DE60122685T2

DE60122685T2 - Induziertes genexpressionssystem basierend auf ecdysonrezeptoren

Info

Publication number: DE60122685T2
Application number: DE60122685T
Authority: DE
Inventors: Reddy Subba Lansdale PALLI; Marianna Zinovjevna North Wales KAPITSKAYA; Ervin Dean Sounderton CRESS
Original assignee: Rheogene Inc
Current assignee: Precigen Inc
Priority date: 2000-03-22
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2021-03-22
Also published as: AU2007200882B2; CA2404253C; ATE338135T1; WO2001070816A3; CN1422334A; AU2001249315A1; JP2003527852A; DE60122685D1; AU2007200882A1; MXPA02009157A; EP1266015A2; CA2404253A1; EP1266015B1; US7091038B2; AR028276A1; CN1304578C; WO2001070816A2; US20020119521A1; JP5031967B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie oder Gentechnologie. Spezifisch ausgedrückt, betrifft diese Erfindung das Gebiet der Genexpression. Spezifischer betrifft diese Erfindung ein neues, Ecdyson-Rezeptor-basiertes, induzierbares Genexpressionssystem und Verfahren zum Modulieren der Expression eines Gens in einer Wirtszelle unter Verwendung dieses induzierbaren Genexpressionssystems.
Hintergrund der Erfindung
Auf dem Gebiet der Gentechnologie ist die präzise Kontrolle der Genexpression ein wertvolles Werkzeug zum Untersuchen, Manipulieren und Kontrollieren der Entwicklung und anderer physiologischer Prozesse. Die Genexpression ist ein komplexer biologischer Prozess, an dem eine Reihe spezifischer Protein-Protein-Interaktionen beteiligt ist. Um die Genexpression auszulösen, sodass sie die RNA produziert, die als erster Schritt bei der Proteinsynthese benötigt wird, muss ein Transkriptionsaktivator in die Nähe eines Promotors gebracht werden, der die Gentranskription kontrolliert. Typischerweise ist der Transkriptionsaktivator selbst mit einem Protein assoziiert, das wenigstens eine DNA-Bindungsdomäne besitzt, die an DNA-Bindungsstellen bindet, die in den Promotorregionen von Genen vorhanden sind. Somit, damit Genexpression stattfindet, muss ein Protein, das eine DNA-Bindungsdomäne und eine Transaktivierungsdomäne umfasst, die in einem geeignetem Abstand von der DNA-Bindungsdomäne angeordnet ist, in die korrekte Position in der Promotorregion des Gens gebracht werden.
Der traditionelle transgene Ansatz verwendet einen zelltypspezifischen Promotor, um die Expression eines erstellten Transgens anzutreiben. Zunächst wird ein DNA-Konstrukt, das das Transgen enthält, in ein Wirtsgenom eingebaut. Wenn eine Auslösung über einen Transkriptionsaktivator erfolgt, findet die Expression des Transgens in einem gegebenen Zelltyp statt.
Ein anderes Mittel zum Regulieren der Expression von Fremdgenen in Zellen erfolgt über induzierbare Promotoren. Verwendungsbeispiele solcher induzierbarer Promotoren beinhalten den PR-1-a-Promotor, prokaryotische Repressor-Operator-Systeme, immunsuppressive Immunophilin-Systeme und höhere eukaryotische Transkriptionsaktivierungssysteme, wie etwa Steroidhormonrezeptorsysteme, und sind unten beschrieben.
Der PR1-a Promotor aus Tabak wird während der syntemischen, erworbenen Resistenzantwort nach Pathogenangriff induziert. Die Verwendung von PR1-a kann eingeschränkt sein, da er oft auf endogene Materialien und externe Faktoren, wie etwa Pathogene, UV-B-Bestrahlung und Umweltgifte reagiert. Genregulationssysteme auf Basis von Promotoren, die durch Hitzeschock, Interferon und Schwermetalle induziert werden, sind beschrieben worden (Wurn et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5414–5418; Arnheiter et al., 1990, Cell 62: 51–61; Filmus et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 27550–27560). Jedoch besitzen diese Systeme Beschränkungen aufgrund ihrer Wirkungen auf die Expression von Nicht-Zielgenen. Diese Systeme sind ebenfalls „durchlässig".
Prokaryotische Repressor-Operatorsysteme verwenden bakterielle Repressorproteine und die singulären Operator-DNA-Sequenzen, an die diese binden. Sowohl die Tetracyclin („Tet")- als auch die Laktose („Lac")-Repressor-Operatorsysteme aus dem Bakterium Escherichia coli sind in Pflanzen und Tieren verwendet worden, um die Genexpression zu kontrollieren. Im Tet-System bindet Tetracyclin an das TetR-Repressor-Protein, was in einer Konformationsänderung resultiert, die das Repressorprotein von dem Operator ablöst, was im Ergebnis das Zustandekommen von Transkription erlaubt. Im Lac-System wird ein lac-Operon in Reaktion auf die Anwesenheit von Laktose oder von synthetischen Analoga, wie etwa Isopropyl-β-D-thiogalaktosid, aktiviert. Unglücklicherweise ist die Verwendung solcher Systeme beschränkt durch die instabile Chemie der Liganden, d.h. Tetracyclin und Laktose, ihre Toxizität, ihr natürliches Vorkommen oder die relativ hohen Spiegel, die für Induktion oder Repression benötigt werden. Aus ähnlichen Gründen ist die Verwendbarkeit solcher Systeme bei Tieren beschränkt.
Immunsuppressive Moleküle, wie etwa FK506, Rapamycin und Cyclosporin A, können an die Immunophiline FKBP12, Cyclophilin, etc. binden. Unter Verwendung dieser Information ist eine allgemeine Strategie erdacht worden, zwei beliebige Proteine einfach dadurch zusammenzubringen, indem man FK506 auf beiden der zwei Proteine anbringt, oder, indem man FK506 an einem und Cyclosporin A an einem anderen anbringt. Ein synthetisches Homodimer von FK506 (FK1012) oder eine Verbindung, die aus der Fusion von FK506-Cyclosporin (FKCsA) resultiert, kann dann verwendet werden, um die Dimerisierung dieser Moleküle zu induzieren (Spencer et al., 1993, Science 262: 1019–24; Belshaw et al., 1996 Proc NatI Acad Sci USA 93: 4604–7). Die Gal4-DNA-Bindungsdomäne in Fusion mit FKBP12- und VP16-Aktivatordomänen, diese an Cyclophilin fusioniert, sowie FKCsA-Verbindung wurden verwendet, um Heterodimerisierung und die Aktivierung eines Reportergens unter der Kontrolle eines Promotors zu zeigen, der Gal4-Bindungsstellen enthält. Unglücklicherweise beinhaltet dieses System Immunsuppressiva, die unerwünschte Nebenwirkungen haben können, und daher ergeben sich Grenzen seiner Anwendung für verschiedene Säuger-Genschalteranordnungen.
Höhere eukaryotische Transkriptionsaktivierungssysteme, wie etwa Steroidhormonrezeptor-Systeme, sind ebenfalls verwendet worden. Steroidhormonrezeptoren sind Mitglieder der Kernrezeptor-Superfamilie und finden sich in Vertebraten- und Invertebratenzellen. Unglücklicherweise ist die Verwendung von Steroidverbindungen, die die Rezeptoren für die Regulation der Genexpression aktivieren, insbesondere bei Pflanzen und Säugern aufgrund von deren Beteiligung in vielen anderen natürlichen biologischen Stoffwechselwegen in solchen Organismen eingeschränkt. Um solche Schwierigkeiten zu überwinden, ist ein alternatives System unter Verwendung von Insekten-Ecdysonrezeptoren (EcR) entwickelt worden.
Wachstum, Häutung und Entwicklung bei Insekten werden durch das Steroidhormon Ecdyson (Häutungshormon) und die Juvenilhormone reguliert (Dhadialla et al., 1998, Annu. Rev. Entomol. 43: 545–569). Das molekulare Ziel für Ecdyson in Insekten besteht wenigstens aus dem Ecdysonrezeptor (EcR) und dem Ultraspiracle-Protein (USP). EcR ist ein Mitglied der Kernsteroid-Rezeptor-Superfamilie, die durch Signatur-DNA und Ligandenbindungsdomänen und eine Aktivierungsdomäne gekennzeichnet ist (Koelle et al., 1991, Cell, 67: 59–77). EcR-Rezeptoren reagieren auf eine Anzahl von Steroidverbindungen, wie etwa Ponasteron A und Muristeron A. Jüngst sind nicht-steroidale Verbindungen mit Ecdysteroid-Agonistenaktivität beschrieben worden, einschließlich der kommerziell erhältlichen Insektizide Tebufenozid und Methoxyfenozid, die von der Rohm und Haas-Company weltweit vermarktet werden (siehe internationale Patentanmeldung Nr. PCT/EP96/00686 (WO 96/27673) und US-Patent 5,530,028). Beide Analoga besitzen außergewöhnliche Sicherheitsprofile gegenüber anderen Organismen.
Die internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US97/05330 (WO 97/38117) offenbart Verfahren zum Modulieren der Expression eines exogenen Gens, bei denen ein DNA-Konstrukt, das das exogene Gen und ein Ecdyson-Antwortelement umfasst, über ein zweites DNA-Konstrukt aktiviert wird, das einen Ecdysonrezeptor umfasst, der in Gegenwart eines Liganden hierfür, und, optional, in Gegenwart eines Rezeptors, der befähigt ist, als ein stiller Partner zu fungieren, an das Ecdyson-Antwortelement bindet, um Genexpression zu induzieren. Der Ecdysonrezeptor der Wahl wurde aus Drosophila melanogaster isoliert. Typischerweise erfordern solche Systeme die Gegenwart des stillen Partners, bevorzugt von Retinoid X-Rezeptor (RXR), um optimale Aktivierung bereitzustellen. In Säugerzellen heterodimerisiert der Insekten-Ecdysonrezeptor (EcR) mit Retinoid X-Rezeptor (RXR) und reguliert die Expression von Zielgenen in einer Liganden-abhängigen Weise. Die internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US98/14215 (WO 99/02683) offenbart, dass der Ecdysonrezeptor, der aus dem Seidenspinner Bombyx mori isoliert wird, in Säugersystemen funktionell ist, ohne dass die Notwendigkeit für einen exogenen Dimerpartner besteht.
Das US-Patent Nr. 5,880,333 offenbart ein Drosophila melanogaster EcR und Ultraspiracle (USP)-Heterodimersystem, das in Pflanzen verwendet wird, und bei dem die Transaktivierungsdomäne und die DNA-Bindungsdomäne auf zwei verschiedenen Hybridproteinen angeordnet sind. Unglücklicherweise ist dieses System nicht wirksam dabei, um eine Reportergen-Expression in tierischen Zellen zu induzieren (zum Vergleich, siehe Beispiele 1, 2 unten).
In jedem dieser Fälle wurden die Transaktivierungsdomäne und die DNA-Bindungsdomäne (entweder als nativer EcR, wie bei der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US98/14215 oder als modifizierter EcR, wie bei der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US97/05330) in ein einziges Molekül eingebaut, und der andere heterodimere Partner, entweder USP oder RXR, wurden in der Form mit ihrer vollen Länge verwendet.
Die Nachteile der oben beschriebenen, auf EcR basierenden Genregulationssysteme beinhalten eine beträchtliche Hintergrundaktivität in Abwesenheit von Liganden, und dass diese Systeme nicht für die Verwendung sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren geeignet sind (siehe US-Patent Nr. 5,880,333). Bei den meisten Anwendungen, die auf der Modulation der Genexpression beruhen, sind diese EcR-basierten Systeme nicht wünschenswert. Daher besteht in der Technik ein Bedarf nach verbesserten Systemen zur präzisen Modulation der Expression von exogenen Genen sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren. Solche verbesserten Systeme wären nützlich für Anwendungen wie etwa Gentherapie, die Produktion von Proteinen und Antikörpern im großen Maßstab, auf Zellen basierende Hochdurchsatz-Screening-Assays, funktionale Genomanalyse und die Regulation von Merkmalen bei transgenen Tieren. Verbesserte Systeme, die einfach und kompakt sind und von Liganden abhängen, die relativ preiswert, leicht verfügbar und von geringer Toxizität für den Wirt sind, würden sich als nützlich erweisen, um biologische Systeme zu regulieren.
Es sind hier verschiedene Veröffentlichungen zitiert, deren Offenbarungsgehalt durch Referenz vollumfänglich in Bezug genommen wird. Jedoch ist das Zitieren einer beliebigen, hier genannten Referenz nicht als Eingeständnis zu werten, dass eine solche Referenz als „Stand der Technik" für die vorliegende Anmeldung verwendbar ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, Ecdyson-Rezeptor-basiertes induzierbares Genexpressionssystem, neue Rezeptorpolynukleotide und Polypeptide für die Verwendung bei dem neuen induzierbaren Genexpressionssystem, sowie Verfahren zum Modulieren der Expression eines Gens innerhalb einer Wirtszelle unter Verwendung dieses induzierbaren Genexpressionssystems. Insbesondere bezieht sich die Erfindung der Anmelder auf ein verbessertes Genexpressionsmodulationssystem, umfassend ein Polynukleotid, das für ein Rezeptorpolypeptid mit einer Trunkierungsmutation codiert.
Spezifisch ausgedrückt, betrifft die vorliegende Erfindung ein die Genexpression modulierendes System, welches folgendes umfasst:

a) eine erste Genexpressionskassette, die in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, umfassend ein Polynukleotid, das ein erstes Polypeptid codiert, welches folgendes umfasst:
i) eine DNA-Bindungsdomäne, die ein Antwortelement erkennt, das mit einem Gen assoziiert ist, dessen Expression moduliert werden soll; und
ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines Kernrezeptors umfasst; und
b) eine zweite Genexpressionskassette, die in der Wirtszelle exprimiert werden kann, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die ein zweites Polypeptid codiert, welches folgendes umfasst:
i) eine Transaktivierungsdomäne und
ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines Kernrezeptors, der kein Ultraspiracle-Rezeptor ist, umfasst;

Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids eine Ecdysonrezeptor (EcR)-Ligandenbindungsdomäne.
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids eine Retinoid X-Rezeptor (RXR)-Ligandenbindungsdomäne.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne, und die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids umfasst eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Genexpressionsmodulationssystem gemäß der Erfindung, weiterhin umfassend c) eine dritte Genexpressionskassette, die folgendes umfasst:

i) ein Antwortelement, an das die DNA-Bindungsdomäne des ersten Polypeptids bindet;
ii) einen Promotor, der durch die Transaktivierungsdomäne des zweiten Polypeptids aktiviert wird; und
iii) das Gen, dessen Expression moduliert werden soll.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein isoliertes Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR-Polypeptid oder für ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, wobei die Trunkierungsmutation die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit beeinflusst.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR-Polypeptid oder ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, dieses umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Ligandenbindungsaktivität oder die Ligandenempfindlichkeit dieses EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR-Polypeptid oder ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Steroidbindungsaktivität oder die Steroidempfindlichkeit dieses EcR-Polypeptids oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR-Polypeptid oder für ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, welches eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder die Nicht-Steroid-Empfindlichkeit dieses EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein isoliertes Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR-Polypeptid oder ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, welches eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Ligandenbindungsaktivität oder die Ligandenempfindlichkeit dieses EcR- oder RXR-Polypeptids steigert. Bei einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR-Polypeptid oder für ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, welches eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit dieses EcR- oder RXR-Polypeptids steigert. Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR-Polypeptid oder für ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, welches eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder die Nicht-Steroid-Empfindlichkeit dieses EcR- oder RXR-Polypeptids steigert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein isoliertes Polynukleotid, das für ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, welches eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Ligandenempfindlichkeit eines Heterodimers steigert, umfassend das trunkierte Retinoid X-Rezeptor-Polypeptid und einen Dimerisierungspartner. Bei einer spezifischen Ausführungsform ist der Dimerisierungspartner ein Ecdysonrezeptor-Polypeptid.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein isoliertes Polypeptid, das durch ein Polynukleotid gemäß der Erfindung der Anmelder codiert wird. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes trunkiertes EcR-Polypeptid oder ein isoliertes trunkiertes RXR-Polypeptid, welches eine Trunkierungsmutation umfasst, wobei das EcR- oder RXR-Polypeptid von einem Polynukleotid gemäß der Erfindung codiert wird.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein isoliertes trunkiertes EcR-Polypeptid oder ein isoliertes trunkiertes RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Ligandenbindungsaktivität oder die Ligandenempfindlichkeit dieses EcR- oder RXR-Polypeptids beeinflusst.
Die Erfindung der Anmelder bezieht sich außerdem auf Verfahren zum Modulieren der Genexpression in einer Wirtszelle unter Verwendung eines Modulationssystems der Genexpression gemäß der Erfindung. Spezifisch stellt die Erfindung der Anmelder ein Verfahren bereit, um die Expression eines Gens in einer Wirtszelle, die das zu modulierende Gen umfasst, zu modulieren, umfassend die folgenden Schritte: a) Einführen eines Genexpressionsmodulationssystems gemäß der Erfindung in die Wirtszelle; und b) Einführen eines Liganden in die Wirtszelle, der in unabhängiger Weise eine Kombination mit den Ligandenbindungsdomänen des ersten Polypeptids und des zweiten Polypeptids des Genexpressionsmodulationssystems eingeht, wobei das zu exprimierende Gen eine Komponente eines chimären Gens ist, welches folgendes umfasst: i) ein Antwortelement, welches eine Domäne umfasst, an die die DNA-Bindungsdomäne aus dem ersten Polypeptid bindet; ii) einen Promotor, der durch die Transaktivierungsdomäne des zweiten Polypeptids aktiviert wird; und iii) das Gen, dessen Expression moduliert werden soll, wodurch ein Komplex ausgebildet wird, der den Liganden, das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid umfasst, und wodurch der Komplex die Expression des Gens in der Wirtszelle moduliert.
Die Erfindung der Anmelder stellt außerdem eine isolierte Wirtszelle bereit, welche ein induzierbares Genexpressionssystem gemäß der Erfindung umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine isolierte Wirtszelle, die ein Polynukleotid oder ein Polypeptid gemäß der Erfindung umfasst. Dementsprechend betrifft die Erfindung der Anmelder auch einen nicht-menschlichen Organismus, der eine Wirtszelle gemäß der Erfindung umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres Gal4DBD-CfEcRDEF-Polypeptid codiert, und eine zweite Genexpressionskassette, die für ein chimäres VP16AD-MmRXRDEF-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.1).
2: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres Gal4DBD-CfEcRDEF-Polypeptid codiert, und eine zweite Genexpressionskassette, die für ein chimäres VP16AD-CfUSPDEF-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.2).
3: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres Gal4DBD-MmRXRDEF-Polypeptid codiert, und eine zweite Genexpressionskassette, die für ein chimäres VP16AD-CfEcRCDEF-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.3).
4: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres Gal4DBD-MmRXRDEF-Polypeptid codiert, und eine zweite Genexpressionskassette, die für ein chimäres VP16AD-DmEcRCDEF-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.4).
5: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres Gal4DBD-CfUSPDEF-Polypeptid codiert, und eine zweite Genexpressionskassette, die für ein chimäres VP16AD-CfEcRCDEF-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.5).
6: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres Gal4DBD-CfEcRDEF-VP16AD-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.6).
7: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres VP16AD-CfEcRCDEF-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.7).
8: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres VP16AD-DmEcRCDEF-Polypeptid codiert, und eine zweite Genexpressionskassette, die für ein MmRXR-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.8).
9: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine erste Genexpressionskassette, die für ein chimäres VP16AD-CfEcRCDEF-Polypeptid codiert, und eine zweite Genexpressionskassette, die für ein MmRXR-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.9).
10: Ecdysonrezeptor-basiertes Genexpressionssystem, umfassend eine Genexpressionskassette, die für ein chimäres Gal4DBD-CfEcRCDEF-Polypeptid codiert; hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 1 (Schalter 1.10).
11: Expressionsdaten der Trunkierungsmutanten GAL4CfEcRA/BCDEF, GAL4CfEcRCDEF, GAL4CfEcR1/2CDEF, GAL4CfEcRDEF, GAL4CfEcREF, GAL4CfEcRDE, die zusammen mit VP16MmRXRDE, pFRLUc und pTKRL Plasmid-DNAs in NIH3T3-Zellen transfiziert wurden.
12: Expressionsdaten der Trunkierungsmutanten GAL4CfEcRA/BCDEF, GAL4CfEcRCDEF, GAL4CfEcR1/2CDEF, GAL4CfEcRDEF, GAL4CfEcREF, GAL4CfEcRDE, die zusammen mit VP16MmRXRE, pFRLUc und pTKRL Plasmid-DNAs in 3T3-Zellen transfiziert wurden.
13: Expressionsdaten der Konstrukte VP16MmRXRA/BCDEF, VP16MmRXRCDEF, VP16MmRXRDEF, VP16MmRXREF, VP16MmRXRBam-EF und VP16MmRXRAF2del, die zusammen mit GAL4CfEcRCDEF, pFRLUc und pTKRL Plasmid-DNAs in NIH3T3-Zellen transfiziert wurden.
14: Expressionsdaten der Konstrukte VP16MmRXRA/BCDEF, VP16MmRXRCDEF, VP16MmRXRDEF, VP16MmRXREF, VP16MmRXRBam-EF und VP16MmRXRAF2del, die zusammen mit GAL4CfEcRDEF, pFRLUc und pTKRL Plasmid-DNAs in NIH3T3-Zellen transfiziert wurden.
15: Expressionsdaten verschiedener trunkierter CfEcR- und MmRXR-Rezeptorpaare, die zusammen mit GAL4CfEcRDEF, pFRLUc und pTKRL Plasmid-DNAs in NIH3T3-Zellen transfiziert wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Anmelder haben nun ein verbessertes Ecdysonrezeptor-basiertes induzierbares Genexpressionssystem entwickelt, welches eine Trunkierungsmutante eines Ecdysonrezeptor- oder eines Retinoid X-Rezeptor (RXR)-Polypeptids umfasst, die die Ligandenbindungsaktivität oder die Ligandenempfindlichkeit beeinflusst. Dieser mutationsabhängige Effekt kann die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit erhöhen oder reduzieren und kann steroidspezifisch oder nicht-steroidspezifisch sein. Somit stellt die Erfindung der Anmelder ein verbessertes Ecdysonrezeptor-basiertes induzierbares Genexpressionssystem bereit, das nützlich ist für die Modulierung der Expression eines interessierenden Gens in einer Wirtszelle. Bei einer besonders erstrebenswerten Ausführungsform stellt die Erfindung der Anmelder ein induzierbares Genexpressionssystem bereit, das ein reduziertes Niveau an Hintergrund-Genexpression besitzt und auf submikromolare Konzentrationen an nicht-steroidalem Liganden reagiert. Somit überwinden das neue induzierbare Genexpressionssystem der Anmelder und dessen Verwendung bei Verfahren zum Modulieren der Genexpression in einer Wirtszelle die Einschränkungen der derzeit verfügbaren induzierbaren Expressionssysteme und statten den begabten Fachmann mit einem wirksamen Mittel zur Kontrolle der Genexpression aus.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues induzierbares Genexpressionssystem bereit, das verwendet werden kann, um die Genexpression sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Wirtszellen zu modulieren. Die Erfindung der Anmelder ist nützlich für Anwendungen, wie etwa die Gentherapie, die Produktion von Proteinen und Antikörpern im großen Maßstab, für Zell-basierte Hochdurchsatz-Screening-Assays, funktionelle Genomanalysen („Genomics") und die Regulation von Merkmalen bei transgenen Organismen.
DEFINITIONEN
In dieser Beschreibung wird eine Anzahl von Begriffen und Abkürzungen verwendet. Es werden die folgenden Definitionen bereitgestellt, und diese sollen hilfreich beim Verstehen des Schutzumfangs und der Durchführung der vorliegenden Erfindung sein.
Bei einer spezifischen Ausführungsform bedeutet der Begriff „etwa" oder „ungefähr" innerhalb von 20%, bevorzugt innerhalb von 10%, bevorzugter innerhalb von 5%, und sogar noch bevorzugter innerhalb von 1% eines gegebenen Wertes oder Bereichs.
Der Begriff „weitgehend frei" bedeutet, dass eine Zusammensetzung, die „A" umfasst (wobei „A" ein einzelnes Protein, DNA-Molekül, ein einzelner Vektor, eine einzelne rekombinante Wirtszelle, etc. ist) weitgehend frei ist von „B" (wobei „B" ein oder mehrere kontaminierende Proteine, DNA-Moleküle, Vektoren, etc. umfasst), wenn wenigstens etwa 75 Gewichts-% der Proteine, DNA, Vektoren (in Abhängigkeit von der Kategorie der Spezies, zu der A und B gehören) in der Zusammensetzung „A" ist. Bevorzugt umfasst „A" wenigstens etwa 90 Gewichts-% der Spezies A + B in der Zusammensetzung, am bevorzugtesten wenigstens etwa 99 Gewichts-%. Es ist außerdem bevorzugt, dass eine Zusammensetzung, die weitgehend frei von Verunreinigung ist, nur eine einzige Molekulargewichts-Spezies enthält, die die Aktivität oder Eigenschaft der Spezies von Interesse besitzt.
Der Begriff „isoliert" für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein biologisches Material (Nukleinsäure oder Protein), das aus seiner ursprünglichen Umgebung (der Umgebung, in der es natürlicherweise vorkommt) entnommen wurde.
Beispielsweise ist ein Polynukleotid, das im natürlichen Zustand in einer Pflanze oder einem Tier vorhanden ist, nicht isoliert. Dasselbe Polynukleotid wird auch von den angrenzenden Nukleinsäuren, in denen es natürlicher Weise vorhanden ist, abgetrennt. Der Begriff „gereinigt" erfordert nicht, dass das Material in einer Form vorliegt, in der es absolute Reinheit unter Ausschluss der Anwesenheit anderer Verbindungen zeigt. Es ist eine eher relative Definition.
Ein Polynukleotid im „gereinigten" Zustand nach der Reinigung aus dem Ausgangsmaterial oder dem natürlichen Material ist um wenigstens eine Größenordnung angereichert, bevorzugt um 2 oder 3, und bevorzugt um 4 oder 5 Größenordnungen.
Eine „Nukleinsäure" ist eine polymere Verbindung, zusammengesetzt aus kovalent verbundenen Untereinheiten, die als Nukleotide bezeichnet werden. Nukleinsäure beinhaltet Polyribonukleinsäure (RNA) und Polydesoxyribonukleinsäure (DNA), von denen beide einzelsträngig oder doppelsträngig sein können. DNA beinhaltet, ohne hierauf beschränkt zu sein, cDNA, genomische DNA, Plasmid-DNA, synthetische DNA und halbsynthetische DNA. DNA kann linear, zirkulär oder mit Supercoiling versehen sein.
Ein „Nukleinsäuremolekül" bezieht sich auf die Phosphatester-Polymerform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; „RNA-Moleküle") oder von Desoxyribonukleosiden (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin; „DNA-Moleküle") oder auf beliebige Phosphoesteranaloga hiervon, wie etwa Phosphorothioate und Thioester, entweder in einzelsträngiger Form oder als doppelsträngige Helix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helizes sind möglich. Der Begriff „Nukleinsäuremolekül", und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül, bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und beschränkt es nicht auf irgendwelche speziellen Tertiärformen. Somit beinhaltet dieser Ausdruck doppelsträngige DNA, die sich unter anderem findet in linearen oder zirkulären DNA-Molekülen (z.B. in Restriktionsfragmenten), in Plasmiden und Chromosomen. Beim Diskutieren der Struktur bestimmter doppelsträngiger DNA-Moleküle können hier Sequenzen beschrieben sein, wobei gemäß der normalen Konvention, nur die Sequenz in 5'-3'-Richtung entlang des nicht-transkribierten DNA-Strangs gezeigt ist (d.h. desjenigen Stranges, der eine zur mRNA homologe Sequenz besitzt). Ein „rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, das eine molekularbiologische Manipulation durchgemacht hat.
Der Begriff „Fragment" wird so zu verstehen sein, dass er eine Nukleotidsequenz reduzierter Länge im Vergleich zur Referenznukleinsäure meint und, über den gemeinsamen Abschnitt, eine Nukleotidsequenz umfasst, die identisch zur Referenznukleinsäure ist. Ein solches Nukleinsäurefragment gemäß der Erfindung kann, dort wo es angemessen ist, in ein größeres Polynukleotid einbezogen sein, von dem es einen Bestandteil darstellt. Solche Fragmente umfassen, oder, bestehen alternativ aus Oligonukleotiden, die in der Länge von wenigstens 8, 10, 12, 15, 18, 20 bis zu 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 oder 1500 aufeinander folgenden Nukleotiden einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung reichen.
Wie hier verwendet, ist ein „isoliertes Nukleinsäurefragment" ein Polymer von RNA oder DNA, das einzel- oder doppelsträngig ist, optional enthaltend synthetische, nicht-natürliche oder veränderte Nukleotidbasen. Ein isoliertes Nukleinsäurefragment in Form eines DNA-Polymers kann aus einem oder mehreren Segmenten von cDNA, genomischer DNA oder synthetischer DNA zusammengesetzt sein.
Ein „Gen" bezieht sich auf eine Zusammensetzung von Nukleotiden, die für ein Polypeptid codieren, und beinhaltet cDNA und genomische DNA-Nukleinsäuren. „Gen" bezieht sich außerdem auf ein Nukleinsäurefragment, das ein spezifisches Protein oder Polypeptid exprimiert, einschließlich regulatorischer Sequenzen, die der codierenden Sequenz vorangehen (5'-nichtcodierende Sequenzen) oder der codierenden Sequenz folgen (3'-nicht-codierende Sequenzen). „Natives Gen" bezieht sich auf ein Gen, wie es in der Natur mit seinen eigenen regulatorischen Sequenzen zu finden ist. „Chimäres Gen" bezieht sich auf ein beliebiges Gen, das kein natives Gen ist, umfassend regulatorische und/oder codierende Sequenzen, die nicht zusammen in der Natur zu finden sind. Entsprechend kann ein chimäres Gen regulatorische Sequenzen und codierende Sequenzen umfassen, die aus verschiedenen Quellen stammen, oder regulatorische Sequenzen und codierende Sequenzen, die aus der gleichen Quelle stammen, jedoch in einer anderen Weise angeordnet sind, als es in der Natur zu finden ist. Ein chimäres Gen kann codierende Sequenzen umfassen, die aus verschiedenen Quellen stammen und/oder regulatorische Sequenzen, die aus verschiedenen Quellen stammen. „Endogenes Gen" bezieht sich auf ein natives Gen in seiner natürlichen Position im Genom eines Organismus. Ein „Fremdgen" oder „heterologes" Gen bezieht sich auf ein Gen, das normalerweise nicht im Wirtsorganismus zu finden ist, das jedoch durch Gentransfer in den Wirtsorganismus eingeführt wird. Fremdgene können native Gene umfassen, die in einen nicht-nativen Organismus inseriert werden, oder chimäre Gene. Ein „Transgen" ist ein Gen, das durch eine Transformationsprozedur in das Genom eingeführt wurde.
„Heterologe" DNA bezieht sich auf eine DNA, die nicht natürlich in der Zelle oder in der chromosomalen Stelle der Zelle befindlich ist. Bevorzugt beinhaltet die heterologe DNA ein Gen, das für die Zelle fremd ist.
Der Begriff „Genom" beinhaltet chromosomale, ebenso wie mitochondriale und aus den Chloroplasten stammende und virale DNA oder RNA.
Ein Nukleinsäuremolekül ist an ein anderes Nukleinsäuremolekül, wie etwa eine cDNA, genomische DNA oder RNA, „hybridisierbar", wenn eine einzelsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls unter geeigneten Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke der Lösung an ein anderes Nukleinsäuremolekül anhybridisieren kann (siehe Sambrook et al., 1989 infra). Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind wohlbekannt und beispielhaft dargestellt in Sambrook, J. Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), insbesondere Kapitel 11 und Tabelle 11.1 darin (hier vollständig durch Referenz in Bezug genommen). Die Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke bestimmen die „Stringenz" der Hybridisierung.
Die Stringenzbedingungen können eingestellt werden, um auf moderat ähnliche Fragmente hin durchzutesten, wie etwa homologe Sequenzen aus entfernt verwandten Organismen, bis hin zu hochgradig ähnlichen Fragmenten, wie etwa Genen, die ein Duplikat funktioneller Enzyme aus nahe verwandten Organismen darstellen. Für die vorläufige Durchmusterung auf homologe Nukleinsäuren können niedrig-stringente Hybridisierungsbedingungen verwendet werden, entsprechend einer T_m von 55°C, z.B. 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,25% Milch und kein Formamid; oder 30% Formamid, 5 × SSC, 0,5% SDS). Moderat stringente Hybridisierungsbedingungen entsprechen einer höheren T_m, z.B. in Form von 40% Formamid mit 5× oder 6 × SCC. Hoch-stringente Hybridisierungsbedingungen entsprechen der höchsten T_m, z.B. als 50% Formamid, 5× oder 6 × SCC. Die Hybridisierung erfordert, dass die beiden Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl in Abhängigkeit von der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind.
Der Begriff „komplementär" wird verwendet, um die Beziehung zwischen Nukleotidbasen zu beschreiben, die befähigt sind, miteinander zu hybridisieren. Beispielsweise, im Hinblick auf DNA, ist Adenosin komplementär zu Thymin, und ist Cytosin komplementär zu Guanin. Entsprechend beinhaltet die vorliegende Erfindung außerdem isolierte Nukleinsäurefragmente, die komplementär zur vollständigen Sequenz sind, wie offenbart oder hier verwendet, und ebenso gegenüber solchen Molekülen mit weitgehend ähnlichen Nukleinsäuresequenzen.
Bei einer spezifischen Ausführungsform bezieht sich der Begriff „Standardhybridisierungsbedingungen" auf eine T_m von 55°C, wobei Bedingungen verwendet werden, wie oben genannt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die T_m 60°C, bei einer bevorzugteren Ausführungsform ist T_m 65°C.
Die nach der Hybridisierung erfolgenden Waschschritte bestimmen ebenfalls die Stringenzbedingungen. Ein Set bevorzugter Bedingungen verwendet eine Reihe von Waschschritten, beginnend mit 6 × SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 Minuten (min), dann wiederholt mit 2 × SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 Minuten, und dann zweimal wiederholt mit 0,2 × SSC, 0,5% SDS bei 50°C für 30 Minuten. Ein bevorzugteres Set stringenter Bedingungen verwendet höhere Temperaturen, bei denen die Waschschritte identisch zu den obigen sind, mit der Ausnahme, dass die Temperatur für die beiden letzten 30 min-Waschschritte in 0,2 × SSC, 0,5% SDS auf 60°C erhöht wurde. Ein anderes bevorzugtes Set hochstringenter Bedingungen verwendet zwei letzte Waschschritte in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Die Hybridisierung erfordert, dass die beiden Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen umfassen, obwohl in Abhängigkeit von der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind.
Die geeignete Stringenz für die Hybridisierung von Nukleinsäuren hängt von der Länge der Nukleinsäuren und dem Grad der Komplementarität ab, Variablen, die in der Technik wohlbekannt sind. Je größer das Ausmaß der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen den beiden Nukleotidsequenzen ist, umso größer ist der Wert von T_m für Hybride von Nukleinsäuren, die diese Sequenzen besitzen. Die relative Stabilität (entsprechend einem höheren T_m) von Nukleinsäurehybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Für Hybride von mehr als 100 Nukleotiden Länge sind Gleichungen zur Berechnung von T_m abgeleitet worden (siehe Sambrook et al., supra, 9.50–0.51). Für die Hybridisierung mit kürzeren Nukleinsäuren, d.h. mit Oligonukleotiden, wird die Position der Fehlpaarungen wichtiger, und die Länge des Oligonukleotids bestimmt dessen Spezifität (siehe Sambrook et al., supra, 11.7–11.8).
Bei einer Ausführungsform beträgt die Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure wenigstens etwa 10 Nukleotide. Bevorzugt beträgt eine Minimallänge für eine hybridisierbare Nukleinsäure wenigstens etwa 15 Nukleotide, bevorzugter wenigstens etwa 20 Nukleotide, und am bevorzugtesten beträgt die Länge wenigstens 30 Nukleotide. Der begabte Fachmann wird weiterhin erkennen, dass die Temperatur und die Salzkonzentration in der Waschlösung eingestellt werden können, wie es gemäß Faktoren, wie etwa der Länge der Sonde, notwendig ist.
Der Begriff „Sonde" bezieht sich auf ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das mit einer komplementären einzelsträngigen Zielnukleinsäure basenpaaren kann, um ein doppelsträngiges Molekül auszubilden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" auf eine Nukleinsäure, allgemein von wenigstens 18 Nukleotiden, die an ein genomisches DNA-Molekül, ein cDNA-Molekül, eine Plasmid-DNA oder ein mRNA-Molekül hybridisieren kann. Oligonukleotide können markiert werden, z.B. mit ³²P-Nukleotiden oder mit Nukleotiden, an die eine Markierung, wie etwa Biotin, kovalent konjugiert worden ist. Ein markiertes Oligonukleotid kann als Sonde verwendet werden, um die Anwesenheit einer Nukleinsäure zu detektieren. Oligonukleotide (von denen einer oder beide markiert werden können) können als PCR-Primer verwendet werden, entweder zum Klonieren einer Nukleinsäure voller Länge oder eines Fragments einer Nukleinsäure, oder, um die Gegenwart einer Nukleinsäure zu detektieren. Ein Oligonukleotid kann auch verwendet werden, um eine Tripelhelix mit einem DNA-Molekül auszubilden. Im allgemeinen werden Oligonukleotide synthetisch hergestellt, bevorzugt mittels eines Nukleinsäuresynthesegeräts. Entsprechend können Oligonukleotide mit nicht natürlich vorkommenden Phosphoester-Analoga-Bindungen, wie etwa Thioesterbindungen, etc. hergestellt werden.
Ein „Primer" ist ein Oligonukleotid, das an eine Zielnukleinsäuresequenz hybridisiert, um eine doppelsträngige Nukleinsäureregion zu erzeugen, die als Startpunkt für die DNA-Synthese unter geeigneten Bedingungen dienen kann. Solche Primer können bei einer Polymerasekettenreaktion verwendet werden.
„Polymerasekettenreaktion" wird mit PCR abgekürzt und bezeichnet ein in vitro-Verfahren für die enzymatische Amplifikation spezifischer Nukleinsäuresequenzen. Die PCR beinhaltet eine Wiederholungsreihe von Temperaturzyklen, wobei jeder Zyklus drei Stufen umfasst: Denaturieren der Matrizennukleinsäure zur Auftrennung der Stränge des Zielmoleküls, Anhybridisieren eines einzelsträngigen PCR-Oligonukleotid-Primers an die Matrizen-Nukleinsäure und Verlängern des/der anhybridisierten Primers/Primer durch DNA-Polymerase. Die PCR liefert ein Mittel zur Detektion der Anwesenheit des Zielmoleküls und, unter quantitativen oder semiquantitativen Bedingungen, zur Bestimmung der relativen Menge dieses Zielmoleküls in dem Ausgangspool der Nukleinsäuren.
„Reverse Transkriptions-Polymerasekettenreaktion" wird mit RT-PCR abgekürzt und bezeichnet ein in vitro-Verfahren zur enzymatischen Herstellung eines Ziel-cDNA-Moleküls oder von Ziel-cDNA-Molekülen aus einem RNA-Molekül oder -Molekülen, gefolgt von enzymatischer Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz oder Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Ziel-cDNA-Moleküls oder der Ziel-cDNA-Moleküle, wie oben beschrieben. Die RT-PCR liefert außerdem ein Mittel zum Detektieren der Gegenwart des Zielmoleküls und, unter quantitativen oder semiquantitativen Bedingungen, zur Bestimmung der relativen Menge dieses Zielmoleküls innerhalb des Ausgangspools von Nukleinsäuren.
Eine DNA „codierender Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die in vitro oder in vivo transkribiert und in ein Polypeptid in einer Zelle translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gestellt wird. „Geeignete regulatorische Sequenzen" beziehen sich auf Nukleotidsequenzen, die stromaufwärts (5'-nichtcodierende Sequenzen), innerhalb oder stromabwärts (3'-nichtcodierende Sequenzen) zu einer codierenden Sequenz positioniert sind, und die die Transkription, RNA-Prozessierung oder RNA-Stabilität oder die Translation der assoziierten codierenden Sequenz beeinflussen. Regulatorische Sequenzen können Promotoren, Translations-Leader-Sequenzen, Introns, Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen, RNA-Prozessierungsstellen, Effektorbindungsstellen und Stamm-Schleife-Strukturen beinhalten. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'-(Amino)-Terminus und ein Translationsstopcodon am 3' (Carboxy)-Terminus bestimmt. Eine codierende Sequenz kann, ohne hierauf beschränkt zu sein, prokaryotische Sequenzen, cDNA aus mRNA, genomische DNA-Sequenzen und sogar synthetische DNA-Sequenzen beinhalten. Wenn die codierende Sequenz für die Expression in einer eukaryotischen Zelle vorgesehen ist, werden für gewöhnlich ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz in 3'-Position zu der codierenden Sequenz angeordnet sein.
„Offenes Leseraster" wird mir ORF abgekürzt und bedeutet eine Länge einer Nukleinsäuresequenz, entweder von DNA, cDNA oder RNA, die ein Translationsstartsignal oder Startcodon, wie etwa ATG oder AUG, umfasst, sowie ein Stopcodon, wobei diese Nukleinsäuresequenz potentiell in eine Polypeptidsequenz translatiert werden kann.
Der Begriff „Kopf-zu-Kopf" wird hier verwendet, um die Orientierung von zwei Polynukleotidsequenzen im Bezug aufeinander zu beschreiben. Zwei Polynukleotide sind in einer Kopf-zu-Kopf-Orientierung angeordnet, wenn das 5'-Ende des codierenden Strangs eines Polynukleotids angrenzt an das 5'-Ende des codierenden Strangs des anderen Polynukleotids, wodurch die Richtung der Transkription jedes Polynukleotids sich vom 5'-Ende des anderen Polynukleotids weg bewegt. Der Begriff „Kopf-zu-Kopf" kann mit (5')-zu-(5') abgekürzt werden und kann außerdem durch die Symbole (← →) oder (3'←5'5'→3') angezeigt werden.
Der Begriff „Schwanz-zu-Schwanz" wird hier verwendet, um die Orientierung von zwei Polynukleotidsequenzen im Bezug aufeinander zu beschreiben. Zwei Polynukleotide sind in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung angeordnet, wenn das 3'-Ende des codierenden Strangs eines Polynukleotids angrenzt an das 3'-Ende des codierenden Strangs des anderen Polynukleotids, wodurch die Richtung der Transkription jedes Polynukleotids auf die des anderen Polynukleotids zuläuft. Der Begriff „Schwanz-zu-Schwanz" kann mit (3')-zu-(3') abgekürzt werden und kann außerdem durch die Symbole (→ ←) oder (5'→3'3'←5') angezeigt werden.
Der Begriff „Kopf-zu-Schwanz" wird hier verwendet, um die Orientierung von zwei Polynukleotidsequenzen im Bezug aufeinander zu beschreiben. Zwei Polynukleotide sind in einer Kopf-zu-Schwanz-Orientierung angeordnet, wenn das 5'-Ende des codierenden Strangs eines Polynukleotids angrenzt an das 3'-Ende des codierenden Strangs des anderen Polynukleotids, wodurch die Richtung der Transkription jedes Polynukleotids in derselben Richtung voranschreitet, wie die des anderen Polynukleotids. Der Begriff „Kopf-zu-Schwanz" kann mit (5')-zu-(3') abgekürzt werden und kann außerdem durch die Symbole (→ →) oder (5'→3'5'→3') angezeigt werden.
Der Begriff „stromabwärts" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die 3' zu der Referenznukleotidsequenz angeordnet ist. Insbesondere beziehen sich stromabwärtige Nukleotidsequenzen allgemein auf Sequenzen, die dem Startpunkt der Transkription nachgeschaltet sind. Beispielsweise ist das Translationsstartcodon eines Gens stromabwärts von der Startstelle der Transkription angeordnet.
Der Begriff „stromaufwärts" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die 5' zu der Referenznukleotidsequenz angeordnet ist. Insbesondere beziehen sich stromaufwärtige Nukleotidsequenzen allgemein auf Sequenzen, die auf der 5'-Seite von einer codierenden Sequenz oder dem Startpunkt der Transkription liegen. Beispielsweise sind die meisten Promotoren stromaufwärts von der Startstelle der Transkription angeordnet.
Die Begriffe „Restriktionsendonuklease" und „Restriktionsenzym" beziehen sich auf ein Enzym, das innerhalb einer spezifischen Nukleotidsequenz in einer doppelsträngigen DNA bindet und schneidet.
„Homologe Rekombination" bezieht sich auf die Insertion einer fremden DNA-Sequenz in ein anderes DNA-Molekül, z.B. die Insertion eines Vektors in ein Chromosom. Bevorzugt zielt der Vektor auf eine spezifische chromosomale Stelle für die homologe Rekombination ab. Für die spezifische homologe Rekombination wird der Vektor hinreichend lange Regionen der Homologie im Bezug auf Sequenzen des Chromosoms enthalten, um eine komplementäre Bindung und den Einbau des Vektors in das Chromosom zu erlauben. Längere Regionen der Homologie und größere Ausmaße an Sequenzähnlichkeit können die Effizienz der homologen Rekombination erhöhen.
Es können mehrere in der Technik bekannte Verfahren verwendet werden, um ein Polynukleotid gemäß der Erfindung zu vermehren. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und Wachstumsbedingungen etabliert sind, können rekombinante Expressionsvektoren vervielfältigt und quantitativ hergestellt werden. Wie hier beschrieben, beinhalten Expressionsvektoren, die verwendet werden können, ohne hierauf beschränkt zu sein, die folgenden Vektoren oder deren Derivate: Humanviren oder Tierviren, wie etwa Vacciniavirus oder Adenovirus; Insektenviren, wie etwa Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagen-Vektoren (z.B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige wenige zu nennen.
Ein „Vektor" ist jedwedes Mittel zum Klonieren und/oder zum Transfer einer Nukleinsäure in eine(r) Wirtszelle. Ein Vektor kann ein Replikon sein, an das ein anderes DNA-Segment angeheftet werden kann, um so die Replikation des angehefteten Segments zu bewirken. Ein „Replikon" ist jedwedes genetische Element (z.B. ein Plasmid, Phage, Cosmid, Chromosom, Virus), das in vivo als autonome Einheit der DNA-Replikation fungiert, d.h. das zur Replikation unter eigener Kontrolle befähigt ist. Der Begriff „Vektor" beinhaltet sowohl virale als auch nicht-virale Mittel zum Einführen der Nukleinsäure in eine Zelle in vitro, ex vivo oder in vivo. Es kann eine große Anzahl an in der Technik bekannten Vektoren verwendet werden, um Nukleinsäuren zu manipulieren, Antwortelemente und Promotoren in Gene einzubauen, etc. Mögliche Vektoren beinhalten z.B. Plasmide oder modifizierte Viren, einschließlich z.B. Bakteriophagen, wie etwa Lambda-Derivaten, oder Plasmiden, wie etwa pBR322- oder pUC-Plasmidderivate oder den Bluescript Vektor. Beispielsweise kann die Insertion des DNA-Fragments, das den Antwortelementen und Promotoren entspricht, in einen geeigneten Vektor erreicht werden durch Ligieren der geeigneten DNA-Fragmente in einen ausgewählten Vektor, der komplementäre, klebrige Enden besitzt. Alternativ können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden, oder es kann jede beliebige Stelle erzeugt werden, indem man Nukleotidsequenzen (Linker) in die DNA-Enden ligiert. Solche Vektoren können künstlich hergestellt werden, um selektierbare Markergene zu enthalten, um die Selektion von Zellen zu ermöglichen, die den Marker in das zelluläre Genom aufgenommen haben. Solche Marker erlauben die Identifizierung und/oder Selektion von Wirtszellen, die die von dem Marker codierten Proteine eingebaut haben und diese exprimieren.
Virale Vektoren und insbesondere retrovirale Vektoren sind bei einer breiten Vielzahl von Anwendungen zur Genauslieferung an Zellen und ebenso bei lebenden tierischen Subjekten verwendet worden. Virale Vektoren, die verwendet werden können, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Retroviren, Adeno-assoziierte Viren, Pockenviren, Baculoviren, Vaccinia, Herpes simplex, Epstein-Barr, Adenovirus, Geminivirus und „Caulimovirus"-Vektoren. Nicht virale Vektoren beinhalten Plasmide, Liposomen, elektrisch geladene Lipide (Cytofectine), DNA-Protein-Komplexe und Biopolymere. Zusätzlich zu einer Nukleinsäure kann ein Vektor außerdem eine oder mehrere regulatorische Regionen und/oder selektierbare Marker umfassen, die nützlich sind für das Selektieren, Messen und Überwachen von Ergebnissen der Nukleinsäureübertragung (Übertragung an welches Gewebe, Zeitdauer der Expression, etc.).
Der Begriff „Plasmid" bezieht sich auf ein extrachromosomales Element, das oft ein Gen trägt, das kein Bestandteil des zentralen Stoffwechsels der Zelle ist, und das für gewöhnlich in Form eines zirkulären doppelsträngigen DNA-Moleküls vorliegt. Solche Elemente können autonom replizierende Sequenzen sein, sich ins Genom integrierende Sequenzen, Phagen- oder Nukleotidsequenzen, linear, zirkulär oder mit Supercoil, mit einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, stammend aus beliebiger Quelle, bei denen eine Anzahl von Nukleotidsequenzen in eine singuläre Konstruktion angeschlossen oder rekombiniert wurde, die befähigt ist, ein Promotorfragment und DNA-Sequenzen für ein ausgewähltes Genprodukt zusammen mit passenden 3'-untranslatierten Sequenzen in eine Zelle einzuführen.
Ein Klonierungsvektor ist ein „Replikon", das eine Längeneinheit einer Nukleinsäure ist, bevorzugt von DNA, die sich sequenziell repliziert und die einen Replikationsursprung umfasst, wie etwa ein Plasmid, ein Phage oder Cosmid, an die ein anderes Nukleinsäuresegment angeheftet werden kann, um so die Replikation des angehefteten Segments zu bewirken. Klonierungsvektoren können zur Replikation in einem Zelltyp und zur Expression in einem anderen Zelltyp befähigt sein („Schaukelvektor").
Vektoren können durch in der Technik bekannte Verfahren in die gewünschten Wirtszellen eingeführt werden, z.B. durch Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Präzipitation, Lipofektion (Lysosomenfusion), durch Verwendung einer Genpistole oder eines DNA-Vektor-Transporters (siehe z.B. Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963–967; Wu und Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621–14624; und Hartmut et al., Kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, eingereicht am 15. März, 1990).
Ein Polynukleotid gemäß der Erfindung kann auch in vivo durch Lipofektion eingeführt werden. Im letzten Jahrzehnt hat es eine ansteigende Verwendung von Liposomen zum Einkapseln und zur Transfektion von Nukleinsäuren in vitro gegeben. Synthetische kationische Lipide, die dafür erstellt wurden, um die Schwierigkeiten und Gefahren zu begrenzen, die bei durch Liposomen vermittelter Transfektion auftreten, können verwendet werden, um Liposomen für die in vivo-Transfektion eines Gens, das einen Marker codiert, herzustellen (Felgner et al., 1987, PNAS 84: 7413; Mackey et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027–8031; und Ulmer et al., 1993, Science 259: 1745–1748). Die Verwendung kationischer Lipide kann die Verkapselung negativ geladener Nukleinsäuren unterstützen, und sie kann außerdem die Fusion mit negativ geladenen Zellmembranen fördern (Felgner und Ringold, 1989, Science 337: 387–388). Besonders nützliche Lipidverbindungen und Zusammensetzungen für die Übertragung von Nukleinsäuren sind in den internationalen Patentveröffentlichungen WO 95/18863 und WO 96/17823, sowie im US-Patent Nr. 5,459,127, beschrieben. Die Verwendung der Lipofektion zur Einführung exogener Gene in spezifische Organe in vivo hat gewisse praktische Vorteile. Die molekulare Zielsteuerung von Liposomen zu spezifischen Zellen stellt ein Gebiet von Nutzen dar. Es ist klar, dass die Zielsteuerung der Transfektion an bestimmte Zelltypen in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität, wie etwa der Pankreas, Leber, Niere und dem Gehirn, besonders bevorzugt wäre. Lipide können zum Zweck der Zielsteuerung chemisch an andere Moleküle gekoppelt werden (Mackey et al., 1988, supra). Zielgesteuerte Peptide, z.B. Hormone und Neurotransmitter, und Proteine, wie etwa Antikörper, oder Nicht-Peptidmoleküle können chemisch an Liposomen gekoppelt werden.
Andere Moleküle sind ebenfalls nützlich zum Erleichtern der Transfektion einer Nukleinsäure in vivo, wie etwa kationisches Oligopeptid (z.B. WO 95/21931), Peptide, die von DNA-bindenden Proteinen abgeleitet werden (z.B. WO 96/25508) oder ein kationisches Polymer (z.B. WO 95/21931).
Es ist außerdem möglich, einen Vektor in vivo als nacktes DNA-Plasmid einzuführen (siehe US-Patente 5,693,622; 5,589,466 und 5,580,859). Ansätze zur Rezeptor-vermittelten DNA-Auslieferung können ebenfalls verwendet werden (Curiel et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3: 147–154; und Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432).
Der Begriff „Transfektion" bedeutet die Aufnahme exogener oder heterologer RNA oder DNA durch eine Zelle. Eine Zelle ist durch eine exogene oder heterologe RNA oder DNA „transfiziert" worden, wenn eine solche RNA oder DNA in die Zelle eingeführt wurde. Eine Zelle ist durch exogene oder heterologe RNA oder DNA „transformiert" worden, wenn die transfizierte RNA oder DNA eine phänotypische Veränderung bewirkt. Die transformierende RNA oder DNA kann in die chromosomale DNA, die das Genom der Zelle ausmacht, integriert (d.h. kovalent mit dieser verbunden) werden.
„Transformation" bezieht sich auf die Übertragung eines Nukleinsäurefragments in das Genom eines Wirtsorganismus, was in genetisch stabiler Vererbung resultiert. Wirtsorganismen, die die transformierten Nukleinsäurefragmente enthalten, werden als „transgene" oder „rekombinante" oder „transformierte" Organismen bezeichnet.
Der Begriff „genetische Region" wird sich auf eine Region eines Nukleinsäuremoleküls oder eine Nukleotidsequenz beziehen, die ein Gen umfasst, das für ein Polypeptid codiert.
Zusätzlich kann der rekombinante Vektor, der ein Polynukleotid gemäß der Erfindung umfasst, ein oder mehrere Replikationsursprünge für die Replikation in den zellulären Wirten, in denen eine Amplifikation oder Expression gewünscht ist, sowie Marker oder Selektionsmarker beinhalten.
Der Begriff „Selektionsmarker" bezeichnet einen Identifizierungsfaktor, für gewöhnlich ein Antibiotika-Resistenzgen oder chemisches Resistenzgen, das auf Basis der Genwirkung des Markers selektiert werden kann, z.B. der Resistenz gegenüber einem Antibiotikum, der Resistenz gegenüber einem Herbizid, sowie colorimetrische Marker, Enzyme, Fluoreszenzmarker und dergleichen, wobei der Effekt verwendet wird, um die Vererbung einer Nukleinsäure von Interesse zu verfolgen und/oder um eine Zelle oder einen Organismus zu identifizieren, der die interessierende Nukleinsäure geerbt hat. Beispiele für selektierbare Markergene, die bekannt sind und in der Technik verwendet werden, beinhalten: Gene, die Resistenz verleihen gegenüber Ampicillin, Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Hygromycin, Bialaphos Herbizid, Sulfonamid und dergleichen; und Gene, die als phänotypische Marker verwendet werden, d.h. Antocyanin-regulatorische Gene, Isopentanyl-Transferasegen und dergleichen.
Der Begriff „Reportergen" bezeichnet eine Nukleinsäure, die für einen Faktor der Identifikation codiert, der auf Basis des Effekts des Reportergens identifiziert werden kann, wobei der Effekt verwendet wird, um die Vererbung einer Nukleinsäure von Interesse zu verfolgen, um eine Zelle oder einen Organismus zu identifizieren, der die Nukleinsäure von Interesse geerbt hat, und/oder um die Induktion der Genexpression oder die Transkription des Gens zu messen. Beispiele von Reportergenen, die bekannt sind und in der Technik verwendet werden, beinhalten: Luciferase (Luc), grünes Fluoreszenzprotein (GFP), Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), β-Galactosidase (LacZ), β-Glucuronidase (Gus) und dergleichen. Selektierbare Markergene können auch als Reportergene angesehen werden.
„Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die befähigt ist, die Expression einer codierenden Sequenz oder funktionellen RNA zu kontrollieren. Im allgemeinen ist eine codierende Sequenz 3' von einer Promotorsequenz angeordnet. Promotoren können in ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen abgeleitet werden, oder sie können aus verschiedenen Elementen aufgebaut sein, die von verschiedenen, in der Natur zu findenden Promotoren abgeleitet sind, oder sie können sogar synthetische DNA-Segmente beinhalten. Fachleute wissen, dass verschiedene Promotoren die Expression eines Gens in verschiedenen Geweben oder Zelltypen, oder bei verschiedenen Stufen der Entwicklung, oder in Reaktion auf verschiedene Umweltbedingungen oder physiologische Bedingungen steuern können. Promotoren, die die Expression eines Gens in den meisten Zelltypen während der meisten Zeit veranlassen, werden gewöhnlich als „konstitutive Promotoren" bezeichnet. Promotoren, die die Expression eines Gens in einem spezifischen Zelltyp bewirken, werden gewöhnlich als „zellspezifische Promotoren" oder „gewebespezifische Promotoren" bezeichnet. Promotoren, die die Expression eines Gens bei einem bestimmten Stadium der Entwicklung oder der Zelldifferenzierung bewirken, werden für gewöhnlich als „entwicklungsspezifische Promotoren" oder zelldifferenzierungsspezifische Promotoren" bezeichnet. Promotoren, die induziert werden und die Expression eines Gens bewirken, nachdem eine Exposition oder Behandlung der Zelle mit einem Mittel, biologischen Molekül, chemischen Stoff, Liganden, Licht oder dergleichen, das den Promotor induziert, erfolgt ist, werden gewöhnlich als „induzierbare Promotoren" oder „regulierbare Promotoren" bezeichnet. Da die exakten Grenzen regulatorischer Sequenzen in den meisten Fällen nicht vollständig definiert sind, ist ferner zu beachten, dass DNA-Fragmente verschiedener Längen identische Promotoraktivität besitzen können.
Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-regulatorische Region, die zur Bindung von RNA-Polymerase in einer Zelle und zur Initiation der Transkription einer stromabwärtigen (3'-Richtung) codierenden Sequenz befähigt ist. Um die vorliegende Erfindung zu definieren, wird die Promotorsequenz an ihrem 3'-Ende durch die Transkriptions-Initiationsstelle begrenzt und dehnt sich stromaufwärts (5'-Richtung) aus, um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen einzubeziehen, die notwendig sind, um die Transkription auf Niveaus zu initiieren, die detektierbar über dem Hintergrund liegen. Innerhalb der Promotorsequenz wird eine Transkriptionsstartstelle zu finden sein (praktischerweise definiert z.B. durch Kartieren mit Nuklease S1), ebenso wie Proteinbindungsdomänen (Konsensus-Sequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind.
Eine codierende Sequenz steht „unter der Kontrolle" transkriptioneller und translationaler Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann trans-RNA-gespleißt (wenn die codierende Sequenz Introns enthält) und in das von der codierenden Sequenz codierte Protein translatiert wird.
„Transkriptionelle und translationale Kontrollsequenzen" sind DNA-regulatorische Sequenzen, wie etwa Promotoren, Enhancer, Terminatoren und dergleichen, die die Expression einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle bereitstellen. Bei eukaryotischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.
Der Begriff „Antwortelement" bezeichnet ein oder mehrere cis-wirkende DNA-Elemente, die Antwortbereitschaft bei einem Promotor verleihen, vermittelt durch die Interaktion mit den DNA-bindenden Domänen des ersten chimären Gens. Dieses DNA-Element kann entweder pallindromisch (perfekt oder nicht perfekt) in seiner Sequenz sein oder aus Sequenzmotiven oder Halbelementen zusammengesetzt sein, die durch eine variable Anzahl von Nukleotiden getrennt sind. Die Halbelemente können ähnlich oder identisch sein und entweder als direkte oder invertierte Wiederholungssequenzen oder als einzelnes Halbelement oder Multimere von angrenzenden Halbelementen in Tandemanordnung angeordnet sein. Das Antwortelement kann einen Minimalpromotor umfassen, der in Abhängigkeit von der Natur der Zelle oder des Organismus, in den das Antwortelement eingebaut werden soll, aus verschiedenen Organismen isoliert sein kann. Die DNA-Bindungsdomäne des ersten Hybridproteins bindet in Gegenwart oder Abwesenheit eines Liganden an die DNA-Sequenz eines Antwortelements, um die Transkription eines stromabwärtigen Gens bzw. stromabwärtiger Gene unter der Regulation dieses Antwortelements zu starten oder zu supprimieren. Beispiele für DNA-Sequenzen von Antwortelementen des natürlichen Ecdysonrezeptors beinhalten: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (siehe Cherbas L. et al., (1991), Genes Dev. 5, 120–131); AGGTCAN_(n)AGGTCA, wobei N_(n) eines oder mehrere Abstandshalter-Nukleotide darstellen kann (siehe D'Avino PP. et al., (1995), Mol. Cell Endocrinol., 113, 1–9); und GGGTTGAATGAATTT (siehe Antoniewski C., et al., (1994), Mol. Cell Biol. 14, 4465–4474).
Der Begriff „funktionsfähig verbunden" bezieht sich auf die Assoziation einer Nukleinsequenz mit einem einzelnen Nukleinsäurefragment, sodass die Funktion des einen durch das andere beeinflusst wird. Beispielsweise ist ein Promotor funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn er befähigt ist, die Expression dieser codierenden Sequenz zu beeinflussen (d.h. die codierende Sequenz unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors steht). Die codierenden Sequenzen können in Sinn- oder Gegensinn (Antisense)-Orientierung funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen verbunden sein.
Der Begriff „Expression", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Transkription und stabile Akkumulation von Sense (mRNA) oder Antisense-RNA, abgeleitet von einer Nukleinsäure oder einem Polynukleotid. Expression kann sich außerdem auf die Translation von mRNA in ein Protein oder Polypeptid beziehen.
Die Begriffe „Kassette", Expressionskassette" und „Genexpressionskassette" beziehen sich auf ein Segment von DNA, das an spezifischen Restriktionsstellen oder durch homologe Rekombination in eine Nukleinsäure oder ein Polynukleotid inseriert werden kann. Das DNA-Segment umfasst ein Polynukleotid, das für ein interessierendes Polypeptid codiert, und die Kassette und die Restriktionsstellen sind dafür konzipiert, um die Insertion der Kassette im richtigen Leseraster für die Transkription und Translation sicherzustellen.
„Transformationskassette" bezieht sich auf einen spezifischen Vektor, der ein Polynukleotid umfasst, das für ein interessierendes Polypeptid codiert und zusätzlich zu dem Polynukleotid Elemente besitzt, die die Transformation einer bestimmten Wirtszelle erleichtern. Kassetten, Expressionskassetten, Genexpressionskassetten und Transformationskassetten der Erfindung können außerdem Elemente umfassen, die eine gesteigerte Expression eines Polynukleotids erlauben, das für ein interessierendes Polypeptid in einer Wirtszelle codiert. Diese Elemente können, ohne hierauf beschränkt zu sein, folgendes beinhalten: einen Promotor, einen minimalen Promotor, einen Enhancer, ein Antwortelement, eine Terminatorsequenz, eine Polyadenylierungssequenz, und dergleichen.
Für die Zwecke dieser Erfindung bezieht sich der Begriff „Genschalter" auf die Kombination eines Antwortelements, das mit einem Promotor assoziiert ist, und auf ein EcR-basiertes System, das in Gegenwart eines oder mehrerer Liganden die Expression eines Gens moduliert, in das das Antwortelement und der Promotor eingebaut sind.
Die Begriffe „modulieren" und „moduliert" meinen das Induzieren, Reduzieren oder Inhibieren der Nukleinsäure- oder Genexpression, was in einer entsprechenden Induktion, Reduktion oder Inhibition der Produktion des Proteins oder Polypeptids resultiert.
Die Plasmide oder Vektoren gemäß der Erfindung können weiterhin wenigstens einen Promotor beinhalten, der geeignet ist, um die Expression eines Gens in einer Wirtszelle anzutreiben. Der Begriff „Expressionsvektor" bezeichnet einen Vektor, ein Plasmid oder Vehikel, das dafür ausgestaltet ist, um die Expression einer inserierten Nukleinsäuresequenz nach der Transformation in den Wirt zu ermöglichen. Das klonierte Gen, d.h. die inserierte Nukleinsäuresequenz, wird gewöhnlich unter die Kontrolle von Kontrollelementen gestellt, wie etwa einem Promotor, einem Minimalpromotor, einem Enhancer oder dergleichen. Die Startkontrollregionen oder Promotoren, die nützlich sind, um die Expression einer Nukleinsäure in der gewünschten Wirtszelle anzutreiben, sind zahlreich und sind Fachleuten bekannt. Es ist praktisch jedweder Promotor, der zum Antreiben dieser Gene befähigt ist, geeignet für die vorliegende Erfindung, darunter, ohne hierauf beschränkt zu sein, virale Promotoren, Pflanzenpromotoren, Bakterienpromotoren, Tierpromotoren, Säugerpromotoren, synthetische Promotoren, konstitutive Promotoren, gewebespezifische Promotoren, entwicklungsspezifische Promotoren, induzierbare Promotoren, lichtregulierte Promotoren; Promotoren von CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI und alkalischer Phosphatase (nützlich für die Expression in Saccharomyces); AOX1-Promotor (nützlich für die Expression in Pichia); Promotoren von β-Lactamase, lac, ara, tet, trp, IP_L, IP_R, T7, tac und trc (nützlich für die Expression in Escherichia coli); sowie lichtregulierte, samenspezifische, pollenspezifische, ovarienspezifische, Pathogenese- oder Erkrankungs-bezogene Promotoren, Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor, CMV 35S Minimal-Promotor, Cassava Venenmosaikvirus (CsVMV)-Promotor, der Promotor von Chlorophyll a/b Bindeprotein, Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase, sprossspezifischer Promotor, wurzelspezifischer Promotor, Chitinase-Promotor, stressinduzierbarer Promotor, Reis-Tungro-Bacilliformvirus-Promotor, Pflanzensuper-Promotor, Promotoren von Kartoffel-Leucin-Aminopeptidase, Nitratreduktase, Mannopinsynthase, Nopalinsynthase, Ubiquitin, Zein-Protein und Anthocyanin (nützlich für die Expression in Pflanzenzellen). Tier- und Säugerpromotoren, die in der Technik bekannt sind, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die frühe SV40 (SV40e)-Promotorregion, den Promotor, der in der 3'-ständigen langen terminalen Sequenzwiederholung (LTR) von Rous Sarcomavirus (RSV) enthalten ist, die Promotoren von E1A oder den späten Hauptpromotor (MLP)-Genen von Adenoviren, den frühen Cytomegalievirus-Promotor, den Thymidinkinase (TK)-Promotor von Herpes simplex-Virus (HSV), einen Promotor aus Elongationsfaktor 1 alpha (EF1), einen Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor, einen Ubiquitin (Ubc)-Promotor, einen Albuminpromotor, die regulatorischen Sequenzen des Maus-Metallothionein-L-Promotors und transkriptionelle Kontrollregionen, die ubiquitären Promotoren (HPRT, Vimentin, α-Actin, Tubulin und dergleichen), die Promotoren der Intermediärfilamente (Desmin, Neurofilamente, Keratin, GFAP und dergleichen), die Promotoren therapeutischer Gene (von MDR, CFTR oder vom Faktor VIII-Typ und dergleichen), und Promotoren, die Gewebespezifität zeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden, wie etwa die Elastase I Gen-Kontrollregion, die in Pankreas-Acinus-Zellen aktiv ist, die Insulingen-Kontrollregion, die in Pankreas-beta-Zellen aktiv ist, die Immunglobulingen-Kontrollregion, die in lymphoiden Zellen aktiv ist, die Maus-Brusttumorvirus-Kontrollregion, die in Hoden-, Brust-, lymphoiden und Mastzellen aktiv ist; Albumingen, Apo AI und Apo AII-Kontrollregionen, die in Leber aktiv sind, die alpha-Fetoproteingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist, die Alpha 1-Antitrypsingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist, die beta-Globingen-Kontrollregion, die in myeloiden Zellen aktiv ist, die Myelin-Basic-Proteingen-Kontrollregion, die in Oligodendrozytenzellen im Gehirn aktiv ist, die Kontrollregion des Gens der leichten Myosinkette 2, die im Skelettmuskel aktiv ist und die Kontrollregion des Gens des Gonadodropin-Releasing-Hormons, die im Hypothalamus aktiv ist, der Pyruvatkinase-Promotor, der Villinpromotor, der Promotor des Fettsäure-bindenden Darmproteins, der Promotor von α-Actin aus glatten Muskelzellen und dergleichen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Promotor ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Blumenkohl-Mosaikvirus 35S-Promotor, einem Cassava-Venenmosaikvirus-Promotor, und einem Blumenkohlmosaikvirus 35S-Minimal-Promotor, einem Elongationsfaktor 1 alpha (EF1)-Promotor, einem Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor, einem Ubiquitin (Ubc)-Promotor und einem Albumin-Promotor. Zusätzlich können diese Expressionssequenzen durch das Hinzufügen von Enhancer-Sequenzen oder regulatorischen Sequenzen und dergleichen modifiziert werden.
Enhancer, die in den Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden können, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, den Tabakmosaikvirus-Enhancer, den Blumenkohlmosaikvirus 35S-Enhancer, den Tabak-Ätzvirus-Enhancer, den Ribulose-1,5-Bisphosphatcarboxylase-Enhancer, den Reis-Tungro-Bacilliformvirus-Enhancer und andere Pflanzen- und Virusgen-Enhancer und dergleichen.
Terminierungskontrollregionen, d.h. Terminator- oder Polyadenylierungssequenzen, können ebenfalls aus verschiedenen Genen abgeleitet werden, die für die bevorzugten Wirte nativ sind. Optional kann eine Terminierungsstelle unnötig sein, es ist jedoch am bevorzugtesten, wenn sie einbezogen wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Terminationskontrollregion eine synthetische Sequenz umfassen oder von dieser abgeleitet sein, z.B. ein synthetisches Polyadenylierungssignal, ein SV 40 spätes Polyadenylierungssignal, ein SV40 Polyadenylierungssignal, ein Polyadenylierungssignal aus Rinderwachstumshormon (BGH), Terminatorsequenzen aus Nopalinsynthase (nos), aus Blumenkohlmosaikvirus (CaMV), aus Octopin-Synthase (ocs), Agrocateum, virale und pflanzliche Terminatorsequenzen oder dergleichen.
Die Begriffe „3'-nicht-codierende Sequenzen" oder „3'-untranslatierte Region (UTR)" beziehen sich auf DNA-Sequenzen, die stromabwärts (3') von einer codierenden Sequenz angeordnet sind und Polyadenylierungs-[poly(A)]-Erkennungssequenzen und andere Sequenzen umfassen können, die für regulatorische Signale codieren, die befähigt sind, die mRNA-Prozessierung oder Genexpression zu beeinflussen. Das Polyadenylierungssignal ist für gewöhnlich dadurch gekennzeichnet, dass es die Anfügung von Polyadenylsäure-Abschnitten an das 3'-Ende des mRNA-Vorläufers beeinflusst.
„Regulatorische Region" meint eine Nukleinsäuresequenz, die die Expression einer zweiten Nukleinsäuresequenz reguliert. Eine regulatorische Region kann Sequenzen beinhalten, die in natürlicher Weise für die Expression einer bestimmten Nukleinsäure (einer homologen Region) verantwortlich sind, oder sie kann Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs beinhalten, die verantwortlich sind für das Exprimieren verschiedener Proteine oder sogar von synthetischen Proteinen (einer heterologen Region). Insbesondere können die Sequenzen Sequenzen prokaryotischer, eukaryotischer oder viraler Gene sein oder abgeleitete Sequenzen, die die Transkription eines Gens in einer spezifischen oder unspezifischen Weise bzw. in einer induzierbaren oder nicht-induzierbaren Weise stimulieren oder reprimieren. Regulatorische Regionen beinhalten Replikationsursprünge, RNA-Spleißstellen, Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminationssequenzen, und Signalsequenzen, die das Polypeptid in den sekretorischen Stoffwechselweg der Zielzelle leiten.
Eine regulatorische Region aus einer „heterologen Quelle" ist eine regulatorische Region, die natürlicherweise nicht mit der exprimierten Nukleinsäure assoziiert ist. Einbezogen unter die heterologen regulatorischen Regionen sind regulatorische Regionen aus unterschiedlichen Spezies, regulatorische Regionen aus einer anderen Spezies, regulatorische Hybridsequenzen und regulatorische Sequenzen, die nicht in der Natur vorkommen, jedoch vom Durchschnittsfachmann erstellt worden sind.
„RNA-Transkript" bezieht sich auf das Produkt, das aus der von RNA-Polymerase katalysierten Transkription einer DNA-Sequenz resultiert. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz ist, wird es als das Primärtranskript bezeichnet, oder es kann eine RNA-Sequenz sein, die durch eine posttranskriptionale Prozessierung des Primärtranskripts abgeleitet wird und als reife RNA bezeichnet wird. „Messenger-RNA (mRNA)" bezieht sich auf die RNA, die ohne Introns ist und die von der Zelle in Protein translatiert werden kann. „cDNA" bezieht sich auf eine doppelsträngige DNA, die von der mRNA abgeleitet ist und komplementär zu dieser ist. „Sinn-RNA (Sense-RNA)" bezieht sich auf ein RNA-Transkript, das die mRNA beinhaltet und so von der Zelle in Protein translatiert werden kann. „Gegensinn-RNA (Antisense-RNA)" bezieht sich auf ein RNA-Transkript, das komplementär zur Gesamtheit oder zu einem Teil eines Primärtranskripts oder einer mRNA eines Ziels ist und das die Expression eines Zielgens blockiert. Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann sich auf einen beliebigen Teil des spezifischen Gentranskripts beziehen, d.h. auf die 5'-nichtcodierende Sequenz, die 3'-nicht-codierende Sequenz oder die codierende Sequenz. „Funktionelle RNA" bezieht sich auf Antisense-RNA, Ribozym-RNA oder eine andere RNA, die nicht translatiert wird, jedoch eine Wirkung auf zelluläre Prozesse hat.
Ein „Polypeptid" ist eine polymere Verbindung, die aus kovalent verbundenen Aminosäureresten besteht. Aminosäuren besitzen die folgende allgemeine Struktur:
Aminosäuren werden auf Basis der Seitenkette R in sieben Gruppen einklassifiziert: (1) aliphatische Seitenketten, (2) Seitenketten mit einer Hydroxyl (OH)-gruppe, (3) Seitenketten mit Schwefelatomen, (4) Seitenketten, die eine Säure- oder Amidgruppe enthalten, (5) Seitenketten, die eine basische Gruppe enthalten, (6) Seitenketten, die einen aromatischen Ring enthalten und (7) Prolin, eine Iminosäure, bei der die Seitenkette mit der Aminogruppe fusioniert ist. Ein Polypeptid der Erfindung umfasst bevorzugt wenigstens etwa 14 Aminosäuren.
Ein „Protein" ist ein Polypeptid, das eine strukturelle oder funktionelle Rolle in einer lebenden Zelle ausübt.
Ein „isoliertes Polypeptid" oder ein „isoliertes Protein" ist ein Polypeptid oder Protein, das weitgehend frei von solchen Verbindungen ist, die in seinem natürlichen Zustand normalerweise damit assoziiert sind (z.B. andere Proteine oder Polypeptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate Lipide). „Isoliert" bedeutet keinen Ausschluss künstlicher oder synthetischer Gemische mit anderen Verbindungen oder die Gegenwart von Verunreinigungen, die nicht störend in die biologische Aktivität eingreifen, und die z.B. aufgrund unvollständiger Reinigung, der Zugabe von Stabilisatoren oder der Einbindung in eine pharmazeutisch verträgliche Präparation vorhanden sein können.
„Fragment" eines Polypeptids gemäß der Erfindung ist so zu verstehen, dass es ein Polypeptid meint, dessen Aminosäuresequenz kürzer ist als die des Referenzpolypeptids und das über diesen gesamten Teilbereich mit diesem Referenzpolypeptid eine identische Aminosäuresequenz umfasst. Solche Fragmente können, da wo es angemessen ist, in ein größeres Polypeptid einbezogen sein, von dem sie einen Teil ausmachen. Solche Fragmente eines Polypeptids gemäß der Erfindung können eine Länge von 10, 15, 20, 30 bis 40, 50, 100, 200 oder 300 Aminosäuren besitzen.
Eine „Variante" eines Polypeptids oder Proteins ist ein beliebiges Analoges, Fragment, Derivat oder eine Mutante, die von einem Polypeptid oder Protein abgeleitet ist, und die wenigstens eine biologische Eigenschaft des Polypeptids oder Proteins beibehält. Es können verschiedene Varianten des Polypeptids oder Proteins in der Natur vorkommen. Diese Varianten können allelische Variationen sein, die durch Unterschiede in den Nukleotidsequenzen des Strukturgens, das für das Protein codiert, gekennzeichnet sind, oder sie können differenzielles Spleißen oder posttranslationale Modifikation beinhalten. Der begabte Techniker kann Varianten herstellen, die einzelne oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Additionen oder Austausche besitzen. Diese Varianten können unter anderem folgendes beinhalten: (a) Varianten, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste mit konservativen oder nicht-konservativen Aminosäuren substituiert sind, (b) Varianten, bei denen ein oder mehrere Aminosäuren an das Polypeptid oder Protein addiert sind, (c) Varianten, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren eine Substituentengruppe beinhalten, und (d) Varianten, bei denen das Polypeptid oder Protein mit einem anderen Polypeptid fusioniert ist, wie etwa mit Serumalbumin. Die Technik zur Gewinnung dieser Varianten, einschließlich genetischen (Suppressionen, Deletionen, Mutationen, etc.), chemischen und enzymatischen Techniken, sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Ein variantes Polypeptid umfasst bevorzugt wenigstens etwa 14 Aminosäuren.
Ein „heterologes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das nicht natürlich in der Zelle produziert wird.
Ein „reifes Protein" bezieht sich auf ein posttranslational prozessiertes Polypeptid, d.h. eines, aus dem alle Prä- oder Pro-Peptide, die im primären Translationsprodukt vorhanden sind, entfernt worden sind. „Vorläuferprotein" bezieht sich auf das primäre Produkt der Translation von mRNA, d.h. mit noch vorhandenen Prä- und Pro-Peptiden. Prä- und Pro-Peptide können, ohne hierauf beschränkt zu sein, intrazelluläre Lokalisationssignale sein.
Der Begriff „Signalpeptid" bezieht sich auf ein aminoterminales Polypeptid, das dem sekretierten reifen Protein vorangeht. Das Signalpeptid wird von diesem abgespalten und ist daher nicht im reifen Protein vorhanden. Signalpeptide haben die Funktion, sekretierte Proteine über Zellmembranen zu leiten und zu translozieren. Das Signalpeptid wird auch als Signalprotein bezeichnet.
Eine „Signalsequenz" ist am Beginn der codierenden Sequenz eines auf der Zelloberfläche zu exprimierenden Proteins einbezogen. Diese Sequenz codiert für ein Signalpeptid, das N-terminal des reifen Polypeptids liegt, und das die Wirtszelle dazu veranlasst, das Polypeptid zu translozieren. Der Begriff „Translokationssignalsequenz" wird hier verwendet, um sich auf diese Art der Signalsequenz zu beziehen. Translokationssignalsequenzen können assoziiert mit einer Vielzahl von Proteinen gefunden werden, die für Eukaryoten und Prokaryoten nativ sind, und die oft in beiden Typen von Organismen funktionell sind.
Der Begriff „Homologie" bezieht sich auf den Prozentwert der Identität zwischen zwei Polynukleotid- oder zwei Polypeptidgruppierungen. Die Übereinstimmung zwischen der Sequenz einer Gruppierung mit einer anderen Gruppierung kann durch in der Technik bekannte Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise kann die Homologie durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation zwischen zwei Polypeptidmolekülen bestimmt werden, indem man die Sequenzinformation einem Alignment unterzieht und problemlos verfügbare Computerprogramme benutzt. Alternativ kann die Homologie bestimmt werden durch Anhybridisierung von Polynukleotiden unter Bedingungen, die stabile Duplizes zwischen homologen Regionen ausbilden, gefolgt vom Verdau mit einzelstrangspezifischer/-spezifischen Nuklease(n) und einer Größenbestimmung der verdauten Fragmente.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „homolog" in allen seinen grammatikalischen Formen und Schreibvarianten auf die Beziehung zwischen Proteinen, die einen „gemeinsamen evolutionären Ursprung" besitzen, einschließlich Proteinen aus Superfamilien (z.B. der Immunglobulinsuperfamilie) und homologen Proteinen aus unterschiedlichen Spezies (z.B. leichte Myosinkette, etc.). (Reek et al., 1987, Cell 50: 667). Solche Proteine (und ihre codierenden Gene) besitzen Sequenzhomologie, wie es sich im hohen Ausmaß ihrer Sequenzähnlichkeit widerspiegelt.
Entsprechend bezieht sich der Begriff „Sequenzähnlichkeit" in allen seinen grammatikalischen Formen auf das Ausmaß der Identität oder Entsprechung zwischen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen von Proteinen, die einen gemeinsamen evolutionären Ursprung haben oder nicht haben können (siehe Reek et al., 1987, Cell 50: 667). Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „homolog" in allen seinen grammatikalischen Formen und Schreibvarianten auf die Beziehung zwischen Proteinen, die einen „gemeinsamen evolutionären Ursprung" besitzen, einschließlich Proteinen aus Superfamilien und homologen Proteinen aus unterschiedlichen Spezies (Reek et al., supra). Solche Proteine (und die sie codierenden Gene) besitzen eine Sequenzhomologie, die durch das hohe Ausmaß an Sequenzähnlichkeit widergespiegelt wird. Jedoch, bei der üblichen Verwendung und in der vorliegenden Anmeldung, kann der Begriff „homolog", wenn er mit einem Adverb, wie etwa „hochgradig" modifiziert wird, sich auf Sequenzähnlichkeit und nicht auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung beziehen.
Bei einer spezifischen Ausführungsform sind die zwei DNA-Sequenzen „weitgehend homolog" oder „im wesentlichen ähnlich", wenn wenigstens etwa 50% (bevorzugt wenigstens etwa 75% und am bevorzugtesten wenigstens etwa 90% oder 95%) der Nukleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen übereinstimmen. Sequenzen, die weitgehend homolog sind, können identifiziert werden durch Vergleichen der Sequenzen unter Verwendung von Standard-Software, die in Sequenzdatenbanken verfügbar ist, oder in einem Southern Hybridisierungsexperiment unter z.B. stringenten Bedingungen, wie für dieses spezielle System definiert. Das Definieren geeigneter Hybridisierungsbedingungen liegt im Bereich der Fähigkeiten auf dem technischen Gebiet (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra).
Wie hier verwendet, bezieht sich „weitgehend ähnlich" auf Nukleinsäurefragmente, bei denen Änderungen in einer oder mehreren Nukleotidbasen in der Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren resultieren, wobei jedoch nicht die funktionellen Eigenschaften des von der DNA-Sequenz codierten Proteins beeinflusst werden. „Weitgehend ähnlich" bezieht sich auch auf Nukleinsäurefragmente, bei denen Änderungen in einer oder mehreren Nukleotidbasen die Fähigkeit des Nukleinsäurefragments, die Veränderung der Genexpression durch Antisense- oder Co-Suppressionstechnologie zu vermitteln, nicht beeinflussen. „Weitgehend ähnlich" bezieht sich auch auf Modifikationen der Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung, wie etwa die Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Nukleotidbasen, die die funktionellen Eigenschaften des resultierenden Transkripts nicht wesentlich beeinflussen. Es versteht sich daher, dass die Erfindung mehr als die spezifischen Beispielsequenzen umfasst. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen liegt ohne weiteres im Bereich der technischen Routinefähigkeiten, ebenso wie die Bestimmung des Erhalts der biologischen Aktivität der codierten Produkte.
Darüber hinaus erkennt der befähigte Fachmann, dass weitgehend ähnliche Sequenzen, die von dieser Erfindung umfasst werden, auch durch ihre Befähigung zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen (0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C und waschen mit 2 × SSC, 0,1% SDS, gefolgt von 0,1 × SSC, 0,1% SDS) mit den hier beispielhaft genannten Sequenzen definiert werden. Weitgehend ähnliche Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung sind diejenigen Nukleinsäurefragmente, deren DNA-Sequenzen zu wenigstens 70% identisch zu der DNA-Sequenz der hier beschriebenen Nukleinsäurefragmente sind. Bevorzugte weitgehend ähnliche Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung sind solche Nukleinsäurefragmente, deren DNA-Sequenzen zu wenigstens 80% identisch mit den DNA-Sequenzen der hier beschriebenen Nukleinsäurefragmente sind. Bevorzugtere Nukleinsäurefragmente sind zu wenigstens 90% identisch zu der DNA-Sequenz der hier beschriebenen Nukleinsäurefragmente. Noch bevorzugter sind Nukleinsäurefragmente, die zu wenigstens 95% identisch zur DNA-Sequenz der hier beschriebenen Nukleinsäurefragmente sind.
Zwei Aminosäuresequenzen sind „weitgehend homolog" oder „weitgehend ähnlich", wenn mehr als etwa 40% der Aminosäuren identisch sind, oder wenn mehr als 60% ähnlich (funktionell identisch) sind. Vorzugsweise werden die ähnlichen oder homologen Sequenzen durch Alignment identifiziert, wobei z.B. das GCG-Programm „Pileup" (Genetics Computer Group, Programmhandbuch für das GCG-Paket, Version 7, Madison, Wisconsin) verwendet werden kann.
Der Begriff „entsprechend (zu)" wird hier verwendet, um sich auf ähnliche oder homologe Sequenzen zu beziehen, egal, ob die exakte Position nun identisch oder verschieden gegenüber dem Molekül ist, im Vergleich mit dem die Ähnlichkeit oder Homologie gemessen wird. Ein Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz-Alignment kann Zwischenräume enthalten. Somit bezieht sich der Begriff „entsprechend (zu)" auf Sequenzähnlichkeit und nicht auf die Nummerierung der Aminosäurereste oder Nukleotidbasen.
Ein „wesentlicher Teil einer Aminosäure- oder Nukleotidsequenz" umfasst genug von der Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder der Nukleotidsequenz eines Gens, um dieses Polypeptid oder Gen putativ zu identifizieren, entweder durch manuelle Bewertung der Sequenz durch einen Fachmann oder durch Computer-automatisierten Sequenzvergleich und Identifizierung unter Verwendung von Algorithmen, wie etwa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F. et al., (1993) J. Mol. Biol. 215: 403–410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Im allgemeinen ist eine Sequenz von zehn oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren oder dreißig oder mehr Nukleotiden notwendig, um eine Polypeptid- oder Nukleinsäuresequenz als putativ homolog zu einem bekannten Protein oder Gen zu identifizieren. Darüber hinaus, im Hinblick auf die Nukleotidsequenzen, können genspezifische Oligonukleotid-Sonden mit 20–30 zusammenhängenden Nukleotiden in sequenzabhängigen Verfahren der Genidentifizierung (z.B. Southern Hybridisierung) und Isolierung (z.B. in situ-Hybridisierung von Bakterienkolonien oder Bakteriophagenplaques) verwendet werden. Zusätzlich können kurze Oligonukleotide von 12–15 Basen als Amplifikations-Primer bei der PCR verwendet werden, um ein bestimmtes Nukleinsäurefragment zu erhalten, das die Primer umfasst. Entsprechend umfasst ein „wesentlicher Anteil" einer Nukleotidsequenz genug von der Sequenz, um ein Nukleinsäurefragment, das die Sequenz umfasst, spezifisch zu identifizieren und/oder zu isolieren.
Der Begriff „prozentuale Identität", wie er in der Technik bekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, wie sie durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt wird. In der Technik bedeutet „Identität" auch das Ausmaß der Sequenzverwandtschaft zwischen (je nach Fall) Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, wie bestimmt durch die Übereinstimmung zwischen Abschnitten solcher Sequenzen. „Identität" und „Ähnlichkeit" können problemlos durch bekannte Verfahren berechnet werden, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, derjenigen, die beschrieben sind in: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Herausgeber) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Herausgeber) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., und Griffin, H. G., Herausgeber) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Herausgeber) Academic Press (1987); und Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. und Devereux, J., Herausgeber) Stockton Press, New York (1991). Es werden bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität dafür erstellt, um die beste Trefferübereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu ergeben. Verfahren zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit sind in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen kodifiziert. Sequenzalignments und die Berechnung prozentualer Identität können durchgeführt werden unter Verwendung des Megalign-Programms der LASERGENE Bioinformatics Computing Suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). Es können multiple Alignments der Sequenzen durchgeführt werden, indem man das Clusterverfahren des Alignments verwendet (Higgins und Sharp (1989) CABIOS 5: 151–153), und zwar mit den Default-Parametern (GAP PENALTY („Lückenstrafe") = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10). Die Default-Parameter für ein paarweises Alignment unter Verwendung des Clusterverfahrens können ausgewählt werden: KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 und DIAGONALS SAVED = 5.
Der Begriff „Sequenzanalysesoftware" bezieht sich auf jeden Computeralgorithmus oder jedwedes Softwareprogramm, der/das für die Analyse der Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen nützlich ist. „Sequenzanalysesoftware" kann kommerziell erhältlich sein oder unabhängig entwickelt werden. Typische Sequenzanalysesoftware wird, ohne hierauf beschränkt zu sein, folgendes beinhalten: die GCG-Suite von Programmen (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990); und DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA). Im Zusammenhang dieser Anmeldung versteht es sich, dass dort, wo Sequenzanalysesoftware für die Analyse verwendet wird, die Ergebnisse der Analyse auf den „Default-Werten" des als Referenz genannten Programms basieren, solange nichts anders angegeben ist. Wie hier verwendet, meinen „Default-Werte (voreingestellte Werte)" jeden Satz von Werten oder Parametern, die in originärer Weise geladen werden, wenn die Software zum ersten Mal gestartet wird.
„Synthetische Gene" können aus Oligonukleotid-Bausteinen („Aufbaublöcken") zusammengebaut werden, die unter Verwendung von Prozeduren, die Fachleuten bekannt sind, chemisch synthetisiert werden. Diese Aufbaublöcke werden ligiert und einem Alignment unterzogen, um Gensegmente auszubilden, die dann enzymatisch zusammengebaut werden, um das vollständige Gen zu konstruieren. „Chemisch synthetisiert", wie auf eine DNA-Sequenz bezogen, bedeutet, dass die Komponenten-Nukleotide in vitro zusammengebaut wurden. Eine manuelle chemische Synthese von DNA kann unter Verwendung gut etablierter Prozeduren durchgeführt werden, oder es kann automatisierte chemische Synthese unter Verwendung einer Anzahl kommerziell erhältlicher Maschinen durchgeführt werden. Dementsprechend können die Gene für eine optimale Genexpression auf Basis einer Optimierung der Nukleotidsequenz, die die Codon-Nutzung („Codon-Voreingenommenheit") der Wirtszelle widerspiegelt, für eine optimale Genexpression maßgeschneidert werden. Der begabte Techniker kann die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Genexpression einschätzen, wenn die Codon-Nutzung einseitig in Richtung der von dem Wirt favorisierten Codons ausgerichtet wird. Die Bestimmung der bevorzugten Codons kann auf der Untersuchung von Genen basieren, die aus der Wirtszelle stammen, wenn Sequenzinformation verfügbar ist.
Modulationssystem der Genexpression gemäß der Erfindung
Die Anmelder haben nun gezeigt, dass die Trennung der Transaktivierungsdomäne und der DNA-Bindungsdomäne, dadurch durchgeführt, dass sie auf zwei verschiedenen Proteinen platziert werden, in Abwesenheit eines Liganden in einer stark reduzierten Hintergrundaktivität resultiert, und die Aktivität signifikant über den Hintergrund hinaus ansteigt, wenn ein Ligand vorhanden ist. Das verbesserte Genexpressionssystem der Anmelder umfasst die Expression von zwei chimären Genen; hiervon codiert das erste für eine DNA-Bindungsdomäne in Fusion mit einem Kernrezeptor-Polypeptid, und das zweite codiert für eine Transaktivierungsdomäne in Fusion mit einem Kernrezeptor-Polypeptid. Die Interaktion des ersten Proteins mit dem zweiten Protein heftet die DNA-Bindungsdomäne effektiv an die Transaktivierungsdomäne. Da die DNA-Bindungsdomäne und die Transaktivierungsdomäne auf zwei verschiedenen Molekülen liegen, wird die Hintergrundaktivität in Abwesenheit von Ligand stark reduziert.
Im allgemeinen umfasst das induzierbare, die Genexpression modulierende System der Erfindung a) ein erstes chimäres Gen, das in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die ein erstes Hybrid-Polypeptid codiert, welches folgendes umfasst: i) eine DNA-Bindungsdomäne, die ein Antwortelement erkennt, das mit einem Gen assoziiert ist, dessen Expression moduliert werden soll, ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines Kernrezeptors umfasst, und b) ein zweites chimäres Gen, das in der Wirtszelle exprimiert werden kann, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die ein zweites Hybrid-Polypeptid codiert, welches folgendes umfasst: i) eine Transaktivierungsdomäne und ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines Kernrezeptors umfasst, der kein Ultraspiracle (USP) ist, wobei die Transaktivierungsdomäne nicht aus EcR, RXR oder USP stammt, und wobei die Ligandenbindungsdomänen des ersten Hybrid-Polypeptids und des zweiten Hybrid-Polypeptids verschieden sind und dimerisieren.
Dieses Zwei-Hybridsystem nutzt die Fähigkeit eines Paars interagierender Proteine, um die Transkriptionsaktivierungsdomäne in eine günstigere Position im Bezug auf die DNA-Bindungsdomäne zu bringen, sodass, wenn die DNA-Bindungsdomäne an die DNA-Bindungsstelle an dem Gen bindet, die Transaktivierungsdomäne den Promotor effektiver aktiviert (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,283,173). Dieses Zweihybrid-System ist ein signifikant verbessertes induzierbares Genexpressionsmodulationssystem im Vergleich zu den zwei Systemen, die in der internationalen Patentanmeldung PCT/US97/05330 und der PCT/US98/14215 offenbart sind.
Das Ecdysonrezeptor-basierte Genexpressionsmodulationssystem der Erfindung kann entweder heterodimer oder homodimer sein. Ein funktioneller EcR-Komplex bezieht sich allgemein auf einen heterodimeren Proteinkomplex, der aus zwei Mitgliedern der Steroidrezeptorfamilie besteht, einem Ecdysonrezeptorprotein, erhalten aus verschiedenen Insekten, und einem Ultraspiracle (USP)-Protein oder dem Vertebraten-Homologen von USP, Retinoid X-Rezeptor-Protein (siehe Yao et al., (1993) Nature 366, 476–479; Yao et al., (1992) Cell 71, 63–72). Jedoch kann der Komplex auch ein Homodimer sein, wie unten im Detail beschrieben wird. Der funktionelle Ecdysteroid-Rezeptorkomplex kann außerdem zusätzliche(s) Protein(e), wie etwa Immunophiline, beinhalten. Weitere Mitglieder der Steroidrezeptorfamilie von Proteinen, die als Transkriptionsfaktoren bekannt sind (wie etwa DHR38 oder betaFTZ-1) können ebenfalls ligandenabhängige oder ligandenunabhängige Partner für EcR, USP und/oder RXR sein. Zusätzlich können andere Cofaktoren benötigt werden, wie etwa Proteine, die allgemein als Coaktivatoren bekannt sind, (auch als Adaptoren oder Mediatoren bezeichnet). Diese Proteine binden nicht sequenzspezifisch an DNA und sind nicht an der basalen Transkription beteiligt. Sie können ihre Wirkung auf die Transkriptionsaktivierung durch verschiedene Mechanismen ausüben, einschließlich der Stimulierung der DNA-Bindung von Aktivatoren, durch Beeinflussen der Chromatinstruktur, oder durch Vermitteln von Aktivator-Initiationskomplex-Interaktionen. Beispiele solcher Coaktivatoren beinhalten RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP, ebenso wie das wahllose Coaktivator C-Antwortelement B-Bindeprotein, CBP/p300 (für einen Übersichtsartikel siehe Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9: 222–232, 1997). Außerdem können Protein-Cofaktoren, die allgemein als Co-Repressoren bekannt sind (auch bekannt als Repressoren, Silencer oder Silencing Mediatoren) benötigt werden, um die Transkriptionsaktivierung in Abwesenheit von Liganden effektiv zu inhibieren. Diese Co-Repressoren können mit dem ligandenfreien Ecdysonrezeptor interagieren, um die Aktivität an dem Antwortelement ruhigzustellen. Derzeitige Anhaltspunkte legen nahe, dass die Bindung des Liganden die Konformation des Rezeptors verändert, was in der Freisetzung des Co-Repressors und der Rekrutierung der oben beschriebenen Co-Aktivatoren resultiert, wodurch die stilllegende Aktivität des ersteren beendet wird. Beispiele von Co-Repressoren beinhalten N-CoR und SMRT (für einen Übersichtsartikel siehe Horwitz et al., Mol. Endocrinol. 10: 1167–1177, 1996). Diese Cofaktoren können entweder endogen für die Zelle oder den Organismus sein, oder sie können exogen als entweder in regulierter oder unregulierter Weise zu exprimierende Transgene hinzugefügt werden. Homodimer-Komplexe von Ecdysonrezeptorprotein, USP oder RXR können ebenfalls unter bestimmten Umständen funktionell sein.
Der Ecdysonrezeptorkomplex beinhaltet typischerweise Proteine, die Mitglieder der Kernrezeptorsuperfamilie sind, wobei alle Mitglieder durch die Gegenwart einer aminoterminalen Transaktivierungsdomäne, einer DNA-Bindungsdomäne („DBD") und einer Ligandenbindungsdomäne („LBD"), die von der DBD durch eine Gelenkregion getrennt ist, gekennzeichnet sind. Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „DNA-Bindungsdomäne" eine minimale Peptidsequenz eines DNA-bindenden Proteins bis hin zur gesamten Länge eines DNA-bindenden Proteins, solange die DNA-Bindungsdomäne so funktioniert, dass sie mit einem bestimmten Antwortelement assoziiert. Mitglieder der Kernrezeptorsuperfamilie sind auch gekennzeichnet durch die Gegenwart von vier oder fünf Domänen: A/B, C, D, E und in einigen Fällen F (siehe Evans, Science 240: 889–895 (1988)). Die „A/B"-Domäne entspricht der Transaktivierungsdomäne, „C" entspricht der DNA-Bindungsdomäne, „D" entspricht der Gelenkregion, und „E" entspricht der Ligandenbindungsdomäne. Einige Mitglieder der Familie können auch eine andere Transaktivierungsdomäne an der carboxyterminalen Seite von LBD besitzen, die „F" entspricht.
Die DBD ist gekennzeichnet durch die Gegenwart von zwei Cystein-Zinkfingern, zwischen denen sich zwei Aminosäuremotive befinden, die P-Box und die D-Box, die Spezifität für Ecdyson-Antwortelemente verleihen. Diese Domänen können entweder nativ, modifiziert oder Chimären verschiedener Domänen heterologer Rezeptorproteine sein. Dieser EcR-Rezeptor, wie eine Untergruppe der Steroidrezeptorfamilie, besitzt auch weniger gut definierte Regionen, die für die Heterodimerisierungseigenschaften verantwortlich sind. Da die Domänen von EcR, USP und RXR in ihrer Natur modular sind, können die LBD, die DBD und die Transaktivierungsdomänen ausgetauscht werden.
Es sind Genschaltersysteme bekannt, die Komponenten aus dem Ecdysonrezeptorkomplex einbauen. Jedoch ist es bei diesen bekannten Systemen so, dass immer dann, wenn EcR verwendet wird, dieses mit nativen oder modifizierten DNA-Bindungsdomänen und Transaktivierungsdomänen auf demselben Molekül verbunden ist. USP oder RXR werden typischerweise als stille Partner verwendet. Wir haben nun gezeigt, dass dann, wenn DNA-Bindungsdomänen und Transaktivierungsdomänen auf demselben Molekül vorliegen, die Hintergrundaktivität in Abwesenheit von Ligand hoch ist, und dass diese Aktivität dramatisch reduziert wird, wenn die DNA-Bindungsdomänen und Transaktivierungsdomänen auf verschiedenen Molekülen liegen, das heißt auf jeweils einem von zwei Partnern eines heterodimeren oder homodimeren Komplexes. Dieses Zweihybridsystem liefert auch eine verbesserte Empfindlichkeit gegenüber nicht-steroidalen Liganden, z.B. Diacylhydrazinen, wenn dies beispielsweise mit steroidalen Liganden, wie z.B. Ponasteron A („PonA") oder Muristeron A („MurA") verglichen wird. Das heißt, im Vergleich zu den Steroiden liefern die nicht-steroidalen Liganden eine höhere Aktivität bei einer niedrigeren Konzentration. Zusätzlich, da die Transaktivierung auf Basis von EcR-Genschaltern oft von der Zelllinie abhängig ist, ist es einfacher, Schaltersysteme zu entwerten, um eine maximale Transaktivierungsbefähigung für jede Anwendung zu erhalten. Weiterhin vermeidet dieses Zwei-Hybrid-System einige Nebenwirkungen aufgrund der Überexpression von RXR, die oft auftreten, wenn unmodifiziertes RXR als Schalterpartner verwendet wird. Bei diesem Zwei-Hybrid-System werden die native DNA-Bindungsdomäne und die Transaktivierungsdomäne von EcR oder RXR eliminiert. Als Ergebnis besitzen diese chimären Moleküle eine geringere Chance der Interaktion mit anderen Steroidhormonrezeptoren, die in der Zelle vorhanden sind, was in verringerten Nebenwirkungen resultiert.
Spezifisch bezieht sich die Erfindung der Anmelder auf ein die Genexpression modulierendes System, das folgendes umfasst: a) eine erste Genexpressionskassette, die in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, wobei die erste Genexpressionskassette ein Polynukleotid umfasst, das ein erstes Polypeptid codiert, welches folgendes umfasst: i) eine DNA-Bindungsdomäne, die ein Antwortelement erkennt, das mit einem Gen assoziiert ist, dessen Expression moduliert werden soll, und ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines Kernrezeptors umfasst, und b) eine zweite Genexpressionskassette, die in der Wirtszelle exprimiert werden kann, wobei die zweite Genexpressionskassette eine Polynukleotidsequenz umfasst, die ein zweites Polypeptid codiert, welches folgendes umfasst: i) eine Transaktivierungsdomäne und ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines Kernrezeptors umfasst, der kein Ultraspiracle (USP) ist, wobei die DNA-Bindungsdomäne und die Transaktivierungsdomäne nicht aus EcR, RXR oder USP stammen, und wobei die Ligandenbindungsdomänen des ersten Polypeptids und des zweiten Polypeptids verschieden sind und dimerisieren.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Genexpressionsmodulationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung, weiterhin umfassend c) eine dritte Genexpressionskassette, die folgendes umfasst: i) das Antwortelement, an das die DNA-Bindungsdomäne des ersten Polypeptids bindet; ii einen Promotor, der durch die Transaktivierungsdomäne des zweiten Polypeptids aktiviert wird; und iii) das Gen, dessen Expression moduliert werden soll.
Bei einer spezifischen Ausführungsform ist das Gen, dessen Expression moduliert werden soll, ein homologes Gen im Hinblick auf die Wirtszelle. Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform ist das Gen, dessen Expression moduliert werden soll, ein heterologes Gen im Hinblick auf die Wirtszelle.
Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids eine Ligandenbindungsdomäne des Ecdysonrezeptors.
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids eine Ligandenbindungsdomäne des Retinoid X-Rezeptors.
Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids eine Ligandenbindungsdomäne des Ecdysonrezeptors.
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids eine Ligandenbindungsdomäne des Retinoid X-Rezeptors.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids eine Ligandenbindungsdomäne des Ecdysonrezeptors, und die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids umfasst eine Ligandenbindungsdomäne des Retinoid X-Rezeptors.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform stammt die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids von einem Retinoid X-Rezeptor-Polypeptid, und die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids stammt von einem Ecdysonrezeptor-Polypeptid.
Bevorzugt ist die Ligandenbindungsdomäne (LBD) eine Ligandenbindungsdomäne eines Familienmitglieds der mit EcR oder RXR verwandten Steroid/Thyroid-Hormon-Kernrezeptorfamilie oder ist ein Analoges, eine Kombination oder eine Modifikation hiervon. Bevorzugter stammt LBD aus EcR oder RXR. Noch bevorzugter stammt die LBD von einem trunkierten EcR oder RXR. Eine Trunkierungsmutation kann durch jedes in der Technik verwendete Verfahren erzeugt werden, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Restriktionsendonukleaseverdau/Deletion, PCR-vermittelte/Oligonukleotid-gesteuerte Deletion, chemische Mutagenese, UV-Strangbruch, und dergleichen.
Bevorzugt ist der EcR ein Insekten-EcR, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Schmetterlings-EcR, einem Dipteren-EcR, einem Arthropoden-EcR, einem Homopteren-EcR und einem Hemipteren-EcR. Bevorzugter ist der EcR zur Verwendung ein EcR aus dem Tannentriebwickler Choristoneura fumiferana) ("CfEcR"), ein EcR aus Tenebrio molitor ("TmEcR"), ein EcR aus Manduca sexta ("MsEcR"), ein EcR aus Heliothies virescens ("HvEcR"), ein EcR aus dem Seidenspinner Bombyx mori ("BmEcR"), ein EcR aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster ("DmEcR"), ein EcR aus dem Moskito Aedes aegypti ("AaEcR"), ein EcR aus der Goldfliege Lucilia capitata ("LcEcR"), ein EcR aus der Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata ("CcEcR"), ein EcR aus der Heuschrecke Locusta migratoria ("LmEcR"), ein EcR aus der Blattlaus Myzus persicae ("MpEcR"), ein EcR aus der Winkerkrabbe Uca pugilator ("UpEcR"), oder ein EcR aus der Zecke Amblyomma americanum ("AmaEcR"). Noch bevorzugter stammt die LBD aus dem EcR des Tannentriebwicklers (Choristoneura fumiferana) ("CfEcR") oder aus dem EcR der Fruchtfliege Drosophila melanogaster ("DmEcR").
Bevorzugt stammt die LBD aus einem trunkierten Insekten-EcR. Die Trunkierung des Insekten-EcR-Polypeptids umfasst eine Deletion von mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175,180, 185, 190,195, 200, 205,210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, oder 265 Aminosäuren. Bevorzugter umfasst die Trunkierung des Insekten-EcR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer teilweisen Polypeptiddomäne. Noch bevorzugter umfasst die Trunkierung des Insekten-EcR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer vollständigen Polypeptiddomäne. Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Trunkierung des Insekten-EcR-Polypeptids eine Deletion wenigstens der A/B-Domänen, eine Deletion der C-Domäne, eine Deletion der D-Domäne, eine Deletion der E-Domäne, eine Deletion der F-Domäne, eine Deletion der A/B/C-Domänen, eine Deletion der Domänen A/B/1/2C, eine Deletion der A/B/C/D-Domänen, eine Deletion der A/B/C/D/F-Domänen, eine Deletion der A/B/F-Domänen und eine Deletion der A/B/C/F-Domänen. Es kann außerdem eine Kombination mehrerer vollständiger und/oder teilweiser Domänen-Deletionen durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ligandenbindungsdomäne des Ecdysonrezeptors von einem Polynukleotid codiert, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des Ecdysonrezeptors eine Polypeptidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20.
Bevorzugt ist das RXR-Polypeptid ein Maus (Mus musculus) RXR ("MmRXR") oder ein humanes (Homo sapiens) RXR ("HsRXR"). Das RXR-Polypeptid kann eine RXR_α-, RXR_β- oder RXR_γ-Isoform sein.
Bevorzugt stammt die LBD aus einem trunkierten RXR. Die Trunkierung des RXR-Polypeptids umfasst eine Deletion von wenigstens 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260 oder 265 Aminosäuren. Bevorzugter umfasst die Trunkierung des RXR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer teilweisen Polypeptiddomäne. Noch bevorzugter umfasst die Trunkierung des RXR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer vollständigen Polypeptiddomäne. Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Trunkierung des RXR-Polypeptids eine Deletion wenigstens der A/B-Domänen, eine Deletion der C-Domäne, eine Deletion der D-Domäne, eine Deletion der E-Domäne, eine Deletion der F-Domäne, eine Deletion der A/B/C-Domänen, eine Deletion der Domänen A/B/1/2C, eine Deletion der A/B/C/D-Domänen, eine Deletion der A/B/C/D/F-Domänen, eine Deletion der A/B/F-Domänen und eine Deletion der A/B/C/F-Domänen. Es kann außerdem eine Kombination mehrerer vollständiger und/oder teilweiser Domänen-Deletionen durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ligandenbindungsdomäne des Retinoid X-Rezeptors durch ein Polynukleotid codiert, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, und SEQ ID NO: 30.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des Retinoid X-Rezeptors eine Polypeptidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, und SEQ ID NO: 40.
Für die Zwecke dieser Erfindung beinhalten EcR und RXR außerdem synthetisches und chimäres EcR und RXR und deren Homologe.
Die DNA-Bindungsdomäne kann jedwede DNA-Bindungsdomäne mit einem bekannten Antwortelement sein, einschließlich synthetischer und chimärer DNA-Bindungsdomänen oder Analoge, Kombinationen oder Modifikationen hiervon. Bevorzugt ist die DBD eine GAL4-DBD eine LexA-DBD, eine Transkriptionsfaktor-DBD, eine DBD eines Mitglied der Steroid/Thyroid-Hormon-Kernrezeptorsuperfamilie, eine DBD von bakteriellem LacZ oder eine Hefe („yeast put")-DBD. Bevorzugter ist die DBD eine GAL4-DBD [SEQ ID NO: 41 (Polynukleotid) oder SEQ ID NO: 42 (Polypeptid)] oder eine LexA-DBD [SEQ ID NO: 43 (Polynukleotid) oder SEQ ID NO: 44 (Polypeptid)].
Die Transaktivierungsdomäne (abgekürzt „AD" oder „TA") kann eine AD von jedwedem Steroid/Thyroid-Hormon-Kernrezeptor, jede synthetische oder chimäre AD, Polyglutamin-AD, basische oder saure Aminosäure-AD, eine VP16 AD, eine GAL4-AD, eine NF-κB AD, eine BP64 AD oder ein Analoges, eine Kombination oder Modifikation hiervon sein. Bevorzugt ist die AD eine synthetische oder chimäre AD oder wird aus VP16, GAL4 oder NF-κB erhalten. Am bevorzugtesten ist die AD eine VP16 AD [SEQ ID NO: 45 (Polynukleotid) oder SEQ ID NO: 46 (Polypeptid)].
Das Antwortelement („RE") kann jedwedes Antwortelement mit einer bekannten DNA-Bindungsdomäne sein, oder ein Analoges, eine Kombination oder Modifikation hiervon. Bevorzugt ist das RE ein RE aus GAL4 („GAL4RE"), LexA, ein RE eines Steroid/Thyroid-Hormon-Kernrezeptors oder ein synthetisches RE, das eine synthetische DNA-Bindungsdomäne erkennt. Bevorzugter ist das RE ein GAL4-RE, umfassend eine Polynukleotidsequenz der SEQ ID NO: 47, oder ein LexA 8X-Operon, umfassend eine Polynukleotidsequenz der SEQ ID NO: 48. Bevorzugt ist das erste Hybridprotein weitgehend frei von einer Transaktivierungsdomäne, und das zweite Hybridprotein ist weitgehend frei von einer DNA-bindenden Domäne. Für die Zwecke dieser Erfindung bedeutet „weitgehend frei", dass das fragliche Protein keine hinreichende Sequenz der fraglichen Domäne enthält, um Aktivierungs- oder Bindungsaktivität bereitzustellen.
Die Liganden für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung, wie unten beschrieben, liefern die Mittel für eine externe zeitliche Regulation der Expression des Gens, wenn sie mit den Ligandenbindungsdomänen von EcR, USP, RXR oder einem anderen Polypeptid kombiniert werden, das wiederum an das mit einem Gen verbundene Antwortelement bindet. Der Bindungsmechanismus oder die Reihenfolge, mit der die verschiedenen Komponenten der Erfindung aneinander binden, d.h. Ligand an Rezeptor, erstes Polypeptid an Antwortelement, zweites Polypeptid an den Promotor, etc. ist nicht entscheidend. Die Bindung des Liganden an die Ligandenbindungsdomänen von EcR, USP, RXR oder einem anderen Protein erlauben die Expression oder Suppression des Gens. Dieser Mechanismus schließt nicht das Potential der Ligandenbindung an EcR, USP oder RXR und die resultierende Ausbildung aktiver Homodimer-Komplexe (z.B. von EcR + EcR oder USP + USP) aus. Bevorzugt können eine oder mehrere der Rezeptordomänen variiert werden, um einen chimären Genschalter zu erzeugen. Typischerweise können eine oder mehrere der drei Domänen DBD, LBD und Transaktivierungsdomäne aus einer Quelle ausgewählt werden, die von der Quelle der anderen Domänen verschieden ist, sodass die chimären Gene und die resultierenden Hybridproteine in der ausgewählten Wirtszelle oder dem ausgewählten Organismus auf Transaktivierungsaktivität bzw. komplementäre Bindung des Liganden und die Erkennung eines spezifischen Antwortelements hin optimiert werden. Zusätzlich kann das Antwortelement selber mit Antwortelementen für andere DNA-Bindungsprotein-Domänen modifiziert oder substituiert werden, wie etwa für das GAL-4-Protein aus Hefe (siehe Sadowski et al., (1988) Nature, 335: 563–564) oder das LexA-Protein aus E. coli (siehe Brent und Ptashne (1985), Cell 43: 729–736), oder mit synthetischen Antwortelementen, die spezifisch sind für die gezielte Interaktion mit Proteinen, die für solche spezifischen Interaktionen (siehe z.B. Kim et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94: 3616–3620) erstellt, modifiziert oder selektiert wurden, um chimäre Rezeptoren aufzunehmen. Ein weiterer Vorteil chimärer Systeme besteht darin, dass sie die Wahl eines Promotors erlauben, der verwendet wird, um die Genexpression gemäß einem gewünschten Endergebnis anzutreiben. Eine solche doppelte Kontrolle kann auf Gebieten der Gentherapie besonders wichtig sein, insbesondere, wenn zytotoxische Proteine produziert werden, da sowohl der Zeitpunkt der Expression als auch die Zellen, in denen die Expression stattfindet, kontrolliert werden können. Wenn Gene, die funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sind, in die Zellen eines Subjekts eingeführt werden, so wird die Expression der exogenen Gene durch die Gegenwart des Systems dieser Erfindung kontrolliert. Promotoren können konstitutiv oder induzierbar reguliert sein oder sie können gewebespezifisch sein (d.h. nur in einem bestimmten Typ von Zellen exprimiert werden), oder sie können für bestimmte Entwicklungsstufen des Organismus spezifisch sein.
Genexpressionskassetten der Erfindung
Das neue Ecdysonrezeptor-basierte induzierbare Genexpressionssystem der Erfindung umfasst eine neue Genexpressionskassette, die in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, wobei die Genexpressionskassette ein Polynukleotid umfasst, das für ein Hybridpolypeptid codiert. Somit liefert die Erfindung der Anmelder auch neue Genexpressionskassetten zur Verwendung bei dem Genexpressionssystem der Erfindung.
Spezifisch stellt die vorliegende Erfindung eine Genexpressionskassette bereit, die ein Polynukleotid umfasst, das für ein Hybridpolypeptid codiert. Das Hybridpolypeptid umfasst entweder 1) eine DNA-Bindungsdomäne, die ein Antwortelement erkennt, und eine Ligandenbindungsdomäne eines Kernrezeptors oder 2) eine Transaktivierungsdomäne und eine Ligandenbindungsdomäne eines Kernrezeptors, wobei die Transaktivierungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein EcR, RXR oder USP ist.
Bei einer spezifischen Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette für ein Hybridpolypeptid, das eine DNA-Bindungsdomäne umfasst, die ein Antwortelement erkennt, und eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne, wobei die DNA-Bindungsdomäne von einem anderen Kernrezeptor stammt als von einem Ecdysonrezeptor.
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette für ein Hybridpolypeptid, das eine DNA-Bindungsdomäne umfasst, die ein Antwortelement erkennt, und für eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne, wobei die DNA-Bindungsdomäne von einem anderen Kernrezeptor stammt als von einem Retinoid X-Rezeptor.
Die DNA-Bindungsdomäne kann jedwede DNA-Bindungsdomäne mit einem bekannten Antwortelement sein, einschließlich synthetischer und chimärer DNA-Bindungsdomänen, oder Analoga, Kombinationen oder Modifikationen hiervon. Bevorzugt ist die DBD eine GAL4-DBD, eine LexA-DBD, eine Transkriptionsfaktor-DBD, eine DBD eines Mitglieds der Steroid/Thyroid-Hormon-Kernrezeptor-Superfamilie, eine bakterielle LacZ-DBD oder eine Hefe („yeast put")-DBD. Bevorzugter ist die DBD eine GAL4-DBD [SEQ ID NO: 41 (Polynukleotid) oder SEQ ID NO: 42 (Polypeptid)] oder eine LexA-DBD [(SEQ ID NO: 43 (Polynukleotid) oder SEQ ID NO: 44 (Polypeptid)].
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette für ein Hybridpolypeptid, das eine Transaktivierungsdomäne und eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfasst, wobei die Transaktivierungsdomäne von einem anderen Kernrezeptor stammt als von einem Ecdysonrezeptor.
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette für ein Hybridpolypeptid, das eine Transaktivierungsdomäne und eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfasst, wobei die Transaktivierungsdomäne von einem anderen Kernrezeptor stammt als von einem Retinoid X-Rezeptor.
Die Transaktivierungsdomäne (abgekürzt „AD" oder „TA") kann eine AD von jedwedem Steroid/Thyroid-Hormon-Kernrezeptor, jedwede synthetische oder chimäre AD, Polyglutamin-AD, basische oder saure Aminosäure-AD, eine VP16-AD, eine GAL4-AD, eine NFκB-AD, eine BP64-AD oder ein Analoges, eine Kombination oder Modifikation hiervon sein. Bevorzugt ist die AD eine synthetische oder chimäre AD, oder sie wird aus VP16, GAL4 oder NF-κB gewonnen. Am bevorzugtesten ist die AD eine AD von VP16 [SEQ ID NO: 45 (Polynukleotid) oder SEQ ID NO: 46 (Polypeptid)].
Bevorzugt ist die Ligandenbindungsdomäne eine Ligandenbindungsdomäne eines Familienmitglieds der mit EcR oder RXR verwandten Steroid/Thyroid-Hormon-Kernrezeptorfamilie oder ist ein Analoges, eine Kombination oder eine Modifikation hiervon. Bevorzugter stammt die LBD aus EcR oder RXR. Noch bevorzugter stammt die LBD von einem trunkierten EcR oder RXR.
Bevorzugt ist der EcR ein Insekten-EcR, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Schmetterlings-EcR, einem Dipteren-EcR, einem Arthropoden-EcR, einem Homopteren-EcR und einem Hemipteren-EcR. Bevorzugter ist der EcR zur Verwendung ein EcR aus dem Tannentriebwickler Choristoneura fumiferana) ("CfEcR"), ein EcR aus Tenebrio molitor ("TmEcR"), ein EcR aus Manduca sexta ("MsEcR"), ein EcR aus Heliothies virescens ("HvEcR"), ein EcR aus dem Seidenspinner Bombyx mori ("BmEcR"), ein EcR aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster ("DmEcR"), ein EcR aus dem Moskito Aedes aegypti ("AaEcR"), ein EcR aus der Goldfliege Lucilia capitata ("LcEcR"), ein EcR aus der Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata ("CcEcR"), ein EcR aus der Heuschrecke Locusta migratoria ("LmEcR"), ein EcR aus der Blattlaus Myzus persicae ("MpEcR"), ein EcR aus der Winkerkrabbe Uca pugilator ("UpEcR"), oder ein EcR aus der Zecke Amblyomma americanum ("AmaEcR"). Noch bevorzugter stammt die LBD aus dem EcR des Tannentriebwicklers (Choristoneura fumiferana) ("CfEcR") oder aus dem EcR der Fruchtfliege Drosophila melanogaster ("DmEcR").
Bevorzugt stammt die LBD aus einem trunkierten Insekten-EcR. Die Trunkierung des Insekten-EcR-Polypeptids umfasst eine Deletion von mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175,180, 185, 190,195, 200, 205,210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, oder 265 Aminosäuren. Bevorzugter umfasst die Trunkierung des Insekten-EcR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer teilweisen Polypeptiddomäne. Noch bevorzugter umfasst die Trunkierung des Insekten-EcR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer vollständigen Polypeptiddomäne. Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Trunkierung des Insekten-EcR-Polypeptids eine Deletion wenigstens der A/B-Domänen, eine Deletion der C-Domäne, eine Deletion der D-Domäne, eine Deletion der E-Domäne, eine Deletion der F-Domäne, eine Deletion der A/B/C-Domänen, eine Deletion der Domänen A/B/1/2C, eine Deletion der A/B/C/D-Domänen, eine Deletion der A/B/C/D/F-Domänen, eine Deletion der A/B/F-Domänen und eine Deletion der A/B/C/F-Domänen. Es kann außerdem eine Kombination mehrerer vollständiger und/oder teilweiser Domänen-Deletionen durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ligandenbindungsdomäne des Ecdysonrezeptors von einem Polynukleotid codiert, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des Ecdyson-Rezeptors eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20.
Bevorzugt ist das RXR-Polypeptid ein Maus (Mus musculus) RXR ("MmRXR") oder ein humanes (Homo sapiens) RXR ("HsRXR"). Das RXR-Polypeptid kann eine RXR_α-, RXR_β- oder RXR_γ-Isoform sein.
Bevorzugt stammt die LBD aus einem trunkierten RXR. Die Trunkierung des RXR-Polypeptids umfasst eine Deletion von wenigstens 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260 oder 265 Aminosäuren. Bevorzugter umfasst die Trunkierung des RXR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer teilweisen Polypeptiddomäne. Noch bevorzugter umfasst die Trunkierung des RXR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer vollständigen Polypeptiddomäne. Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Trunkierung des RXR-Polypeptids eine Deletion wenigstens der A/B-Domänen, eine Deletion der C-Domäne, eine Deletion der D-Domäne, eine Deletion der E-Domäne, eine Deletion der F-Domäne, eine Deletion der A/B/C-Domänen, eine Deletion der Domänen A/B/1/2C, eine Deletion der A/B/C/D-Domänen, eine Deletion der A/B/C/D/F-Domänen, eine Deletion der A/B/F-Domänen und eine Deletion der A/B/C/F-Domänen. Es kann außerdem eine Kombination mehrerer vollständiger und/oder teilweiser Domänen-Deletionen durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ligandenbindungsdomäne des Retinoid X-Rezeptors durch ein Polynukleotid codiert, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, und SEQ ID NO: 30.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Ligandenbindungsdomäne des Retinoid X-Rezeptors eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, und SEQ ID NO: 40.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette ein Hybridpolypeptid, umfassend eine DNA-Bindungsdomäne, die von einem Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer GAL4-DBD (SEQ ID NO: 41) oder einer LexA-DBD (SEQ ID NO: 43), und eine Ligandenbindungsdomäne eines Ecdysonrezeptors, codiert durch ein Polynukleotid, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette ein Hybridpolypeptid, umfassend eine DNA-Bindungsdomäne, die eine Polypeptidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer GAL4-DBD (SEQ ID NO: 42) oder einer LexA-DBD (SEQ ID NO: 44), und eine Ligandenbindungsdomäne eines Ecdysonrezeptors, umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette ein Hybridpolypeptid, umfassend eine DNA-Bindungsdomäne, die von einem Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer GAL4-DBD (SEQ ID NO: 41) oder einer LexA-DBD (SEQ ID NO: 43), und eine Ligandenbindungsdomäne eines Retinoid X-Rezeptors, codiert durch ein Polynukleotid, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, und SEQ ID NO: 30.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette ein Hybridpolypeptid, umfassend eine DNA-Bindungsdomäne, die eine Polypeptidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer GAL4-DBD (SEQ ID NO: 42) oder einer LexA-DBD (SEQ ID NO: 44), und eine Ligandenbindungsdomäne eines Retinoid X-Rezeptors, umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, und SEQ ID NO: 40.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette ein Hybridpolypeptid, umfassend eine Transaktivierungsdomäne, die von einem Polynukleotid codiert wird, das eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 45 umfasst, und eine Ligandenbindungsdomäne eines Ecdysonrezeptors, codiert von einem Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette ein Hybridpolypeptid, umfassend eine Transaktivierungsdomäne, die eine Polypeptidsequenz der SEQ ID NO: 46 umfasst, und eine Ligandenbindungsdomäne eines Ecdysonrezeptors, die eine Polypeptidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette ein Hybridpolypeptid, umfassend eine Transaktivierungsdomäne, die von einem Polynukleotid codiert wird, das eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 45 umfasst, und eine Ligandenbindungsdomäne eines Retinoid X-Rezeptors, codiert von einem Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, und SEQ ID NO: 30.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert die Genexpressionskassette ein Hybridpolypeptid, umfassend eine Transaktivierungsdomäne, die eine Polypeptidsequenz der SEQ ID NO: 46 umfasst, und eine Ligandenbindungsdomäne eines Retinoid X-Rezeptors, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, und SEQ ID NO: 40.
Für die Zwecke dieser Erfindung beinhalten EcR und RXR außerdem synthetische und chimäre EcR und RXR und deren Homologe.
Polynukleotide der Erfindung
Das neue Ecdysonrezeptor-basierte induzierbare Genexpressionssystem der Erfindung umfasst eine Genexpressionskassette, die ein Polynukleotid umfasst, das für ein trunkiertes EcR- oder RXR-Polypeptid codiert, das eine Trunkierungsmutation umfasst und nützlich bei Verfahren zur Modulation der Expression eines Gens in einer Wirtszelle ist.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein Polynukleotid, das für ein EcR- oder RXR-Polypeptid codiert, das eine Trunkierungsmutation umfasst. Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR- oder RXR-Polypeptid codiert, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit beeinflusst.
Bevorzugt resultiert die Trunkierungsmutation in einem Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR-Polypeptid oder ein trunkiertes RXR-Polypeptid codiert, dieses umfassend eine Deletion von wenigstens 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260 oder 265 Aminosäuren. Bevorzugter umfasst die Trunkierung des EcR- oder RXR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer teilweisen Polypeptiddomäne. Noch bevorzugter umfasst die Trunkierung des EcR- oder RXR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer vollständigen Polypeptiddomäne. Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Trunkierung des EcR- oder RXR-Polypeptids eine Deletion wenigstens der A/B-Domänen, eine Deletion der C-Domäne, eine Deletion der D-Domäne, eine Deletion der E-Domäne, eine Deletion der F-Domäne, eine Deletion der A/B/C-Domänen, eine Deletion der Domänen A/B/1/2C, eine Deletion der A/B/C/D-Domänen, eine Deletion der A/B/C/D/F-Domänen, eine Deletion der A/B/F-Domänen und eine Deletion der A/B/C/F-Domänen. Es kann außerdem eine Kombination mehrerer vollständiger und/oder teilweiser Domänen-Deletionen durchgeführt werden.
Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst das EcR-Polynukleotid gemäß der Erfindung eine Polynukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10. Bei einer spezifischen Ausführungsform codiert das Polynukleotid gemäß der Erfindung für ein Ecdysonrezeptor-Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 12 (CfEcR-1/2CDEF, das die letzten 33 carboxy-terminalen Aminosäuren der C-Domäne umfasst), SEQ ID NO: 13 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 14 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 15 (CfEcR-DE), SEQ ID NO: 16 (DmEcR-CDEF), SEQ ID NO: 17 (DmEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 18 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 19 (DmEcR-EF) und SEQ ID NO: 20 (DmEcR-DE).
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform umfasst das RXR-Polynukleotid gemäß der Erfindung eine Polynukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, und SEQ ID NO: 30. Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform codiert das Polynukleotid gemäß der Erfindung für ein trunkiertes RXR-Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, bestehend aus SEQ ID NO: 31 (MmRXR-CDEF), SEQ ID NO: 32 (MmRXR-DEF), SEQ ID NO: 33 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 34 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 35 (MmRXR-E), SEQ ID NO: 36 (HsRXR-CDEF), SEQ ID NO: 37 (HsRXR-DEF), SEQ ID NO: 38 (HsRXR-EF), SEQ ID NO: 39 (HsRXR-trunkiertes EF) bzw. SEQ ID NO: 40 (HsRXR-E).
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR- oder RXR-Polypeptid codiert, das eine Trunkierungsmutation umfasst, wobei die Mutation die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR- oder RXR-Polypeptid codiert, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR-Polypeptid codiert, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR-Polypeptids reduziert, wobei das Polynukleotid eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 4 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 8 (DmEcR-DEF) oder SEQ ID NO: 9 (DmEcR-EF) umfasst. Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR- oder RXR-Polypeptid codiert, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR-Polypeptid codiert, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR-Polypeptids reduziert, wobei das Polynukleotid eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 4 (CfEcR-EF) oder SEQ ID NO: 9 (DmEcR-EF) umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein isoliertes Polynukleotid, codierend für ein EcR- oder RXR-Polypeptid, das eine Trunkierungsmutation umfasst, wobei die Mutation die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht. Bei einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR- oder RXR-Polypeptid codiert, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht. Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR- oder RXR-Polypeptid codiert, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein EcR-Polypeptid codiert, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR-Polypeptids erhöht, wobei das Polynukleotid eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3 (CfEcR-DEF) oder SEQ ID NO: 8 (DmEcR-DEF) umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Retinoid X-Rezeptorpolypeptid codiert, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Ligandenempfindlichkeit eines Heterodimers steigert, welches das mutierte Retinoid X-Rezeptorpolypeptid und einen Dimerisierungspartner umfasst. Bevorzugt umfasst das isolierte Polynukleotid, das für ein Retinoid X Rezeptorpolypeptid codiert, das eine die Ligandenempfindlichkeit eines Heterodimers steigernde Trunkierungsmutation aufweist, eine Polynukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 23 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 24 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 28 (HsRXR-EF) oder SEQ ID NO: 29 (HsRXR-trunkiertes EF). Bei einer spezifischen Ausführungsform ist der Dimerisierungspartner ein Ecdysonrezeptor-Polypeptid. Bevorzugt ist der Dimerisierungspartner ein trunkiertes EcR-Polypeptid. Bevorzugter ist der Dimerisierungspartner ein EcR-Polypeptid, bei dem die Domänen A/B/C deletiert wurden. Noch bevorzugter ist der Dimerisierungspartner ein EcR-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 13 (CfEcR-DEF) oder der SEQ ID NO: 18 (DmEcR-DEF) umfasst.
Polypeptide der Erfindung
Das neue Ecdysonrezeptor-basierte induzierbare Genexpressionssystem der Erfindung umfasst ein Polynukleotid, das für ein trunkiertes EcR- oder RXR-Polypeptid codiert und das nützlich bei Verfahren zur Modulation der Expression eines Gens innerhalb einer Wirtszelle ist. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein isoliertes trunkiertes EcR- oder RXR-Polypeptid, das von einem Polynukleotid oder einer Genexpressionskassette gemäß der Erfindung codiert wird. Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes trunkiertes EcR- oder RXR-Polypeptid mit einer die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit beeinflussenden Trunkierungsmutation, das von einem Polynukleotid gemäß der Erfindung codiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein isoliertes trunkiertes EcR- oder RXR-Polypeptid, das eine Trunkierungsmutation umfasst. Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Ligandenbindungsaktivität oder die Ligandenempfindlichkeit beeinflusst.
Bevorzugt resultiert die Trunkierungsmutation in einem trunkierten EcR-Polypeptid oder in einem trunkierten RXR-Polypeptid, umfassend eine Deletion von wenigstens 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260 oder 265 Aminosäuren. Bevorzugter umfasst die Trunkierung des EcR- oder RXR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer teilweisen Polypeptiddomäne. Noch bevorzugter umfasst die Trunkierung des EcR- oder RXR-Polypeptids eine Deletion von wenigstens einer vollständigen Polypeptiddomäne. Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Trunkierung des EcR- oder RXR-Polypeptids eine Deletion wenigstens der A/B-Domänen, eine Deletion der C-Domäne, eine Deletion der D-Domäne, eine Deletion der E-Domäne, eine Deletion der F-Domäne, eine Deletion der A/B/C-Domänen, eine Deletion der Domänen A/B/1/2C, eine Deletion der A/B/C/D-Domänen, eine Deletion der A/B/C/D/F-Domänen, eine Deletion der A/B/F-Domänen und eine Deletion der A/B/C/F-Domänen. Es kann außerdem eine Kombination mehrerer vollständiger und/oder teilweiser Domänen-Deletionen durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das isolierte trunkierte Ecdysonrezeptor-Polypeptid durch ein Polynukleotid codiert, das eine Polynukleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 2 (CfEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 3 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 4 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 5 (CfEcR-DE), SEQ ID NO: 6 (DmEcR-CDEF), SEQ ID NO: 7 (DmEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 8 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 9 (DmEcR-EF) und SEQ ID NO: 10 (DmEcR-DE). Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte trunkierte Ecdysonrezeptor-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 12 (CfEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 13 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 14 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 15 (CfEcR-DE), SEQ ID NO: 16 (DmEcR-CDEF), SEQ ID NO: 17 (DmEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 18 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 19 (DmEcR-EF), und SEQ ID NO: 20 (DmEcR-DE).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das isolierte trunkierte RXR-Polypeptid durch ein Polynukleotid codiert, das eine Polynukleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21 (MmRXR-CDEF), SEQ ID NO: 22 (MmRXR-DEF), SEQ ID NO: 23 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 24 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 25 (MmRXR-E), SEQ ID NO: 26 (HsRXR-CDEF), SEQ ID NO: 27 (HsRXR-DEF), SEQ ID NO: 28 (HsRXR-EF), SEQ ID NO: 29 (HsRXR-trunkiertes EF) und SEQ ID NO: 30 (HsRXR-E). Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte trunkierte RXR-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 31 (MmRXR-CDEF), SEQ ID NO: 32 (MmRXR-DEF), SEQ ID NO: 33 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 34 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 35 (MmRXR-E), SEQ ID NO: 36 (HsRXR-CDEF), SEQ ID NO: 37 (HsRXR-DEF), SEQ ID NO: 38 (HsRXR-EF), SEQ ID NO: 39 (HsRXR-trunkiertes EF), und SEQ ID NO: 40 (HsRXR-E).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit des EcR-Polypeptids oder des RXR-Polypeptids reduziert, wobei das Polypeptid durch ein Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 2 (CfEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 3 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 4 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 5 (CfEcR-DE), SEQ ID NO: 6 (DmEcR-CDEF), SEQ ID NO: 7 (DmEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 8 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO; 9 (DmEcR-EF), SEQ ID NO: 10 (DmEcR-DE), SEQ ID NO: 21 (MmRXR-CDEF), SEQ ID NO: 22 (MmRXR-DEF), SEQ ID NO: 23 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 24 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 25 (MmRXR-E), SEQ ID NO: 26 (HsRXR-CDEF), SEQ ID NO: 27 (HsRXR-DEF), SEQ ID NO: 28 (HsRXR-EF), SEQ ID NO: 29 (HsRXR-trunkiertes EF), und SEQ ID NO: 30 (HsRXR-E).
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes trunkiertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit des EcR-Polypeptids oder des RXR-Polypeptids reduziert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 12 (CfEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 13 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 14 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 15 (CfEcR-DE), SEQ ID NO: 16 (DmEcR-CDEF), SEQ ID NO: 17 (DmEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 18 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 19 (DmEcR-EF), SEQ ID NO: 20 (DmEcR-DE), SEQ ID NO: 31 (MmRXR-CDEF), SEQ ID NO: 32 (MmRXR-DEF), SEQ ID NO: 33 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 34 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 35 (MmRXR-E), SEQ ID NO: 36 (HsRXR-CDEF), SEQ ID NO: 37 (HsRXR-DEF), SEQ ID NO: 38 (HsRXR-EF), SEQ ID NO: 39 (HsRXR-trunkiertes EF), und SEQ ID NO: 40 (HsRXR-E).
Bei einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR-Polypeptids reduziert, wobei das EcR-Polypeptid durch ein Polynukleotid codiert wird, das eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 4 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 8 (DmEcR-DEF) oder SEQ ID NO: 9 (DmEcR-EF) umfasst. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein isoliertes trunkiertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR-Polypeptid mit einer Trunkierungsmutation, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR-Polypeptids reduziert, wobei das EcR-Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 13 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 14 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 18 (DmEcR-DEF) oder SEQ ID NO: 19 (DmEcR-EF) umfasst.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR-Polypeptids reduziert, wobei das EcR-Polypeptid durch ein Polynukleotid codiert wird, das eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 4 (CfEcR-EF) oder SEQ ID NO: 9 (DmEcR-EF) umfasst. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein isoliertes trunkiertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder die Steroid-Empfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids reduziert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR-Polypeptid mit einer Trunkierungsmutation, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR-Polypeptids reduziert, wobei das EcR-Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 14 (CfEcR-EF) oder SEQ ID NO: 19 (DmEcR-EF) umfasst.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht, wobei das Polypeptid durch ein Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 2 (CfEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 3 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 4 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 5 (CfEcR-DE), SEQ ID NO: 6 (DmEcR-CDEF), SEQ ID NO: 7 (DmEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 8 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 9 (DmEcR-EF), SEQ ID NO: 10 (DmEcR-DE), SEQ ID NO: 21 (MmRXR-CDEF), SEQ ID NO: 22 (MmRXR-DEF), SEQ ID NO: 23 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 24 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 25 (MmRXR-E), SEQ ID NO: 26 (HsRXR-CDEF), SEQ ID NO: 27 (HsRXR-DEF), SEQ ID NO: 28 (HsRXR-EF), SEQ ID NO: 29 (HsRXR-trunkiertes EF), und SEQ ID NO: 30 (HsRXR-E).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 12 (CfEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 13 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 14 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 15 (CfEcR-DE), SEQ ID NO: 16 (DmEcR-CDEF), SEQ ID NO: 17 (DmEcR-1/2CDEF), SEQ ID NO: 18 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 19 (DmEcR-EF), SEQ ID NO: 20 (DmEcR-DE), SEQ ID NO: 31 (MmRXR-CDEF), SEQ ID NO: 32 (MmRXR-DEF), SEQ ID NO: 33 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 34 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 35 (MmRXR-E), SEQ ID NO: 36 (HsRXR-CDEF), SEQ ID NO: 37 (HsRXR-DEF), SEQ ID NO: 38 (HsRXR-EF), SEQ ID NO: 39 (HsRXR-trunkiertes EF), und SEQ ID NO: 40 (HsRXR-E).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Ligandenbindungsaktivität oder Ligandenempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht. Bei einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR-Polypeptids oder RXR-Polypeptids erhöht. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Steroidbindungsaktivität oder Steroidempfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, das eine Trunkierungsmutation umfasst, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR-Polypeptids erhöht, wobei das EcR-Polypeptid durch ein Polynukleotid codiert wird, das eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3 (CfEcR-DEF) oder SEQ ID NO: 8 (DmEcR-DEF) umfasst. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein isoliertes EcR- oder RXR-Polypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder die Steroid-Empfindlichkeit des EcR- oder RXR-Polypeptids erhöht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes EcR-Polypeptid mit einer Trunkierungsmutation, die die Nicht-Steroid-Bindungsaktivität oder Nicht-Steroid-Empfindlichkeit des EcR-Polypeptids erhöht, wobei das EcR-Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 13 (CfEcR-DEF) oder SEQ ID NO: 18 (DmEcR-DEF) umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein isoliertes Retinoid X-Rezeptorpolypeptid, umfassend eine Trunkierungsmutation, die die Ligandenempfindlichkeit eines Heterodimers steigert, umfassend das mutierte Retinoid X-Rezeptorpolypeptid und einen Dimerisierungspartner. Bevorzugt umfasst das isolierte Retinoid X-Rezeptorpolypeptid eine die Ligandenempfindlichkeit eines Heterodimers steigernde Trunkierungsmutation und ist codiert durch ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 23 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 24 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 28 (HsRXR-EF) oder SEQ ID NO: 29 (HsRXR-trunkiertes EF). Bevorzugter umfasst das isolierte Polynukleotid, das für ein Retinoid X-Rezeptorpolypeptid mit einer die Ligandenempfindlichkeit eines Heterodimers steigernden Trunkierungsmutation codiert, eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 33 (MmRXR-EF), SEQ ID NO: 34 (MmRXR-trunkiertes EF), SEQ ID NO: 38 (HsRXR-EF) oder SEQ ID NO: 39 (HsRXR-trunkiertes EF).
Bei einer spezifischen Ausführungsform ist der Dimerisierungspartner ein Ecdysonrezeptor-Polypeptid. Bevorzugt ist der Dimerisierungspartner ein trunkiertes EcR-Polypeptid. Bevorzugter ist der Dimerisierungspartner ein EcR-Polypeptid, bei dem die Domänen A/B/C deletiert wurden. Noch bevorzugter ist der Dimerisierungspartner ein EcR-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 13 (CfEcR-DEF) oder der SEQ ID NO: 18 (DmEcR-DEF) umfasst.
Verfahren zur Modulierung der Genexpression der Erfindung
Die Erfindung der Anmelder bezieht sich auch auf Verfahren zum Modulieren der Genexpression in einer Wirtszelle unter Verwendung eines Genexpressionsmodulationssystems gemäß der Erfindung. Spezifisch stellt die Erfindung der Anmelder ein Verfahren zum Modulieren der Genexpression in einer Wirtszelle bereit, umfassend die folgenden Schritte: a) Einführen eines Genexpressionsmodulationssystems gemäß der Erfindung in die Wirtszelle; und b) Einführen eines Liganden in die Wirtszelle, der in unabhängiger Weise eine Kombination mit den Ligandenbindungsdomänen des ersten Polypeptids und des zweiten Polypeptids des Genexpressionsmodulationssystems eingeht, wobei das zu exprimierende Gen eine Komponente einer Genexpressionskassette ist, welche folgendes umfasst: i) ein Antwortelement, welches eine Domäne umfasst, an die die DNA-Bindungsdomäne aus dem ersten Polypeptid bindet; ii) einen Promotor, der durch die Transaktivierungsdomäne des zweiten Polypeptids aktiviert wird; und iii) ein Gen, dessen Expression moduliert werden soll, wodurch ein Komplex ausgebildet wird, der den Liganden, das erste Polypeptid des Genexpressionsmodulationssystems und das zweite Polypeptid des Genexpressionsmodulationssystems umfasst, und wodurch der Komplex die Expression des Gens in der Wirtszelle moduliert.
Gene von Interesse für die Expression in einer Wirtszelle unter Verwendung der Verfahren der Anmelder können endogene Gene oder heterologe Gene sein. Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzinformation für ein gewünschtes Gen oder Protein kann in einer von vielen öffentlich zugänglichen Datenbanken befindlich sein, z.B. in GENBANK, EMBL, SwissProt und PIR, oder in vielen Journal-Veröffentlichungen mit biologischem Bezug. Somit haben Fachleute Zugang zu Nukleinsäuresequenzinformation für praktisch alle bekannten Gene. Eine solche Information kann dann verwendet werden, um die gewünschten Konstrukte für die Insertion des interessierenden Gens in die Genexpressionskassetten, die bei den hier beschriebenen Verfahren der Anmelder verwendet werden, herzustellen.
Beispiele für Gene von Interesse für die Expression in einer Wirtszelle unter Verwendung der Verfahren der Anmelder beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, folgende Bereiche: in Pflanzen als Impfstoffe produzierte Antigene, Enzyme, wie etwa alpha-Amylase, Phytase, Glucanase und Xylanase, Gene für die Resistenz gegenüber Insekten, Nematoden, Pilzen, Bakterien, Viren und abiotischen Stress, Nutrazeutika, Pharmazeutika, Vitamine, Gene für die Modifikation des Aminosäuregehalts, Herbizidresistenz, Kälte, Dürre und Hitzetoleranz, industrielle Produkte, Öle, Proteine, Kohlenhydrate, Antioxidantien, sterile männliche Pflanzen, Blumen, Treibstoffe, andere nach außen verwirklichte Merkmale, Gene, die therapeutisch erwünschte Polypeptide oder Produkte codieren, so wie etwa Gene, die Polypeptide, die bei der Behandlung eines Zustands, einer Erkrankung, einer Störung, einer Fehlfunktion, eines genetischen Defekts und dergleichen wichtig sind, bereitstellen, modulieren, mildern, korrigieren, und/oder wiederherstellen können.
Akzeptable Liganden sind sämtliche, die die Expression des Gens modulieren, wenn die Bindung der DNA-Bindungsdomäne des Zwei-Hybrid-Systems an das Antwortelement in Gegenwart des Liganden in einer Aktivierung oder Suppression der Expression der Gene resultiert. Bevorzugte Liganden beinhalten Ponasteron, Muristeron A, N,N'-Diacylhydrazine, wie etwa diejenigen, die in den US-Patenten Nr. 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; und 5,378,726 offenbart sind; Dibenzoylalkyl-Cyanohydrazine, wie etwa solche, die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 461,809 offenbart sind; N-Alkyl-N,N'-diaroylhydrazine, wie etwa solche, die im US-Patent Nr. 5,225,443 offenbart sind; N-Acyl-N-alkylcarbonylhydrazine, wie etwa solche, die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 234,994 offenbart sind; N-Aroyl-N-alkyl-N'-aroylhydrazine, wie etwa solche, die im US-Patent Nr. 4,985,461 beschrieben sind; wobei jedes hiervon durch Referenz in Bezug genommen wird, sowie andere, ähnliche Materialien, einschließlich 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxy-N-isobutylbenzamid, 8-O-Acetylharpagid und dergleichen.
Bevorzugt ist der Ligand zur Verwendung bei einem Verfahren der Anmelder zur Modulation der Expression eines Gens eine Verbindung der Formel:
wobei:
E ein (C₄-C₆)-Alkyl, das ein tertiäres Kohlenstoffatom enthält, oder ein Cyano-(C₃-C₅)-alkyl, das ein tertiäres Kohlenstoffatom enthält, ist,
R¹ H, Me, Et, i-Pr, F, Formyl, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, CCH, 1-Propinyl, 2-Propinyl, Vinyl, OH, OMe, OEt, Cyclopropyl, CF₂CF₃, CH=CHCN, Allyl, Azido, SCN oder SCHF₂ ist,
R² H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Formyl, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, CCH, 1-Propinyl, 2-Propinyl, Vinyl, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃, OCF₂CF₂H, COEt, Cyclopropyl, CF₂CF₃, CH=CHCN, Allyl, Azido, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe, NH-CN ist oder verbunden ist mit R³ und den Phenylkohlenstoffen, an die R² und R³ angebunden sind, um ein Ethylendioxy auszubilden, um einen Dihydrofurylring mit dem einem Phenylkohlenstoff benachbarten Sauerstoff auszubilden, oder um einen Dihydropyrylring mit dem einem Phenylkohlenstoff benachbarten Sauerstoff auszubilden,
R³ H, Et ist oder verbunden ist mit R² und den Phenylkohlenstoffen, an die R² und R³ angebunden sind, um ein Ethylendioxy auszubilden, um einen Dihydrofurylring mit dem einem Phenylkohlenstoff benachbarten Sauerstoff auszubilden, oder um einen Dihydropyrylring mit dem einem Phenylkohlenstoff benachbarten Sauerstoff auszubilden,
R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander H, Me, Et, F, Cl, Br, Formyl, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C°CH, 1-Propinyl, 2-Propinyl, Vinyl, OMe, OEt, SMe oder SEt sind.
Die Erfindung der Anmelder stellt die Modulation der Genexpression in prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen bereit. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf Verfahren zur Modulation der Genexpression in einer Wirtszelle, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Bakterienzelle, einer Pilzzelle, einer Hefezelle, einer Pflanzenzelle, einer Tierzelle und einer Säugerzelle. Bevorzugt ist die Wirtszelle eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle, eine Mauszelle oder eine menschliche Zelle.
Die Expression in transgenen Wirtszellen kann nützlich sein für die Expression verschiedener Polypeptide von Interesse, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, therapeutische Polypeptide, Stoffwechselweg-Zwischenprodukte; für die Modulation von bereits im Wirt existierenden Stoffwechselwegen für die Synthese neuer Produkte, die bisher nicht unter Verwendung des Wirts möglich waren; für zellbasierte Assays und dergleichen. Zusätzlich können die Genprodukte nützlich sein, um höhere Wachstumsausbeuten des Wirts zu ermöglichen oder um die Verwendung alternativer Wachstumsmodi zu ermöglichen.
Wirtszellen und nicht-menschliche Organismen der Erfindung
Wie oben beschrieben, kann das Genexpressionsmodulationssystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Genexpression in einer Wirtszelle zu modulieren. Die Expression in transgenen Wirtszellen kann nützlich für die Expression verschiedener Gene von Interesse sein. Somit stellt die Erfindung der Anmelder auch eine isolierte Wirtszelle bereit, die ein Genexpressionssystem gemäß der Erfindung umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine isolierte Wirtszelle bereit, die eine Genexpressionskassette gemäß der Erfindung umfasst. Die Erfindung der Anmelder stellt außerdem eine isolierte Wirtszelle bereit, die ein Polynukleotid oder Polypeptid gemäß der Erfindung umfasst. Die isolierte Wirtszelle kann entweder eine prokaryotische oder eine eukaryotische Wirtszelle sein.
Bevorzugt wird die Wirtszelle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Bakterienzelle, einer Pilzzelle, einer Hefezelle, einer Pflanzenzelle, einer Tierzelle und einer Säugerzelle. Beispiele bevorzugter Wirtszellen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Pilz- oder Hefespezies, wie etwa Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula oder Bakterienspezies, wie diejenigen der Gattungen Synechocystis, Synechococcus, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas, Methylomonas, Methylobacter, Alcaligenes, Synechocystis, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium und Klebsiella, Pflanzen-, Tier- und Säuger-Wirtszellen. Bevorzugter ist die Wirtszelle eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle, eine Mauszelle oder eine menschliche Zelle.
Bei einer spezifischen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Hefezelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Saccharomyces-, einer Pichia- und einer Candida-Wirtszelle.
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Wirtszelle von Apfel, Arabidopsis, Bajra, Banane, Gerste, Bohne, Rübe, Urdbohne, Kichererbse, Chili, Gurke, Aubergine, Ackerbohne, Mais, Melone, Rispen-Hirse, Mungobohne, Hafer, Gemüse-Eibisch, Panicum, Papaya, Erdnuss, Erbse, Pfeffer, Straucherbse, Ananas, Phaseolus, Kartoffel, Kürbis, Reis, Hirse, Sojabohne, Squash-Kürbis, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Süßkartoffel, Tee, Tomate, Tabak, Wassermelone und Weizen.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Mauszelle.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine humane Zelle.
Die Transformation von Wirtszellen ist in der Technik wohlbekannt und kann mittels einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Elektroporation, virale Infektion, Plasmid/Vektor-Transfektion, nicht durch einen Virusvektor vermittelte Transfektion, Agrobacterium-vermittelte Transformation, Partikelbeschuss und dergleichen. Die Expression gewünschter Genprodukte beinhaltet das Kultivieren transformierter Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen und das Induzieren der Expression des transformierten Gens. Die Kulturbedingungen und Genexpressionsprotokolle für prokaryotische und eukaryotische Zellen sind in der Technik wohlbekannt (siehe allgemeinen Verfahrensteil der Beispiele). Die Zellen können geerntet werden, und die Genprodukte können gemäß den Protokollen, die für das Genprodukt spezifisch sind, isoliert werden.
Zusätzlich kann eine Wirtszelle ausgewählt werden, die die Expression des inserierten Polynukleotids moduliert oder das Polypeptidprodukt in der spezifischen gewünschten Weise modifiziert und prozessiert. Verschiedene Wirtszellen besitzen charakteristische und spezifische Mechanismen für die translationale und posttranslationale Prozessierung und Modifikation (z.B. Glykosylierung, Abspaltung [z.B. der Signalsequenz]) bei Proteinen. Es können geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins sicherzustellen. Beispielsweise kann die Expression in einem Bakteriensystem verwendet werden, um ein nicht-glykosyliertes Kernproteinprodukt zu erzeugen.
Jedoch kann ein in Bakterien exprimiertes Polypeptid unkorrekt gefaltet werden. Die Expression in Hefe kann ein glykosyliertes Produkt erzeugen. Die Expression in eukaryotischen Zellen kann die Wahrscheinlichkeit einer „nativen" Glykosylierung und Faltung eines heterologen Proteins erhöhen. Darüber hinaus kann die Expression in Säugerzellen ein Werkzeug liefern, um die Aktivität eines Polypeptids wiederherzustellen oder zu begründen. Des weiteren können verschiedene Vektor/Wirts-Expressionssysteme die Prozessierungsreaktionen, wie etwa proteolytische Spaltungen, in einem unterschiedlichen Maße beeinflussen.
Die Erfindung der Anmelder bezieht sich auch auf einen nicht-menschlichen Organismus, der eine isolierte Wirtszelle gemäß der Erfindung umfasst. Bevorzugt ist der nicht-menschliche Organismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Bakterium, einem Pilz, einer Hefe, einer Pflanze, einem Tier und einem Säugetier. Bevorzugter ist der nicht-menschliche Organismus eine Hefe, eine Pflanze, eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, eine Katze, ein Hund, ein Rind, eine Ziege, ein Schwein, ein Pferd, ein Schaf, ein Affe oder ein Schimpanse.
Bei einer spezifischen Ausführungsform ist der nicht-menschliche Organismus eine Hefe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Saccharomyces, Pichia und Candida.
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform ist der nicht-menschliche Organismus eine Pflanze, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Apfel, Arabidopsis, Bajra, Banane, Gerste, Bohne, Rübe, Urdbohne, Kichererbse, Chili, Gurke, Aubergine, Ackerbohne, Mais, Melone, Rispen-Hirse, Mungobohne, Hafer, Gemüse-Eibisch, Panicum, Papaya, Erdnuss, Erbse, Pfeffer, Straucherbse, Ananas, Phaseolus, Kartoffel, Kürbis, Reis, Hirse, Sojabohne, Squash-Kürbis, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Süßkartoffel, Tee, Tomate, Tabak, Wassermelone und Weizen.
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform ist der nicht-menschliche Organismus eine Maus (Mus musculus).
Messung der Genexpression/Transkription
Eine nützliche Messung bei den Verfahren der Anmelder der Erfindung ist diejenige des Transkriptionszustands der Zelle, einschließlich der Identität und Häufigkeit der RNA, bevorzugt der mRNA-Spezies. Solche Messungen werden praktischerweise durchgeführt, indem man die cDNA-Häufigkeiten durch beliebige mehrerer bestehender Genexpressionstechniken misst.
Die Nukleinsäurearray-Technik ist eine nützliche Technik zur Bestimmung der differenziellen mRNA-Expression. Eine solche Technik beinhaltet z.B. Oligonukleotid-Chips und DNA-Mikroarrays. Diese Techniken basieren auf DNA-Fragmenten oder Oligonukleotiden, die verschiedenen Genen entsprechen, oder cDNAs, die auf einem festen Träger immobilisiert werden und mit Sonden hybridisiert werden, die aus Gesamt-mRNA-Pools hergestellt werden, die aus Zellen, Geweben oder ganzen Organismen extrahiert und zu cDNA umgesetzt werden. Oligonukleotid-Chips sind Arrays von Oligonukleotiden, die unter Verwendung photolithographischer Techniken auf einem Substrat synthetisiert werden. Es sind Chips hergestellt worden, die bis zu 1700 Gene analysieren können. DNA-Mikroarrays sind Arrays von DNA-Proben, typischerweise PCR-Produkten, die per Roboter auf einen mikroskopischen Objektträger gedruckt werden. Jedes Gen wird über eine Ziel-DNA-Sequenz voller oder teilweiser Länge analysiert. Mikroarrays mit bis zu 10.000 Genen werden inzwischen kommerziell routinemäßig hergestellt. Der primäre Unterschied zwischen diesen beiden Techniken besteht darin, dass Oligonukleotid-Chips typischerweise 25-mer-Oligonukleotide verwenden, die eine Fraktionierung kurzer DNA-Moleküle erlauben, wogegen die großen DNA-Ziele von Mikroarrays, solche mit etwa 1000 Basenpaaren, mehr Empfindlichkeit beim Auftrennen komplexer DNA-Gemische bereitstellen können.
Eine andere nützliche Messung bei den erfindungsgemäßen Verfahren der Anmelder besteht in der Bestimmung des Translationszustands der Zelle durch Messen der Häufigkeit der als Komponenten vorliegenden Proteinspezies, die in der Zelle vorhanden sind, unter Verwendung in der Technik wohlbekannter Verfahren.
Dort, wo eine Identifizierung der mit verschiedenen physiologischen Funktionen assoziierten Gene gewünscht ist, kann ein Assay verwendet werden, bei dem Änderungen solcher Funktionen wie Zellwachstum, Apoptose, Seneszenz, Differenzierung, Adhäsion, die Bindung an spezifische Moleküle, die Bindung an eine andere Zelle, die zelluläre Organisation, die Organogenese, der intrazelluläre Transport, die Transportförderung, die Energieumsetzung, der Metabolismus, die Myogenese, die Neurogenese und/oder die Hämatopoese gemessen werden.
Zusätzlich können selektierbare Marker oder die Expression von Reportergenen verwendet werden, um die Modulation der Genexpression unter Verwendung der Erfindung der Anmelder zu messen.
Andere Verfahren zur Detektion der Produkte der Genexpression sind in der Technik wohlbekannt und beinhalten Southern Blots (DNA-Detektion), Dot oder Slot Blots (DNA, RNA), Northern Blots (RNA) und RT-PCR (RNA)-Analysen. Obwohl weniger bevorzugt, können markierte Proteine verwendet werden, um eine bestimmte Nukleinsäuresequenz, an die eine Hybridisierung erfolgt, zu detektieren.
In einigen Fällen ist es notwendig, die Menge einer Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren. Dies kann durchgeführt werden unter Verwendung eines oder mehrerer aus einer Anzahl geeigneter Verfahren, einschließlich z.B. Polymerasekettenreaktion („PCR"), Ligasekettenreaktion („LCR"), Strang-Verdrängungs-Amplifikation („SDA"), Transkriptions-basierter Amplifikation und dergleichen. Die PCR erfolgt in Übereinstimmung mit bekannten Techniken, bei denen z.B. eine Nukleinsäureprobe in Gegenwart hitzestabiler DNA-Polymerase unter Hybridisierungsbedingungen und mit einem Oligonukleotid-Primer für jeden Strang der spezifischen, zu detektierenden Sequenz behandelt wird. Ein Verlängerungsprodukt jedes Primers, das synthetisiert wird, ist komplementär zu jedem der zwei Nukleinsäurestränge, wobei die Primer zu jedem Strang der spezifischen Sequenz hinreichend komplementär sind, um mit diesem zu hybridisieren. Das ausgehend von jedem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt kann auch als Matrize für die weitere Synthese von Verlängerungsprodukten unter Verwendung der gleichen Primer sein. Nach einer hinreichenden Anzahl von Syntheserunden von Verlängerungsprodukten kann die Probe analysiert werden, wie oben beschrieben, um zu bestimmen, ob die zu detektierende Sequenz oder die zu detektierenden Sequenzen vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung kann durch die Bezugnahme auf die folgenden nicht-limitierenden Beispiele besser verstanden werden, die als beispielhaft für diese Erfindung bereitgestellt werden.
BEISPIELE
ALLGEMEINE VERFAHREN
Die hier verwendeten Standardtechniken für rekombinante DNA und molekulare Klonierung sind in der Technik wohlbekannt und sind beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) und in T. J. Silhavy, M. L. Bennan, und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1987).
Verfahren für die Pflanzengewebekultur, Transformation, Pflanzenmolekularbiologie und Pflanzentechniken sowie für die allgemeine Molekularbiologie sind zu finden in Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises, herausgegeben von RN Trigiano und DJ Gray, 2. Auflage, 2000, CRC Press, New York; Agrobacterium Protocols, herausgegeben von KMA Gartland und MR Davey, 1995, Humana Press, Totowa, New Jersey; Methods in Plant Molecular Biology, P. Maliga et al., 1995, Cold Spring Harbor Lab Press, New York; und Molecular Cloning, J. Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Lab Press, New York.
Materialien und Methoden, die für die Aufrechterhaltung und das Wachstum von Bakterienkulturen geeignet sind, sind in der Technik wohlbekannt. Techniken, die für die Verwendung in den folgenden Beispielen geeignet sind, sind zu finden in Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg und G. Briggs Philips, Herausgeber), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) oder in Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, zweite Auflage, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989). Alle für das Wachstum und die Haltung der Wirtszellen verwendeten Reagenzien, Restriktionsenzyme und Materialien wurden von Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), oder von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten, solange nicht anders angegeben.
Manipulationen genetischer Sequenzen können unter Verwendung der Programmreihe durchgeführt werden, die bei der Genetics Computer Group Inc. (Wisconsin Paket, Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI) erhältlich ist. Dort wo das GCG-Programm „Pile up" verwendet wird, können die Defaultwerte 12 für die Lückenerzeugung bzw. 4 für die Lückenverlängerung verwendet werden. Dort, wo die CGC-Programme „Gap" oder „Bestfit" verwendet werden, kann die Default-Strafe der Lückenerzeugung von 50, sowie die Default-Strafe der Lückenverlängerung von 3 verwendet werden. In allen Fällen, bei denen die GCG-Programmparameter nicht eingegeben werden, bei diesen oder beliebigen anderen GCG-Programmen, können Defaultwerte verwendet werden.
Die Bedeutung der Abkürzungen ist wie folgt: „h" bedeutet Stunde(n), „min" bedeutet Minute(n), „sec" bedeutet Sekunde(n), „d" bedeutet Tag(e), „μl" bedeutet Mikroliter, „ml" bedeutet Milliliter, „l" bedeutet Liter, „μM" bedeutet mikromolar, „mM" bedeutet millimolar, „μg" bedeutet Mikrogramm, „mg" bedeutet Milligramm, „A" bedeutet Adenin oder Adenosin, „T" bedeutet Thymin oder Thymidin, „G" bedeutet Guanin oder Guanosin, „C" bedeutet Cytidin oder Cytosin, „× g" bedeutet mal Schwerkraft, „nt" bedeutet Nukleotid(e), „AS (bzw. „AA")" bedeutet „Aminosäure(n), „bp" bedeutet Basenpaar(e), „kb" bedeutet Kilobase(n), „k" bedeutet Kilo, „μ" bedeutet Mikro und „°C" bedeutet Grad Celsius.
BEISPIEL 1
Das verbesserte EcR-basierte induzierbare Genmodulationssystem der Anmelder wurde für die Verwendung bei verschiedenen Anwendungen, einschließlich der Gentherapie, der Expression interessierender Proteine in Wirtszellen, der Produktion transgener Organismen und zellbasierter Assays, entwickelt. Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion und Bewertung verschiedener Genexpressionskassetten für die Verwendung bei dem EcR-basierten induzierbaren Genexpressionssystem der Erfindung.
Bei verschiedenen zellulären Hintergründen, einschließlich Säugerzellen, heterodimerisiert der Insekten-Ecdysonrezeptor (EcR) mit Retinoid X-Rezeptor (RXR) und transaktiviert bei Ligandenbindung Gene unter der Kontrolle von Ecdyson-Antwortelementen. Die Anmelder konstruierten mehrere EcR-basierte Genexpressionskassetten auf Basis des EcR des Tannentriebwicklers Choristoneura fumiferana („CfEcR"; Polynukleotid voller Länge und Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID NO: 49 bzw. SEQ ID NO: 50 angegeben), C. fumiferana Ultraspiracle („CfUSP", Polynukleotid voller Länge, und Aminosäuresequenzen sind in der SEQ ID NO: 51 bzw. der SEQ ID NO: 52 dargestellt) und Maus Mus musculus RXRα (MmRXRα; Polynukleotid voller Länge und Aminosäuresequenzen sind in der SEQ ID NO: 53 bzw. der SEQ ID NO: 54 angegeben). Die hergestellten Rezeptorkonstrukte umfassen eine Ligandenbindungsdomäne von EcR und von RXR oder von USP; eine DNA-Bindungsdomäne von GAL4 oder von EcR und eine Aktivierungsdomäne von VP16. Die Rezeptorkonstrukte beinhalten ein Reportergen, Luciferase oder LacZ, funktionsfähig verbunden mit einem synthetischen Promotorkonstrukt, das entweder GAL4- oder EcR/USP-Bindungsstellen (Antwortelemente) umfasst. Es wurden verschiedene Kombinationen dieser Rezeptor- und Reporter-Konstrukte in CHO, NIH3T3, CV1 und 293-Zellen co-transfiziert. Das Geninduktionspotential (Stärke der Induktion) und die Ligandenspezifität und Ligandenempfindlichkeit wurden unter Verwendung von vier verschiedenen Liganden untersucht: zwei Steroidliganden (Ponasteron A und Muristeron A) und zwei Nicht-Steroid-Liganden (N-(2-Ethyl-3-methoxybenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin und N-(3,4-(1,2-ethylendioxy)-2-methylbenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin) bei einer dosisabhängigen Induktion der Reportergen-Expression in den transfizierten Zellen. Die Aktivitäten der Reportergen-Expression wurden 24 h oder 48 h nach der Zugabe des Liganden gemessen.
Genexpressionskassetten: Ecdysonrezeptor-basierte, chemisch induzierbare Genexpressionskassetten (Schalter) wurden wie folgt konstruiert, wobei in der Technik verfügbare Standardklonierungsverfahren verwendet wurden. Das folgende ist eine kurze Beschreibung der Herstellung und Zusammenstellung jedes Schalters.

1.1 – GAL4EcR/VP16RXR: Die D-, E-, und F-Domänen aus dem EcR des Tannentriebwicklers Choristoneura fumiferana ("CfEcRDEF"; SEQ ID NO: 3) wurden mit der GAL4 DNA-Bindungsdomäne ("DNABD"; SEQ ID NO: 41) fusioniert und unter die Kontrolle eines SV40e-Promotors (SEQ ID NO: 55) gestellt. Die DEF-Domänen von RXR aus der Maus (Mus musculus) ("MmRXRDEF"; SEQ ID NO: 22) wurden mit der Aktivierungsdomäne von VP16 ("VP16AD"; SEQ ID NO: 45) fusioniert und unter die Kontrolle eines SV40e-Promotors (SEQ ID NO: 55) gestellt. Fünf Konsensus-GAL4-Bindungsstellen ("5XGAL4RE"; umfassend 5 GAL4RE, umfassend SEQ ID NO: 47) wurden mit einem synthetischen E1b-Minimalpromotor (SEQ ID NO: 56) fusioniert und stromaufwärts des Luciferasegens (SEQ ID NO: 57) angeordnet.
1.2 – GAL4EcR/VP16USP: Dieses Konstrukt wurde in derselben Weise wie der Schalter 1.1 oben hergestellt, mit der Ausnahme, dass MmRXRDEF durch die D-, E- und F-Domänen aus dem USP des Tannentriebwicklers ersetzt wurde (CfUSPDEF"; SEQ ID NO: 58). Die in diesem Beispiel verwendeten Konstrukte sind denen ähnlich, die im US-Patent Nr. 5,880,333 offenbart sind, mit der Ausnahme, dass Choristoneura fumiferana-USP statt Drosophila melanogaster-USP verwendet wurde.
1.3 – GAL4RXR/VP16CfEcR: MmRXRDEF (SEQ ID NO: 22) wurde an GAL4DNABD (SEQ ID NO: 41) fusioniert und CfEcRCDEF (SEQ ID NO: 1) wurde an VP16AD (SEQ ID NO: 45) fusioniert.
1.4 – GAL4RXR/VP16DmEcR: Dieses Konstrukt wurde in derselben Weise konstruiert wie Schalter 1.3, mit dem Unterschied, dass CfEcRCDEF durch DmEcRCDEF (SEQ ID NO: 6) ersetzt wurde.
1.5 – GAL4USP/VP16CfEcR: Dieses Konstrukt wurde in derselben Weise konstruiert wie Schalter 1.3, mit dem Unterschied, dass MmRXRDEF durch CfUSPDEF (SEQ ID NO: 58) ersetzt wurde.
1.6 – GAL4RXRCfEcRVP16: Dieses Konstrukt wurde so hergestellt, dass GAL4 DNABD und VP16AD auf demselben Molekül angeordnet wurden. GAL4DNABD (SEQ ID NO: 41) und VP16AD (SEQ ID NO: 45) wurden mit CfEcRDEF (SEQ ID NO: 3) am N- bzw. C-Terminus fusioniert. Die Fusion wurde unter die Kontrolle eines SV40e-Promotors (SEQ ID NO: 55) gestellt.
1.7 – VP16CfEcR: Dieses Konstrukt wurde so hergestellt, dass CfEcRCDEF (SEQ ID NO: 1) mit VP16AD (SEQ ID NO: 45) fusioniert und unter die Kontrolle eines SV40e-Promotors (SEQ ID NO: 55) gestellt wird. Sechs Ecdyson-Antwortelemente („EcRE"; SEQ ID NO: 59) aus dem hsp27-Gen wurden stromaufwärts des Promotors und eines Luciferasegens (SEQ ID NO: 57) angeordnet. Dieser Schalter verwendet mit größter Wahrscheinlichkeit endogenes RXR.
1.8 – DmVgRXR: Dieses System wurde bei der Invitrogen Corp., Carlsbad, Kalifornien, erworben. Es umfasst einen Drosophila melanogaster EcR ("DmEcR") mit einem modifizierten DNABD, fusioniert an VP16AD und gestellt unter die Kontrolle eines CMV-Promotors (SEQ ID NO: 60). MmRXR voller Länge (SEQ ID NO: 53) wurde unter die Kontrolle des RSV-Promotors (SEQ ID NO: 61) gestellt. Der Reporter, pIND(SP1)LacZ, enthält fünf Kopien eines modifizierten Ecdyson-Antwortelements („EcRE", E/GRE), drei Kopien eines SP1-Enhancers und einen minimalen Hitzeschockpromotor, die alle stromaufwärts des LacZ-Reportergens angeordnet wurden.
1.9 – CfVgRXR: Dieses Beispiel wurde in derselben Weise hergestellt wie Schalter 1.8, mit der Ausnahme, dass DmEcR durch einen trunkierten CfEcR ersetzt wurde, der eine partielle A/B-Domäne und die vollständigen CDEF-Domänen [SEQ ID NO: 62 (Polynukleotid) und SEQ ID NO: 63 (Polypeptid)] umfasste.
1.10 – CfVgRXRdel: Dieses Beispiel wurde in derselben Weise hergestellt wie Schalter 1.9, mit dem Unterschied, dass MmRXR (SEQ ID NO: 53) deletiert wurde.

Zelllinien: Es wurden vier Zelllinien in diesen Versuchen verwendet: CHO, eine Ovarialzelllinie aus dem Chinesischer Hamster Cricetulus griseus; NIH3T3 (3T3) Maus (Mus musculus)-Zelllinie; 293 humane Homo sapiens Nierenzelllinie, und CV1 Nierenzelllinie der afrikanischen grünen Meerkatze. Die Zellen wurden in ihren entsprechenden Medien gehalten und wurden subkultiviert, wenn sie 60% Konfluenz erreicht hatten. Man folgte Standardverfahren für die Kultur und Aufrechterhaltung der Zellen.
Transfektionen: Mehrere kommerziell erhältliche Lipofaktoren, ebenso wie Elektroporationsverfahren, wurden bewertet, und die besten Bedingungen für die Transfektion jeder Zelllinie wurden entwickelt. CHO-, NIH3T3-, 293- und CV1-Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 60% herangezogen. DNAs, die den verschiedenen Schalterkonstrukten entsprechen, dargestellt in den Beispielen 1.1 bis 1.10, wurden wie folgt in CHO-Zellen, NIH3T3-Zellen, 293-Zellen oder CV1-Zellen transfiziert.
CHO-Zellen: Die Zellen wurden geerntet, wenn sie 60–80% Konfluenz erreicht hatten, und in 6- oder 12- oder 24-Well-Platten mit 250.000, 100.000 oder 50.000 Zellen in 2,5, 1,0 bzw. 0,5 ml Wachstumsmedium mit 10% fetalem Rinderserum ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit Wachstumsmedium gespült und für vier Stunden transfiziert. LipofectAMINE^TM 2000 (Life Technologies Inc.) wurde als das beste Transfektionsreagenz für diese Zellen ermittelt. Für 12 Well-Platten wurden 4 μl LipofectAMINE^TM 2000 mit 100 μl Wachstumsmedium gemischt. Es wurden 1,0 μg an Reporterkonstrukt und 0,25 μg an Rezeptorkonstrukt(en) zu dem Transfektionsgemisch hinzugegeben. Es wurde ein zweites Reporterkonstrukt hinzugegeben [pTKRL (Promega), 0,1 μg/Transfektionsgemisch], dieses umfassend ein Renilla Luciferasegen (SEQ ID NO: 64), das funktionsfähig verbunden mit und unter die Kontrolle eines konstitutiven Thymidinkinase (TK)-Promotors gestellt war und für die Normalisierung verwendet wurde. Der Inhalt des Transfektionsgemischs wurde in einem Vortexmischer gemischt und für 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Am Ende der Inkubation wurde das Transfektionsgemisch zu den Zellen hinzugegeben, die in 400 μl Wachstumsmedium gehalten wurden. Die Zellen wurden für fünf Stunden bei 37°C und 5% CO₂ gehalten. Am Ende der Inkubation wurden 500 μl Wachstumsmedium mit 20% FBS und entweder DMSO (Kontrolle) oder einer DMSO-Lösung mit geeigneten Liganden hinzugegeben, und die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO₂ für 24–48 h gehalten. Die Zellen wurden geerntet, und die Reporteraktivität wurde untersucht. Die gleiche Prozedur erfolgte ebenso für die 6- und 24-Well-Platten, mit dem Unterschied, dass alle Reagenzien für die 6-Well-Platten verdoppelt und für die 24-Well-Platten auf die Hälfte reduziert wurden.
NIH3T3-Zellen: Superfect^TM (Qiagen Inc.) wurde als das beste Transfektionsreagenz für die 3T3-Zellen ermittelt. Für die 3T3-Zellen folgte man den gleichen Prozeduren, wie für die CHO-Zellen beschrieben, ebenfalls mit zwei Modifikationen. Die Zellen wurden ausplattiert, wenn sie 50% Konfluenz erreicht hatten. Es wurden 125.000 oder 50.000 oder 25.000 Zellen pro Well für die 6-, 12- bzw. 24-Well-Platten ausplattiert. Das Gal4EcR/VP16RXR und die Reportervektor-DNAs wurden in NIH3T3-Zellen transfiziert und die transfizierten Zellen wurden für 48 h in Medium herangezüchtet, das PonA, MurA, N-(2-Ethyl-3-methoxybenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-t-butylhydrazin oder N-(3,4-(1,2-Ethylendioxy)-2-methylbenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin enthielt. Die Ligandenbehandlungen erfolgten, wie im obigen Abschnitt für die CHO-Zellen beschrieben.
293-Zellen: LipofectAMINE^TM 2000 (Life Technologies) wurde als das beste Lipofektionsmittel für die 293-Zellen ermittelt. Die gleichen Prozeduren, die für die CHO-Zellen beschrieben worden waren, wurden auch für die 293-Zellen verfolgt, mit dem Unterschied, dass die Zellen in biobeschichtete Platten plattiert wurden, um eine Verklumpung zu vermeiden. Die Ligandenbehandlungen wurden durchgeführt, wie oben im Abschnitt für die CHO-Zellen beschrieben.
CV1-Zellen: LipofectAMINE^TM plus (Life Technologies) wurde als das beste Lipofektionsmittel für die CV1-Zellen ermittelt. Man folgte für die CV1-Zellen der gleichen Prozedur wie für die NIH3T3-Zellen beschrieben.
Liganden: Ponasteron A und Muristeron A wurden bei der Sigma Chemical Company erworben. Die zwei Nicht-Steroide N-(2-Ethyl-3-methoxybenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-t-butylhydrazin bzw. N-(3,4-(1,2-Ethylendioxy)-2-methylbenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin sind synthetisch stabile Ecdysteroide, die von der Rohm und Haas Company synthetisiert werden. Alle Liganden wurden in DMSO gelöst, und die Endkonzentration von DMSO wurde sowohl bei den Kontrollen als auch bei den Behandlungen auf 0,1% gehalten.
Reporter-Assays: Die Zellen wurden 24–48 Stunden nach der Zugabe der Liganden geerntet. Es wurden 125, 250 oder 500 μl an passivem Lysepuffer (Bestandteil des Dual-Luciferase^TM Reporterassay-Systems der Promega Corporation) zu jedem Well von 6- bzw. 12- bzw. 24-Well-Platten hinzugegeben. Die Platten wurden für 15 Minuten auf einem Rotationsschüttler platziert. Es wurden zwanzig μl an Lysat getestet. Die Luciferaseaktivität wurde unter Verwendung des Dual-Luciferase^TM Reporterassay-Systems der Promega Corporation nach Herstelleranweisung gemessen. β-Galactosidase wurde unter Verwendung des Galacto-Star^TM Assay-Kits von TROPIX nach Herstelleranweisung gemessen. Alle Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitäten wurden unter Verwendung von Renilla-Luciferase als Standard normalisiert. Die Vervielfachung der Aktivitäten wurde berechnet, indem man die normalisierten relativen Lichteinheiten („RLU") in mit Ligand behandelten Zellen durch die normalisierten RLU in mit DMSO behandelten Zellen (unbehandelte Kontrolle) dividierte.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den folgenden Tabellen dargestellt.
Tabelle 1 Transaktivierung von Reportergenen durch verschiedene Schalter in den CHO-Zellen
Tabelle 2 Transaktivierung von Reportergenen durch verschiedene Schalter in den 3T3-Zellen
Tabelle 3 Transaktivierung von Reportergenen durch verschiedene Schalter in den 293-Zellen
Tabelle 4 Transaktivierung von Reportergenen durch verschiedene Schalter in den CV1-Zellen
Tabelle 5 Transaktivierung des Reportergens GAL4CfEcRDEF/VP16MmRXRDEF (Schalter 1.1) durch Steroide und Nicht-Steroide in 3T3-Zellen
Tabelle 6 Transaktivierung des Reportergens GAL4MmRXRDEF/VP16CfEcRCDEF (Schalter 1.3) durch Steroide und Nicht-Steroide in 3T3-Zellen
Die Ergebnisse der Anmelder zeigen, dass die nicht-steroidalen Ecdyson-Agonisten N-(2-Ethyl-3-methoxybenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin und N'-(3,4-(1,2-Ethylendioxy)-2-methylbenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin wirkungsstärkere Aktivatoren bei CfEcR waren als im Vergleich dazu bei Drosophila melanogaster EcR (DmEcR) (siehe Tabellen 1–4). Auch bei den getesteten Säugerzelllinien zeigte MmRXR als heterodimerer Partner für CfEcR eine bessere Leistung als CfUSP (siehe Tabellen 1–4). Zusätzlich zeigte das induzierbare Genexpressionsmodulationssystem der Anmelder eine bessere Leistung bei Verwendung von exogenem MmRXR als dann, wenn das System sich nur auf die endogenen RXR-Spiegel stützte (siehe Tabellen 1–4).
Die Ergebnisse der Anmelder zeigen außerdem, dass bei einem CfEcR-basierten induzierbaren Genexpressionssystem die nicht-steroidalen Ecdyson-Agonisten die Reportergen-Expression bei einer niedrigeren Konzentration induzierten (d.h. erhöhte Ligandenempfindlichkeit) im Vergleich zu den Steroid-Liganden Ponasteron A und Muristeron A (siehe Tabellen 5 und 6).
Von den 10 getesteten EcR-basierten Genschaltern zeigte der GAL4EcR/VP16RXR-Schalter (Schalter 1.1) eine bessere Leistung als jeder andere Schalter in allen vier untersuchten Zelllinien und war gegenüber Nicht-Steroiden empfindlicher als gegenüber Steroiden. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass die Anbringung der Aktivierungsdomäne (AD) und der DNA-Bindungsdomäne (DNABD) an den jeweiligen zwei Partnern den Hintergrund reduzierte, wenn man dies damit verglich, sowohl AD als auch DNABD zusammen auf einem der zwei Partner anzuordnen. Somit wirkt ein Schalterformat, bei dem AD und DNABD zwischen den zwei Partnern aufgeteilt werden bei EcR-basierten Genschalteranwendungen gut.
Zusätzlich zeigten die MmRXR/EcR-basierten Schalter eine bessere Leistung als die CfUSP/EcR-basierten Schalter, die in Abwesenheit von Ligand eine höhere Hintergrundaktivität aufweisen als die MmRXR/EcR-Schalter.
Schließlich war der GAL4EcR/VP16RXR-Schalter (Schalter 1.1) empfindlicher gegenüber den Nicht-Steroid-Liganden als gegenüber den Steroid-Liganden (siehe Tabellen 5 und 6). Insbesondere initiierten die Steroid-Liganden Transaktivierung bei Konzentrationen von 50 μM, wogegen die Nicht-Steroid-Liganden eine Transaktivierung bei einer Konzentration von weniger als 1 μM (submikromolar) initiierten.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel beschreibt die von den Anmeldern durchgeführte weitere Analyse der trunkierten EcR- und RXR-Polypeptide in dem verbesserten EcR-basierten induzierbaren Genexpressionssystem der Erfindung. Um die beste Kombination und Länge von zwei Rezeptoren zu identifizieren, die einen Schalter ergeben mit a) maximaler Induktion in Gegenwart von Ligand; b) minimalem Hintergrund in Abwesenheit von Ligand; c) hochgradiger Empfindlichkeit gegenüber der Ligandenkonzentration; und d) minimaler Quer-Interaktion zwischen Liganden und Rezeptoren. Die Anmelder erstellten und analysierten mehrere Trunkierungsmutanten der CfEcR- und MmRXR-Rezeptorpolypeptide in NIH3T3-Zellen.
Kurz dargestellt, wurden Polynukleotide, die für EcR- oder RXR-Rezeptoren codieren, an den Verbindungsstellen der Domänen A/B, C, D, E und F trunkiert und entweder mit einem Polynukleotid für CfEcR (SEQ ID NO: 41) fusioniert, das eine GAL4-DNA-Bindungsdomäne codiert, oder mit einem Polynukleotid für MmRXR (SEQ ID NO: 45) fusioniert, das eine VP16-Aktivierungsdomäne codiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die resultierenden Rezeptortrunkierungs-/Fusions-Polypeptide wurden in NIH3T3-Zellen untersucht. Das Plasmid pFRLUC (Stratagene), das ein Luciferase-Polypeptid codiert, wurde als Reportergenkonstrukt verwendet, und pTKRL (Promega), das ein Renilla-Luciferase-Polypeptid unter der Kontrolle des konstitutiven TK-Promotors codiert, wurde verwendet, um die Transfektionen gemäß obiger Beschreibung zu normalisieren. Die Analyse wurde in Dreifachansätzen durchgeführt, und die mittleren Luciferase-Zählimpulse wurden, wie oben beschrieben, bestimmt.
Genexpressionskassetten, die trunkierte Ecdysonrezeptor-Polypeptide codieren
Genexpressionskassetten, umfassend Polynukleotide, die entweder CfEcR-Polypeptide voller Länge oder trunkierte CfEcR-Polypeptide codieren, fusioniert mit einer GAL4 DNA-Bindungsdomäne (SEQ ID NO: 41): GAL4CfEcRA/BCDEF (voll-langes CfEcRA/BCDEF; SEQ ID NO: 49), GAL4CfEcRCDEF (CfEcRCDEF; SEQ ID NO: 1), GAL4CfEcRI/2CDEF (CfEcRI/2CDEF; SEQ ID NO: 2), GAL4CfEcRDEF (CfEcRDEF; SEQ ID NO: 3), GAL4CfEcREF (CfEcREF; SEQ ID NO: 4), und GAL4CfEcRDE (CfEcRDE; SEQ ID NO: 5) wurden zusammen mit VP16MmRXRDEF (konstruiert wie in Beispiel 1.1; 11) oder VP16MmRXREF [konstruiert wie in Beispiel 1.1, mit dem Unterschied, dass MmRXRDEF durch MmRXREF (SEQ ID NO: 23) ersetzt wurde; 12] und pFRLUc- und pTKRL-Plasmid-DNAs in NIH3T3-Zellen transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden in Gegenwart von 0, 1, 5 oder 25 μM an N-(2-Ethyl-3-methoxybenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin oder PonA für 48 h herangezogen. Die Zellen wurden geerntet, lysiert, und die Aktivität des Luciferase-Reporters wurde in den Zelllysaten gemessen. Es ist der Gesamtwert der relativen Lichteinheiten der Fliegen-Luciferase dargestellt. Die Zahl oben auf jedem Balken gibt an, wie hoch die maximale x-fache Induktion für diese Behandlung ist.
Die Ergebnisse der Anmelder zeigen, dass die EF-Domäne von MmRXR hinreichend ist und eine bessere Leistung erbringt als die Domänen DEF dieses Rezeptors (siehe 11 und 12). Die Anmelder haben außerdem gezeigt, dass EcR/RXR-Rezeptorkombinationen im allgemeinen nicht empfindlich gegenüber PonA sind (siehe 11 und 12). Wie in den 11 und 12 gezeigt, zeigt das GAL4CfEcRCDEF-Hybridpolypeptid (SEQ ID NO: 7) eine bessere Leistung als jedes andere CfEcR-Hybrid-Polypeptid.
Genexpressionskassetten, die trunkierte Retinoid X-Rezeptor-Polypeptide codieren
Genexpressionskassetten mit Konstrukten, umfassend Polynukleotide, die entweder für MmRXR-Polypeptide voller Länge oder für trunkierte MmRXR-Polypeptide codieren, in Fusion mit einer VP16-Transaktivierungsdomäne (SEQ ID NO: 45): VP16MmRXRA/BCDEF (voll-langes MmRXRA/BCDEF; SEQ ID NO: 53), VP16MmRXRCDEF (MmRXRCDEF; SEQ ID NO: 21), VP16MmRXRDEF (MmRXRDEF; SEQ ID NO: 22), VP16MmRXREF (MmRXREF; SEQ ID NO: 23), VP16MmRXRBam-EF ("MmRXRBam-EF" oder "MmRXR-trunkiertes EF"; SEQ ID NO: 24), und VP16MmRXRAF2del ("MmRXRAF2del" oder "MmRXR-E"; SEQ ID NO: 25) wurden zusammen mit GAL4CfEcRCDEF (konstruiert wie in Beispiel 1.1; 13) oder GAL4CfEcRDEF [konstruiert wie in Beispiel 1.1, mit dem Unterschied, dass CfEcRCDEF durch CfEcRDEF (SEQ ID NO: 3) ersetzt wurde; 14], pFRLUc- und pTKRL-Plasmid-DNAs gemäß obiger Beschreibung in NIH3T3-Zellen transfiziert. Man ließ die transfizierten Zellen n Gegenwart von 0, 1, 5 und 25 μM an N-(2-Ethyl-3-methoxybenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin oder PonA für 48 h wachsen. Die Zellen wurden geerntet und lysiert, und die Reporteraktivität wurde in dem Zelllysat gemessen. Es ist der Gesamtwert der relativen Lichteinheiten der Fliegen-Luciferase dargestellt. Die Zahl oben auf jedem Balken gibt an, wie hoch die maximale x-fache Induktion für diese Behandlung ist.
Die Ergebnisse der Anmelder zeigen, dass von allen getesteten Trunkierungen von MmRXR der MmRXREF-Rezeptor der beste Partner für CfEcR ist (13 und 14). CfEcRCDEF zeigte bei Verwendung von MmRXREF eine bessere Induktion als CfEcRDEF. Die Deletion von AF2 (abgekürzt mit „EF-AF2del") oder den Helizes 1–3 der E-Domäne (abgekürzt „EF-Bamdel") resultierte in einem RXR-Rezeptor, der die Geninduktion und Ligandenempfindlichkeit reduzierte, wenn eine Paarung entweder mit CfEcRCDEF (13) oder CfEcRDEF (14) in NIH3T3-Zellen erfolgte. Im allgemeinen war der auf CfEcR/RXR-basierende Schalter weit empfindlicher gegenüber dem Nicht-Steroid N-(2-Ethyl-3-methoxybenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin als gegenüber dem Steroid PonA.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt die von den Anmeldern durchgeführte weitere Analyse der Genexpressionskassetten, die für trunkierte EcR- oder RXR-Rezeptorpolypeptide codieren, die entweder die Ligandenbindungsaktivität oder die Ligandenempfindlichkeit oder beide beeinflussen. Kurz dargestellt, wurden sechs verschiedene Kombinationen chimärer Rezeptorpaare, konstruiert wie in den Beispielen 1 und 2, in einem einzelnen Experiment in NIH3T3-Zellen weiter analysiert. Diese sechs Kombinationen von Rezeptorpaaren und ihre entsprechenden Probennummern sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7: CfEcR- und MmRXR-Trunkierungs-Rezeptor-Kombinationen in NIH3T3-Zellen
Die obigen Rezeptorkonstrukt-Paare wurden zusammen mit dem Reporter-Plasmid pFRLuc in NIH3T3-Zellen transfiziert, wie oben beschrieben. Die sechs CfEcR-Trunkierungs-Rezeptor-Kombinationen wurden zu zwei Gruppen dupliziert und entweder mit Steroid (ungerade Nummern auf der x-Achse von 15) oder mit Nicht-Steroid (gerade Nummern auf der x-Achse von 15) behandelt. Insbesondere wurden die Zellen in Medium herangezogen, das 0, 1, 5 oder 25 μM PonA (Steroid) oder N-(2-Ethyl-3-methoxybenzoyl)-N'-(3,5-dimethylbenzoyl)-N'-tert-butylhydrazin (Nicht-Steroid-Ligand) enthielt. Die Reportergenaktivität wurde gemessen und die Gesamt-RLU angezeigt. Die Zahl oben auf jedem Balken gibt an, wie hoch die maximale x-fache Induktion für diese Behandlung ist und ist der Mittelwert von drei Wiederholungen.
Wie in 15 gezeigt, waren die CfEcRCDEF/MmRXREF-Rezeptorkombinationen die besten Schalterpaare sowohl in Begriffen der Gesamt-RLU als auch der vielfachen Induktion (vergleiche Säulen 1–6 mit Säulen 7–12). Dies bestätigt die früheren Ergebnisse der Anmelder, wie beschrieben in 2 (11–14). Die gleichen Genexpressionskassetten, die für die trunkierten EcR- und RXR-Polypeptide codieren, wurden auch in der humanen Lungenkarzinomzelllinie A549 (ATCC) getestet, und es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
SEQUENZLISTE

Claims

Die Genexpression modulierendes System, welches folgendes umfaßt: a) eine erste Genexpressionkassette, die in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die ein erstes Polypeptid codiert, welches folgendes umfaßt: i) eine DNA-Bindungsdomäne, die ein Antwortelement erkennt, das mit einem Gen, dessen Expression moduliert werden soll, assoziiert ist, ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines Ecdysonrezeptorpolypeptids umfaßt, b) eine zweite Genexpressionskassette, die in der Wirtszelle exprimiert werden kann, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die ein zweites Polypeptid codiert, welches folgendes umfaßt: i) eine Transaktivierungsdomäne und ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines verkürzten Retinoid X-Rezeptors, der eine Deletion wenigstens der A- und der B-Domäne aufweist, umfaßt, wobei die Transaktivierungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Ecdysonrezeptor, kein Retinoid X-Rezeptor oder kein Ultraspiracle-Rezeptor ist, und wobei die Ligandenbindungsdomänen des ersten Polypeptids und des zweiten Polypeptids verschieden sind und dimerisieren.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 1, welches weiterhin eine dritte Genexpressionskassette umfaßt, die folgendes umfaßt: i) ein Antwortelement, an das die DNA-Bindungsdomäne des Polypeptids bindet, ii) einen Promotor, der durch die Transaktivierungsdomäne des zweiten Polypeptids aktiviert wird, und iii) das Gen, dessen Expression moduliert werden soll.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 40.
Die Genexpression modulierendes System, welches folgendes umfaßt: a) eine erste Genexpressionskassette, die in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, umfassend eine Polynukleotidsequenz, welche ein erstes Polypeptid codiert, das folgendes umfaßt: i) eine DNA-Bindungsdomäne, die ein Antwortelement erkennt, das mit einem Gen, dessen Expression moduliert werden soll, assoziiert ist, und ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines verkürzten Retinoid X-Rezeptors, der eine Deletion wenigstens der A- und der B-Domäne aufweist, umfaßt und b) eine zweite Genexpressionskassette, die in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die ein zweites Polypeptid codiert, das folgendes umfaßt: i) eine Transaktivierungsdomäne und ii) eine Ligandenbindungsdomäne, die eine Ligandenbindungsdomäne eines Ecdysonrezeptors umfaßt, wobei die Ligandenbindungsdomänen des ersten Polypeptids und des zweiten Polypeptids verschieden sind und dimerisieren.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 7, welches weiterhin eine dritte Genexpressionkassette umfaßt, die folgendes umfaßt: i) ein Antwortelement, an das die DNA-Bindungsdomäne des ersten Polypeptids bindet, ii) einen Promotor, der durch die Transaktivierungsdomäne des zweiten Polypeptids aktiviert wird, und iii) das Gen, dessen Expression moduliert werden soll.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 7, wobei die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 7, wobei die Ligandenbindungsdomäne des ersten Polypeptids eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 40.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 7, wobei die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Die Genexpression modulierendes System nach Anspruch 7, wobei die Ligandenbindungsdomäne des zweiten Polypeptids eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid umfaßt, das ein hybrides Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einer DNA-Bindungsdomäne und einer Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne, wobei die DNA-Bindungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Ecdysonrezeptor ist, b) einer DNA-Bindungsdomäne und einer Ligandenbindungsdomäne eines verkürzten Retinoid X-Rezeptors, welcher eine Deletion wenigstens der A- und der B-Domäne aufweist, wobei die DNA-Bindungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Retinoid X-Rezeptor ist, c) einer Transaktivierungsdomäne und einer Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne, wobei die Transaktivierungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Ecdysonrezeptor ist, und d) einer Transaktivierungsdomäne und einer Ligandenbindungsdomäne eines verkürzten Retinoid X-Rezeptors, welcher eine Deletion wenigstens der A- und der B-Domäne aufweist, wobei die Transaktivierungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Retinoid X-Rezeptor ist.
Genexpressionskassette nach Anspruch 13, wobei die Expressionskassette ein Polynukleotid umfaßt, welches ein hybrides Polypeptid codiert, das folgendes aufweist: eine DNA-Bindungsdomäne und eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne, wobei die DNA-Bindungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Ecdysonrezeptor ist, oder eine DNA-Bindungsdomäne und eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne, wobei die DNA-Bindungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Retinoid X-Rezeptor ist, und wobei die DNA-Bindungsdomäne eine GAL4-DNA-Bindungsdomäne oder eine LexA-DNA-Bindungsdomäne ist.
Genexpressionskassette nach Anspruch 13, wobei die Expressionskassette ein Polynukleotid umfaßt, welches ein hybrides Polypeptid codiert, das folgendes aufweist: eine Transaktivierungsdomäne und eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne, wobei die Transaktivierungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Ecdysonrezeptor ist, oder eine Transaktivierungsdomäne und eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne, wobei die Transaktivierungsdomäne von einem Kernrezeptor stammt, der kein Retinoid X-Rezeptor ist, und wobei die Transaktivierungsdomäne eine VP16-Transaktivierungsdomäne ist.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid umfaßt, das ein hybrides Polypeptid codiert, welches eine DNA-Bindungsdomäne umfaßt, die durch ein Polynukleotid codiert ist, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus GAL4 DBD (SEQ ID NO: 41) oder LexA DBD (SEQ ID NO: 43), und eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfaßt, die durch ein Polynukleotid codiert ist, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid, das ein hybrides Polypeptid codiert, welches eine DNA-Bindungsdomäne umfaßt, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus GAL4 DBD (SEQ ID NO: 42) oder LexA DBD (SEQ ID NO: 44), umfaßt, und eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20, umfaßt.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid umfaßt, das ein hybrides Polypeptid codiert, welches eine DNA-Bindungsdomäne umfaßt, die durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus GAL4 DBD (SEQ ID NO: 41) oder LexA DBD (SEQ ID NO: 43), und eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfaßt, die durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid umfaßt, das ein hybrides Polypeptid codiert, welches eine DNA-Bindungsdomäne umfaßt, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus GAL4 DBD (SEQ ID NO: 42) oder LexA DBD (SEQ ID NO: 44), und eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfaßt, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 40.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid umfaßt, das ein hybrides Polypeptid codiert, welches eine Transaktivierungsdomäne umfaßt, die durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 45 umfaßt, und eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfaßt, die durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid umfaßt, das ein hybrides Polypeptid codiert, welches eine Transaktivierungsdomäne umfaßt, die eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 46 umfaßt, und eine Ecdysonrezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfaßt, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid umfaßt, das ein hybrides Polypeptid codiert, welches eine Transaktivierungsdomäne umfaßt, die durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 45 umfaßt, und eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfaßt, die durch ein Polynukleotid codiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30.
Genexpressionskassette, welche ein Polynukleotid umfaßt, das ein hybrides Polypeptid codiert, welches eine Transaktivierungsdomäne umfaßt, die eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 46 umfaßt, und eine Retinoid X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne umfaßt, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 40.
Isoliertes Polynukleotid, welches ein verkürztes Retinoid X-Rezeptorpolypeptid codiert, wobei das Polynukleotid eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30.
Isoliertes verkürztes Retinoid X-Rezeptorpolypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 40.
Isoliertes Polynukleotid, welches eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die das isolierte Polypeptid nach Anspruch 25 codiert.
Verfahren zum Modulieren der Expression eines Gens in einer Wirtszelle, die das zu modulierende Gen enthält, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) Einbringen des die Genexpression modulierenden Systems nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in die Wirtszelle und b) Einbringen eines Liganden, der sich unabhängig mit den Ligandenbindungsdomänen des ersten Polypeptids und des zweiten Polypeptids vereinigt, in die Wirtszelle, wobei das zu exprimierende Gen eine Komponente eines chimären Gens ist, welches folgendes umfaßt: i) ein Antwortelement, an das die DNA-Bindungsdomäne des ersten Polypeptids bindet, ii) einen Promotor, der durch die Transaktivierungsdomäne des zweiten Polypeptids aktiviert wird, und iii) das Gen, dessen Expression moduliert werden soll, wobei ein Komplex gebildet wird, der den Liganden, das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid umfaßt, und wobei der Komplex die Expression des Gens in der Wirtszelle moduliert.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Ligand eine Verbindung der Formel
ist, wobei: E ein (C₄-C₆)-Alkyl, das ein tertiäres Kohlenstoffatom enthält, oder ein Cyano-(C₃-C₅)-alkyl, das ein tertiäres Kohlenstoffatom enthält, ist, R¹ H, Me, Et, i-Pr, F, Formyl, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, CCH, 1-Propinyl, 2-Propinyl, Vinyl, OH, OMe, OEt, Cyclopropyl, CF₂CF₃, CH=CHCN, Allyl, Azido, SCN oder SCHF₂ ist, R² H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Formyl, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, CCH, 1-Propinyl, 2-Propinyl, Vinyl, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃, OCF₂CF₂H, COEt, Cyclopropyl, CF₂CF₃, CH=CHCN, Allyl, Azido, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe, NH-CN ist oder verbunden ist mit R³ und den Phenylkohlenstoffen, an die R² und R³ angebunden sind, um ein Ethylendioxy auszubilden, um einen Dihydrofurylring mit dem einem Phenylkohlenstoff benachbarten Sauerstoff auszubilden, oder um einen Dihydropyrylring mit dem einem Phenylkohlenstoff benachbarten Sauerstoff auszubilden, R³ H, Et ist oder verbunden ist mit R² und den Phenylkohlenstoffen, an die R² und R³ angebunden sind, um ein Ethylendioxy auszubilden, um einen Dihydrofurylring mit dem einem Phenylkohlenstoff benachbarten Sauerstoff auszubilden, oder um einen Dihydropyrylring mit dem einem Phenylkohlenstoff benachbarten Sauerstoff auszubilden, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander H, Me, Et, F, Cl, Br, Formyl, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C°CH, 1-Propinyl, 2-Propinyl, Vinyl, OMe, OEt, SMe oder SEt sind.
Isolierte Wirtszelle, in die das die Genexpression modulierende System nach Anspruch 1 oder 7 eingebracht wurde.
Isolierte Wirtszelle nach Anspruch 29, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Bakterienzelle, einer Pilzzelle, einer Hefezelle, einer Pflanzenzelle, einer Tierzelle und einer Säugerzelle.
Isolierte Wirtszelle nach Anspruch 30, wobei die Säugerzelle eine Mauszelle oder eine menschliche Zelle ist.
Nicht-menschlicher Organismus, welcher eine Wirtszelle, in die das die Genexpression modulierende System nach Anspruch 1 oder 7 eingebracht wurde, umfaßt.
Nicht-menschlicher Organismus nach Anspruch 32, wobei der nicht-menschliche Organismus aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Bakterium, einem Pilz, einer Hefe, einer Pflanze, einem Tier und einem Säuger.
Nicht-menschlicher Organismus nach Anspruch 33, wobei der Säuger aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einer Katze, einem Hund, einem Rind, einer Ziege, einem Schwein, einem Pferd, einem Schaf, einem Affen und einem Schimpansen.