에 의하여 C57BL/6N:Crl(야생형) 쥐(Charle River Laboratories)로 투여되었다. 투여량은 3, 10, 30 또는 50 ㎎/㎏/일 및 2.5 ㎖/㎏/용량으로 설정되었다(도 16). 1회 용량은 9 일(제1 그룹당 18 개 암컷) 또는 12 일(제2 그룹당 18 개 암컷) 동안 투여되었다(도 16). 혈액은 9-일 및 12-일 시점에 채취되었다. 농도는 역상 HPLC에 의하여 정량화되었다.
각 농도에 대하여, 상기 표본은 비이커에 담긴 고체 R 거울상이성질체 또는 라세미체에 라브라졸을 첨가하고, 초음파 분해하여 눈에 보이는 덩어리를 쪼개며 균일한 외양이 생기게 될 때까지 자석 교반을 하여 제조되었다. 상기 혼합물은 눈금이 새겨진 실린더로 옮겨졌으며 상기 비이커의 라브라졸 린스를 사용하여 필요한 부피로 최상층을 증류시켰다. 상기 실린더의 내용물은 거꾸로 돌려 혼합하고 투여할 때까지 자석으로 교반되었다.
이 라브라졸 투여 제제는 비-마이크로화된 라세미체를 제외한 마이크로화된 R 거울상이성질체를 활용하였다. 상기 비-마이크로화된 라세미체 시편이 라브라졸에서의 그 용해 속도를 편향(bias)할 수 있는 가능성을 해결하기 위하여, 독립된 실험이 수행되었다. 본 실험에서, 마이크로화된 라세미체 및 비-마이크로화된 라세미체의 20 ㎎/㎖ 제제의 용해도 및 외양이 조사되었다. 마이크로화된 라세미체, 비-마이크로화된 라세미체 및 마이크로화된 R 거울상이성질체(로트 번호REH-28-4-2)는 각각 라브라졸에 현탁되고, 손으로 휘저어졌으며, 이후 브랜손(Branson) 2100 테이블 탑(table top) 소니케이터에서 중간에 손을 이용하여 휘저어주며 25 내지 28℃에서 3x5 분 간격 및 1x10 분 간격으로 초음파 분해되었다. 상기 R 거울상이성질체는 용이하게 용해되는 반면에 상기 마이크로화된 라세미체 및 비-마이크로화된 라세미체 혼합물은 현탁된 고운 입자로 흐린 상태를 유지하였다(사진 미도시). 시각 검사에 의하여 마이크로화된 라세미체 및 비-마이크로화된 라세미체 표본에서 용해되지 않은 물질의 양은 실질적으로 동일하였다. 현미경검사(도 17)에 의하여 마이크로화된 라세미체 및 비-마이크로화된 라세미체 현탁액 양쪽 모두에서의 대부분의 입자는 25 마이크론 미만이라는 것으로 드러났다(도 17). 크기가 더 큰 결정 단편이 상기 비-마이크로화된 표본에 남아 있었다. 라세미체의 마이크로화된 표본 및 비-마이크로화된 표본 양쪽 모두가 용해되지 않은 물질을 비슷하게 남겨 두기 때문에, R 거울상이성질체 및 라세미체 라브라졸 제제 사이의 가장 큰 차이는 용질의 최초 입자 크기보다는 고유 용해도인 것으로 보인다.
시간의 함수로서 마우스 혈청 레벨은 수량 HPLC에 의하여 측정되었다. 라브라졸 내에서 상기 R 거울상이성질체는 30 및 50 ㎎/㎏/일(12 및 20 ㎎/㎖ 라브라졸 투여분) 이라는 고용량에서 상당히 더 높은 혈청 레벨에 이른다. 라세미체 혈청 레벨은 실질적으로 더 낮게(4 내지 5 배 AUC 미만) 유지된다(도 18 및 19). 라세미체 및 R 거울상이성질체 사이의 최초 입자 크기 차이는 혈청 레벨 차이 부분에 해당한다. 또한, 라브라졸 내에서 상기 라세미체에 대한 상기 거울상이성질체의 고유 용해도가 크면 클수록 혈청 레벨 차이 분에 해당할 수 있다. 또한, 혈청 레벨 차이는 막 투과율(Caco-2 세포 및 MDCK 세포 실험당; 도 13 및 14), 흡수, 분포 또는 배설에서의 차이에 기인한 것일 수 있다.
실시예 72
유전자 변형 종양 세포로부터 형질전환 유전자 IL-12 생성의 체내 유도를 위한 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 R 거울상이성질체 및 라세미체의 비교
본 실시예에서 시험된 형질전환 유전자는 RTS의 제어하에 있는 쥐 IL-21였다. 마우스 흑색종 세포(B16)은 RTS의 제어하에 있는 쥐 IL-12 형질전환 유전자를 보유한 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-mIL-12로 형질도입되었다. 상기 세포는 C57BL/6 마우스(B16 세포와 조직친화성) 속으로 경피적으로(s.c.) 주사되고 상기 마우스는 R 거울상이성질체 및 라세미체 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드를 다른 용량으로 3 일 동안 처리되었다. 대조 그룹은 형질도입되지 않은 B16 세포 및 더 높은 용량의 리간드를 받은 마우스 및 상기 형질도입된 B16 세포는 받지만 리간드를 받지 않은 다른 그룹을 포함하였다. 상기 리간드에 의하여 직접적으로 유도된 형질전환 유전자 발현을 평가하기 위하여, 종양 및 혈청은 경피 주사 이후 72 시간에 각 그룹의 마우스의 절반으로부터 채집되었다. 종양 추출물 및 혈청은 제조되어 ELISA에 의하여 IL-12에 대하여 검정되었다.
잔여 마우스는 리간드 투여가 나머지 72 시간 동안 단절되는 경우에 형질전환 유전자 턴-오프(turn-off)를 시험하는데 사용되었다. 결과는 상기 리간드의 라세미체 및 R 거울상이성질체로 처리된 마우스에서 종양 및 혈청 레벨에 있어서 형질전환 유전자 IL-12 발현의 차이를 나타낸다. 상기 리간드 투여의 단절로 인해 모든 그룹에서의 형질전환 유전자 턴-오프를 유사한 방식으로 가져오게 하였다.
물질 및 방법: B16 세포는 Ad.-RTS-mIL-12(MOI = 100)로 시험관 내에서 감염되었다. 48 시간 이후에, 5 x 105 개(B16, 오른쪽 플랭크) 세포가 C57 BL/6 마우스(10 마우스/그룹) 속으로 s.c. 주사되었다. 상기 R 거울상이성질체 및 라세미체 리간드는 10 ㎎/㎖ 혼합물을 50℃에서 5 분 동안 가열하여 라브라졸에 용해되었다. 양쪽 리간드는 시각 검사를 바탕으로 라브라졸에 용해되었다. 활성 리간드는 하기 용량(0 ㎎/㎏; 3 ㎎/㎏; 10 ㎎/㎏; 30 ㎎/㎏ 및 50 ㎎/㎏)으로 3 일 동안 경구 가브즈를 통하여 제공되었다. 다른 대조 그룹은 리간드만 받은 B16-보유 마우스(3 일 동안 50 ㎎/㎏/일을 받은 마우스 및 미처리 종양-보유 마우스)를 포함한다. 조직은 인산완충식염수 총 1 ㎖에 균질화되었다. 용해질/혈청은 -80℃에서 냉동보존되었다. 다른 5 마우스/그룹은 리간드를 더 투여하지 않고 72 시간 더 방치되었다. 상기 다른 5 마우스/그룹은 종양 병변 및 제대혈에 대한 분리를 위해 수거되었다. 조직은 상기와 같이 균질화되었고, 냉동보관되었으며 용해질/혈청은 -80℃에서 냉동보관되었다. 시편은 37℃ 수조에서 해동되었으며 특이적 ELISA(BD-Pharmingen)를 사용하여 mIL-12p70 및 종양으로의 CTL 트래피킹(trafficking)에 중요한 결과적인(corollary) IL-12 의존성 시토카인인 mIFN-γ에 대하여 분석되었다.
결과: 혈청 레벨뿐만 아니라 종양에서의 형질전환 유전자 IL-12 발현은 상기 리간드 양쪽 모두에 대한 용량 의존성 패턴을 따랐다(도 24 및 25). 그러나, 발현 레벨은 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드로 처리된 마우스에서 2.5 내지 3 배 더 높았다. 이 패턴은 종양 추출물 및 혈청에서 관찰되었다. 마우스가 리간드의 최대 용량에 더하여 형질도입되지 않은 B16 세포 또는 리간드 투여 없는 형질도입된 B16 세포 중 어느 하나를 받은 대조 그룹은 임의의 IL-12 발현을 보이지 않았다. 리간드 처리가 3 일 동안 단절된 그룹에서, 발현 레벨은 모든 처리 그룹에서 유사한 비율로 떨어졌는데, 이는 상기 리간드가 추출되는 경우에 상기 리간드는 제거되고 RTS 활성화는 가역적이라는 것을 의미하는 것이다. 상기 IFN-γ 레벨이 종양 및 혈청에서 검정되는 경우에, R-거울상이성질체 그룹은 향상된 발현을 명백히 보여주었다.
실시예73
2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드를 포함하는 약학적 조성물
표 1은 2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드, PL90G, 비타민 E TPGS, BHT 및 Miglyol 812N을 포함하는 약학적 조성물을 보여준다. PL90G는 대두로부터 고도로 정제한 포스파티딜콜린이다. PL90G의 제조자는 Lipoid사의 자회사인 PHOSPHOLIPID GmbH이다. 비타민 E TPGS는 GRAS(일반적으로 안전하다고 인정되는) 화합물이며 현재 미국 국가처방전(National Formulary: NF)의 모든 요구사항을 준수한다. Miglyol 812N은 분획된 식물 C8 및 C10 지방산의 트리글리세리드를 함유한다. Miglyol 812N의 생성에 사용된 지방산은 GRAS로 분류되며 중간-사슬 트리글리세리드에 대한 현재 NF 및 EP 특수연구서(monograph) 요구사항을 충족하고 있다. BHT[MeC6H2(CMe3)2OH]는 항산화제 음식 첨가물로 널리 사용되는 지용성(지방-가용성) 페놀이다. 상기 제형은 경질 젤라틴 캡슐 속으로 분배되었다.
실시예 74
동물 질병 모델에서의 치료효능
RTS 및 mIL-12 또는 hIL-12를 각각 인코딩하는 아데노 바이러스로 형질도입된 쥐 또는 인간 수지상 세포(DCs)는 (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 존재하에 시토카인을 용량 의존적 방식으로 시험관 내에서 발현시킨다. (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드이 부재하는 경우, IL-12 발현은 기저 레벨에 있다.
쥐 인터류킨-12 p70(DC-SP1(IL-12p70))을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 종양 내적으로 전달된 DC의 항-종양 치료효능에 대한 (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 다양한 투여 경로 및 용량의 비교 분석은 B16 흑색종 마우스 모델에서 수행되었다. 결과에 의하면 항-종양 치료효능은 복강내(i.p.) 주사, 경구 가바즈 또는 식이 혼합물(diet admix)에 의하여 투여된 (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드와 병용한 (DC-SP1(IL-12p70)) 요법을 이용하여 증명되었음을 보여주었다. 최적 항-종양 효과는 (DC-SP1(IL-12p70)) 요법과 함께 투여된 30 ㎎/㎏ (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드 용량에서 발생하였다.
치료 개시 이전에 마우스가 종양을 접종받은 쥐 B16 흑색종 모델(C57/BL6 마우스가 B16 세포를 경피적으로 주사 받아서 종양을 형성함)에서, 상기 종양으로 주사된 쥐 IL-12 유전자를 보유한 형질도입된 AdDC는 종양의 완전한 퇴행을 중재하였으며 AdDC 주사 이후 48 시간 이내에 (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드의 전신 투여에 의존하는 동물 생존을 연장시켰다. 이러한 약물 의존 효과는 하기 사항과 연관되었다: 종양 및 DLN에서의 형질전환 유전자 발현; 종양 마이크로환경에서의 연장된 Ad-DC 생존; DLN에서의 AdDC의 이동 및 잔존(persistence); 및 항 B16 CD8+ T 세포의 유도.
상기 쥐 B16 흑색종 모델에서, (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드로 13 일간의 처리와 병용한 107 개 AdDC의 주사로 이루어진 종양내 요법은 종양-특이적인 보호 면역성을 보여주었다. 무종양 동물이 면역성을 다시 시험받는(rechallenged) 경우에, 상기 동물은 MC38 결장 결장암이 아닌 B16 흑색종에 저항하여 진전이 있다.
실시예 75
RTS 및 hIL-12를 보유한 복제 불능 재조합 아데노바이러스(replication incompetent recombinant adenovirus)
도 23은 E1 및 E3 영역은 결실되었고 RTS-IL12 성분은 E1 영역을 교체하는 Ad-RTS-hIL-12의 도해적 재현이다(도 23은 축적으로 그려지지 않는다). 도 23에 사용된 용어는 하기의 의미를 갖는다:
RTS - IL -12: RheoSwitch
Figure 112009080717400-pct00134
Therapeutic System의 제어하에 인간 IL-12
P reg : 활성화된 약물에 의하여 조절된 IL12 발현을 구동하는 프로모터
hIL -12: IRES 서열에 의하여 분리된 인간 IL-12의 p40 및 p35 소단위체에 대한 코딩 서열
polyA: 폴리아데닐화 신호
P ubC : 유비퀴틴 C 프로모터
VP16 - RXR: VP16 전사 활성화 도메인 및 키메라 RXR 사이의 융합
IRES: 내재 리보솜 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site)
Gal4 - EcR: Gal4 DNA 결합 도메인 및 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인 사이의 융합 단백질
Ad: E1 및 E3 유전자 결실을 함유하는 아데노바이러스-5 골격
재조합 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-hIL-12는 Anderson et al., Gene Therapy, 4: 1034-1038 (2000)에 기술된 바와 같이 제조된다. 상기 Ad-RTS-hIL-12 벡터는 하기와 같은 방식으로 생성된다. EMCV-IRES(내재 리보솜 진입 부위)에 의하여 분리된 VP16-RXR 및 Gal4-EcR 수용체 융합 단백질에 대한 코딩 서열은 인간 유비퀴틴 C 프로모터(항상 프로모터)의 제어하에 아데노바이러스 셔틀 벡터 속으로 삽입된다. 이후, 합성 유도성 프로모터의 제어하에 놓여있는 IRES에 의하여 분리된 hIL-12의 p40 및 p35 소단위체에 대한 코딩 서열은 상기 C 프로모터 및 상기 수용체 서열의 상류로 삽입된다. 상기 셔틀 벡터는 좌측 말단으로부터 mu16에 이르기까지 아데노바이러스 혈청형 5 개 서열을 함유하는데, 여기서부터 상기 E1 서열은 결실되며 상기 RTS 및 IL-12 서열(RTS- hIL-12)에 의하여 교체된다. 상기 RTS-hIL-12를 보유하는 셔틀 벡터는 리간드 의존성 IL-12 발현용 HT-1080 세포에서 일시적 핵산전달감염에 의하여 시험된다. 상기 셔틀 벡터는 이후 HEK 293 세포로의 공동형질감염(cotransfection)에 의하여 상기 E3-결실된 아데노바이러스 골격과 함께 재조합되어 재조합 아데노바이러스 Ad-RTS-hIL-12를 얻게 된다. 임상급 아데노바이러스 벡터는 cGMP 설비(facility)에서 생성된다.
실시예 76
hIL-12 형질전환 유전자 및 Rheoswitch
Figure 112009080717400-pct00135
Therapeutic System을 함유하는 아데노바이러스에 의한 자가 면역 수지상 세포의 형질 도입
백혈구분반술(leukaphresis)에 의한 PBMC 의 수거: 피검자는 Hillman 외래환자 CTRC에서 90 내지 120 분의 백혈구분반술을 거친다. 상기 백혈구분반술 절차는 한쪽 팔의 정맥으로부터 혈액의 제거; 구성성분이 분리되고 하나 이상의 구성요소가 제거되는 원심분리기(세포 분리기)를 통한 혈액의 통과; 및 상기 피검자의 동일 팔 또는 나머지 다른 팔의 정맥에의 잔류 성분의 회수를 포함한다. 상기 피검자의 총 혈액 부피의 15% 정도가 혈액이 상기 세포 분리기 장치를 통해 처리되는 과정에서 임의의 시간에 채혈된다. 상기 세포 분리기에서, 혈액은 혈장, 혈소판, 백혈구 및 적혈구로 분리된다. 백혈구(WBC)는 제거되며 다른 모든 성분들은 상기 피검자의 순환계로 되돌려진다. 본 절차를 위해 두 개의 말초 IV 선을 사용하는데 모든 시도를 다한다. 그것이 가능하지 않다면, 중추선(central line)이 필요할 수 있다. 상기 피검자는 백혈구분반술를 거치도록 외과의가 승인하여야 하며, 상기 절차 이전에 활력 증상(혈압 포함) 여부에 대하여 일상적으로 선별받아야 한다.
처리: 채집 이후에, 백혈구분반술패키지(leukapack)는 손으로 CPL에게 전달되었으며 ELUTRATM에서 원심분리 세광(elutriation)에 의하여 즉시 처리된다. 이는 임상용으로 입증된 폐쇄 시스템이다. 단핵구 분획이 수거되며, 세포의 회수 및 생존력이 입증된 이후에, 이 세포들은 IL-4 및 GM-CSF이 존재하는 6 일 배양을 위해 아스트롬(Aastrom) 카트리지로 옮겨졌다. 모든 처리 및 세척 절차는 살균 조건하에서 수행된다.
최초 플레이팅 ( Initial plating ): 단일 백혈구분반술패키지로부터 회수된 단핵구는 트립판 블루 염료의 존재하에 계수되어 생존한 세포의 수를 측정하였다. 단핵구는 유동 세포계측기에 의하여 순도에 대해 평가되었다. 단핵구는 SOP-CPL-0166 당 IL-4를 1,000 IU/㎖ 그리고 GM-CSF를 1,000 IU/㎖ 함유하는 무혈청 및 무항생제 CellGenix 배지에 현탁되며 아스트롬 카트리지 내에 놓인다. 카세트 접종을 위해 50 ㎖의 최소 적재 부피 및 최소 세포수가 요구된다.
배양: 상기 아스트롬 카트리지는 미성숙 DC 발생을 위한 충분히 폐쇄된 cGMP-친화 자동화 배양 장치인 Replicell System의 배양기 내에 놓인다.
미성숙 DC 수거: 6일째 되는 날, 상기 아스트롬 카트리지는 상기 배양기로부터 제거되어 미성숙 CD가 수거된다. 상기 세포는 1,500 rpm으로 원심분리되고, CellGenix 배지에서 세척되고, 트립판 블루 염료가 있는 곳에서 계측되며, 형태학적 및 표현형적인 특징 여부에 대하여 검사된다.
생존도: 이는 트립판 블루가 있는 곳에서 혈구계(hemocytometer) 세포 계측을 수행하여 측정된다. 일반적으로, 수거된 세포의 95%를 초과하는 수가 생존한다, 즉, 트립판 블루 염료를 배제한다. 생존도가 70% 미만이라면, 미성숙 DC는 폐기될 것이다.
표현형검사(Phenotyping): 배양으로 발생된 세포는 혈구계 상에서 현미경 관찰에 의하여 계측되며, 트립판 블루 염료를 사용하여 예비 시차 계측(DC 대 림프구)이 구해진다. 상기 시차 계측은 DC 대 림프구에 관하여 게이트하고(gating) 확인 기준으로서 미성숙 DC의 높은 전진 및 측면 산란 특성을 이용하는 유동 세포계측에 의하여 확인된다. 미성숙 DC는 통상적으로 수지상 세포 형태를 갖는 세포를 80% 초과하여 함유하며 DC 표현형을 갖는다.
IL -12 p70 역가 검정: 성숙한 DC(mDCs)는 고유한 면역 신호(예컨대, LPS)를 첨가하거나 첨가하지 않고 동시 또는 CD40L로의 활성화 경우에 IL-12p70을 생성하는 능력을 갖는 것으로 입증되었다. 표준화된 IL-12p70 생성 검정은 최근에 수립되었으며 다양한 조건 하에서 발생된 DC 백신의 작은 표본 또는 큰 로트에 적용할 수 있다. 현재 역가 검정은 우선 감응자(responder) DC를 인간 CD40 리간드 유전자를 자극인자로서 안정적으로 핵산전달감염된 J588 리프종 세포와 함께 공동 배양하는 단계를 포함하는 2 개의 구별된 단계로 이루어져 있다. 제2 단계는 상기 공동 배양물로부터 유래한 상청액을 루미넥스(Luminex) 시스템에서 J558/CD40L +/- LPS로 자극된 DC에 의하여 분비된 IL-12p70의 레벨에 대하여 시험하는 단계를 포함한다. 본 역가 검정은 18.5% (n=30)의 인터-검정(inter-assay) CV 및 IL-12p70 생성의 매우 다른 레벨에 의하여 특징되는 다양한 DC 생성물의 평가를 용이하게 하는 넓은 동적 범위를 갖는다. 13 명의 정상 기증자의 단핵구로부터 발생된 DC 생성물을 사용하여 수립된 검정에 대한 정상 범위는 270 pg/㎖의 평균을 갖는 8 내지 999 pg/㎖였다.
실시예 77
미성숙 DC의 아데노바이러스 형질도입
미성숙 DC는 수거되고, 계측되며 생존도에 대하여 시험된다. 약 6-7 x 107 DC가 최적한 바이러스성 흡착 시간(최종적으로 2 시간 내지 4 시간 사이) 동안 아데노바이러스 벡터를 사용하여 최적 감염 다수(최적 MOI, 최종적으로 500 내지 1000 사이)로 형질도입된다. 형질도입 이후, 상기 세포는 반복적으로 세척되어 임의의 미흡착 바이러스 입자를 제거하였다. 불임성, 내독소, 미코플라즈마, DC 표현형 및 IL-12 형질전환 유전자 도입 검정을 위해 분취량이 유보된다. 방출 시험이 완료될 때까지 5 x 107 개 세포의 표적 용량이 4℃ 식염수에 유지된다.
모든 방출 시험을 통과한 형질도입된 DC(AdDCs) 하기에 기술된 바와 같이 환자 투여용으로 진료소에 전달된다.
형질도입된 AdDCs에 의한 IL-12 형질도입 유전자 유도의 시험관 내 시험은 이용가능한 결과를 위해 최소 2 일의 시간이 걸리며 따라서, (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드에 반응하여 생성된 IL-12 생성은 상기 AdDCs의 종양내 주사를 위한 방출 기준이 아닐 것이다. 그러나, 3 명의 건강한 지원자로부터 유래된 AdDCs를 사용한 예비 연구를 바탕으로, 상기 (R)-2-에틸-3-메톡시-벤조산 N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라자이드에 반응하여 유도된 IL-12 발현은 24 시간에 백만 개의 세포당 80 내지 300 ng IL-12의 표적 범위 내에서 달성된다(80 ng/백만 세포/24 시간의 발현 레벨은 3 가지 AdDC 제제 중 2 곳에서 관찰되었다). 그러므로, 상기 시험관 내 IL-12 유도 결과는 처리 결과의 분석을 위해 사용된다. 상기 형질도입된 AdDCs는 그 자체로 바이러스 형질도입 및 세척 이후에 주사용으로 사용된다. 임의의 여분의 형질도입되지 않은 DC 및 형질도입된 DC는 필요하다면 장래 분석을 위해 냉동보존된다.
상기 AdDCs의 환자에게로 투여: 150 마이크로리터의 부피로 1회 주사 당 약 5 x 107 세포(또는 시험 피검자로부터 약 90%의 DC 수율)을 함유하는 0.9% 식염수 용액에 AdDCs의 단독 종양내 주사. 피검자는 주사당 5 x 107 개 세포를 초과하지 않은 AdDCs의 최대 가능 용량으로 투여되어야 한다.
실시예 78
단계 III 및 IV 흑색종 피검자에 RheoSwitch
Figure 112009080717400-pct00136
Therapeutic System의 제어하에9 hIL-12를 발현하도록 처리된 아데노바이러스적으로 형질도입된 자가 수지상 세포의 인간 투여
코호트(cohort) 1은 12 명의 피검자로 이루어지며 코호트 2는 28 명의 피검자로 이루어질 것인데, 모두 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드의 최초 용량 이후 약 24 시간에 형질도입된 자가 AdDCs의 단독 종양내 주사를 받을 것이다. 코호트 1 피검자는 3 명의 피검자로된 4 개 그룹(A, B, C, D)로 배치되어 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드의 증가된 용량을 받을 것이다. 코호트 2 피검자는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드(코호트 1로부터 측정된 바와 같이)의 최대 허용 경구 용량을 받을 것이다. AdDCs 주사를 받은 즉시, 피검자는 13 개의 다른 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드 일일 용량으로 처리될 것이다. AdDCs의 주사 이후 코호트 1의 각 그룹에 있는 모든 피검자를 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드의 다음 단계 고농도 용량을 받도록 등록하기 이전 최대 1 달 동안 안전성, 내성 및 형질전환 유전자 기능이 코호트 1의 각 그룹에 있는 모든 피검자에 대하여 평가될 것이다. 코호트 1이 입원환자 치료 단계를 완료한 후 13 일 및 형질도입된 자가 수지상 세포의 종양내 주사 이후 적어도 6 내지 8 주에 상기 피검자가 재치료를 원하고 재치료의 기준을 충족시키면 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드의 연속 14 일 용량과 함께 CDs의 추가 주사가 투여될 수 있다. (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드의 용량(0.01 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏ 또는 10.0 ㎎/㎏)의 용량은 코호트 1의 최대 허용 용량일 것이다.
환자는 신체 검사(ECOG 수행 상태 포함), 활력 증상, 혈청 화학, 소변분석, 혈액학(hematology), 부작용, RheoSwitch
Figure 112009080717400-pct00137
Therapeutic System의 아데노바이러스 벡터 및 성분에 대한 항체 및 세포 면역 반응에 의하여 평가될 것이다. 경구 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드 및 그 주요 대사산물의 단독 투여 및 정상-상태 약동학/ADME, 표적 종양 및/또는 배수 림프절(draining lymph nodes)의 생검에서 hIL-12 레벨의 측정을 통한 형질전환 유전자의 분석, 표적 종양, 배수 림프절 및 말초 순환의 생검에서 세포 면역 반응(T 세포)의 측정에 의한 면역학적 효과의 평가 및 혈청 시토카인 프로파일도 평가될 것이다.
앞서 기술된 실시예 및 예시사항은 본 발명의 범위를 임의적으로 한정하려는 의도는 아니며, 본 명세서에 제시된 청구의 범위는 본 명세서에 명시적으로 제시되었나의 여부에 상관없이 모든 실시예 및 예시사항을 포함하는 의도인 것을 알아야 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> INTREXON CORPORATION HORMANN, Robert Eugene LI, Bing <120> CHIRAL DIACYLHYDRAZINE LIGANDS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF EXOGENOUS GENES VIA AN ECDYSONE RECEPTOR COMPLEX <130> 2584.001PC01 <140> PCT/US2008/006757 <141> 2008-05-29 <150> US 12/155,111 <151> 2008-05-29 <150> US 60/940,525 <151> 2007-05-29 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1054 <212> DNA <213> Chorietoneura fumiferana <400> 1 cctgagtgcg tagtacccga gactcagtgc gccatgaagc ggaaagagaa gaaagcacag 60 aaggagaagg acaaactgcc tgtcagcacg acgacggtgg acgaccacat gccgcccatt 120 atgcagtgtg aacctccacc tcctgaagca gcaaggattc acgaagtggt cccaaggttt 180 ctctccgaca agctgttgga gacaaaccgg cagaaaaaca tcccccagtt gacagccaac 240 cagcagttcc ttatcgccag gctcatctgg taccaggacg ggtacgagca gccttctgat 300 gaagatttga agaggattac gcagacgtgg cagcaagcgg acgatgaaaa cgaagagtct 360 gacactccct tccgccagat cacagagatg actatcctca cggtccaact tatcgtggag 420 ttcgcgaagg gattgccagg gttcgccaag atctcgcagc ctgatcaaat tacgctgctt 480 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ccccagctca 180 ccaaatgacc ctgttaccaa catctgtcaa gcagcagaca agcagctctt cactcttgtg 240 gagtgggcca agaggatccc acacttttct gagctgcccc tagacgacca ggtcatcctg 300 ctacgggcag gctggaacga gctgctgatc gcctccttct cccaccgctc catagctgtg 360 aaagatggga ttctcctggc caccggcctg cacgtacacc ggaacagcgc tcacagtgct 420 ggggtgggcg ccatctttga cagggtgcta acagagctgg tgtctaagat gcgtgacatg 480 cagatggaca agacggagct gggctgcctg cgagccattg tcctgttcaa ccctgactct 540 aaggggctct caaaccctgc tgaggtggag gcgttgaggg agaaggtgta tgcgtcacta 600 gaagcgtact gcaaacacaa gtaccctgag cagccgggca ggtttgccaa gctgctgctc 660 cgcctgcctg cactgcgttc catcgggctc aagtgcctgg agcacctgtt cttcttcaag 720 ctcatcgggg acacgcccat cgacaccttc ctcatggaga tgctggaggc accacatcaa 780 gccacc 786 <210> 12 <211> 1560 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg aggctacagc tctccctggg catcatccca 60 gttgaggagg agaacccgga cttctggaac cgggaggcag ccgaggccct gggtgccgcc 120 aagaagctgc agcctgcaca gacagccgcc aagaacctca tcatcttcct gggcgatggg 180 atgggggtgt ctacggtgac agctgccagg atcctaaaag ggcagaagaa ggacaaactg 240 gggcctgaga tacccctggc catggaccgc ttcccatatg tggctctgtc caagacatac 300 aatgtagaca aacatgtgcc agacagtgta gccacagcca cggcctacct gtgcggggtc 360 aagggcaact tccagaccat tggcttgagt gcagccgccc gctttaacca gtgcaacacg 420 acacgcggca acgaggtcat ctccgtgatg aatcgggcca agaaagcagg gaagtcagtg 480 ggagtggtaa ccaccacacg agtgcagcac gcctcgccag ccggcaccta cgcccacacg 540 gtgaaccgca actggtactc ggacgccgac gtgcctgcct cggcccgcca ggaggggtgc 600 caggacatag ctacgcagct catctccaac atggacattg acgtgatcct aggtggaggc 660 cgaaagtaca tgtttcgcat gggaacccca gaccctgagt acccagatga ctacagccaa 720 ggtgggacca ggctggacgg gaagaatctg gtgcaggaat ggctggcgaa gcgccagggt 780 gtccgttatg tgtggaaccg cactgagctc atgcaggctt ccctggaccc gtctgtgacc 840 catctcatgg gtctctttga gcctygagac atgaaatacg agatccaccg agactccaca 900 ctggacccct ccctgatgga gatgacagag gctgccctgc gcctgctgag caggaacccc 960 cgcggcttct tcctcttcgt ggagggtggt cgcatcgacc atggtcatca tgaaagcagg 1020 gcttaccggg cactgactga gacgatcatg ttcgacgacg ccattgagag ggcgggccag 1080 ctcaccagcg aggaggacac gctgagcctc gtgactgccg accactccca cgtcttctcc 1140 ttcggaggct accccctggg agggagctcc atcttcgggc tggcccctgg caaggcccgg 1200 gacaggaagg cctacacggt cctcctatac ggaaacggtc caggctatgt gctcaaggac 1260 ggcgcccgac cggatgttac cgagagcgag agcgggagcc ccgagtatcg gcagcagtca 1320 gcagtgcccc tggacgaaga gacccacgca ggcgaggacg tggcggtgtt cgcgcgcggc 1380 ccycaggcgc acctggttca cggcgtgcag gagcagacct tcatagcgca cgtcatggcc 1440 ttcgccgcct gcctggagcc ctacaccgcc tgcgacctgg cgccccccgc cggcaccacc 1500 gacgccgcgc acccgggtta ctctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga 1560 <210> 13 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic response element <400> 13 gcggagtact gtcctccgag cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg 60 gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcg 117 <210> 14 <211> 136 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 cttttgttga ctaagtcaat aatcagaatc agcaggtttg gagtcagctt ggcagggatc 60 agcagcctgg gttggaagga gggggtataa aagccccttc accaggagaa gccgtcacac 120 agatccacaa gctcct 136 <210> 15 <211> 659 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 15 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgaggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaact 659 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ecdysone receptor <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is Glycine or Threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X is Cysteine or Alanine <400> 16 Arg Arg Gly Xaa Thr Cys Ala Asn Thr Gly Ala Xaa Cys Tyr Tyr 1 5 10 15 <210> 17 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ecdysone receptor <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is one or more spacer nucleotides <400> 17 aggtcanagg tca 13 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ecdysone receptor <400> 18 gggttgaatg aattt 15

Claims (47)

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  9. (R)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르((R)-N'-(1-tert-Butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester);
    (R)-N'-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 터트-부틸 에스테르((R)-N'-(1-tert-Butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid tert-butyl ester);
    (R)-N'-(1-터트-부틸-4-히드록시-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라진카르복실산 벤질 에스테르((R)-N'-(1-tert-Butyl-4-hydroxy-butyl)-N'-(3,5-dimethyl-benzoyl)-hydrazinecarboxylic acid benzyl ester);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-벤조일-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-benzoyl-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-fluoro-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(2-브로모-벤조일)-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-(2-bromo-benzoyl)-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-chloro-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-ethyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-chloro-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-difluoro-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2,6-디클로로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,6-dichloro-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,4-디메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,4-dimethoxy-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,5-difluoro-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3,5-dimethoxy-4-methyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메틸-벤조[1,3]디옥솔-5-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzo[1,3]dioxole-5-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(5-메틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(5-methyl-2,3-dihydro-benzo[1,4]dioxine-6-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(5-ethyl-2,3-dihydro-benzo[1,4]dioxine-6-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(나프탈렌-1-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(naphthalene-1-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(나프탈렌-2-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(naphthalene-2-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(티오펜-2-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(thiophene-2-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2.5-디메틸-퓨란-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2,5-dimethyl-furan-3-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(6-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethoxy-4-methyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide); 및
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(4-에틸-벤조일)-N-(1-펜에틸-부트-3-에닐)-히드라자이드((R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(4-ethyl-benzoyl)-N-(1-phenethyl-but-3-enyl)-hydrazide)
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 95% 이상의 거울상이성질체 잉여(enantiomeric excess)를 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide), 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 수화물.
  11. 99% 이상의 거울상이성질체 잉여를 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide), 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 수화물.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는, 피검자의 암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  13. 하기 화학식 IV의 화합물 제조 공정에 있어서,
    [화학식 IV]
    Figure 112014109747669-pct00144
    여기서, A는 아릴알킬; 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오(alkylthio), 카르복사미도(carboxamido), 및 술폰아미도(sulfonamido)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 한개 내지 다섯개의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 아릴; 또는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 및 술폰아미도로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 한개 내지 다섯개의 치환기가 치환가능한 탄소 원자에서 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴;
    B는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 및 술폰아미도로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 한개 내지 다섯개의 치환기로 치환되거나 치환되지 않은 아릴; 또는 할로, 니트로, 사이아노, 히드록시, 아미노, 알킬, 할로알킬, 히드록시알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 알콕시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티오, 카르복사미도, 및 술폰아미도로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 한개 내지 다섯개의 치환기로 치환가능한 탄소 원자에서 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴;
    R2는 알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴이며;
    단, R2는 -CR8R9CHR10CR11R12와 동일하지 않으며; 및
    R8, R9, R10, R11 및 R12는 독립적으로 각각 수소, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 선택되며;
    여기서, R2가 결합되어 있는 비대칭 탄소 원자는 R 또는 S 이성질체 중 어느 하나로 거울상이성질체적으로 농축되어 있으며;
    a) 하기 화학식 VII의 화합물을 형성하기 위하여 하기 화학식 V의 화합물을 하기 화학식 VI의 화합물과 반응시켜는 단계;
    [화학식 V]
    Figure 112014109747669-pct00145
    [화학식 VI]
    R2HC=N-NH-CO2R7
    [화학식 VII]
    Figure 112014109747669-pct00146
    여기서,
    X 및 Y는 독립적으로 O 또는 NR이고, 여기서 R은 알킬 또는 아릴이며;
    Ca 및 Cb는 독립적으로 각각 S 배열의 비대칭 탄소 원자 또는 R 배열의 비대칭 탄소 원자이며;
    R14 및 R15는 독립적으로 각각 알킬 또는 아릴이며;
    R13은 할로, 수소, 알킬, 알콕시 또는 OSO2CF3이며;
    R7은 알킬, 아릴알킬 또는 아릴이며; 그리고
    R2, R8, R9, R10, R11 및 R12는 전술한 바와 동일한 의미를 갖고;
    b) 하기 화학식 VIII의 화합물을 형성하기 위하여 상기 화학식 VII의 화합물을 환원시키는 단계;
    [화학식 VIII]
    Figure 112014109747669-pct00147
    c) 하기 화학식 IX의 화합물을 형성하기 위하여 상기 화학식 VIII의 화합물을 LG가 이탈기인 화학식 B-CO-LG의 화합물과 반응시키는 단계;
    [화학식 IX]
    Figure 112014109747669-pct00148
    d) 하기 화학식 X의 화합물을 형성하기 위하여 상기 화학식 IX의 화합물의 R7CO2 - 기를 제거하는 단계; 및
    [화학식 X]
    Figure 112014109747669-pct00149
    e) 화학식 IV의 화합물을 형성하기 위하여 상기 화학식 X의 화합물을 LG가 이탈기인 화학식 A-CO-LG의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 공정.
  14. 제 13 항에 있어서,
    R8, R9, R10, R11 및 R12는 수소인 것을 특징으로 하는 공정.
  15. 삭제
  16. 숙주 세포에서 관심대상 유전자의 발현을 조절하는 시험관 내 방법에 있어서,
    상기 숙주 세포는,
    i) DNA-결합 도메인; 및
    ii) 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인
    을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 재조합 유전자 발현 카세트: 및
    i) 상기 DNA 결합 도메인과 결합할 수 있는 반응 구성요소;
    ii) 프로모터; 및
    iii) 상기 관심대상 유전자
    를 포함하는 제2 재조합 유전자 발현 카세트를 포함하고,
    상기 숙주 세포를 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시켜서 관심대상 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심대상 유전자의 발현을 조절하는 시험관 내 방법.
  17. 인간을 제외한 형질전환 피검자의 세포 내의 엑디손 수용체 복합체와 리간드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 피검자에서 내인성 또는 이종(heterologus) 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서,
    상기 세포는 상기 리간드와 조합시에 상기 엑디손 수용체 복합체에 대한 DNA 결합 서열을 더 함유하며, 엑디손 수용체 복합체-리간드-DNA 결합 서열 복합체의 형성은 상기 유전자의 발현을 유도하며, 그리고
    상기 리간드는 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 화합물이고; 상기 피검자에서 내인성 또는 이종 유전자 발현은 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 피검자는 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 삭제
  20. 인간을 제외한 형질전환 피검자에서 형질전환 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서,
    상기 피검자는 형질전환 유전자 발현을 조절할 수 있는 재조합 엑디손 수용체 복합체를 포함하며; 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 상기 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 숙주 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 시험관 내 방법에 있어서,
    (a) 상기 숙주 세포에 하기를 포함하는 유전자 발현 조절 시스템을 도입하는 단계:
    (i) 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제1 재조합 유전자 발현 카세트로서, 상기 제1 재조합 유전자 발현 카세트는:
    (a) 그 발현이 조절될 유전자와 연관된 반응 구성요소를 인식하는 DNA-결합 도메인; 및
    (b) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인
    을 포함하는 제1 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며;
    (ii) 상기 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제2 재조합 유전자 발현 카세트로서, 상기 제2 재조합 유전자 발현 카세트는:
    (a) 전이활성화 도메인; 및
    (b) 키메라 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인
    을 포함하는 제2 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며; 및
    (iii) 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제3 재조합 유전자 발현 카세트로서, 상기 제3 재조합 유전자 발현 카세트는:
    (a) 상기 제1 하이브리드 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의하여 인식되는 반응 구성요소;
    (b) 상기 제2 하이브리드 폴리펩티드의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및
    (c) 그 발현이 조절될 유전자
    를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며; 그리고
    (b) 상기 숙주 세포에 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 화합물을 도입하여 숙주 세포에서 유전자의 발현이 조절되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 시험관 내 방법.
  22. 폴리펩티드를 생성하는 시험관 내 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 화합물에 대한 노출에 실질적으로 영향받지 않는 숙주 세포를 선택하는 단계;
    (b) 상기 숙주 세포에 하기를 도입하는 단계;
    (i) DNA 구조체로서:
    (a) 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 유전자; 및
    (b) 반응 구성요소를 포함하며; 상기 외인성 유전자가 상기 반응 구성요소의 제어하에 있는 DNA 구조체; 그리고
    (ii) 엑디손 수용체 복합체로서:
    a) 상기 반응 구성요소와 결합하는 DNA 결합 도메인;
    b) 상기 화합물에 대한 결합 도메인; 및
    c) 전이활성화 도메인을 포함하는 엑디손 수용체 복합체; 그리고
    (c) 상기 세포를 상기 화합물에 노출시켜서 폴리펩티드가 생성되는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관 내 방법.
  23. 제 9 항에 있어서,
    85% 이상의 거울상이성질체 잉여를 갖는, 하기 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물:
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-ethyl-3-methoxy-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-벤조일-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-benzoyl-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-methyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-플루오로-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-fluoro-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N'-(2-브로모-벤조일)-N-(1-터트-부틸-부틸)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N'-(2-bromo-benzoyl)-N-(1-tert-butyl-butyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(4-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(4-methyl-benzoyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(2-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide);
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(6-클로로-피리딘-3-카르보닐)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-hydrazide); 및
    (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide).
  24. 95% 이상의 거울상이성질체 잉여를 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide), 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 수화물.
  25. 99% 이상의 거울상이성질체 잉여를 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라자이드((R)-3,5-Dimethyl-benzoic acid N-(1-tert-butyl-butyl)-N'-(3-methoxy-2-methyl-benzoyl)-hydrazide), 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 수화물.
  26. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는, 피검자의 암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  27. 숙주 세포에서 관심대상 유전자의 발현을 조절하는 시험관 내 방법에 있어서,
    상기 숙주 세포는,
    i) DNA-결합 도메인; 및
    ii) 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인
    을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 재조합 유전자 발현 카세트: 및
    i) 상기 DNA 결합 도메인과 결합할 수 있는 반응 구성요소;
    ii) 프로모터; 및
    iii) 상기 관심대상 유전자
    를 포함하는 제2 재조합 유전자 발현 카세트를 포함하고,
    상기 숙주 세포를 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시켜서 관심대상 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심대상 유전자의 발현을 조절하는 시험관 내 방법.
  28. 인간을 제외한 형질전환 피검자의 세포 내의 엑디손 수용체 복합체와 리간드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 피검자에서 내인성 또는 이종(heterologus) 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서,
    상기 세포는 상기 리간드와 조합시에 상기 엑디손 수용체 복합체에 대한 DNA 결합 서열을 더 함유하며, 엑디손 수용체 복합체-리간드-DNA 결합 서열 복합체의 형성은 상기 유전자의 발현을 유도하며, 그리고
    상기 리간드는 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 화합물이고; 상기 피검자에서 내인성 또는 이종 유전자 발현은 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 피검자는 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 인간을 제외한 형질전환 피검자에서 형질전환 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서,
    상기 피검자는 형질전환 유전자 발현을 조절할 수 있는 재조합 엑디손 수용체 복합체를 포함하며; 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 상기 피검자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 숙주 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 세포 내 방법에 있어서,
    (a) 상기 숙주 세포에 하기를 포함하는 유전자 발현 조절 시스템을 도입하는 단계:
    (i) 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제1 재조합 유전자 발현 카세트로서, 상기 제1 재조합 유전자 발현 카세트는:
    (a) 그 발현이 조절될 유전자와 연관된 반응 구성요소를 인식하는 DNA-결합 도메인; 및
    (b) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인
    을 포함하는 제1 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며;
    (ii) 상기 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제2 재조합 유전자 발현 카세트로서, 상기 제2 재조합 유전자 발현 카세트는:
    (a) 전이활성화 도메인; 및
    (b) 키메라 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인
    을 포함하는 제2 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며; 및
    (iii) 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제3 재조합 유전자 발현 카세트로서, 상기 제3 재조합 유전자 발현 카세트는:
    (a) 상기 제1 하이브리드 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의하여 인식되는 반응 구성요소;
    (b) 상기 제2 하이브리드 폴리펩티드의 전이활성화 도메인에 의하여 활성화되는 프로모터; 및
    (c) 그 발현이 조절될 유전자
    를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며; 그리고
    (b) 상기 숙주 세포에 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 화합물을 도입하여 숙주 세포에서 유전자의 발현이 조절되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 세포 내 방법.
  32. 폴리펩티드를 생성하는 세포 내 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 화합물에 대한 노출에 실질적으로 영향받지 않는 숙주 세포를 선택하는 단계;
    (b) 상기 숙주 세포에 하기를 도입하는 단계;
    (i) DNA 구조체로서:
    (a) 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 유전자; 및
    (b) 반응 구성요소를 포함하며; 상기 외인성 유전자가 상기 반응 구성요소의 제어하에 있는 DNA 구조체; 그리고
    (ii) 엑디손 수용체 복합체로서:
    a) 상기 반응 구성요소와 결합하는 DNA 결합 도메인;
    b) 상기 화합물에 대한 결합 도메인; 및
    c) 전이활성화 도메인을 포함하는 엑디손 수용체 복합체; 그리고
    (c) 상기 세포를 상기 화합물에 노출시켜서 폴리펩티드가 생성되는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 내 방법.
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