CN109810993B

CN109810993B - 一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因及其应用

Info

Publication number: CN109810993B
Application number: CN201910228477.8A
Authority: CN
Inventors: 黄训兵; 刘�文; 王月月
Original assignee: Linyi University
Current assignee: Linyi University
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-03-25
Also published as: CN109810993A

Abstract

本发明公开了一种蝗虫β‑D‑葡萄糖苷水解酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。根据该基因设计引物合成用于干扰β‑D‑葡萄糖苷水解酶基因的dsRNA，将dsRNA导入蝗虫对β‑D‑葡萄糖苷水解酶基因进行RNA干扰，可抑制蝗虫的正常蜕皮或产卵，进而为害虫绿色、可持续防控提供新的方法，也为创制新型生物农药提供了技术支撑。

Description

一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因及其应用。

背景技术

农作物遭受虫害会降低生产力，危害粮食安全。传统的害虫防治方法多以化学防治为主，但过分依赖于化学农药的使用，容易引发害虫的抗性、再猖獗、残毒严重等问题，严重破坏生态环境和农产品质量安全。因此，开发并创制绿色、高效、可持续的害虫防控技术显得尤为重要。

亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus Bey-Bienko是我国北方地区危害最为严重的优势种蝗虫之一，可取食禾本科牧草和粮食作物，严重破坏北方地区农牧业生产，是重要的生物灾害。目前，针对亚洲小车蝗的防控与治理多采用传统化学防控的方法，不利于农业环境的绿色、可持续发展。因此，如何利用新手段开发绿色、高效的防控技术和方法是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶(BG)基因，利用该基因设计dsRNA对蝗虫进行RNA干扰可抑制蝗虫的正常产卵或蜕皮，进而在控制蝗虫大量繁殖的同时降低若虫存活率，达到防控目的。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因编码的酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因在防控虫害中的应用。

一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因在防控虫害中的应用，根据蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因设计引物合成dsRNA，对蝗虫进行RNA干扰，抑制蝗虫蜕皮或产卵。

一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因在防控虫害中的应用，以蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因为模板，以BG-2F、BG-2R为引物扩增得到dsRNA；BG-2F序列如SEQ ID NO：3所示；BG-2R序列如SEQ ID NO：4所示。

一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因在制备生物农药中的应用。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因，根据该基因设计引物合成用于干扰β-D-葡萄糖苷水解酶基因的dsRNA，将dsRNA导入蝗虫对β-D-葡萄糖苷水解酶基因进行RNA干扰，可抑制蝗虫的正常蜕皮或产卵，进而做到防治结合，为害虫绿色、可持续防控提供新的方法，也为创制新型生物农药提供了技术支撑。

附图说明

图1所示为BG基因PCR扩增产物；

图2所示为亚洲小车蝗β-D-葡萄糖苷水解酶基因BG dsRNA干扰效果；

图3所示为dsBG干扰对亚洲小车蝗生长速率的影响；

图4所示为dsBG干扰对亚洲小车蝗蜕皮率的影响；

图5所示为dsBG干扰后无法正常蜕皮的亚洲小车蝗；

图6所示为dsBG干扰对亚洲小车蝗蜕皮激素含量的影响；

图7所示为dsBG对亚洲小车蝗排卵的影响；

图8所示为RNA干扰实验处理后的亚洲小车蝗雌虫及卵形态，其中，左图为空白对照组，右图为dsBG组；

图9所示为dsBG干扰对亚洲小车蝗卵黄原蛋白含量的影响。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

供试虫源：野外采集4龄亚洲小车蝗蝗蝻，置于人工智能气候箱中饲养，条件如下：温度30℃，湿度80％，光照黑暗比为12h:12h，每天以采集的新鲜克氏针茅饲喂。

主要试剂及试剂盒：

RNA分离试剂(invitrogen原装)，RNA spin column(全式金)，胶回收试剂盒(Axygen)，EX Taq DNA聚合酶(Takara)，T4DNA连接酶(Takara)，pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)，无水乙醇、异丙醇、丙三醇等试剂均为国产分析醇。

主要仪器：超净工作台(上海博讯实业有限公司)、东胜龙ETC-811 PCR仪(北京东胜创新生物科技有限公司)、德国Sigma 3K15冷冻离心机(德国希格玛离心机有限公司)、NanoPhotometer微量分光光度计(德国IMPLEN公司)、HPX-9052 MBE数显电热培养箱(上海博讯实业有限公司)、THZ-D台式恒温振荡器(华美生化仪器厂)、漩涡振荡器QL-901(海门市其林贝尔仪器制造)、高压灭菌锅YXQ-LS-50SII(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

实施例1亚洲小车蝗β-D-葡萄糖苷水解酶BG编码基因的获得

1、亚洲小车蝗总RNA的提取

采用

RNA分离试剂提取亚洲小车蝗样品的总RNA。具体步骤如下：

1)匀浆器置于冰上，加入1mL

RNA分离试剂和100-200mg亚洲小车蝗组织，研磨。

2)将匀浆液转移至1.5mL离心管中，室温静置5min，4℃条件下13000r离心5min。

3)将上清转移至干净的1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，漩涡震荡15s。室温放置5min，4℃条件下13000r离心10min。

4)吸取400μL上清转移至新的1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，漩涡震荡30s，室温放置5min，4℃条件下13000r离心10min。

5)吸取300μL上清，加入300μL异丙醇，漩涡震荡30s，转移至RNA spin column中，冰上静置10min。

6)4℃，13000r离心2min，弃滤液。

7)加入600μL RNA washsolution，吸打使沉降物洗涤，4℃，13000r离心2min，弃滤液。再次加入600μL RNA washsolution，吸打使沉降物洗涤，4℃，13000r离心2min，弃滤液。4℃，13000r空离3min，除去多余乙醇，空气吹干3min。

8)更换一个新的收集管，向RNA spin column中加入50μL 65℃预热的RNase-free-water，余热下热置5min，4℃，13000r离心3min。

9)收集滤出液，用NanoPhotometer微量分光光度计检测RNA浓度和OD260/280值，确认RNA质量。同时，取2μL提取的RNA，琼脂糖凝胶电泳检测，剩余RNA储存于-20℃备用。

2、cDNA反转录

用PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒反转录获得cDNA。具体步骤如下：

1)配置10μL体系：Oligo dT Primer(50μM)1μL、dNTP Mixture(10mM each)1μL、total RNA<5μL、RNase Free dH₂O补足体系至10μL。

2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

3)配置20μL反应液：5×PrimeScript Buffer 4μL、RNase Inhibitor(400U/μL)0.5μL(20units)、PrimeScript RTase(200U/μL)1μL(200units)、RNase Free dH₂O补足体系至20μL。

4)缓慢混匀。

5)42℃保温30-60min。

6)95℃保温5min，使酶失活，冰上放置，-20℃保存cDNA。

3、亚洲小车蝗β-D-葡萄糖苷水解酶BG编码基因的获得

1)引物设计

根据前期获得的亚洲小车蝗转录组得到BG基因片段序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，部分基因片段编码的β-D-葡萄糖苷水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。设计引物如下：

BG-F：CTGTTAATGTCATCCTTGCAGCAGC(SEQ ID NO:5)；

BG-R：CTGAATAACTCTGAATAGTATTGTC(SEQ ID NO:6)。

2)PCR反应

以亚洲小车蝗cDNA为模板，以引物BG-F/BG-R进行PCR扩增，得到PCR产物。

PCR反应体系如下：cDNA模板1μL、dNTP 4μL、10×Buffer 5μL、BG-F 1μL、BG-R 1μL、Taq酶0.25μL、ddH₂O 38μL。

PCR反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

3)PCR产物回收、克隆、测序

3-1)将PCR产物在TAE配制的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳(图1)，当目标带分离较好时，用刀片切下目标带所在的胶块放入无菌的离心管中。再用胶回收试剂盒(Axygen)回收纯化目标带，回收纯化过程参照试剂盒说明书进行。

3-2)PCR产物回收后连接pGEM-T Easy载体，得到重组载体。连接体系如下：T4 DNAligase 1μL、2×buffer 5μL、pGEM-T Easy 1μL、PCR回收产物3μL。连接条件：室温下连接6个小时。

3-3)感受态细胞的制备与转化

在1.5mL离心管中，加入33.3μL Trans1-t1感受态细胞，冰上放置15min，42℃水浴90s，冰上放置10min。在每个1.5mL离心管中加入500μL的液体LB培养液，37℃，200rpm摇菌2h。摇菌后，吸取100μL菌液至含1‰AMP的LB固体培养基中，37℃培养过夜。挑选单菌落于2mL的离心管中，管中添加1mL含1‰AMP的LB液体培养基，37℃，200rpm摇菌3-6h，观察生长情况。

3-4)菌液PCR

对3-3)中的菌液进行PCR验证，菌液PCR反应体系如下：菌液1μL、dNTP 4μL、10×Buffer 5μL、BG-F 1μL、BG-R 1μL、Taq酶0.25μL、ddH₂O 38μL。

反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。

将阳性克隆菌株送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定并对测序结果进行分析。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为1520bp的DNA片段。

实施例2 dsRNA的合成及其在防治害虫中的应用

1、dsRNA的合成

采用T7 RiboMAX^TM Express RNAi System试剂盒合成dsRNA。具体步骤如下：

1)dsRNA引物的合成

根据已克隆出的基因片段设计引物，在引物的5'端引入T7启动子。引物序列如下：

BG-2F：5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCAATCTCATTATCAGTATAAC-3’(SEQ ID NO:3)；

BG-2R：5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCATCCCCATTCACCATGGTGACG3’(SEQ IDNO:4)。

2)DNA模板的制备

用试剂盒提取实施例1中的阳性克隆菌株菌液质粒，以该质粒为模板，采用BG-2F和BG-2R进行PCR扩增，得到含有T7启动子序列的目的片段，大小645bp。

PCR反应体系如下：质粒1μL、dNTP 4μL、10×Buffer 5μL、BG-2F 1μL、BG-2R 1μL、Taq酶0.25μL、ddH₂O 38μL。

PCR反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

回收PCR产物，并用NanoPhotometer微量分光光度计检测目标DNA浓度，回收浓度需大于150ng/μL。

3)dsRNA的合成

采用T7 RiboMAX ^TM Express RNAi System试剂盒将回收的DNA体外转录合成β-D-葡萄糖苷水解酶基因BG的dsRNA，并用NanoPhotometer微量分光光度计检测dsRNA浓度，dsRNA浓度需要大于1000ng/μL。再将dsRNA浓度调整为3ng/μL，得到dsRNA溶液(溶剂为Nucleause free water)。

本发明获得的亚洲小车蝗β-D-葡萄糖苷水解酶基因BG的dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成。上述亚洲小车蝗β-D-葡萄糖苷水解酶基因BG的dsRNA也可通过人工合成的方法获得。将亚洲小车蝗β-D-葡萄糖苷水解酶基因BG的dsRNA命名为dsBG。

4)对照GFP的dsRNA

按照上述方法合成对照GFP的dsRNA，将对照GFP的dsRNA命名为dsGFP，得到浓度为3ng/μL的dsGFP溶液。对照GFP的dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成。合成GFPdsRNA的引物如下：

GFP-1F：5’-TAATACGACTCACTATAGGTACGACTCACTATAGGAGTAAAGG-3’(SEQ ID NO:7)；

GFP-1R：5’-TAATACGACTCACTATAGGTAGGTTTGTATAGTTCATCCATACC-3’(SEQ ID NO:8)。

2、dsRNA在防治害虫中的应用

dsRNA注射导入亚洲小车蝗，具体步骤如下：采用10μL微量注射器吸取5μL浓度为3ng/μL的dsBG溶液(实验组)和dsGFP溶液(dsGFP对照组)，分别从亚洲小车蝗腹部第2腹节和第3腹节节间膜注射进入，注意注射器针头和腹部保持平行，避免损伤蝗虫内部器官组织；设置注射5μL Nucleause free water的处理作为空白对照组(CK)。

1)实时荧光定量PCR

注射后36h提取实验组和对照组(dsGFP对照组和空白对照组)的亚洲小车蝗虫体的总RNA，Takara反转录试剂盒合成cDNA，以actin基因作为内参基因，检测BG基因表达量。

BG基因定量PCR引物序列如下：

F：CTGTAGACATTGTGCTCTACC(SEQ ID NO:9)；

R：CATAAGAAGCCCTCTAATTCACG(SEQ ID NO:10)；

actin基因引物序列如下：

F’：GTTACAAACTGGGACGACAT(SEQ ID NO:11)；

R’：AGAAAGCACAGCCTGAATAG(SEQ ID NO:12)。

结果表明：与对照组(dsGFP对照组、空白对照组CK)相比，dsBG实验组的亚洲小车蝗中的BG基因的表达量显著降低，说明dsBG成功干扰了亚洲小车蝗中BG基因的表达。(图2)。

2)RNA干扰对蝗虫生长发育的影响

dsRNA注射处理16头4龄亚洲小车蝗蝗蝻(雌雄各半)，重复5次。注射后放入智能人工气候箱中饲养，饲养条件如下：温度30℃，湿度80％，光照黑暗比为12h：12h，观察并统计亚洲小车蝗体重、生长速率及蜕皮情况。初始蝗虫数量为S0＝16，各处理组蜕皮数M，蜕皮率＝M/S0；实验前各处理组平均体重为A1，进入成虫阶段后各处理组平均体重为A2，体重增加量＝A2-A1；生长速率＝(A2-A1)/D，式中D为天数。

结果如图3-5所示，dsBG干扰后的亚洲小车蝗生长速率、蜕皮率与对照组(dsGFP对照组和空白对照组)有显著差异(P＜0.05)，dsBG干扰后的蝗虫生长速率显著低于对照组，dsGFP对照组和空白对照组结果无显著性差异。

进一步地，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(GTX，Ecdysone ELISA Kit)测定dsRNA处理的蝗虫蜕皮激素含量，虫体研磨溶于1mL PBS溶液，按照试剂盒说明往预先包被酶抗体的包被微孔中，依次加入标准品和样品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算蝗虫蜕皮激素浓度，每处理重复5次。

结果表明(图6)：dsBG干扰后的亚洲小车蝗蜕皮激素含量与对照组(dsGFP对照组和空白对照组)有显著差异(P＜0.05)，dsBG干扰后的蜕皮激素显著低于对照组，dsGFP对照组和空白对照组结果无显著性差异。结果表明dsBG显著抑制了亚洲小车蝗蜕皮激素的产生。

3)RNA干扰对蝗虫排卵的影响

dsRNA注射处理16头4龄亚洲小车蝗雌虫，重复5次。注射后将其在智能人工气候箱中进行饲养，饲养条件如下：温度30℃，湿度80％，光照黑暗比为12h：12h，每天观察亚洲小车蝗发育情况，进入成虫阶段并产卵后统计各处理组存活数S及各处理组产卵量M，计算单雌产卵量＝M/S，并观察卵形态。

结果如图7-8所示，dsBG干扰后的亚洲小车蝗单雌产卵量与对照组(dsGFP对照组和空白对照组)有显著差异(P＜0.05)，dsBG干扰后的蝗虫单雌产卵量显著低于对照组，dsGFP对照组和空白对照组结果无显著性差异。

进一步地，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(GTX，VTGELISA Kit)测定dsRNA处理的蝗虫卵黄原蛋白含量，虫体研磨溶于1mL PBS溶液，按照试剂盒说明往预先包被酶抗体的包被微孔中，依次加入标准品和样品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算蝗虫卵黄原蛋白含量，每处理重复5次。

结果表明(图9)：dsBG干扰后的亚洲小车蝗卵黄原蛋白含量与对照组(dsGFP对照组和空白对照组)有显著差异(P＜0.05)，dsBG干扰后的卵黄原蛋白显著低于对照组，dsGFP对照组和空白对照组结果无显著性差异。结果表明BG基因RNAi显著抑制了亚洲小车蝗卵黄原蛋白的产生。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 临沂大学

<120> 一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1693

<212> DNA

<213> Oedaleus asiaticus

<400> 1

tgtgatgtgc tgttaatgtc atccttgcag cagcctcggg tacagtaatc agtcagatca 60

gtccattgcc cactataaat agttggaaga gtagaataaa aatctcaaaa gcattgattt 120

agctagactt ctgtgtcatg ctgttgatga cttccttaaa agaaccttgg gtacagtaaa 180

cacttagata agtccgtcgc tcactataaa tacttggaag agtagaataa aaatcccaac 240

tgcatacatt tagcacatta gataaggatg aatgaaaaaa aagaaaaacg tttccagctg 300

atggttgttt ttttggacac ttttctactt ggttggagtg ctctgtcaat ctcattatca 360

gtataaccat ttttcttaag agccattcgg aagtgattca gttccccttg caaatatatt 420

ggctcacaga tattgttaga cctatctgta agtgttttca tgacacctct cttctactta 480

ggtgattcga gttcttatac tagtaacgat aggtgcgtat atctttgctg tagacattgt 540

gctctacctg tttaattact gatacatcta aaaagttcaa ttgtccatta ttctctttct 600

tcatgattaa tctttggatt tatactattt aggtatagca ggaaatcatt taaatactcc 660

tcactgtgat tccatatcac aaaggagtca tctacgtaac gataccaaca cgaagggctt 720

ttggttgccg actgcagcga ttgttgttca aagaattcca tgaataaatt aacaattacg 780

tgaattagag ggcttcttat ggctaacccc tcaatttgtt cataaaattc gcttttattc 840

tgaaaataag tcgtgggcag acaatgttgg aagaacgcta ctatattagt agggaactta 900

ttggctatat aagagcttcg tcaccatggt gaatggggat gctacatcaa aactaataag 960

gatgtcagta atcgccttaa ttttacaata aagtgcagat aattatttta atatgattct 1020

ccattttacc tatgtacagt tgtagcaaag aggtaaggtg tcaggctagc tccaatcccg 1080

ctcactatcg gtctcaaagg aacaccaggc ttatgtatct ttggtagcca atataaacgc 1140

cgggggtaag catcccttta gcaaagatat tttttaactt ctgtaggaat gtaatactgt 1200

tttatcaaac gattggtaac atttagcatg ttcgttatat gatccttttt ccacgtttta 1260

tatgtggtag ggaccaggag gtcactaatc ttcctgtgat tatcttcact attcagtaca 1320

acgatgatgt tccccttatc agctgcaagt atcataacat ttctgcctgc attaatctcc 1380

cgcaacgcct ttattttccc ctttagtcaa attgctgcta ggtggcatgg tggattttct 1440

gttcataact tttcattata aagaagtgcc ttgaacactt atttataaca tttttgttgg 1500

tagtgacaat actattcaga gttattcagc accattgctt gattgaggcc aataaaatgt 1560

tttatttttc ttcaggagag gaagcaaggc atttcgcgat ttttgttaag tgtatgggaa 1620

gtactgttgc ttacattata cagagagtgt caggtagaaa ggtacacgca ttgagggata 1680

ataacactgg tga 1693

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> Oedaleus asiaticus

<400> 2

Cys Asp Val Leu Leu Met Ser Ser Leu Gln Gln Pro Arg Val Gln Ser

1 5 10 15

Val Arg Ser Val His Cys Pro Leu Ile Val Gly Arg Val Glu Lys Ser

20 25 30

Gln Lys His Phe Ser Thr Ser Val Ser Cys Cys Leu Pro Lys Asn Leu

35 40 45

Gly Tyr Ser Lys His Leu Asp Lys Ser Val Ala His Tyr Lys Tyr Leu

50 55 60

Glu Glu Asn Lys Asn Pro Asn Cys Ile His Leu Ala His Ile Arg Met

65 70 75 80

Asn Glu Lys Lys Glu Lys Arg Phe Gln Leu Met Val Val Phe Leu Asp

85 90 95

Thr Phe Leu Leu Gly Trp Ser Ala Leu Ser Ile Ser Leu Ser Val Pro

100 105 110

Phe Phe Leu Arg Ala Ile Arg Lys Phe Ser Ser Pro Cys Lys Tyr Ile

115 120 125

Gly Ser Gln Ile Leu Leu Asp Leu Ser Val Ser Val Phe Met Thr Pro

130 135 140

Leu Phe Tyr Leu Gly Asp Ser Ser Ser Tyr Thr Ser Asn Asp Arg Cys

145 150 155 160

Val Tyr Leu Cys Cys Arg His Cys Ala Leu Pro Val Leu Leu Ile His

165 170 175

Leu Lys Ser Ser Ile Val His Tyr Ser Leu Ser Ser Leu Ile Phe Gly

180 185 190

Phe Ile Leu Phe Arg Tyr Ser Arg Lys Ser Phe Lys Tyr Ser Ser Leu

195 200 205

Phe His Ile Thr Lys Glu Ser Ser Thr Arg Tyr Gln His Glu Gly Leu

210 215 220

Leu Val Ala Asp Cys Ser Asp Cys Cys Ser Lys Asn Ser Met Asn Lys

225 230 235 240

Leu Thr Ile Thr Ile Arg Gly Leu Leu Met Ala Asn Pro Ser Ile Cys

245 250 255

Ser Asn Ser Leu Leu Phe Lys Val Val Gly Arg Gln Cys Trp Lys Asn

260 265 270

Ala Thr Ile Leu Val Gly Asn Leu Leu Ala Ile Glu Leu Arg His His

275 280 285

Gly Glu Trp Gly Cys Tyr Ile Lys Thr Asn Lys Asp Val Ser Asn Arg

290 295 300

Leu Asn Phe Thr Ile Lys Cys Arg Leu Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Tyr

305 310 315 320

Leu Cys Thr Val Val Ala Lys Arg Gly Val Arg Leu Ala Pro Ile Pro

325 330 335

Leu Thr Ile Gly Leu Lys Gly Thr Pro Gly Leu Cys Ile Phe Gly Ser

340 345 350

Gln Tyr Lys Arg Arg Gly Ala Ser Leu Gln Arg Tyr Phe Leu Thr Ser

355 360 365

Val Gly Met Tyr Cys Phe Ile Lys Arg Leu Val Thr Phe Ser Met Phe

370 375 380

Val Ile Ser Phe Phe His Val Leu Tyr Val Val Gly Thr Arg Arg Ser

385 390 395 400

Leu Ile Phe Leu Leu Ser Ser Leu Phe Ser Thr Thr Met Met Phe Pro

405 410 415

Leu Ser Ala Ala Ser Ile Ile Thr Phe Leu Pro Ala Leu Ile Ser Arg

420 425 430

Asn Ala Phe Ile Phe Pro Phe Ser Gln Ile Ala Ala Arg Trp His Gly

435 440 445

Gly Phe Ser Val His Asn Phe Ser Leu Arg Ser Ala Leu Asn Thr Tyr

450 455 460

Leu His Phe Cys Trp Gln Tyr Tyr Ser Glu Leu Phe Ser Thr Ile Ala

465 470 475 480

Leu Arg Pro Ile Lys Cys Phe Ile Phe Leu Gln Glu Arg Lys Gln Gly

485 490 495

Ile Ser Arg Phe Leu Leu Ser Val Trp Glu Val Leu Leu Leu Thr Leu

500 505 510

Tyr Arg Glu Cys Gln Val Glu Arg Tyr Thr His Gly Ile Ile Thr Leu

515 520 525

Val

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

ggatcctaat acgactcact ataggcaatc tcattatcag tataac 46

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

ggatcctaat acgactcact ataggcatcc ccattcacca tggtgacg 48

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

ctgttaatgt catccttgca gcagc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

ctgaataact ctgaatagta ttgtc 25

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

taatacgact cactataggt acgactcact ataggagtaa agg 43

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

taatacgact cactataggt aggtttgtat agttcatcca tacc 44

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

ctgtagacat tgtgctctac c 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

cataagaagc cctctaattc acg 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

gttacaaact gggacgacat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

agaaagcaca gcctgaatag 20

Claims

1.一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因编码的酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

3.根据权利要求1所述的一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因合成的dsRNA在防控亚洲小车蝗虫害中的应用，其特征在于，所述dsRNA用于对蝗虫进行RNA干扰，抑制蝗虫蜕皮或产卵。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以所述蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因为模板，以BG-2F、BG-2R为引物扩增得到所述dsRNA；所述BG-2F序列如SEQ ID NO：3所示；所述BG-2R序列如SEQ ID NO：4所示。

5.根据权利要求1所述的一种蝗虫β-D-葡萄糖苷水解酶基因合成的干扰所述基因的dsRNA在制备生物农药中的应用。