JP2003527852A - 新規エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系 - Google Patents

新規エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系

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Abstract

(57)【要約】 本発明はバイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。具体的には、本発明は遺伝子発現の分野に関する。より具体的には、本発明は新規な誘導性遺伝子発現系および遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミックスおよびトランスジェニック植物および動物における特性の調節のような適用のための宿主細胞における遺伝子発現を調整する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、２０００年３月２２日に出願された同時係属米国仮出願シリアル番
号６０／１９１，３５５および２００１年２月２０日に出願された同時係属米国
仮出願シリアル番号６０／２６９，７９９に対する優先権を主張する。
【０００２】 （発明の分野） 本発明はバイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。具体的には、
本発明は遺伝子発現の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は新規なエクジソ
ン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系およびこの誘導性遺伝子発現系を用いて宿
主細胞内で遺伝子の発現を調整する方法に関する。
【０００３】 （発明の背景） 遺伝子工学の分野においては、遺伝子発現の正確な制御は発生および他の生理
学的プロセスを研究し、操作し、および制御するための価値あるツールである。
遺伝子発現は、多数の特異的蛋白質−蛋白質相互作用に関連する複雑な生物学的
プロセスである。それが蛋白質合成における最初の工程として必要なＲＮＡを生
産するように遺伝子発現がトリガーされるためには、転写アクチベータが、遺伝
子転写を制御するプロモーターの近隣に運ばれなければならない。典型的には、
転写アクチベータそれ自体は、遺伝子のプロモーター領域に存在するＤＮＡ結合
部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有する蛋白質に関連する
。このように、遺伝子発現が起こるためには、ＤＮＡ結合ドメインから適切な距
離に位置するＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含む蛋白質が
、遺伝子のプロモーター領域中の正しい位置に運ばれなければならない。
【０００４】 伝統的なトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的プロモーターを利用
して設計されたトランスジーンの発現を駆動する。トランスジーンを含むＤＮＡ
構築体はまず宿主ゲノムに取り込まれる。転写アクチベータによってトリガーさ
れると、トランスジーンの発現が与えられた細胞型で起こる。 細胞中の外来性遺伝子の発現を調節するためのもう１つの手段は誘導性プロモ
ーターを介するものである。そのような誘導性プロモーターの使用の例はＰＲ１
−ａプロモーター、原核生物リプレッサ−オペレータ系、免疫抑制−イミュノフ
ィリン系、およびステロイドホルモン受容体系のような高等真核生物転写活性化
系を含むが、それらは後記する。 タバコからのＰＲ１−ａプロモーターは、病原体攻撃後の全身獲得抵抗性応答
の間に誘導される。ＰＲ１−ａの使用は限定されるであろう。なぜならば、それ
は、しばしば、内因性物質および病原体、ＵＶ−Ｂ放射線および汚染物のような
外的因子に応答するからである。熱ショック、インターフェロンおよび重金属に
よって誘導されたプロモーターに基づく遺伝子調節系が記載されている（Ｗｕｒ
ｎら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５４
１４〜５４１８、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９９０ Ｃｅｌｌ ６２：５１〜６
１、Ｆｉｌｍｕｓら、１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ２０：２７５５０〜２７５６０）。しかしながら、これらの系は非標的遺伝
子の発現に対するそれらの効果のため制限を有する。これらの系は漏洩性でもあ
る。
【０００５】 原核生物リプレッサーオペレータ系は、細菌リプレッサ蛋白質およびそれらが
結合するユニークなオペレータＤＮＡ配列を利用する。細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉからのテトラサイクリン（「Ｔｅｔ」）およびラクトース（「Ｌ
ａｃ」）リプレッサーオペレータ系は、共に、遺伝子発現を制御するために植物
および動物で用いられてきた。Ｔｅｔ系では、テトラサイクリンがＴｅｔＲリプ
レッサ蛋白質に結合し、その結果、オペレータからリプレッサ蛋白質を放出する
立体配座変化をもたらし、その結果、転写が起こるのを可能とする。Ｌａｃ系は
ラクトース、またはイソプロピルーｂ−Ｄ−チオガラクトシドのような合成アナ
ログに応答してｌａｃオペロンが活性化される。生憎、そのような系の使用は、
リガンド、すなわち、テトラサイクリンおよびラクトースの不安定な化学的性質
、それらの毒性、それらの天然での存在、または誘導または抑制に必要な比較的
高いレベルによって制限される。同様の理由で、動物におけるそのような系の利
用性は制限されている。 ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびサイクロスポリンＡのような免疫抑制分子は
イムノフィリンＦＫＢＰ１２、シクロフィリン等に結合することができる。この
情報を用い、単に、ＦＫ５０６を２つの蛋白質のうちの各々上に置くことによっ
て、またはＦＫ５０６を１つの上に、およびサイクロスポリンＡをもう１つの上
に置くことによって、いずれかの２つの蛋白質を一緒にするための一般的戦略が
工夫されてきた。次いで、ＦＫ５０６（ＦＫ１０１２）の合成ホモダイマーまた
はＦＫ５０６−サイクロスポリンの融合から得られた化合物（ＦＫＣｓＡ）を用
いて、これらの分子の二量体化を誘導することができる（Ｓｐｅｎｃｅｒら、１
９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９〜２４、Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９
６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：４６０４〜７）。
ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４ ＤＮＡ−結合ドメインおよびシクロフィリン
に融合したＶＰ１６アクチベータドメイン、およびＦＫＣｓＡ化合物を用いて、
Ｇａｌ４結合部位を含むプロモーターの制御下でのレポーター遺伝子のヘテロ二
量体化および活性化を示した。生憎、この系は、望まない副作用を有し、従って
、種々の哺乳動物遺伝子スイッチ適用に対するその使用を制限しかねないイムノ
サプレッサントを含む。
【０００６】 ステロイドホルモン受容体系のような高等真核生物転写活性化系も使用されて
きた。ステロイドホルモン受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであ
って、脊椎動物および非脊椎動物細胞に見出される。生憎、特に植物および動物
において遺伝子発現の調節のための受容体を活性化するステロイド化合物の使用
は、そのような生物における多くの他の天然生物学的経路におけるその関与のた
め制限される。そのような困難を克服するために、昆虫エクジソン受容体（Ｅｃ
Ｒ）を用い、別の系が開発されてきた。 昆虫における成長、脱皮および発生は、エクジソンステロイドホルモン（脱皮
ホルモン）および幼若ホルモンによって調節される（Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１
９９８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５〜５６９）。昆虫に
おけるエクジソンに対する分子標的は少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）お
よびウルトロスピラクル（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）蛋白質（ＵＳＰ）より
なる。ＥｃＲは、シグニチャーＤＮＡおよびリガンド結合ドメイン、および活性
化ドメインによって特徴付けられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメ
ンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１，Ｃｅｌｌ，６７：５９〜７７）。Ｅ
ｃＲ受容体は、ポナステロンＡおよびムリステロンＡのような多数のステロイド
化合物に対して応答する。最近、Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ
によって世界的に市販されている商業的に入手可能な殺虫剤テブフェノジドおよ
びメトキシフェノジドを含めた、エクジステロイドアゴニスト活性を持つ非ステ
ロイド化合物が記載されている（例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９６／
００６８６および米国特許第５，５３０，０２８号参照）。双方のアナログは他
の生物に対して例外的安全性プロフィールを有する。
【０００７】 国際特許出願番号（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０（ＷＯ９７／３８１１７）
は、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築体が、それ
に対するリガンドの存在下にて、かつ所望によりサイレントパートナーとして作
用することができる受容体の存在下にて、エクジソン応答エレメントに結合して
遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡ構築体によって活性
化される外因性遺伝子の発現を調整する方法を開示する。選択されたエクジソン
受容体はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離された。典
型的には、そのような系は、最適な活性化を供するためには、サイレントパート
ナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を要する。哺乳動物細胞
においては、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）
とヘテロ二量体化し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許
出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５（ＷＯ９９／０２６８３）は、絹ガ（ｓ
ｉｌｋ ｍｏｔｈ）Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉから単離されたエクジソン受容体が
、外因性ダイマパートナーに対する必要性なくして、哺乳動物系で機能的である
ことを開示する。
【０００８】 米国特許第５，８８０，３３３号は植物で用いられるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ
ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ヘテロ
ダイマー系を開示し、ここに、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ−結合ドメ
インは２つの異なるハイブリッド蛋白質に位置している。生憎、この系は、動物
細胞において受容体遺伝子の発現を誘導するには効果的ではない（比較のために
は、後記実施例１．２参照）。 これらの場合の各々において、（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２
１５におけるように天然ＥｃＲとして、または国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９
７／０５３３０におけるように修飾されたＥｃＲとしての）トランス活性化ドメ
インおよびＤＮＡ−結合ドメインを単一の分子に組み込み、他のヘテロダイマー
パートナー（ＵＳＰまたはＲＸＲいずれか）をそれらの天然状態で用いた。 前記したＥｃＲ−ベースの遺伝子調節系の欠点は、リガンドの不存在下におけ
るかなりのバックグラウンド活性およびこれらの系が植物および動物双方におい
て用いるには適用できないことを含む（米国特許第５，８８０，３３３号参照）
。遺伝子発現の調整に依拠するほとんどの適用では、これらのＥｃＲ−ベースの
系は望ましくない。従って、植物および動物双方において外因性遺伝子の発現を
正確に調整するための改良された系に対する要望が当該分野に存在する。そのよ
うな改良された系は、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベー
スの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミックスおよびトラン
スジェニック動物における特性の調節のような適用で有用であろう。単純で、コ
ンパクトであって、比較的安価で容易に入手でき、かつ宿主に対して低毒性であ
るリガンドに依存する改良された系は、生物学的系を調節するのに有用であるこ
とが判明しよう。 種々の刊行物が本明細書中で引用されており、その開示は、その全体が本発明
の一部として参照される。しかしながら、本明細書中におけるいずれの文献の引
用も、そのような文献が本出願に対して「先行技術」として利用できることを認
めるものと解釈されるべきではない。
【０００９】 （発明の概要） 本発明は、新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系、該新規な誘
導性遺伝子発現系で用いられる新規な受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド、およびこの誘導性遺伝子発現系を用いて宿主内の遺伝子の発現を調整する方
法に関する。特に、出願人の発明は、トランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ
）突然変異を含む受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む改良
された遺伝子発現調整系に関する。 具体的には、本発明は、ａ）ｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する
応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およびｉｉ）核受容体からの
リガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含む第１のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞で発現させることができる第１の
遺伝子発現カセットと、ｂ）ｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）ウルト
ラスピラクル受容体以外の核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド
結合ドメイン、を含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を
含む宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセットとを含み、Ｄ
ＮＡ−結合ドメインおよびトランス活性化ドメインはエクジソン受容体、レチノ
イドＸ受容体、またはウルトラスピラクル受容体以外のポリペプチドからのもの
であり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからのリガンド結合ドメ
インは異なり、二量体化する遺伝子発現調整系に関する。
【００１０】 特別の実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエク
ジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメインを含む。 もう１つの特別の実施形態において、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメ
インはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）リガンド結合ドメインを含む。 好ましい実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエ
クジソン受容体リガンド結合ドメインを含み、第２のポリペプチドのリガンド結
合ドメインはレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む。 また、本発明は、さらに、ｃ）ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメイ
ンが結合する応答エレメント、ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメ
インによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調整される
べき遺伝子、を含む第３の遺伝子発現カセットを含む本発明による遺伝子発現調
整系に関する。 また、本発明は、トランケーテッド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＥｃＲまたはトラ
ンケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであ
って、トランケーション突然変異はリガンド結合活性またはリガンド感受性に影
響する単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１１】 特に、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性また
はリガンド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッ
ドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポ
リヌクレオチドに関する。特別の実施形態において、本発明は、該ＥｃＲまたは
ＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させる
トランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッ
ドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。もう
１つの特別の実施形態において、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチド
の非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーショ
ン突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペ
プチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。 また、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性また
はリガンド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッ
ドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポ
リヌクレオチドに関する。特別の実施形態において、本発明は、該ＥｃＲまたは
ＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させる
トランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッ
ドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。もう
１つの特別の実施形態において、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチド
の非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーショ
ン突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペ
プチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１２】 また、本発明は、トランケーテッドレチノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二
量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケ
ーション突然変異を含むトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離
されたポリヌクレオチドに関する。特別の実施形態において、該二量体化パート
ナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。 また、本発明は、出願人の発明によるポリヌクレオチドによってコードされる
単離されたポリペプチドに関する。特に、本発明は、トランケーション突然変異
を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペ
プチドに関し、ここに、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドは本発明によるポリヌ
クレオチドによってコードされる。 このように、また、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド
結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含む単離
されたトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドに関
する。
【００１３】 また、出願人の発明は、本発明による遺伝子発現調整系を用いて宿主細胞にお
いて遺伝子発現を調整する方法に関する。具体的には、出願人の発明は、ａ）宿
主細胞に本発明による遺伝子発現調整系を導入する工程、およびｂ）遺伝子発現
調整系の第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのリガンド結合ドメイン
と独立して組み合わされるリガンドを宿主細胞に導入する工程を含む、調整され
るべき遺伝子を含む宿主細胞において遺伝子の発現を調整する方法であって、発
現されるべき遺伝子は、ｉ）第１のポリペプチドからのＤＮＡ−結合ドメインが
結合するドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス
活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が
調整されるべき遺伝子を含むキメラ遺伝子の構成要素であり、それにより、リガ
ンド、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む複合体が形成され、
およびそれにより、複合体は宿主細胞において遺伝子の発現を調整する方法を提
供する。 また、出願人の発明は、本発明による誘導性遺伝子発現系を含む単離された宿
主細胞を提供する。また、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを含む単離された宿主細胞に関する。従って、また、出願人の発明は、
本発明による宿主細胞を含む非ヒト生物に関する。
【００１４】 （発明の詳細な説明） 出願人は、今回、リガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するエクジソ
ン受容体またはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）ポリペプチドのトランケーション
突然変異体を含む改良されたエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系を開
発した。この突然変異効果はリガンド結合活性またはリガンド感受性を増加また
は低下させることができ、それはステロイドまたは非ステロイド特異的とするこ
とができる。このように、出願人の発明は、宿主細胞において注目する遺伝子の
発現を調整するのに有用な改良されたエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発
現系を提供する。特に望ましい実施形態において、出願人の発明は、低下したレ
ベルのバックグラウンド遺伝子発現を有し、かつ非ステロイドリガンドのマイク
ロモル下濃度に応答する誘導性遺伝子発現系を提供する。このように、出願人の
新規な誘導性遺伝子発現系および宿主において遺伝子発現を調整する方法におけ
るその使用は、現在入手可能な誘導性発現系の制限を克服し、遺伝子発現を制御
するための効果的な手段を当業者に提供する。 本発明は、原核生物および真核生物宿主細胞双方において遺伝子発現を調整す
るのに用いることができる新規な誘導性遺伝子発現系を提供する。出願人の発明
は、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループッ
トスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミックスおよびトランスジェニック生物
における特性の調節のような適用で有用である。
【００１５】 （定義） 本開示において、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義を供するが
、それは本発明の範囲および実施を理解する助けとなるはずである。 特別の実施形態において、用語「約」または「ほぼ」は、与えられた値または
範囲の２０％内、好ましくは１０％内、より好ましくは５％内、よりいっそう好
ましくは１％内を意味する。 用語「実質的に含まない」は、組成物中の少なくとも約７５重量％の蛋白質、
ＤＮＡ、ベクターが「ＡおよびＢが属するスピーシズのカテゴリーに応じて」「
Ａ」である場合に、「Ａ」（ここで、「Ａ」は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベク
ター、組み換え宿主細胞等である）を含む組成物が、「Ｂ」（ここで、「Ｂ」は
１以上の汚染蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター等を含む）を実質的に含まないこと
を意味する。好ましくは、「Ａ」は、組成物中に少なくとも、Ａ＋Ｂスピーシズ
の約９０重量％で含まれ、最も好ましくは少なくとも約９９重量％である。また
、汚染物を実質的に含まない組成物が、注目するスピーシズの活性または特徴を
有する単一の分子量スピーシズのみを含むのが好ましい。 本発明の目的では用語「単離された」は、その元来の環境（それが天然で存在
する環境）から取り出されてしまっている生物学的物質（核酸または蛋白質）を
示す。 例えば、植物または動物において天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離
されていない。同ポリヌクレオチドが、それが天然で存在する隣接核酸から分離
される。用語「精製された」は、物質が、他の化合物の存在を排除して絶対的純
度を呈する形態で存在することを要しない。それはむしろ相対定義である。
【００１６】 ポリヌクレオチドは、少なくとも１オーダーの大きさ、好ましくは２または３
、好ましくは４または５オーダーの大きさまでの出発物質または天然物質の精製
後に「精製された」状態である。 「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットが共有結合して構成される
ポリマー化合物である。核酸はポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ
核酸（ＤＮＡ）を含み、その双方は一本鎖または二本鎖であってよい。ＤＮＡは
、限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合
成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは線状、環状またはスーパーコイ
ルドであってよい。 「核酸分子」とは、一本鎖形態、あるいは二本鎖ラセンいずれかの、リボヌク
レオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン、「ＲＮＡ分子」
）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン
、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）のリン酸エス
テルポリマー形態、あるいは、ホスホロチオエートおよびチオエステルのような
そのいずれかのホスホエステルアナログをいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ
−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡラセンは可能である。用語「核酸分子」、特にＤ
ＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみをいい、それをいず
れかの特定の三次形態に限定しない。このように、この用語は、とりわけ、線状
または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミドおよび染色体で見出さ
れる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論するにおいて、
配列は、ＤＮＡの非転写ストランド（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する
ストランド）に沿って５’から３’への方向の配列のみを与える通常の約束に従
ってここでは記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操
作を受けたＤＮＡ分子である。
【００１７】 用語「断片」は、参照核酸に対して長さが減少し、かつ通常の部分にわたって
、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を意味すると理解
されるであろう。そのような本発明による核酸断片は、適切な場合には、それが
その構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含ませることができる。その
ような断片は、本発明による核酸の少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２
０ないし２５，３０、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０
００または１５００連続ヌクレオチドの長さの範囲であるオリゴヌクレオチドを
含み、またはそのようなオリゴヌクレオチドよりなる。 本明細書中で用いるように、「単離された核酸断片」は、所望により合成、非
天然または改変ヌクレオチド塩基を含む一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたは
ＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態である単離された核酸断片は
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントを含むことがで
きる。
【００１８】 「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリをいい
、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。「遺伝子」とは、コード配列に先行
し（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）調節配列を含め
た、特異的蛋白質またはポリペプチドを発現する核酸断片もいう。「天然遺伝子
」とは、その自身の調節配列を持つものとして天然で見出される遺伝子をいう。
「キメラ遺伝子」とは、一緒に天然では見出されない調節および／またはコード
配列を含む、天然遺伝子ではないいずれの遺伝子もいう。従って、キメラ遺伝子
は、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同一源に由来するが
、天然で見出されるものとは異なるように配列された調節配列およびコード配列
を含むことができる。キメラ遺伝子は、異なる源に由来するコード配列および／
または異なる源に由来する調節配列を含むことができる。「内因性遺伝子」とは
、生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然遺伝子をいう。「外来性」遺
伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物に通常は見出されないが、遺伝子導入
によって宿主生物に導入される遺伝子をいう。外来性遺伝子は、非天然生物に挿
入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランスジー
ン」は、形質転換手法によってゲノムに導入されている遺伝子である。 「異種」ＤＮＡとは、細胞において、または細胞の染色体部位において天然に
は位置しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡは細胞に対して外来性であ
る遺伝子を含む。 用語「ゲノム」は、染色体ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスＤ
ＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００１９】 核酸分子は、該核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適切な条
件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
またはＲＮＡのようなもう１つの核酸分子に「ハイブリダイズできる（ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｂｌｅ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（下記）参照）。ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．
，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）その中の
特に第１１章および表１１．１（その全てが本明細書の一部として参照される）
に例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「
ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」を決定する。 ストリンジェンシー条件を調整して、遠縁関係の生物からの相同配列のような
中程度に類似する断片ないし、密接に関係する生物からの機能的酵素を複製する
遺伝子のような高度に類似する断片までにつきスクリーニングすることができる
。相同核酸についての予備的スクリーニングでは、５５°のＴｍに対応する低ス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ、０．２５％ミルクおよびホルムアミド無し、または３０％ホルムアミド
、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いることができる。中程度のストリンジェン
シーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、５×または６×
ＳＣＣにての４０％ホルムアミドに対応する。高ストリンジェンシーハイブリダ
イゼーション条件は、最高Ｔｍ、例えば、５×または６×ＳＣＣにての５０％ホ
ルムアミドに対応する。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションの
ストリンジェンシーに依存して塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸
が相補的配列を含むことを要する。
【００２０】 用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基
間の関係を記載するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンは
チミジンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明
は、ここに開示される、または用いられる完全な配列ならびにそれらの実質的に
同様な核酸配列に相補的な単離された核酸ヌクレオチドも含む。 特別な実施形態において、用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは５５
℃のＴｍを言い、前記した条件を利用する。好ましい実施形態において、Ｔｍは
６０℃であり、より好ましい実施形態においては、Ｔｍは６５℃である。 ハイブリダイゼーション後洗浄もまたストリンジェンシー条件を決定する。好
ましい条件の１つの組は、室温にての１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで
出発する一連の洗浄を利用し、次いで、４５℃にての３０分間の２×ＳＳＣ、０
．５％ＳＤＳで反復し、次いで、５０℃にての３０分間の０．２×ＳＳＣ、０．
５％ＳＤＳで２回反復する。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高
い温度を用い、ここに、洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおける最終
の２回の３０分間洗浄の温度を６０℃まで上昇させたことを除いて前記のものに
同一である。高度にストリンジェントな条件のもう１つの好ましい組は６５℃で
の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の最終洗浄を用いる。ハイブリダイ
ゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間の
ミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的配列を含むことを要する。
【００２１】 核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当該分野で
よく知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌク
レオチド配列の間の同様性または相同性の程度が大きくなると、それらの配列を
有する核酸のハイブリッドに対するＴｍの値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼ
ーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は以下の順番で低下する：
ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌク
レオチドのハイブリッドでは、Ｔｍを計算するための方程式が導かれている（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、上記、９．５０〜０．５１参照）。より短い核酸、すなわち
、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置はよ
り重要となり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、上記、１１．７〜１１．８参照）。 １つの実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは少なく
とも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸についての好ましい
最小長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約
２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、該長さは少なくとも３０ヌクレオチ
ドである。さらに、当業者であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度は、要すれば
、プローブの長さのような因子に従って調整することができる。
【００２２】 用語「プローブ」とは、相補的な一本鎖標的核酸とで塩基対合して、二本鎖分
子を形成できる一本鎖核酸分子をいう。 本明細書中で用いるように、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡ
分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズで
きる、一般に少なくとも１８ヌクレオチドの核酸をいう。オリゴヌクレオチドは
、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチドまたはビオチンのような標識が共有結合により
コンジュゲートしているヌクレオチドで標識することができる。標識されたオリ
ゴヌクレオチドはプローブとして用いて核酸の存在を検出することができる。オ
リゴヌクレオチド（その一方または双方は標識できる）を、全長または核酸の断
片いずれかをクローニングするために、あるいは核酸の存在を検出するためにＰ
ＣＲプライマーとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを用いて
、ＤＮＡ分子とで三重ラセンを形成させることもできる。一般に、オリゴヌクレ
オチドは、好ましくは核酸合成器で合成により調製される。従って、オリゴヌク
レオチドは、チオエステル結合等のような非天然ホスホエステルアナログ結合に
て調製することができる。
【００２３】 「プライマー」は、標的核酸配列にハイブリダイズして、適当な条件下でＤＮ
Ａ合成用の開始点として働くことができる二本鎖核酸領域を作り出すオリゴヌク
レオチドである。そのようなプライマーはポリメラーゼ鎖反応で用いることがで
きる。 「ポリメラーゼ鎖反応」はＰＣＲと略され、特異的核酸配列を酵素により増幅
するためのイン・ビトロ方法を意味する。ＰＣＲは、各サイクルが３つの段階：
標的分子のストランドを分離するための鋳型核酸の変性、鋳型核酸への一本鎖Ｐ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼ
によるアニールされたプライマーの伸長を含む温度サイクルの反復シリーズを含
む。ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で
、核酸の出発プール内でその標的核酸の相対的量を測定する手段を提供する。 「逆転写−ポリメラーゼ鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと略され、ＲＮＡ分子または
複数分子から標的ｃＤＮＡ分子または複数分子を酵素的に生産し、続いて、前記
したように標的ｃＤＮＡ分子または複数分子内で特異的核酸配列または複数配列
を酵素的に増幅するイン・ビトロ方法を意味する。また、ＲＴ−ＰＣＲは、標的
分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール
内でその標的分子の相対的量を測定する手段を提供する。
【００２４】 ＤＮＡ「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、イン・
ビトロまたはイン・ビボにて細胞において転写され、ポリペプチドに翻訳される
二本鎖ＤＮＡ配列である。「適当な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非
コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡ
プロセッシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響するヌ
クレオチド配列をいう。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イント
ロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクタ結合部
位およびステム−ループ構造を含むことができる。コード配列の境界は、５’（
アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンに
よって決定する。コード配列は、限定されるものではないが、原核生物配列、ｍ
ＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含むこ
とができる。コード配列が真核生物細胞における発現で意図されるならば、ポリ
アデニル化シグナルおよび転写終止配列は、通常、コード配列の３’側に位置す
るであろう。 「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略され、ＡＴＧまたはＡＵＧ
のような翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、潜在的
にポリペプチド配列に翻訳することができるＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡいず
れかのある長さの核酸配列を意味する。
【００２５】 用語「ヘッド−ツー−ヘッド」は、相互に関連する２つのポリヌクレオチド配
列の向きを記載するために本明細書中で用いられる。１つのポリヌクレオチドの
コーディングストランドの５’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングスト
ランドの５’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他
のポリヌクレオチドの５’末端から離れるように進行する場合に、ヘッド−ツー
−ヘッドの向きで２つのポリヌクレオチドは位置する。用語「ヘッド−ツー−ヘ
ッド」は（５’）−ｔｏ−（５’）と略することができ、記号（←→）または（
３’←５’５’→３’）によって示すこともできる。 用語「テール−ツー−テール」は、相互に関連する２つのポリヌクレオチド配
列の向きを記載するために本明細書中で用いられる。１つのポリヌクレオチドの
コーディングストランドの３’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングスト
ランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他
のポリヌクレオチドに向かって進む場合に、２つのポリヌクレオチドはテール−
ツー−テールの向きに位置する。用語「テール−ツー−テール」は（３’）−ｔ
ｏ−（３’）と略することができ、記号（→←）または（５’→３’３’←５’
）によって示すこともできる。 用語「ヘッド−ツー−テール」は、相互に関連する２つのポリヌクレオチド配
列の向きを記載するために本明細書中で用いられる。１つのポリヌクレオチドの
コーディングストランドの５’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングスト
ランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他
のポリヌクレオチドのそれと同一方向に進行する場合、２つのポリヌクレオチド
はヘッド−ツー−テールの向きに位置する。用語「ヘッド−ツー−テール」は（
５’）−ｔｏ−（３’）と略することができ、記号（→→）または（５’→３’
５’→３’）によって示すこともできる。
【００２６】 用語「下流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオ
チド配列をいう。特に、下流ヌクレオチド配列は、一般に、転写の開始点に続く
配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置
する。 用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオ
チド配列をいう。特に、上流ヌクレオチド配列は、一般に、コード配列または転
写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーター
は転写の開始点の上流に位置する。 用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、二本鎖ＤＮＡ内の
特異的ヌクレオチド配列に結合し、切断する酵素をいう。 「相同組換え」とは、もう１つのＤＮＡ分子への外来性ＤＮＡ配列の挿入、例
えば、ベクターの染色体への挿入をいう。好ましくは、ベクターは、相同組換え
用の特異的染色体部位を標的とする。特異的相同組換えでは、ベクターは、染色
体の配列に対する相同性の十分に長い領域を含んで、染色体への相補的結合およ
びそれへのベクターの組込みを可能とする。相同性のより長い領域、および配列
同様性のより大きな程度は相同組換えの効率を増加させることができる。
【００２７】 当該分野で知られたいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチド
を増殖させることができる。一旦適当な宿主系および増殖条件が確立されれば、
組換え発現ベクターを増殖させ、量的に調製することができる。本明細書中に記
載するように、用いることができる発現ベクターは、限定されるものではないが
、名前を挙げると少数であるが、以下のベクターまたはそれらの誘導体：ワクシ
ニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス、バキュロ
ウイルスのような昆虫ウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（
例えば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターを含む。 「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローニングおよび／または導入のため
のいずれかの手段である。ベクターは、もう１つのＤＮＡセグメントをそれに付
着させて、付着されたセグメントの複製を行うことができるレプリコンであり得
る。「レプリコン」は、イン・ビボでＤＮＡ複製の自律単位として機能する、す
なわち、それ自体の制御下で複製することができるいずれかの遺伝的エレメント
（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語
「ベクター」は、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボにて、核酸を細
胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段を共に含む。当該分野で公知
の多数のベクターを用いて、核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーター
を遺伝子等に組み込むことができる。可能なベクターは、例えば、ラムダ誘導体
のようなバクテリオファージ、またはＰＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導
体のようなプラスミド、またはブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベク
ターを含めたプラスミドまたは修飾されたウイルスを含む。例えば、応答エレメ
ントおよびプロモーターに対応するＤＮＡ断片の適当なベクターへの挿入は、相
補的粘着末端を有する選択されたベクターへ適当なＤＮＡ断片を連結することに
よって達成することができる。別法として、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾す
ることができるか、あるいはいずれの部位もヌクレオチド配列（リンカー）をＤ
ＮＡ末端に連結することによって生じさせることができる。そのようなベクター
を作成して、細胞ゲノムにマーカーを取り込んだ細胞の選択を供する選択マーカ
ー遺伝子を含ませることができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコ
ードされる蛋白質を取り込み、それを発現する宿主細胞の同定および／または選
択を可能とする。
【００２８】 ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、細胞ならびに生き
た動物対象において広く種々の遺伝子送達適用で用いられてきた。用いることが
できるウイルスベクターは、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデ
ノ−関連ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純疱疹、エプ
スタイン−バール、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカウリモウイルス
ベクターを含む。非ウイルスベクターはプラスミド、リポソーム、電気的に荷電
された脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−蛋白質複合体およびバイオポリマー
を含む。核酸に加えて、ベクターは核酸導入の結果（その組織への導入、発現の
持続等）を選択し、測定しおよびモニターするのに有用な１以上の調節領域およ
び／または選択マーカーも含むことができる。 用語「プラスミド」とは、細胞の中枢的代謝の一部ではない遺伝子をしばしば
運び、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外エレメントをいう。
そのようなエレメントは、いずれかの源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ
またはＲＮＡの自律複製配列、ゲノム取り込み配列、ファージまたはヌクレオチ
ド配列（線状、環状またはスーパーコイルド）とすることができ、そこでは、適
当な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片および選択された遺伝子産物につい
てのＤＮＡ配列を細胞に導入することができるユニークな構築に多数のヌクレオ
チド配列が合わせ、または組み換えられている。
【００２９】 「クローニングベクター」は、もう１つの核酸セグメントが付着され、該付着
されたセグメントの複製を行うことができる、プラスミド、ファージまたはコス
ミドのような、順次に複製する核酸、好ましくはＤＮＡの単位長さであって、複
製起点を含む「レプリコン」である。クローニングベクターは、１つの細胞型に
おいて複製することができ、もう１つの細胞型において発現することができるよ
うにできる（「シャトルベクター」）。 ベクターは、当該分野で知られた方法、例えば、トランスフェクション、エレ
クトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡ
Ｅデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）
によって、遺伝子銃またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用によって所望
の宿主細胞に導入することができる（例えばＷｕら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１〜１４６２４、およびＨａｒｔｍｕｔら、
１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第２，０１２，３１１号参照
）。
【００３０】 また、本発明によるポリヌクレオチドは、リポフェクションによって、イン・
ビボにて導入することができる。過去１０年間、イン・ビトロにて核酸のカプセ
ル化およびトランスフェクションのためにリポソームが徐々に使用されてきた。
リポソーム媒介トランスフェクションで遭遇する困難および危険性を制限するた
めに設計された合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のイ
ン・ビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる（Ｆｅｌ
ｇｎｅｒら、１９８７．ＰＮＡＳ ８４：７４１３、Ｍａｃｋｅｙら、１９８８
．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７〜８０
３１、およびＵｌｍｅｒら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５〜１
７４８）。カチオン性脂質の使用は負に荷電した核酸のカプセル化を促進するこ
とができ、また、負に荷電した細胞膜との融合を促進することもできる（Ｆｅｌ
ｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ，１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７〜
３８８）。核酸の導入のための特に有用な脂質化合物および組成物は国際特許出
願公開ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、および米国特許第５
，４５９，１２７号に記載されている。外来性遺伝子をイン・ビボにて特異的器
官に導入するためのリポフェクションの使用はある種の実用的利点を有する。特
異的細胞に対するリポソームの分子標的化は１つの有利な領域を表す。特定の細
胞型へトランスフェクションを向けるのは、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような
、細胞不均一性を持つ組織で特に好ましいであろうことは明らかである。脂質は
、標的化の目的で他の分子に化学的にカップリングさせることができる（Ｍａｃ
ｋｅｙら、１９８８，上記）。標的化ペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝
達物質、および抗体のような蛋白質、または非ペプチド分子を化学的にリポソー
ムにカップリングさせることができよう。
【００３１】 また、他の分子は、カチオン性オリゴペプチド（例えば、ＷＯ９５／２１９３
１）、ＤＮＡ−結合蛋白質に由来するペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８
）、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）のような、イ
ン・ビボでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用である。 また、裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターをイン・ビボで導入するのも可能
である（米国特許第５，６９３，６２２号、５，５８９，４６６号、および５，
５８０，８５９号参照）。また、受容体−媒介ＤＮＡ送達アプローチも用いるこ
とができる（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１
４７〜１５４、および、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、１９８７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６２：４４２９〜４４３２）。
【００３２】 用語「トランスフェクション」は、細胞による外因性または異種ＲＮＡまたは
ＤＮＡの摂取を意味する。外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内部に導
入されてしまっている場合、細胞はそのようなＲＮＡまたはＤＮＡによって「ト
ランスフェクト」されている。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表
現型の変化に影響する場合、細胞は外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによっ
て「形質転換」されている。形質転換ＲＮＡまたはＤＮＡは、染色体ＤＮＡに組
み込む（共有結合させる）ことができ、細胞のゲノムを形成する。 「形質転換」とは、宿主生物のゲノムへの核酸断片の導入をいい、その結果、
遺伝的に安定な遺伝がもたらされる。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は
、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物をい
う。 用語「遺伝子領域」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子ま
たはヌクレオチド配列の領域をいう。 加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、それらの増
幅またはそれらの発現が求められる細胞宿主における複製のための１以上の起点
、マーカーまたは選択マーカーを含むことができる。 用語「選択マーカー」は、同定因子、通常は、マーカー遺伝子の効果、すなわ
ち、抗生物質に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性に基づいて選択することが
できる抗生物質または化学物質抵抗性遺伝子、比色マーカー、酵素、蛍光マーカ
ー等を意味し、ここに、該効果を用いて注目する核酸の遺伝を追跡しおよび／ま
たは注目する核酸を遺伝した細胞または生物を同定する。当該分野で知られ用い
られる選択マーカー遺伝子の例は：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタ
マイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミ
ド等に対する抵抗性を供する遺伝子、および表現型マーカーとして用いられる遺
伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラー
ゼ遺伝子等を含む。
【００３３】 用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定するこ
とができる同定因子をコードする核酸を意味し、ここで、該効果を用いて注目す
る核酸の遺伝子を追跡し、注目する核酸を遺伝した細胞または生物を同定し、お
よび／または遺伝子発現導入または転写を測定する。当該分野で知られ用いられ
るレポーター遺伝子の例は：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦ
Ｐ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラ
クトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等を含む。選択マ
ーカーはレポーター遺伝子とも考えられる。 「プロモーター」とは、コード配列の発現を制御することができるＤＮＡ配列
または機能的ＲＮＡをいう。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３
’側に位置する。プロモーターはその全部が天然遺伝子に由来することができる
か、あるいは天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメント
で構成することができるか、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含みさえできる。
異なるプロモーターが異なる細胞または細胞型において、または発生の異なる段
階において、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現
を指令することができるのは当業者によって理解される。遺伝子が種々の時点に
おいてほとんどの細胞型で発現されるようにするプロモーターは、通常は、「構
成的プロモーター」といわれる。遺伝子が特異的細胞型で発現されるようにする
プロモーターは、通常、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモ
ーター」をいう。遺伝子が発生または細胞分化の特定の段階で発現されるように
するプロモーターは、通常、「発生的に特異的なプロモーター」または「細胞分
化特異的プロモーター」という。遺伝子が、プロモーターを誘導する剤、生物学
的分子、化学的リガンド、光等での細胞の暴露または処理に続いて誘導され、発
現されるようにするプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター」または「調
節性プロモーター」という。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には
規定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片は同一のプロモーター活性を有
し得ることがさらに認識される。
【００３４】 「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合することが
でき、および下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ
調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は転写開始部位
によってその３’末端が境界となり、バックグラウンドを超える検出可能なレベ
ルで転写を開始するのに必要な最終数の塩基またはエレメントを含ませるように
上流（５’方向）に伸びる。プロモーター配列内には、（便宜には、例えば、ヌ
クレアーゼＳ１でのマッピングによって規定される）転写開始部位、ならびにＲ
ＮＡポリメラーゼの結合を担う蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出
されるであろう。 コード配列が、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで
、それは（もしコード配列がイントロンを含めば）トランスーＲＮＡスプライス
され、コード配列によってコードされる蛋白質に翻訳される場合、細胞において
転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。 「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を供する
プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのようなＤＮＡ調節配列であ
る。真核生物細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。 用語「応答エレメント」は、第１のキメラ遺伝子のＤＮＡ−結合ドメインとの
相互作用を介して媒介されるプロモーターに応答性を付与する１以上のシスー作
用性ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントはその配列が回文構造
（完全または不完全）とすることができるか、あるいは可変数のヌクレオチドに
よって分離された配列モチーフまたはハーフサイト（ｈａｌｆ ｓｉｔｅ）から
構成することができる。ハーフサイトは同様または同一とすることができ、直接
的または逆反復繰り返しとして、または単一ハーフサイトまたはタンデムにての
隣接ハーフサイトのマルチマーとして配置することができる。応答エレメントは
、応答エレメントを取り込むことができる細胞または生物の性質に応じて、異な
る生物から単離された最小プロモーターを含むことができる。第１のハイブリッ
ド蛋白質のＤＮＡ−結合ドメインは、リガンドの不存在または存在下において、
応答エレメントのＤＮＡ配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流遺
伝子の転写を開始または抑制する。天然エクジソン受容体の応答エレメントにつ
いてのＤＮＡ配列の例は：ＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（Ｃｈｅｒ
ｂａｓ Ｌら、（１９９１），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５、１２０〜１３１参照）
、Ｎ（ｎ）が１以上のスペーサーヌクレオチドであり得るＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）
ＡＧＧＴＣＡ（Ｄ’Ａｖｉｎｏ ＰＰら、（１９９５），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１１３、１〜９参照）、およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡ
ＴＴＴ（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ Ｃ．ら、（１９９４）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．１４、４４６５〜４４７４参照）を含む。
【００３５】 用語「作動可能に連結され（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、１つの
機能がもう１つによって影響され得るような、単一核酸断片への核酸配列の会合
をいう。例えば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現に影響される場
合、コード配列に作動可能に連結している（すなわち、そのコード配列はプロモ
ーターの転写制御下にある）。コード配列はセンスまたはアンチセンス向きに調
節配列に作動可能に連結することができる。 本明細書中で用いる用語「発現」は、核酸またはポリヌクレオチドに由来する
センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。
発現は蛋白質またはポリペプチドへのｍＲＮＡの転写もいうことができる。
【００３６】 用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」とは、特
異的制限部位にて、あるいは相同組換えによって核酸またはポリヌクレオチドに
挿入することができるＤＮＡのセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは、注目
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部
位は、転写および翻訳のために適切なリーディングフレームにてのカセットの挿
入を確実とするように設計される。「形質転換カセット」とは、注目するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ該ポリヌクレオチドに加えて
、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特異的ベクターをい
う。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセ
ットは、宿主細胞における注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
の増強された発現を可能とするエレメントも含むこともできる。これらのエレメ
ントは、限定されるものでないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハン
サー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むこと
ができる。
【００３７】 本発明の目的では、用語「遺伝子スイッチ」では、プロモーターと会合した応
答エレメントと、１以上のリガンドの存在下で、応答遺伝子およびプロモーター
が組み込まれる遺伝子の発現を調整するＥｃＲベースの系との組合わせをいう。 用語「調整する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、核酸または遺伝子の発現を誘導し
、低下し、または阻害することを意味し、その結果、蛋白質またはポリペプチド
の生産の各誘導、低下または阻害がもたらされる。 本発明によるプラスミドまたはベクターは、さらに、宿主細胞において遺伝子
の発現を駆動するのに適した少なくとも１つのプロモーターを含むことができる
。用語「発現ベクター」は、宿主への形質転換に続いて挿入された核酸配列の発
現を可能とするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味す
る。クローン化遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常は、プロモータ
ー、最小プロモーター、エンハンサー等のような制御エレメントの制御下に置か
れる。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動するのに有用な開始制御領域ま
たはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆
動することができる実質的にいずれのプロモーターも本発明で適しており、該プ
ロモーター、限定されるものではないが：ウイルスプロモーター、植物プロモー
ター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロ
モーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモー
ター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ
１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ
１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、アルカリホスファターゼ
プロモーター（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現で有用）、ＡＯＸ１プロモ
ーター（Ｐｉｃｈｉａでの発現で有用）、ｂ−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、
ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃプロモーター（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの発現で有用）、および光調節−、種子特
異的−、花粉特異的−、卵巣特異的−、病原体または病気関連−、カリフラワー
モザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ ３５Ｓ最小、キャッサバベインモザイクウイ
ルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質、リブロース１，５−ビス
ホスフェイトカルボキシラーゼ、苗条−特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレ
ス誘導性、イネｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍウイルス、植物スーパー
プロモーター、タバコロイシンアミノペプチダーゼ、ニトレートレダクターゼ、
マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼイン蛋白質、およ
びアントシアニンプロモーター（植物細胞での発現で有用）を含み、当該分野で
知られている動物および哺乳動物プロモーターは、限定されるのもではないが、
ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）
の３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター、アデノウ
イルスのＥ１Ａのプロモーターまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子、
サイトメガロウイルス初期プロモーター、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーター、延長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、
ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プ
ロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモータ
ーの調節配列、および転写制御領域、普遍的プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチ
ン、α−アクチン、チューブリン等）、中間フィラメント（デスミン、ニューロ
フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）のプロモーター、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲま
たは第ＶＩＩＩ、型因子等の）治療剤のプロモーター、および膵臓腺房細胞で活
性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域のような、組織特異性を呈し、かつトランス
ジェニック動物で利用されてきたプロモーター、膵臓ベータ細胞で活性なインス
リン遺伝子制御領域、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精
巣、乳房、リンパおよび肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域、アルブ
ミン遺伝子、肝臓で活性なＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＩ制御領域、肝臓で活性
なアルファーフェト蛋白質遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ１−抗トリプ
シン遺伝子制御領域、骨髄様細胞で活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳
中の稀突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域、骨格筋で
活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部で活性なゴナドトロピ
ン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルベートキナーゼプロモーター、ビリンプロ
モーター、脂肪酸結合腸蛋白質のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロ
モーター等を含む。本発明の好ましい実施形態において、プロモーターは、カリ
フラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、キャッサバベインモザイクウイ
ルスプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ最小プロモーター、延
長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧ
Ｋ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、およびアルブミンプロ
モーターよりなる群から選択される。加えて、これらの発現配列は、エンハンサ
ーまたは調節配列等の付加によって修飾することができる。
【００３８】 本発明の実施形態で用いることのできるエンハンサーは、限定されるものでは
ないが、タバコモザイクウイルスエンハンサー、カリフラワーモザイクウイルス
３５Ｓエンハンサー、タバコエッチウイルスエンハンサー、リブロース１，５−
ビスホスフェイトカルボキシラーゼエンハンサー、イネｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉ
ｌｌｉｆｏｒｍウイルスエンハンサー、および他の植物およびウイルス遺伝子エ
ンハンサー等を含む。 また、終止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列は
、好ましい宿主にとって天然の種々の遺伝子に由来することができる。所望によ
り終止部位は不必要であり得るが、もし含ませると最も好ましい。本発明の好ま
しい実施形態において終止制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル
、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウ
シ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ノパリンシンターゼ（ｎｏ
ｓ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、オクトピンシンターゼ（ｏ
ｃｓ）、アグロカテウムウイルスおよび植物ターミネーター配列等を含むことが
できるか、あるいはそれらに由来することができる。
【００３９】 用語「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、コード
配列の下流（３’）に位置したＤＮＡ配列をいい、それはポリアデニル化［ポリ
（Ａ）］認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響するこ
とができる調節シグナルをコードする他の配列を含むことができる。ポリアデニ
ル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸区域のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付
加に影響することによって特徴付けられる。 「調節領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節
領域は、天然では特定の核酸（同種領域）を発現するのを担う配列を含むことが
できるか、あるいは異なる蛋白質または合成蛋白質（異種領域）さえを発現する
ことを担う異なる源の配列を含むことができる。特に、該配列は、特異的または
非特異的に、および誘導性または非誘導性にて遺伝子の転写を刺激または抑制す
る、原核生物、真核生物またはウイルス遺伝子の配列、あるいは誘導配列とする
ことができる。調節領域は複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エ
ンハンサー、転写終止配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路に向ける
シグナル配列を含む。
【００４０】 「異種源」からの調節領域は、発現された核酸と天然では関連しない調節領域
である。異種調節領域には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節
領域、ハイブリッド調節配列、天然では生じないが、当業者によって設計される
調節配列が含まれる。 「ＲＮＡ転写体」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ−触媒転写に由来す
る産物をいう。ＲＮＡ転写体がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、そ
れは一次転写体というか、あるいはそれは一次転写体の転写後プロセッシングに
由来するＲＮＡ配列とすることができ、それは成熟ＲＮＡという。「メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンがなく、かつ細胞によって蛋白質に
翻訳することができるＲＮＡをいう。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的であ
って、それに由来する二本鎖ＤＮＡをいう。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを
含み、従って、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写体をいう
。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写体またはｍＲＮＡの全てまたは一
部に相補的であって、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写体をいう。ア
ンチセンスＲＮＡの相補性は、特異的遺伝子転写体のいずれかの部分に関するも
のであり、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列またはコード配列に
おけるものである。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳されていないが、細胞プロセス
に対して影響を有するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または他のＲＮ
Ａをいう。
【００４１】 「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基よりなるポリマー化合物であ
る。アミノ酸は以下の構造式：
【化４】 を有する。アミノ酸は側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類される：（１）脂肪族側
鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含有する側鎖、（３）硫黄原子を含有する
側鎖、（４）酸性またはアミド基を含有する側鎖、（５）塩基性基を含有する側
鎖、（６）芳香族環を含有する側鎖、（７）プロリン、側鎖がアミノ基に融合し
たイミノ酸。本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４アミノ酸
を含む。 「蛋白質」は、生細胞において構造的または機能的役割を実行するポリペプチ
ドである。 「単離されたポリペプチド」または「単離された蛋白質」は、天然状態ではそ
れと通常は会合する化合物（例えば、他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭
水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたは蛋白質である。「単離さ
れた」は、他の化合物との人工的または合成混合物、または生物学的活性に干渉
せず、および例えば、医薬上許容される製剤への不完全な精製、安定化剤の添加
、または調合により存在するかもしれない不純物の存在を排除することを意図し
ない。
【００４２】 本発明によるポリペプチドの「断片」は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチ
ドのそれよりも短く、これらの参照ポリペプチドに関する全部分にわたって、同
一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解されるであろう。そのよ
うな断片は、適切な場合には、それらが一部であるより大きなポリペプチドに含
ませることができる。本発明によるポリペプチドのそのような断片は、１０、１
５、２０、３０ないし４０、５０、１００、２００または３００アミノ酸の長さ
を有することができる。 ポリペプチドまたは蛋白質の「変種」は、ポリペプチドまたは蛋白質に由来し
、かつ該ポリペプチドまたは蛋白質の少なくとも１つの生物学的特性を保有する
いずれかのアナログ、断片、誘導体または突然変異体である。該ポリペプチドま
たは蛋白質の異なる変種は天然に存在し得る。これらの変種は蛋白質につきコー
ドする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴付けられる対立遺伝子変
種であり得るか、あるいは異なるスプライシングまたは翻訳後修飾を含むことが
できる。当業者であれば、単一または複数アミノ酸の置換、欠失、付加または置
き換えを有する変種を製造することができる。これらの変種は、とりわけ、（ａ
）１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変種、（
ｂ）１以上のアミノ酸がポリペプチドまたは蛋白質に付加された変種、（ｃ）１
以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および（ｄ）ポリペプチドまたは蛋白質が
血清アルブミンのようなもう１つのポリペプチドと融合した変種を含むことがで
きる。遺伝子的（抑制、欠失、突然変異等）、化学的および酵素的技術を含めた
、これらの変種を得るための技術は当業者に知られている。変種ポリペプチドは
好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を含む。
【００４３】 「異種蛋白質」とは、天然では細胞で生産されない蛋白質をいう。 「成熟蛋白質」とは、翻訳後にプロセッシングされたポリペプチド、すなわち
、一次翻訳産物に存在するいずれかのプレ−またはプロペプチドが除去されてい
るものをいう。「前駆体」蛋白質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物をいい、すな
わち、プレ−およびプロペプチドが依然として存在する。プレ−およびプロペプ
チドは、限定されるものではないが、細胞内局所化シグナルであり得る。 用語「シグナルペプチド」とは、分泌された成熟蛋白質に先立つアミノ末端ポ
リペプチドをいう。シグナルペプチドは成熟蛋白質から切断されており、従って
、成熟蛋白質には存在しない。シグナルペプチドは分泌された蛋白質を細胞膜を
横切って方向付けし、転移させる機能を有する。シグナルペプチドはシグナル蛋
白質ともいわれる。 「シグナル配列」は蛋白質のコード配列の最初に含まれて、細胞の表面に発現
される。この配列は、宿主細胞に指令してポリペプチドを転移させる、成熟ポリ
ペプチドのＮ−末端側にあるシグナルペプチドをコードする。用語「転移シグナ
ル配列」はこの種のシグナル配列をいうために本明細書中で用いられる。転移シ
グナル配列は真核生物および原核生物に対して天然の種々の蛋白質と会合して見
出すことができ、しばしば、両方のタイプの生物で機能的である。
【００４４】 用語「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部位
の間の同一性のパーセントをいう。もう１つのものに対する１つの部位からの配
列の間の相当性は当該分野で知られている技術によって決定することができる。
例えば、配列情報を整列させ、容易に入手できるコンピュータープログラムを用
いることによって、２つのポリペプチド分子の間の配列情報の直接的比較によっ
て相同性を決定することができる。別法として、相同性は、相同領域の間で安定
なデュプレックスを形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョン、続いての一本鎖−特異的ヌクレアーゼでの消化および消化された断片のサ
イズ測定によって決定することができる。 本明細書中で用いるように、全てのその文法的形式およびスペリングの変形に
おける用語「相同な」は、スーパーファミリーからの蛋白質（例えば、免疫グロ
ブリンスーパーファミリー）および異なる種からの相同蛋白質（例えば、ミオシ
ン軽鎖等）を含めた、「通常の進化源」を保有する蛋白質の間の関係をいう（Ｒ
ｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ ５０：６６７．）。そのような蛋白質（およ
びそれらのコード配列）は、配列同様性のその高い程度によって反映されるよう
に配列相同性を有する。
【００４５】 従って、全てのその文法的形式における用語「配列同様性（ｓｉｑｕｅｎｃｅ
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とは、共通の進化起源を共有するまたは共有しない
かもしれない蛋白質の核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の程度
をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ ５０：６６７参照）。本明細書中
で用いるように、全てのその文法的形式およびスペリング変形における用語「相
同な」とは、スーパーファミリーからの蛋白質および異なる種からの相同蛋白質
を含めた、「共通の進化起源」を保有する蛋白質の間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋ
ら、上記）。そのような蛋白質（およびそれらのコーディング遺伝子）は、配列
同様性のその高い程度によって反映されるように配列相同性を有する。しかしな
がら、共通の用法において、および本出願において、用語「相同な」は、「高度
に」のような副詞で修飾する場合、配列同様性をいい、共通の進化起源をいわな
い。 特別の実施形態において、ヌクレオチドの少なくとも約５０％（好ましくは少
なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がＤＮＡ配
列の規定された長さにわたってマッチする場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に
相同」であるかまたは「実質的に同様」である。実質的に相同な配列は、配列デ
ータバンクで入手可能な標準的ソフトウェアを用いて配列を比較することによっ
て、または例えば、その特定の系に対して規定されたストリンジェントでの条件
下でのサザーンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適
切なハイブリダイゼーション条件の規定は当業者の技量内のものである。例えば
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、（上記）参照。
【００４６】 本明細書中で用いるように、「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド
塩基の変化の結果、１以上のアミノ酸の置換がもたらされるが、ＤＮＡ配列によ
ってコードされる蛋白質の機能的特性に影響しない核酸断片をいう。また、「実
質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたは
共−抑制技術によって遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響しない
核酸断片もいう。また、「実質的に同様な」とは、得られた転写体の機能的特性
に実質的に影響しない１以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入のような本発
明の核酸断片に対する修飾もいう。従って、本発明は具体的例示配列を超えて含
むことが理解される。コードされた産物の生物学的活性の保持の測定が当てはま
るように、提案された修飾の各々は当該分野においてルーチン的技量内のもので
ある。 さらに、当業者であれば、本発明に含まれる実質的に同様な配列は、ストリン
ジェント条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳ、続いての０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄）下で、本明
細書中に例示された配列にハイブリダイズするそれらの能力によっても規定され
ることを認識する。本発明の実質的に同様な核酸断片は、そのＤＮＡ配列が本明
細書中に報告される核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも７０％同一である核酸断
片である。本発明の好ましい実質的に同様な核酸断片は、そのＤＮＡ配列が本明
細書中に報告した核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも８０％同一である核酸断片
である。より好ましい核酸断片は、本明細書中に報告された核酸断片のＤＮＡ配
列に少なくとも９０％同一である。なおより好ましいのは、本明細書中に報告さ
れた核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも９５％同一である核酸断片である。 アミノ酸の約４０％を超えて同一であるか、６０％を超えて同様である（機能
的に同一である）場合に、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」または「実質
的に同様」である。好ましくは、同様または相同アミノ酸は、例えば、ＧＣＧ（
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｎ
ｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ７，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを用いる整列によっ
て同定される。
【００４７】 用語「に対応する」とは、正確な位置が、同様性または相同性がそれに対して
測定される分子とは同一または異なるに拘わらず、本明細書中では、同様または
相同配列をいうのに用いられる。核酸またはアミノ酸配列の整列はスペースを含
むことができる。このように、用語「に対応する」とは、配列同様性をいう。ア
ミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングをいわない。 アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手
動評価によって、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅ
ｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照）のようなアルゴリズムを用いるコンピュ
ーター−自動配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたはその遺伝子
を推定的に同定するために十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌ
クレオチド配列を含む。一般に、１０以上の連続アミノ酸または３０以上のヌク
レオチドの配列が、公知の蛋白質または遺伝子に相同なポリペプチドまたは核酸
配列を推定的に同定するために必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して
は、２０〜３０連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロー
ブを、遺伝子の同定（例えば、サザーンハイブリダイゼーション）および単離（
例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのイン・サイチュハイ
ブリダイゼーション）の配列−依存的方法で用いることができる。加えて、１２
〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける増幅プライマーとして用
いて、プライマーを含む特定の核酸断片を得ることができる。従って、ヌクレオ
チド配列の「実質的部分」は、当該配列を含む核酸断片を特異的に同定しおよび
／または単離するのに十分な配列を含む。
【００４８】 用語「パーセント同一性」は、当該分野で知られているように、配列を比較す
ることによって決定された、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌク
レオチド配列の間の関係である。当該分野においては、「同一性」は、かかる配
列のストリングの間のマッチによって決定して当てはまるように、ポリペプチド
またはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」お
よび「同様性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．
Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）
、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，
Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）
Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、および
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．
およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ（１９９１）に記載されたものを含むがそれらに限定されない公知の方法
によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は
、テストした配列の間でのベストマッチを与えるように設計される。同一性およ
び同様性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータープログラムに
体系化されている。配列整列およびパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮ
ＥバイオインフォーマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇ
ｎプログラムを用いて実行することができる（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。配列の複数整列は、デフォルトパラメーター（ＧＡＰ Ｐ
ＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）での整列
のＣｌｕｓｔａｌ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡ
ＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）を用いて実行することができる。Ｃｌｕｓｔａ
ｌ方法を用いる対様式（ｐａｉｒｗｉｓｅ）整列のためのデフォルトパラメータ
ーは選択することができる：ＫＴＵＰＬＥ１，ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、Ｗ
ＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５。
【００４９】 用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析
で有用ないずれのコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムも
いう。「配列分析ソフトウェア」は商業的に入手可能であるか、独立して開発す
ることができる。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定されるものではないが
、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ
）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０
））、および（ＤＮＡＳＴＡＲ（（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐ
ａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）を含むであろう。
本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを用いる場合、特記しない限り、分
析の結果は引用されたプログラムの「デフォルト値」に基づくであろうことが理
解されるであろう。本明細書中で用いるように、「デフォルト値」は、最初に開
始されると元来はソフトウェアにロードされる値またはパラメーターのいずれか
の組を意味する。
【００５０】 「合成遺伝子」は、当業者に知られた手法を用いて化学的に合成されるオリゴ
ヌクレオチド形成ブロックから組み立てることができる。これらの形成ブロック
を連結し、アニールして遺伝子セグメントが形成され、これは、次いで、酵素的
に組み立てられて全遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関連する「化学的に合成
された」とは、成分ヌクレオチドがイン・ビトロで組み立てられたことを意味す
る。ＤＮＡの手動化学合成はよく確立された手法を用いて達成することができる
か、あるいは自動化学合成は、多数の商業的に入手可能なマシーンの内の１つを
用いて実行することができる。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンの偏りを反
映するように、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適遺伝子発現のために仕
立てることができる。当業者であれば、もしコドンの用法が宿主に都合の良いコ
ドンに偏っていれば、成功した遺伝子発現の確率を認識する。好ましいコドンの
決定は、配列の情報が入手できる場合、宿主細胞に由来する遺伝子の概観に基づ
くことができる。
【００５１】 本発明の遺伝子発現調整系 出願人は、今回、トランス活性化およびＤＮＡ−結合ドメインを２つの異なる
蛋白質上に置くことによって、分離した結果、リガンドの不存在下での大いに低
下したバックグラウンド活性およびリガンドの存在下でのバックグラウンドより
もかなり増加した活性がもたらされることを示した。出願人の改良された遺伝子
発現系は２つのキメラ遺伝子発現を含み、第１のものは核受容体ポリペプチドに
融合したＤＮＡ−結合ドメインをコードし、第２のものは核受容体ポリペプチド
に融合したトランス活性化ドメインをコードする。第１の蛋白質と第２の蛋白質
との相互作用は、ＤＮＡ−結合ドメインをトランス活性化ドメインに効果的に連
結させる。ＤＮＡ−結合およびトランス活性化ドメインは２つの異なる分子に存
在するので、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は大いに低下す
る。
【００５２】 一般に、本発明の誘導性遺伝子発現調整系は、ａ）ｉ）その発現が調整される
べき遺伝子に関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、および
ｉｉ）核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含
む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿
主細胞で発現させることができる第１のキメラ遺伝子、およびｂ）ｉ）トランス
活性化ドメイン、およびｉｉ）ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）以外の核受容体か
らのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含む第２のハイブリ
ッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞で発現させ
ることができる第２のキメラ遺伝子を含み、トランス活性化ドメインはＥｃＲ、
ＲＸＲまたはＵＳＰ以外からのものであり、および、第１のハイブリッドポリペ
プチドおよび第２のハイブリッドペプチドからのリガンド結合ドメインは異なり
、二量体化する。 この２−ハイブリッド系は、ＤＮＡ−結合ドメインが遺伝子上のＤＮＡ−結合
部位に結合する場合に、トランス活性化ドメインがプロモーターをより効果的に
活性化するように、ＤＮＡ−結合ドメインに対してより都合の良い位置に転写活
性化ドメインを運ぶ相互作用蛋白質の対の能力を開発する（例えば、米国特許第
５，２８３，１７３号参照）。この２−ハイブリッド系は、国際特許出願ＰＣＴ
／ＵＳ９７／０５３３０およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５に開示されておる
２つの系と比較してかなり改良された誘導性遺伝子発現調整系である。
【００５３】 本発明のエクジソン受容体ベースの遺伝子発現調整系はヘテロダイマーおよび
ホモダイマーいずれかとすることができる。機能的ＥｃＲ複合体は、一般に、ス
テロイド受容体ファミリーの２つのメンバー、種々の昆虫から得られたエクジソ
ン受容体蛋白質、およびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）蛋白質またはＵＳＰの脊
椎動物ホモログ、レチノイドＸ受容体蛋白質よりなるヘテロダイマー蛋白質複合
体をいう（Ｙａｏら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，４７６〜４７９、Ｙ
ａｏら、（１９９２）Ｃｏｌｌ ７１，６３〜７２参照）。しかしながら、該複
合体は後に詳細に記載するごときホモダイマーとすることもできる。機能的エク
ジステロイド受容体複合体はイムノフィリンのようなさらなる蛋白質（類）を含
むこともできる。（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１のような）転写因子とし
て知られた蛋白質のステロイド受容体ファミリーのさらなるメンバーは、ＥｃＲ
、ＵＳＰおよび／またはＲＸＲに対するリガンド依存性または非依存性パートナ
ーとすることもできる。加えて、（アダプターまたはメディエーターともいう）
コアクチベータとして一般に知られた蛋白質のような他の補因子が必要な場合が
ある。これらの蛋白質はＤＮＡに配列−特異的には結合せず、基本的な転写には
関与しない。それらは、クロマチン構造に影響することによって、またはアクチ
ベータ−開始複合体相互作用を媒介することによって、アクチベータのＤＮＡ−
結合の刺激を含めた、種々のメカニズムを介して転写活性化に対してその効果を
発揮することができる。そのようなコアクチベータの例はＲＩＰ１４０、ＴＩＦ
１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ１、ＴＩＦ２
／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰならびに
渾然としたコアクチベータＣ応答エレメントＢ結合蛋白質、ＣＢＰ／ｐ３００を
含む（レビューには、Ｇｌａｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．９：２２２〜２３２，１９９７参照）。また、（リプレッサ、サイレンサーま
たはサイレンシングメディエーターとしても知られた）コリプレッサとして一般
には知られた蛋白質補因子が、リガンドの不存在下で転写活性を効果的に阻害す
るのに必要であろう。これらのコリプレッサは未リガンド化（ｕｎｌｉｇａｎｄ
ｅｄ）エクジソン受容体と相互作用して、応答エレメントにおいて活性をサイレ
ンス化させることができる。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体の立体配座
を変化させ、その結果、コリプレッサの放出および前記したコアクチベータの動
員をもたらし、それにより、それらのサイレンシング活性を無くすることを示唆
する。コリプレッサの例はＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴを含む（レビューには、Ｈ
ｏｒｗｉｔｚら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：１１６７〜１１７７，
１９９６参照）。これらの補因子は細胞または生物内で内因性であり得るか、あ
るいはトランスジーンとして外因的に付加されて、調節または未調節様式いずれ
かで発現させることができる。エクジソン受容体蛋白質、ＵＳＰまたはＲＸＲの
ホモダイマー複合体もまたある状況下では機能的であり得る。
【００５４】 エクジソン受容体複合体は、典型的には、全てのメンバーがアミノ−末端トラ
ンス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域
によってＤＢＤから分離されたリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によ
って特徴付けられる核受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質を含む
。本明細書中で用いるように用語「ＤＮＡ−結合ドメイン」は、ＤＮＡ−結合ド
メインが特定の応答エレメントと会合するように機能する限り、ＤＮＡ−結合蛋
白質の全長まで、ＤＮＡ−結合蛋白質の最小ペプチド配列を含む。核受容体スー
パーファミリーのメンバーは４つまたは５つドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよ
びいくつかのメンバーではＦの存在によっても特徴付けられる（Ｅｖａｎｓ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４０：８８９〜８９５（１９８８）参照）。「Ａ／Ｂ」ドメイ
ンはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ−結合ドメインに対応し
、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、および「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応す
る。該ファミリーのいくつかのメンバーは、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキ
シ末端側にもう１つのトランス活性化ドメインを有することもできる。 ＤＢＤは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する２つのアミノ
酸モチーフ、Ｐ−ボックスおよびＤ−ボックスである間の２つのシステイン亜鉛
フィンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは天然のものであ
り、修飾されており、または異種受容体蛋白質の異なるドメインのキメラであり
得る。ステロイド受容体ファミリーのサブセットのように、このＥｃＲ受容体は
、ヘテロ二量体化特性を担うようには規定されていない領域も保有する。ＥｃＲ
、ＵＳＰおよびＲＸＲのドメインは天然でモジュール式であるので、ＬＢＤ、Ｄ
ＢＤおよびトランス活性化ドメインは相互に交換することができる。
【００５５】 エクジソン受容体複合体からの構成物を取り込む遺伝子スイッチ系が知られて
いる。しかしながら、これらの公知の系においては、ＥｃＲが用いられる場合は
常に、それは、同一分子上の天然もしくは修飾されたＤＮＡ−結合ドメインおよ
びトランス活性化ドメインと会合している。ＵＳＰまたはＲＸＲは、典型的には
、サイレントパートナーとして用いられる。我々は、今回、ＤＮＡ−結合ドメイ
ンおよびトランス活性化ドメインが同一分子上にある場合、リガンドの不存在下
でのバックグラウンド活性は高く、そのような活性は、ＤＮＡ−結合ドメインお
よびトランス活性化ドメインが異なる分子上、すなわち、ヘテロダイマーまたは
ホモダイマー複合体の２つのパートナー各々の上にある場合、劇的に低下するこ
とを示した。この２−ハイブリッド系は、ステロイドリガンド、例えば、ポナス
テロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場
合、非ステロイドリガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対して改良された感
受性を提供する。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイドリガンド
はより低い濃度でより高い活性を供する。加えて、ＥｃＲ遺伝子スイッチに基づ
くトランス活性化はしばしば細胞系依存的であるので、スイッチング系を仕立て
て、各適用のために最大トランス活性化能力を得るのは容易である。さらに、こ
の２−ハイブリッド系は、未修飾ＲＸＲをスイッチングパートナーとして用いる
場合にしばしば起こるＲＸＲの過剰発現によるいくつかの副作用を回避する。こ
の２−ハイブリッド系では、ＥｃＲまたはＲＸＲの天然ＤＮＡ−結合およびトラ
ンス活性化ドメインは排除される。その結果、これらのキメラ分子は、細胞に存
在する他のステロイドホルモン受容体と相互作用するチャンスは低く、その結果
副作用は低下する。
【００５６】 具体的には、出願人の発明は、ａ）宿主細胞で発現させることができる第１の
発現カセット、ここで、該第１の遺伝子発現カセットはｉ）その発現が調整され
るべき遺伝子に関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およ
びｉｉ）核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を
含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、およびｂ）宿主
細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセット、ここで、該第２の遺
伝子発現カセットは、ｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）ウルトラスピ
ラクル（ＵＳＰ）以外の核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結
合ドメイン、を含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含
み、ＤＮＡ−結合ドメインおよびトランス活性化ドメインはＥｃＲ、ＲＸＲ、ま
たはＵＳＰ以外からのものであり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチ
ドからのリガンド結合ドメインは異なり、二量体化する遺伝子発現調整系に関す
る。 また、本発明は、さらに、ｃ）ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメイ
ンが結合する応答エレメント、ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメ
インによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調整される
べき遺伝子、を含む第３の遺伝子発現カセットを含む本発明による遺伝子発現調
整系に関する。
【００５７】 特別の実施形態において、その発現が調整されるべき遺伝子は宿主細胞に関し
て相同遺伝子である。もう１つの特別の実施形態において、その発現が調整され
るべき遺伝子は宿主細胞に関して異種遺伝子である。 特別の実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエク
ジソン受容体リガンド結合ドメインを含む。 もう１つの特別の実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメ
インはレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む。 特別の実施形態において、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエク
ジソン受容体リガンド結合ドメインを含む。 もう１つの特別の実施形態において、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメ
インはレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む。 好ましい実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエ
クジソン受容体リガンド結合ドメインを含み、第２のポリペプチドのリガンド結
合ドメインはレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む。 もう１つの好ましい実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ド
メインはレチノイドＸ受容体ポリペプチドからのものであり、第２のポリペプチ
ドのリガンド結合ドメインはエクジソン受容体ポリペプチドからのものである。 好ましくは、リガンド結合ドメインはＥｃＲまたはＲＸＲ関連ステロイド／甲
状腺ホルモン核受容体ファミリーメンバーのリガンド結合ドメイン、またはその
アナログ、組合わせもしくは修飾である。より好ましくは、ＬＢＤはＥｃＲまた
はＲＸＲからのものである。なおより好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッドＥ
ｃＲまたはＲＸＲからのものである。トランケーション突然変異は、限定される
ものではないが、制限エンドヌクレアーゼ消化／欠失、ＰＣＲ−媒介／オリゴヌ
クレオチド−指向性欠失、化学的突然変異誘発、ＵＶストランド分解等を含めた
、当該分野で用いられるいずれの方法によっても作成することができる。
【００５８】 好ましくは、ＥｃＲはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ ＥｃＲ、Ｄｉｐｔｅｒａｎ
ＥｃＲ、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ ＥｃＲ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａｎ ＥｃＲおよび
Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ ＥｃＲよりなる群から選択される昆虫ＥｃＲである。よ
り好ましくは、用いられるＥｃＲはハマキガ科のガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ
ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ Ｍｏ
ｌｉｔｏｒ ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ ＥｃＲ
（「ＭｓＥｃＲ」）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃＲ（「
ＨｖＥｃＲ」）、絹ガＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、シ
ョウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＥｃＲ（「
ＤｍＥｃＲ」）、カＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、
クロバエ科およびニクバエ科のハエＬｕｃｉｌｉａ ｃａｐｉｔａｔａ ＥｃＲ
（「ＬｃＥｃＲ」）、地中海ショウジョウバエＣｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔ
ａｔａ ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、イナゴＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒ
ｉａ ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ
ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキＵｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ Ｅｃｒ（
“「ＵｐＥｃＲ」）、またはマダニＡｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ
ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）である。尚より好ましくは、ＬＢＤはハマキガ科
のガ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥｃＲ（「ＣｆＥ
ｃＲ」）またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ ｍｅｌａｎｏｇａ
ｓｔｅｒ ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）からのものである。
【００５９】 好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッド昆虫ＥｃＲからのものである。昆虫Ｅ
ｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０，１
５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２
５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７
０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１
５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６
０または２６５アミノ酸の欠失を含む。より好ましくは、昆虫ＥｃＲポリペプチ
ドトランケーションは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。な
おより好ましくは、昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポ
リペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、昆虫ＥｃＲポリペ
プチドトランケーションは少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失
、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメ
イン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失
、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、およびＡ／Ｂ／
Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。いくつかの完全なおよび／または部分的ド
メイン欠失の組合わせも行うことができる。
【００６０】 好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、配列
番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番
号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０より
なる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。 もう１つの好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメイ
ンは配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列
番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１
９および配列番号：２０よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。 好ましくは、ＲＸＲポリペプチドはマウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＲＸＲ
（「ＭｍＲＸＲ」）またはヒトＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＲＸＲ（「ＨｓＲＸ
Ｒ」）である。ＲＸＲポリペプチドはＲＸＲα、ＲＸＲβまたはＲＸＲγアイソ
フォームであり得る。 好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッドＲＸＲからのものである。ＲＸＲポリ
ペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０，１５、２０
、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０
、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２５、１３
０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７
５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２
０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または
２６５アミノ酸の欠失を含む。より好ましくはＲＸＲポリペプチドトランケーシ
ョンは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。なおより好ましく
は、ＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメイン
の欠失を含む。特別の実施形態において、ＲＸＲポリペプチドトランケーション
は少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ
−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／
２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−
ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、およびＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の
欠失を含む。いくつかの完全はおよび／または部分的ドメイン欠失の組合わせも
行うことができる。
【００６１】 好ましい実施形態において、レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインは、配
列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：
２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９およ
び配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドに
よってコードされる。 もう１つの好ましい実施形態において、レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメ
インは配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配
列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：
３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。 本発明の目的では、ＥｃＲおよびＲＸＲは合成およびキメラＥｃＲおよびＲＸ
Ｒならびにそれらのホモログも含む。 ＤＮＡ−結合ドメインは、合成およびキメラＤＮＡ−結合ドメイン、またはそ
のアナログ、組合わせまたは修飾を含めた、公知の応答エレメントを持ついずれ
のＤＮＡ−結合ドメインでもあり得る。好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４ ＤＢＤ
、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ス
ーパーファミリーメンバーＤＢＥ，細菌ＬａｃＺ ＤＢＤまたは酵母ｐｕｔ Ｄ
ＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４ ＤＢＤ［配列番号：４１（ポ
リヌクレオチド）または配列番号：４２（ポリペプチド）］またはＬｅｘＡ Ｄ
ＢＤ［配列番号：４３（ポリヌクレオチド）または配列番号：４４（ポリペプチ
ド））である。
【００６２】 トランス活性化ドメイン（「ＡＤ」または「ＴＡ」と略する）はいずれかのス
テロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＡＤ、合成またはキメラＡＤ、ポリグルタミ
ンＡＤ、塩基性または酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６ ＡＤ、ＧＡＬ４ ＡＤ、Ｎ
Ｆ−κＢ ＡＤ、ＢＰ６４ ＡＤ、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾で
あり得る。好ましくは、ＡＤは合成またはキメラＡＤであるか、あるいはＶＰ１
６、ＧＡＬ４またはＮＦ−κＢから得られる。最も好ましくは、ＡＤはＶＰ１６ ＡＤ［配列番号：４５（ポリヌクレオチド）または配列番号：４６（ポリペプ
チド）］である。 応答エレメント（「ＲＥ」）は公知のＤＮＡ−結合ドメインを持ついずれもの
応答エレメント、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾であり得る。好まし
くは、ＲＥはＧＡＬ４（「ＧＡＬ４ＲＥ」）、ＬｅｘＡ、ステロイド／甲状腺ホ
ルモン核受容体ＲＥ、または合成ＤＮＡ−結合ドメインを認識する合成ＲＥから
のＲＥである。より好ましくは、ＲＥは、配列番号：４７のポリヌクレオチド配
列を含むＧＡＬ４ＲＥまたは配列番号：４８のポリヌクレオチド配列を含むＬｅ
ｘＡ ８Ｘオペロンである。好ましくは、第１のハイブリッド蛋白質はトランス
活性化ドメインを実質的に含まず、第２のハイブリッド蛋白質はＤＮＡ−結合ド
メインを実質的に含まない。本発明の目的では、「実質的に含まない」は、問題
の蛋白質が、活性化または結合活性を供するのに問題のドメインの十分な配列を
含まないことを意味する。
【００６３】 後記する本発明で用いるリガンドは、ＥｃＲ、ＵＳＰ、ＲＸＲのリガンド結合
ドメイン、または遺伝子に連結した応答エレメントに結合するもう１つのポリペ
プチドと組み合わせるときに、遺伝子の発現の外的一時的調節のための手段を提
供する。本発明の種々の成分が相互に結合する結合メカニズムまたは順番、すな
わち、受容体に対するリガンド、応答エレメントに対する第１のポリペプチド、
プロモーターに対する第２のポリペプチド等は臨界的ではない。ＥｃＲ、ＵＳＰ
、ＲＸＲまたは他の蛋白質のリガンド結合ドメインへのリガンドの結合は、遺伝
子の発現または抑制を可能とする。このメカニズムは、ＥｃＲ、ＵＳＰまたはＲ
ＸＲに対するリガンド結合の可能性、および活性ホモダイマー複合体（例えば、
ＥｃＲ＋ＥｃＲまたはＵＳＰ＋ＵＳＰ）の結果としての形成を排除しない。好ま
しくは、１以上の受容体ドメインはキメラ遺伝子スイッチを生産するように変化
させることができる。典型的には３つのドメイン、ＤＢＤ、ＬＢＤおよびトラン
ス活性化ドメインの１以上を、他のドメインの源とは異なる源から選択すること
ができ、従って、キメラ遺伝子および得られたハイブリッド蛋白質は、活性、リ
ガンドの相補的結合、および特異的応答エレメントの認識をトランス活性化する
ために選択された宿主細胞または生物において最適化される。加えて、応答エレ
メントそれ自体は、酵母からのＧＡＬ−４蛋白質（Ｓａｄｏｗｓｋｉら、（１９
８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３５：５６３〜５６４参照）またはＥ．ｃｏｌｉからの
ＬｅｘＡ蛋白質（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ（１９８５），Ｃｅｌｌ，４
３：７２９〜７３６）、あるいはそのような特異的相互作用につき設計し、修飾
しおよび選択して（例えば、Ｋｉｍら、（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：３６１６〜３６２０）キメラ受容体を収容す
る蛋白質との標的化相互作用につき特異的な合成応答エレメントのような他のＤ
ＮＡ−結合蛋白質ドメインについての応答エレメントで修飾または置換すること
ができる。キメラ系のもう１つの利点は、それらが、所望の目的結果に従って遺
伝子発現を駆動するのに用いられるプロモーターの選択を可能とすることである
。そのような二重制御は、特に、細胞毒性蛋白質が生産される場合に遺伝子治療
の領域で特に重要であり得る。なぜならば、発現のタイミングおよび発現が起こ
る細胞は共に制御できるからである。適当なプロモーターに作動可能に連結した
遺伝子が対象の細胞に導入されると、本発明の系の存在によって、外因性遺伝子
の発現が制御される。プロモーターは構成的にまたは誘導的に調節できるか、あ
るいは組織特異的（すなわち、特定タイプの細胞でのみ発現される）でありうる
か、または生物のある発生段階まで特異的であり得る。
【００６４】 本発明の遺伝子発現カセット 本発明の新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系は、宿主細胞で
発現されることができる新規な遺伝子発現カセットを含み、ここに、遺伝子発現
カセットはハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。こ
のように、出願人の発明は、本発明の遺伝子発現系で用いられる新規な遺伝子発
現カセットも提供する。 具体的には、本発明はハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含む遺伝子発現カセットを提供する。該ハイブリッドポリペプチドは、１）
応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインおよび核受容体のリガンド結合
ドメインまたは２）トランス活性化ドメインおよび核受容体のリガンド結合ドメ
インのいずれかを含み、トランス活性化ドメインはＥｃＲ、ＲＸＲまたはＵＳＰ
以外の核受容体からのものである。 特別の実施形態において、遺伝子発現カセットは応答エレメントを認識するＤ
ＮＡ−結合ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハリブ
リッドポリペプチドをコードし、ＤＮＡ−結合ドメインはエクジソン受容体以外
の核受容体からのものである。
【００６５】 もう１つの特別の実施形態において、遺伝子発現カセットは応答エレメントを
認識するＤＮＡ−結合ドメインおよびレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン
を含むハイブリッドポリペプチドをコードし、ＤＮＡ−結合ドメインはレチノイ
ドＸ受容体以外の核受容体からのものである。 ＤＮＡ−結合ドメインは、合成およびキメラＤＮＡ−結合ドメイン、またはそ
のアナログ、組合せまたは修飾を含めた、公知の応答エレメントを持ついずれの
ＤＮＡ−結合ドメインとすることもできる。好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４ Ｄ
ＢＤ、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容
体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ ＤＢＤ、または酵母ｐｕ
ｔ ＤＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４ ＤＢＤ［配列番号：４
１（ポリヌクレオチド）または配列番号：４２（ポリペプチド）］またはＬｅｘ
Ａ ＤＢＤ［配列番号：４３（ポリヌクレオチド）または配列番号：４４（ポリ
ペプチド）］である。 もう１つの特別の実施形態において、遺伝子発現カセットはトランス活性化ド
メインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペ
プチドをコードし、トランス活性化ドメインはエクジソン受容体以外の核受容体
からのものである。 もう１つの特別の実施形態において、遺伝子発現カセットはトランス活性化ド
メインおよびレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリ
ペプチドをコードし、トランス活性化ドメインはレチノイドＸ受容体以外の核受
容体からのものである。
【００６６】 トランス活性化ドメイン（「ＡＤ」または「ＴＡ」と略する）はいずれのステ
ロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＡＤ、合成またはキメラＡＤ、ポリグルタミン
ＡＤ、塩基性または酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６ ＡＤ、ＧＡＬ４ ＡＤ、ＮＦ
−κＢ ＡＤ、ＢＰ６４ ＡＤ、またはそのアナログ、組合せまたは修飾であっ
てもよい。好ましくは、ＡＤは合成またはキメラＡＤであるか、あるいはＶＰ１
６、ＧＡＬ４またはＮＦ−κＢから得られる。最も好ましくは、ＡＤはＶＰ１６
ＡＤ［配列番号：４５（ポリヌクレオチド）または配列番号：４６（ポリペプ
チド）］である。 好ましくは、リガンド結合ドメインはＥｃＲまたはＲＸＲ関連ステロイド／甲
状腺ホルモン核受容体ファミリーメンバーリガンド結合ドメイン、またはそのア
ナログ、組合せまたは修飾である。より好ましくは、ＬＢＤはＥｃＲまたはＲＸ
Ｒからのものである。なおより好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッドＥｃＲま
たはＲＸＲからのものである。
【００６７】 好ましくは、ＥｃＲはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ ＥｃＲ、Ｄｉｐｔｅｒａｎ
ＥｃＲ、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ ＥｃＲ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａｎ ＥｃＲおよび
Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ ＥｃＲよりなる群から選択される昆虫ＥｃＲである。よ
り好ましくは、用いられるＥｃＲはハマキガ科のガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ
ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ Ｍｏ
ｌｔｉｏｒ ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ ＥｃＲ
（「ＭｓＥｃＲ」）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃＲ（「
ＨｖＥｃＲ」）、絹ガＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、シ
ョウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｒ ＥｃＲ（「Ｄ
ｍＥｃＲ」）、カＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、ク
ロバエ科およびニクバエ科のハエＬｕｃｉｌｉａ ｃａｐｉｔａｔａ ＥｃＲ（
「ＬｃＥｃＲ」）、地中海ショウジョウバエＣｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａ
ｔａ ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、イナゴＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉ
ａ ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ Ｅ
ｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキＵｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ Ｅｃｒ（“
「ＵｐＥｃＲ」）、またはマダニＡｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ
ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）である。尚より好ましくは、ＬＢＤはハマキガ科の
ガ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃ
Ｒ」）またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ ｍｅｌａｎｏ ｇａ
ｓｔｅｒ ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）からのものである。
【００６８】 好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッド昆虫ＥｃＲからのものである。昆虫Ｅ
ｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０，１
５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２
５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７
０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１
５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６
０または２６５アミノ酸の欠失を含む。より好ましくは、昆虫ＥｃＲポリペプチ
ドトランケーションは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。な
おより好ましくは、昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポ
リペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、昆虫ＥｃＲポリペ
プチドトランケーションは少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失
、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメ
イン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失
、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、およびＡ／Ｂ／
Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。いくつかの完全はおよび／または部分的ド
メイン欠失の組合せも行うことができる。
【００６９】 好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、配列
番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番
号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０より
なる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。 もう１つの好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメイ
ンは配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列
番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１
９および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。 好ましくは、ＲＸＲポリペプチドはマウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＲＸＲ
（「ＭｍＲＸＲ」）またはヒトＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＲＸＲ（「ＨｓＲＸ
Ｒ」）である。ＲＸＲポリペプチドはＲＸＲα、ＲＸＲβまたはＲＸＲγアイソ
フォームであり得る。
【００７０】 好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッドＲＸＲからのものである。ＲＸＲポリ
ペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０，１５、２０
、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０
、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２５、１３
０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７
５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２
０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または
２６５アミノ酸の欠失を含む。より好ましくはＲＸＲポリペプチドトランケーシ
ョンは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。なおより好ましく
は、ＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメイン
の欠失を含む。特別の実施形態において、ＲＸＲポリペプチドトランケーション
は少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ
−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／
２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−
ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、およびＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の
欠失を含む。いくつかの完全はおよび／または部分的ドメイン欠失の組合せも行
うことができる。
【００７１】 好ましい実施形態において、レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインは、配
列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：
２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９およ
び配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドに
よってコードされる。 もう１つの好ましい実施形態において、レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメ
インは配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配
列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：
３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。 好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４ ＤＢＤ（配列
番号：４１）またはＬｅｘＡ ＤＢＤ（配列番号：４３）よりなる群から選択さ
れる核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたＤＮＡ−結合ドメイ
ンおよび配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号
：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番
号：１０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコ
ードされたエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプ
チドをコードする。
【００７２】 もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４ Ｄ
ＢＤ（配列番号：４２）またはＬｅｘＡ ＤＢＤ（配列番号：４４）よりなる群
から選択されるポリペプチド配列を含むＤＮＡ−結合ドメインおよび配列番号：
１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配
列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番
号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むエクジソン受容体リガン
ド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。 もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４ Ｄ
ＢＤ（配列番号：４１）またはＬｅｘＡ ＤＢＤ（配列番号：４３）よりなる群
から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたＤＮＡ−
結合ドメインおよび配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番
号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８
、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含
むポリヌクレオチドによってコードされたレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメ
インを含むハイブリッドポリペプチドをコードする．
【００７３】 もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４ Ｄ
ＢＤ（配列番号：４２）またはＬｅｘＡ ＤＢＤ（配列番号：４４）よりなる群
から選択されるポリペプチド配列を含むＤＮＡ−結合ドメインおよび配列番号：
３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配
列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列番
号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むレチノイドＸ受容体リガ
ンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。 もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号：４
５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメ
インおよび配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番
号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列
番号：１０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによって
コードされたエクジソン受容体リガンドを含むハイブリッドポリペプチドをコー
ドする。 もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号：４
６のポリペプチド配列を含むトランス活性化ドメインおよび配列番号：１１、配
列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：
１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０
よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含むエクジソン受容体リガンド結
合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【００７４】 もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号：４
５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメ
インおよび配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４
、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番
号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌ
クレオチドによってコードされたレチノイドＸ受容体リガンドを含むハイブリッ
ドポリペプチドをコードする。 もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号：４
６のポリペプチド配列を含むトランス活性化ドメインおよび配列番号：３１、配
列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：
３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合
ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。 本発明の目的では、ＥｃＲおよびＲＸＲは合成およびキメラＥｃＲおよびＲＸ
Ｒならびにそれらのホモログも含む。
【００７５】 本発明のポリヌクレオチド 本発明の新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系はトランケーシ
ョン突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含み、宿主細胞内で遺伝子の
発現を調整する方法で有用である。 このように、本発明はトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。具体的には、本発明は、
リガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を
含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
に関する。 好ましくは、トランケーション突然変異の結果、少なくとも１、２、３、４、
５、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６
５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，
１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、
１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、
２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、
２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失を含むトランケーテッドＥｃＲポリ
ペプチドまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドが得られる。より好ましくは、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケー
ションは少なくとも部分的なポリペプチドドメインの欠失を含む。なおより好ま
しくは、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリ
ペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、ＥｃＲまたはＲＸＲ
ポリペプチドトランケーションは少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイ
ン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ
−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイ
ン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメインおよびＡ／
Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。
【００７６】 特別の実施形態において、本発明によるＥｃＲポリヌクレオチドは、配列番号
：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：
６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる
群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。特別の実施形態において、本発
明によるポリヌクレオチドは配列番号：１１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番
号：１２（Ｃドメインの最後の３３カルボキシー末端アミノ酸を含む、ＣｆＥｃ
Ｒ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１
４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：１５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：１
６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）
、配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ
）および配列番号：２０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）よりなる群から選択されるアミノ
酸配列を含むエクジソン受容体ポリペプチドをコードする。
【００７７】 もう１つの特別の実施形態において、本発明によるＲＸＲポリヌクレオチドは
配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号
：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９お
よび配列番号：３０よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。も
う１つの特別の実施形態において、本発明によるポリヌクレオチドは配列番号：
３１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列
番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテ
ッドＥＦ）、配列番号：３５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：３６（ＨｓＲＸＲ
−ＣＤＥＦ）、配列番号：３７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３８（Ｈｓ
ＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、およ
び配列番号：４０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を
含むトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする。 特に、本発明はトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプ
チドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、突然変異はＥｃ
ＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下さ
せる。特別の実施形態において、本発明は、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの
ステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然
変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレ
オチドに関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドのス
テロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変
異を含むＥｃＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、
ここに、ポリヌクレオチドは配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：
４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、または配列番
号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）の核酸配列を含む。もう１つの特別の実施形態にお
いて、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または
非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたは
ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。好まし
い実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性また
は非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲポリ
ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、ポリヌクレ
オチドは配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）または配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−
ＥＦ）の核酸配列を含む。
【００７８】 また、本発明はトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプ
チドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、突然変異はＥｃ
ＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強さ
せる。特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのス
テロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変
異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオ
チドに関する。もう１つの特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸ
Ｒポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させる
トランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする
単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、本発明はＥ
ｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させ
るトランケーション突然変異を含むＥｃＲポリペプチドをコードする単離された
ポリヌクレオチドに関し、ここに、ポリヌクレオチドは配列番号：３（ＣｆＥｃ
Ｒ−ＤＥＦ）または配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）の核酸配列を含む。 また、本発明は、突然変異したレチノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二量体
化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーシ
ョン突然変異を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポ
リヌクレオチドに関する。好ましくは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加
させるトランケーション突然変異を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコー
ドする単離されたポリヌクレオチドは配列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配
列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：２８（ＨｓＲ
ＸＲ−ＥＦ）または配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）より
なる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。特別の実施形態において、
二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。好ましくは、二量
体化パートナーはトランケーテッドＥｃＲポリペプチドである。より好ましくは
、二量体化パートナーは、ドメインＡ／Ｂ／Ｃが欠失されているＥｃＲポリペプ
チドである。なおより好ましくは、二量体化パートナーは配列番号：１３（Ｃｆ
ＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）のアミノ酸配列
を含むＥｃＲポリペプチドである。
【００７９】 本発明のポリペプチド 本発明の新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系はトランケーテ
ッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードし、宿主細胞内で遺伝子の発現を
調整する方法で有用である。このように、本発明はポリヌクレオチドまたは本発
明による遺伝子発現カセットによってコードされた単離されたトランケーテッド
ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、本発明によ
るポリヌクレオチドによってコードされたリガンド結合活性またはリガンド感受
性に影響するトランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃ
ＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。 また、本発明はトランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッド
ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。具体的には、本発明はリガンド結合
活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含む単離され
たＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。 好ましくは、トランケーション突然変異の結果、少なくとも１、２、３、４、
５、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６
５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，
１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、
１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、
２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、
２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失を含むトランケーテッドＥｃＲポリ
ペプチドまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドが得られる。より好ましく
は、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも部分的ポリ
ペプチドドメインの欠失を含む。より好ましくは、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプ
チドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失を含む。特別
の実施形態において、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは、少
なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ド
メイン欠失、Ｆ−ドメインおよびＡ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−
Ｃドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠
失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメインおよびＡ／Ｂ／
Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。いくつかの完全はおよび／または部分的ド
メイン欠失の組合せも実行することもできる。
【００８０】 好ましい実施形態において、単離されたトランケーテッドエクジソン受容体ポ
リペプチドは配列番号：１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２（ＣｆＥｃ
Ｒ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：４（
ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：６（Ｄｍ
ＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号
：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列
番号：１０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。もう１つの好ましい実施形態
において、単離されたトランケーテッドエクジソン受容体ポリペプチドは配列番
号：１１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤ
ＥＦ）、配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ
−ＥＦ）、配列番号：１５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：１６（ＤｍＥｃＲ
−ＣＤＥＦ）、配列番号：１７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１
８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列
番号：２０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む
。 好ましい実施形態において、単離されたトランケーテッドＲＸＲポリペプチド
は配列番号：２１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２２（ＭｍＲＸＲ−Ｄ
ＥＦ）、配列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−
トランケーテッドＥＦ）、配列番号：２５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：２６
（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号
：２８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッド
ＥＦ）および配列番号：３０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるポリ
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。もう１つの好
ましい実施形態において単離されたトランケーテッドＲＸＲポリペプチドは配列
番号：３１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）
、配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３４（ＭｍＲＸＲ−トラン
ケーテッドＥＦ）、配列番号：３５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：３６（Ｈｓ
ＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３８
（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）
および配列番号：４０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるアミノ酸配
列を含む。
【００８１】 本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド
感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲ
ＸＲポリペプチドに関し、ここに、ポリペプチドは配列番号：１（ＣｆＥｃＲ−
ＣＤＥＦ）、配列番号：２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：３（Ｃ
ｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：５（Ｃｆ
ＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：７（Ｄｍ
ＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：
９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ、および配列番号：１０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号
：２１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配
列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−トランケー
テッドＥＦ）、配列番号：２５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：２６（ＨｓＲＸ
Ｒ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：２８（Ｈ
ｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）およ
び配列番号：３０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるポリヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。 このように、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性ま
たはリガンド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたト
ランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関し、ここにポリペプチドは
配列番号：１１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１２（ＣｆＥｃＲ−１／
２ＣＤＥＦ）、配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（Ｃｆ
ＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：１５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：１６（Ｄｍ
ＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番
号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、およ
び配列番号：２０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：３１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥ
Ｆ）、配列番号：３２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−
ＥＦ）、配列番号：３４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：３
５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：３６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：
３７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号
：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）および配列番号：４０（ＨｓＲＸ
Ｒ−Ｅ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８２】 特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロ
イド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を
含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。好ましい実施形態に
おいて、本発明はＥｃＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感
受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲポリペプチ
ドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）
、配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）ま
たは配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドによ
ってコードされる。従って、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロ
イド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を
含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドにも関する。
好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドのステロイド結合活性
またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離され
たＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：１３（
ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：１８
（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、または配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）のアミノ
酸配列を含む。 もう１つの特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチ
ドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーシ
ョン突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。好ま
しい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性ま
たは非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離され
たＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：４（Ｃ
ｆＥｃＲ−ＥＦ）または配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）の核酸配列を含むポ
リヌクレオチドによってコードされる。従って、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポ
リペプチドの非ステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトラン
ケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリ
ペプチドにも関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチド
の非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーショ
ン突然変異を含む単離されたＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペ
プチドは配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）または配列番号：１９（ＤｍＥｃ
Ｒ−ＥＦ）のアミノ酸配列を含む。
【００８３】 特に、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリ
ガンド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲま
たはＲＸＲポリペプチドに関し、ここに、ポリペプチドは配列番号：１（ＣｆＥ
ｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：
３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：５
（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：７
（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列
番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列番号：１０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）、
配列番号：２１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥ
Ｆ）、配列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−ト
ランケーテッドＥＦ）、配列番号：２５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：２６（
ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：
２８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥ
Ｆ）および配列番号：３０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるポリヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。 本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド
感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲ
ＸＲポリペプチドに関し、ここに、ポリペプチドは配列番号：１１（ＣｆＥｃＲ
−ＣＤＥＦ）、配列番号：１２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１
３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：
１５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：１６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番
号：１７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ
Ｆ）、配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列番号：２０（ＤｍＥｃ
Ｒ−ＤＥ）、配列番号：３１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３２（Ｍｍ
ＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３４（Ｍ
ｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：３５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列
番号：３６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）
、配列番号：３８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トラン
ケーテッドＥＦ）および配列番号：４０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択
されるアミノ酸配列を含む。
【００８４】 本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド
感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲ
ＸＲポリペプチドに関する。特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲ
ＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させるト
ランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関
する。従って、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性
またはステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離され
たＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドにも関する。 もう１つの特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチ
ドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーシ
ョン突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。好ま
しい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性ま
たは非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離され
たＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：３（Ｃ
ｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）の核酸配列を含
むポリヌクレオチドによってコードされる。従って、本発明はＥｃＲまたはＲＸ
Ｒポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させる
トランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに
も関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロ
イド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異
を含む単離されたＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリヌクレオチド
は配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−
ＤＥＦ）のアミノ酸配列を含む。
【００８５】 また、本発明は突然変異したレチノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二量体化
パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーショ
ン突然変異を含む単離されたレチノイドＸ受容体ポリペプチドに関する。好まし
くは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異
を含む単離されたレチノイドＸ受容体ポリペプチドは配列番号：２３（ＭｍＲＸ
Ｒ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号
：２８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）または配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテ
ッドＥＦ）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによって
コードされる。より好ましくは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させる
トランケーション突然変異を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする
単離されたポリヌクレオチドは配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号
：３４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：３８（ＨｓＲＸＲ−
ＥＦ）または配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）よりなる群
から選択されるアミノ酸配列を含む。 特別の実施形態において、二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチ
ドである。好ましくは、二量体化パートナーはトランケーテッドＥｃＲポリペプ
チドである。より好ましくは、二量体化パートナーは、ドメインＡ／Ｂ／Ｃが欠
失されているＥｃＲポリペプチドである。なおより好ましくは、二量体化パート
ナーは配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：１８（ＤｍＥｃ
Ｒ−ＤＥＦ）のアミノ酸配列を含むＥｃＲポリペプチドである。
【００８６】 本発明の遺伝子発現を調整する方法 また、出願人の発明は、本発明による遺伝子発現調整系を用いて宿主細胞にお
いて遺伝子発現を調整する方法に関する。具体的には、出願人の発明は、ａ）本
発明による遺伝子発現調整系を宿主細胞に導入し、次いで、ｂ）遺伝子発現調整
系の第１のポリペプチド゛および第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインと
独立して組み合わされるリガンドを宿主細胞に導入する、工程を含み、ここに、
発現されるべき遺伝子は：ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結
合するドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活
性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調
整されるべき遺伝子、を含む遺伝子発現カセットの構成要素であり、それにより
、リガンド、遺伝子発現調整系の第１のポリペプチドおよび遺伝子発現調整系の
第２のポリペプチドを含む複合体が形成され、それにより、該複合体が宿主細胞
において遺伝子の発現を調整することを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発
現を調整する方法を提供する。 出願人の方法を用いる宿主細胞における発現のための注目する遺伝子は、内因
性遺伝子または異種遺伝子であってよい。望まれる遺伝子または蛋白質について
の核酸またはアミノ酸配列の情報は、多くの公のアクセスデータベースの内の１
つ、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ，ＥＭＢＬ，Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲに
おいて、または多くの生物学関連雑誌刊行物において突き止めることができる。
このように、当業者であれば、実質的に全ての公知の遺伝子についての核酸配列
情報に対するアクセスを有する。次いで、そのような情報を用いて、本明細書中
に記載する出願人の方法で用いる遺伝子発現カセット内への注目する遺伝子の挿
入用の所望の構築体を構築することができる。
【００８７】 出願人の方法を用いる宿主細胞における発現のための注目する遺伝子の例は、
状態、病気、障害、不全、遺伝子欠陥等を治療するのに重要なポリペプチドを調
整し、軽減し、修正しおよび／または回復することができる遺伝子のような、限
定されるものではないが、ワクチンのような植物で生産される抗原、アルファ‐
アミラーゼ、フィターゼ、グルカンおよびキシランセのような酵素、昆虫、線虫
、真菌、細菌、ウイルスおよび非生物ストレスに対する抵抗性のための遺伝子、
ヌトラシューティカル、医薬、ビタミン、アミノ酸内容、除草剤抵抗性、寒さ、
乾燥および熱許容性を修飾するための遺伝子、産業製品、油、蛋白質、炭水化物
、抗酸化剤、雄性無菌植物、花、燃料、他の出力特性、治療上所望のポリペプチ
ドまたは産物をコードする遺伝子を含む。 許容されるリガンドは、リガンドの存在下における応答エレメントへの２ハイ
ブリッド系のＤＮＡ−結合ドメインの結合の結果、遺伝子の発現の活性化または
抑制がもたらされる場合に、遺伝子の発現を調整するいずれのものでもある。好
ましいリガンドは、米国特許第６，０１３，８３６号、第５，１１７，０５７号
、第５，５３０，０２８号および第５，３７８，７２６号に開示されたもののよ
うなポナステロン、ムリステロンＡ、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、欧州出願
第４６１，８０９号に開示されたもののようなジベンゾイルアルキルシアノヒド
ラジン、米国特許第５，２２５，４４３号に開示されたもののようなＮ−アルキ
ル‐Ｎ，Ｎ’‐ジアロイルヒドラジン、欧州出願第２３４，９９４号に開示され
たもののようなＮ‐アシル‐Ｎ‐アルキルカルボニルヒドラジン、米国特許第４
，９８５，４６１号に記載されたもののようなＮ‐アロイル‐Ｎ‐アルキル‐Ｎ
’−アロイルヒドラジン（その各々が、本明細書の一部として参照される）およ
び３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズア
ミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド等を含めた他の同様の物質を含む。
【００８８】 好ましくは、遺伝子の発現を調整する出願人の方法で用いるリガンドは、式：
【００８９】
【化５】
【００９０】 （式中、 Ｅは第三級炭素を含む（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含むシアノ
（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり、 Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、
ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、
ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｏ
Ｅｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣ
ＮまたはＳＣＨＦ２であり、 Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣ
ｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、
Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、
ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ
、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、
ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣ
Ｎ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、あるいはＲ３とＲ２およびＲ３ が結合するフェニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素
に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接する酸素を
持つジヒドロピリル環を形成し、 Ｒ３は、Ｈ、Ｅｔであるか、あるいはＲ２とＲ２およびＲ３が結合するフェニ
ル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持
つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル
環を形成し、 Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル
、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、
Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ
またはＳＥｔである） の化合物である。
【００９１】 出願人の発明は、原核生物および真核生物宿主細胞において遺伝子発現の調整
を提供する。このように、本発明は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞
、動物細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される宿主細胞において遺伝
子発現を調整する方法にも関する。好ましくは、宿主細胞は酵母細胞、植物細胞
、マウス細胞またはヒト細胞である。 トランスジェニック宿主細胞における発現は、限定されるものではないが、治
療ポリペプチド、経路中間体を含めた注目する種々のポリペプチドの発現で、宿
主を用いて従前では可能でなかった新しい産物の合成用の宿主に既に存在する経
路の調整で、細胞ベースのアッセイ等で有用であろう。加えて、遺伝子産物は、
宿主のより高い成長率を付与し、または利用されるべき別の成長様式を可能とす
るために有用であろう。
【００９２】 本発明の宿主細胞および非ヒト生物 前記したように、本発明の遺伝子発現調整系を用いて、宿主細胞において遺伝
子発現を調整することができる。トランスジェニック宿主細胞における発現は、
注目する種々の遺伝子の発現で有用であろう。このように、出願人の発明は、本
発明による遺伝子発現系を含む単離された宿主細胞も提供する。また、本発明は
、本発明による遺伝子発現カセットを含む単離された宿主細胞も提供する。また
、出願人の発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む単
離された宿主細胞も提供する。単離された宿主細胞は原核生物または真核生物宿
主細胞であってよい。 好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細
胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される。好ましい宿主細胞の例は、限
定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａのような真菌または酵母種、あるいは属Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ，Ｓｙ
ｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｃｉｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ，
Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓ
ｔｉｓ，Ａｎａｂａｅｎａ，Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａにおけるもののような細菌種、植物、
動物および哺乳動物宿主細胞を含む。より好ましくは、宿主細胞は酵母細胞、植
物細胞、マウス細胞またはヒト細胞である。 特別の実施形態において、宿主細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， Ｐｉｃ
ｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａ宿主細胞よりなる群から選択される酵母細胞である
。 もう１つの特別な実施形態において、宿主細胞はリンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマ
メ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ
、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパヤ、落花生、エンドウ、コショウ、
キマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ソ
ルガム、大豆、スクワッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマ
イモ、茶、トマト、タバコ、スイカおよび小麦宿主細胞よりなる群から選択され
る植物細胞である。 もう１つの特別の実施形態において、宿主細胞はマウス細胞である。 もう１つの特別の実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。
【００９３】 宿主細胞形質転換は当該分野でよく知られており、限定されるものではないが
、エレクトロポレーション、ウイルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェ
クション、非ウイルスベクター媒介トランスフェクション、アグロバクテリウム
ー媒介形質転換、粒子衝撃等を含めた種々の方法によって達成することができる
。所望の遺伝子産物の発現は、適当な条件下での形質転換された宿主細胞の培養
および形質転換された遺伝子の発現の誘導を含む。原核生物および真核生物細胞
における培養条件および遺伝子発現プロトコルは当該分野でよく知られている（
実施例の一般的方法セクション参照）。細胞を回収し、遺伝子産物に特異的なプ
ロトコルに従って遺伝子産物を単離することができる。 加えて、挿入されたポリヌクレオチドの発現を調整し、望まれる特異的様式で
ポリペプチド産物を修飾し、加工する宿主細胞を選択することができる。異なる
宿主細胞は、蛋白質の翻訳および翻訳後プロセッシングおよび修飾（例えば、グ
リコシル化、［例えば、シグナル配列の］切断）についての特徴および特異的メ
カニズムを有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来性蛋
白質の所望の修飾およびプロセッシングを保証することができる。例えば、細菌
系における発現を用いて、非グリコシル化コア蛋白質産物を生産することができ
る。しかしながら、細菌で発現されたポリペプチドは適切には折り畳むことがで
きない。酵母における発現はグリコシル化産物を生じさせることができる。真核
生物細胞における発現は、異種蛋白質の「天然」グリコシル化および折り畳みの
確率を増加させることができる。さらに、哺乳動物細胞における発現は、ポリペ
プチドの活性を復元または構成するためのツールを提供することができる。さら
に、異なるベクター／宿主発現系は、蛋白質分解切断のようなプロセッシング反
応に種々の程度影響することができる。
【００９４】 また、出願人の発明は、本発明による単離された宿主細胞を含む非ヒト生物に
関する。好ましくは、非ヒト生物は細菌、真菌、酵母、植物、動物および哺乳動
物よりなる群から選択される。より好ましくは、非ヒト生物は酵母、植物、マウ
ス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サルまた
はチンパンジーである。 特別の実施形態において、非ヒト生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃ
ｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａよりなる群から選択される酵母である。 もう１つの特別の実施形態において、非ヒト生物はリンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆、ビート、ブラックグラム、ヒヨコ
マメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナ
リ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパヤ、落花生、エンドウ、コショウ
、キマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、
ソルガム、大豆、スクワッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツ
マイモ、茶、トマト、タバコ、スイカおよび小麦よりなる群から選択される植物
である。 もう１つの特別の実施形態において、非ヒト生物はＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ
マウスである。
【００９５】 遺伝子発現／トランスフェクションの測定 本発明の出願人の方法の１つの有用な測定は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ種
の同一性および豊富さ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を含めた細胞の転写状態のそれで
ある。そのような測定は、便宜には、いくつかの現存する遺伝子発現技術のいず
れかによりｃＤＮＡ豊富さを測定することによって行われる。 核酸アレイ（ａｒｒａｙ）技術は、異なるｍＲＮＡ発現を測定するための優良
な技術である。そのような技術は、例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびＤ
ＮＡマイクロアレイを含む。これらの技術は、異なる遺伝子に対応するＤＮＡ断
片またはオリゴヌクレオチドあるいは固体支持体に固定化され、細胞、組織また
は全生物から抽出された全ｍＲＮＡプールから調製されたプローブにハイブリダ
イズし、ｃＤＮＡに変換されたｃＤＮＡに依拠する。オリゴヌクレオチドチップ
は、フォトリソグラフィ技術を用いて基材上で合成されたオリゴヌクレオチドの
アレイである。１７００までの遺伝子につき分析できるチップが製造されている
。ＤＮＡマイクロアレイは、ロボットにより顕微鏡スライド上にプリントされた
ＤＮＡ試料、典型的にはＰＣＲ産物のアレイである。各遺伝子は、全長または部
分長の標的ＤＮＡ配列によって分析される。１０，０００までの遺伝子を持つマ
イクロアレイが、今日、商業的にルーチン的に調製される。これらの２つの技術
の間の主な差は、オリゴヌクレオチドチップが、典型的には、短いＤＮＡ分子の
分画を可能とする２５−量体オリゴヌクレオチドを利用し、他方、ほぼ１０００
塩基対のマイクロアレイのより大きなＤＮＡ標的が、完全なＤＮＡ混合物を分画
するにおいてより大きな感受性を提供できることである。
【００９６】 本発明の出願人の方法のもう１つの有用な測定は、当該分野でよく知られたプ
ロセスを用いて細胞に存在する構成要素蛋白質種の豊富さを測定することによっ
て細胞の翻訳状態を測定するそれである。 種々の生理学的機能に関連した遺伝子の同定が望まれる場合、細胞増殖、アポ
トーシス、老化、分化、接着、特異的分子への結合、もう１つの細胞への結合、
細胞組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋肉形
成、神経形成および／または造血のような機能の変化が測定されるアッセイを使
用することができる。 加えて、選択マーカーまたはレポーター遺伝子発現を用いて、出願人の発明を
用い、遺伝子発現の調整を測定することができる。 遺伝子発現の産物を検出する他の方法は当該分野でよく知られており、サーザ
ンブロット（ＤＮＡ検出）、ドットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）
、ノーザンブロット（ＲＮＡ）およびＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）分析を含む。より
好ましくはないが、標識された蛋白質を用いて、それがハイブリダイズする特定
の核酸配列を検出することができる。 いくつかの場合において、核酸配列の量を増幅する必要がある。これは、例え
ば、ポリメラーゼ鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガーゼ鎖反応（「ＬＣＲ」）、スト
ランド置換増幅（「ＳＤＡ」）、転写−ベースの増幅等を含めた多数の適当な方
法のうち１以上を用いて行うことができる。ＰＣＲは公知の技術に従って行われ
、ここに、例えば、ハイブリダイズする条件下で、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
の存在下にて、検出すべき特異的配列の各ストランドについての１つのオリゴヌ
クレオチドプライマーで核酸試料を処理する。合成される各プライマーの延長産
物は、２つの核酸ストランドの各々に相補的であり、プライマーは、それにハイ
ブリダイズする特異的配列の各ストランドに対して十分に相補的である。また、
各プライマーから合成された延長産物は、同一プライマーを用いる延長産物のさ
らなる合成のための鋳型として働くことができる。延長産物の合成の十分な数の
ラウンドに続き、試料を前記したように分析して、検出すべき配列または複数配
列が存在するか否かを評価することができる。 本発明の例示として提供される以下の非限定的実施例を参照して、本発明はよ
りよく理解することができる。
【００９７】 一般的方法 本明細書で用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分
野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．お
よびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，（１
９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．
Ｌ．Ｂｅｎｎａｎおよび Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１
９８４）によって、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ
ｃｅ（１９８７）によって記載されている。 植物組織培養、形質転換、植物分子生物学および植物一般分子生物学のための
方法は、ＲＮ ＴｒｉｇｉａｎｏおよびＤＪ Ｇｒａｙによって編集されたＰｌ
ａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｅｘｅｒｃｉｓｅｓ、第２版、２０００ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＫＭＡ ＧａｒｔｌａｎｄおよびＭＲ Ｄａｖｅｙによって
編集されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９５，Ｈｕ
ｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐ．Ｍａｌｉｇａ
ら、１９９５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことができる。
【００９８】 細菌培養の維持および増殖に適した材料および方法は当該分野でよく知られて
いる。以下の例で用いるのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ
Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌ
ｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅ
ｌ Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編），Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））または Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａ
ｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９
８９）に記載されているように見出すことができる。宿主細胞の増殖および維持
で用いる全ての試薬、制限酵素および材料は、特記しない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。 遺伝子配列の操作は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉ
ｎｃ．（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｍ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
）から入手可能なプログラムのスウィートを用いて達成することができる。ＧＣ
Ｇプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」を用いる場合、１２のギャップ創製デフォルト値
および４のギャップ延長デフォルト値を用いることができる。ＣＧＣ「Ｇａｐ」
または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを用いる場合、５０のデフォルトギャップ
創製ペナルティおよび３のデフォルトギャップ延長ペナルティを用いることがで
きる。いずれの場合においても、ＧＣＧプログラムパラメーターが促進されない
場合、これらのまたはいずれかの他のＧＣＧプログラムにおいて、デフォルト値
を用いることができる。
【００９９】 略語の意味は以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意
味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリッ
トルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、
「μＭ」はマイクロモラーを意味し、「ｍＭ」はミリモラーを意味し、「μｇ」
はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ａ」はアデニン
またはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」は
グアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し
、「ｘｇ」は重力倍を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ａａ」はア
ミノ酸を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、
「ｋ」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、および「℃」は摂氏度を意
味する。
【０１００】 実施例１ 遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生
物の生産および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用で用いるために、出
願人の改良されたＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子調整系を開発した。この実施例
は、本発明のＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現系で用いるための、いくつかの
遺伝子発現カセットの構築および評価を記載する。 哺乳動物細胞を含めた種々の細胞バックグラウンドにおいて、レチノイドＸ受
容体（ＲＸＲ）を持つ昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）ヘテロダイマーは、リガ
ンドの結合に際して、エクジソン応答エレメントの制御下で遺伝子をトランス活
性化させる。ハマキガ科ガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ
ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」、全長ポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、各々
、配列番号：４９および配列番号：５０に記載される）、Ｃ．ｆｕｍｉｆｅｒａ
ｎａウルトラスピラクル（「ＣｆＵＳＰ」、全長ポリヌクレオチドおよびアミノ
酸配列は、各々、配列番号：５１および配列番号：５２に記載される）、および
マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＲＸＲα（ＭｍＲＸＲα、全長ポリヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列は、各々、配列番号：５３および配列番号：５４に記載
される）に基づいて、出願人はいくつかのＥｃＲ−ベースの遺伝子発現カセット
を構築した。調製された受容体構築体は，ＥｃＲの、およびＲＸＲの、またはＵ
ＳＰのリガンド結合ドメイン、ＧＡＬ４の、またはＥｃＲのＤＮＡ−結合ドメイ
ン、およびＶＰ１６の活性化ドメインを含む。レポーター構築体は、ＧＡＬ４ま
たはＥｃＲ／ＵＳＰ結合部位（応答エレメント）のいずれかを含む合成プロモー
ター構築体に作動可能に連結した、レポーター遺伝子、ルシフェラーゼまたはＬ
ａｃＺを含む。これらの受容体およびレポーター構築体の種々の組合せをＣＨＯ
、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＶ１および２９３細胞に共トランスフェクトした。遺伝子誘
導能力（誘導の大きさ）およびリガンドの特異性および感受性は、４つの異なる
リガンド：２つのステロイドリガンド（ポナステロンＡおよびムリステロンＡ）
および２つの非ステロイドリガンド（Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイ
ル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラ
ジンおよびＮ−（３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチルベンゾイ
ル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラ
ジン）を用い、トランスフェクトされた細胞におけるレポーター遺伝子発現の用
量−依存性誘導において調べた。レポーター遺伝子発現活性は、リガンド添加の
２４時間または４８時間後にアッセイした。
【０１０１】 遺伝子発現カセット：エクジソン受容体ベースの化学的に誘導可能な遺伝子発
現カセット（スイッチ）を、当該分野で入手可能な標準クローニング方法を用い
て以下のように構築した。以下は各スイッチの調製および組成の簡単な記載であ
る。 １．１−ＧＡＬ４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＲＸＲ：ハマキガ科ガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅ
ｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ ＥｃＲからのＤ、ＥおよびＦドメイン（「Ｃｆ
ＥｃＲＤＥＦ」、配列番号：３）をＧＡＬ４ ＤＮＡ−結合ドメイン（「ＤＮＡ
ＢＤ」、配列番号：４１）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：５
５）の制御下に置いた。マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＸＲからのＤＥ
Ｆドメイン（「ＭｍＲＸＲＤＥＦ」、配列番号：２２）をＶＰ１６からの活性化
ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」、配列番号：４５）に融合し、ＳＶ４０ｅプロモー
ター（配列番号：５５）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４結合部
位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」、配列番号：４７を含む５、ＧＡＬ４ＲＥを含む）を
合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：５６）に融合させ、ルシフェラーゼ遺
伝子（配列番号：５７）の上流に置いた。
【０１０２】 １．２−ＧＡＬ４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＵＳＰ：ＭｍＲＸＲＤＥＦをハマキガ科ガＵ
ＳＰからのＤ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＵＳＰＤＥＦ」、配列番号：５８）
で置き換える以外は、この構築体は前記したスイッチ１．１と同様に調製した。
この実施例で用いた構築体は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ
ｒ ＵＳＰではなくＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ ＵＳ
Ｐを利用した以外は、米国特許第５，８８０，３３３号に開示したものと同様で
ある。 １．３−ＧＡＬ４ＲＸＲ／ＶＰ１６ＣｆＥｃＲ：ＭｍＲＸＲＤＥＦ（配列番号：
２２）をＧＡＬ４ＤＮＡＢＤ（配列番号：４１）に融合させ、ＣｆＥｃＲＣＤＥ
Ｆ（配列番号：１）をＶＰ１６ＡＤ（配列番号：４５）に融合させた。 １．４−ＧＡＬ４ＲＸＲ／ＶＰ１６ＤｍＥｃＲ：ＣｆＥｃＲＣＤＥＦをＤｍＥｃ
ＲＣＤＥＦ（配列番号：６）で置き換えた以外は、この構築体はスイッチ１．３
と同様に調製した。 １．５−ＧＡＬ４ＵＳＰ／ＶＰ１６ＣｆＥｃＲ：ＭｍＲＸＲＤＥＦをＣｆＵＳＰ
ＤＥＦ（配列番号：５８）で置き換えた以外は、この構築体はスイッチ１．３と
同様に調製した。 １．６−ＧＡＬ４ＲＸＲＣｆＥｃＲＶＰ１６：この構築体は、ＧＡＬ４ＤＮＡＢ
ＤおよびＶＰ１６ＡＤを共に同一分子上に置くように調製した。ＧＡＬ４ＤＮＡ
ＢＤ（配列番号：４１）およびＶＰ１６ＡＤ（配列番号：４５）を、各々、Ｎ−
およびＣ−末端にてＣｆＥｃＲＤＥＦ（配列番号：３）に融合させた。該融合を
ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：５５）の制御下に置いた。 １．７−ＶＰ１６ＣｆＥｃＲ：この構築体は、ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（配列番号：
１）がＶＰ１６ＡＤ（配列番号：４５）に融合され、ＳＶ４０Ｅプロモーター（
配列番号：５５）の制御下に置かれるように調製した。ｈｓｐ２７遺伝子からの
６つのエクジソン応答エレメント（「ＥｃＲＥ」、配列番号：５９）を、プロモ
ーターおよびルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：５７）の上流に置いた。このス
イッチが最も好適に内因性ＲＸＲを用いる。 １．８−ＤｍＶｇＲＸＲ：この系はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，から購入した。それはＶＰ１６ＡＤに融合
した修飾されたＤＮＡＢＤを持つＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔ
ｅｒ ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）を含み、ＣＭＶプロモーター（配列番号：６０
）の制御下に置いた。全長ＭｍＲＸＲ（配列番号：５３）をＲＳＶプロモーター
（配列番号：６１）の制御下に置いた。レポーターｐＩＮＤ（ＳＰＩ）ＬａｃＺ
は、修飾されたエクジソン応答エレメント（「ＥｃＲＥ」、Ｅ／ＧＲＥ）の５つ
のコピー、ＳＰ１エンハンサーの３つのコピー、および最小熱ショックプロモー
ターを含み、その全てがＬａｃＺレポーター遺伝子の上流に置かれた。 １．９−ＣｆＶｇＲＸＲ：この例は、部分的Ａ／Ｂドメインおよび完全なＣＤＥ
Ｆドメインを含むトランケーテッドＣｆＥｃＲ［配列番号：６２（ポリヌクレオ
チド）および配列番号：６３（ポリペプチド）］でＤｍＥｃＲを置き換える以外
は、スイッチ１．８と同様に調製した。 １．１０−ＣｆＶｇＲＸＲｄｅｌ：この例は、ＭｍＲＸＲ（配列番号：５３）を
欠失させた以外は、スイッチ１．９と同様に調製した。
【０１０３】 細胞系（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）：４つの細胞系：ＣＨＯ、チャイニーズハムス
ターＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ卵巣細胞系、ＮＩＨ３Ｔ３（３Ｔ３
）マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ細胞系、２９３ヒトＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ
ｓ腎臓細胞系、およびＣＶ１アフリカミドルザル腎臓細胞系をこれらの実験で用
いた。細胞をそれらの各培地中に維持し、それらが６０％コンフルエンシーに達
すると継代した。細胞の培養および維持についての標準的な方法は以下の通りで
あった。
【０１０４】 トランスフェクション：いくつかの商業的に入手可能なリポファクターならび
にエレクトロポレーション方法を評価し、各細胞系のトランスフェクションにつ
いての最良な条件を開発した。ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３，２９３およびＣＶ１細胞
を６０％コンフルエンシーまで増殖させた。実施例１．１ないし１．１０に概説
した種々のスイッチ構築体に対応するＤＮＡを、以下に示すように、ＣＨＯ細胞
、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞またはＣＶ１細胞にトランスフェクトした。 ＣＨＯ細胞：細胞が６０〜８０％コンフルエンシーに達するとそれらを回収し
、各々、１０％胎児ウシ血清を含む増殖培地、２．５、１．０または０．５ｍｌ
中で２５０，０００、１００，０００または５０，０００細胞にて６−、１２−
または２４−ウエルプレート中で平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ
、４時間トランスフェクトした。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００
（Ｌｉｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）は、これらの細胞について
の最良のトランスフェクション試薬であることが判明した。１２−ウエルプレー
トでは、４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００を１００μｌの
増殖培地と混合した。１．０μｇのレポーター構築体および０．２５μｇの受容
体構築体をトランスフェクションミックスに添加した。第２のレポーター構築体
を添加し［ｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．１μｇ／トランスフェクション
ミックス］、それは作動可能に連結したＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子（
配列番号：６４）を含み、チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモーターの制御
下に置き、正規化のために用いた。トランスフェクションミックスの内容物を撹
拌ミキサー中で混合し、室温で３０分間放置した。インキュベーションの最後に
、４００μｌの増殖培地中に維持した細胞にトランスフェクションミックスを添
加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて４時間維持した。インキュベーショ
ンの最後に、２０％ＦＢＳおよびＤＭＳＯ（対照）または適当なリガンドのＤＭ
ＳＯ溶液いずれかを含有する５００μｌの増殖培地を添加し、細胞を３７℃およ
び５％ＣＯ２にて２４〜４８時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性をア
ッセイした。全ての試薬を６ウエルプレートについて２倍とし、２４−ウエルプ
レートについて半分まで減少した以外は、同一の手法を６および２４ウエルプレ
ートにつき行った。
【０１０５】 ＮＩＨ３Ｔ３細胞：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）
は、３Ｔ３細胞について最良のトランスフェクション試薬であることが判明した
。ＣＨＯ細胞について記載したのと同一の手法を２つの修飾を施して同様に３Ｔ
３細胞について行った。細胞が５０％コンフルエンシーに達するとそれらを平板
培養した。１２５，０００または５０，０００または２５，０００細胞を、各々
、６−または１２−または２４−ウエルプレートのウエル当たりに平板培養した
。ＧＡ１４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＲＸＲおよびレポーターベクターＤＮＡをＮＩＨ３
Ｔ３細胞にトランスフェクトし、ＰｏｎＡ、ＭｕｒＡ、Ｎ−（２−エチル−３−
メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔ−ブ
チルヒドラジンまたはＮ−（３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチ
ルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブ
チルヒドラジンを含有する培地中でトランスフェクトされた細胞を４８時間増殖
させた。リガンド処理は前記ＣＨＯ細胞セクションに記載したように行った。
【０１０６】 ２９３細胞：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｌｉｔｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、２９３細胞について最良のリポファクターであるこ
とが判明した。細胞をバイオ被覆したプレート中で平板培養してクランピングを
回避した以外は、ＣＨＯについて記載したのと同一の手法を２９３細胞で行った
。リガンド処理は前記ＣＨＯ細胞セクションに記載したようにに行った。 ＣＶ１細胞：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＣＶ１細胞について最良のリポファクターであるこ
とが判明した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞について記載したのと同一の手法をＣＶ１細胞
で行った。
【０１０７】 リガンド：ポナステロンＡおよびムリステロンＡはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。２つの非ステロイドＮ−（２−エチル‐３
−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔ−
ブチルヒドラジンまたはＮ−（３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メ
チルベンゾイル）−Ｎ’−（３，４−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−
ブチルヒドラジンはＲｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙで合成された
合成安定エクジステロイドである。全ての試薬はＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＳＯ
の最終濃度は対照および処理双方において０．１％に維持した。
【０１０８】 レポーターアッセイ：リガンドを添加して２４〜４８時間後に細胞を回収した
。１２５、２５０または５００μｌの受動溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓ
ｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａ
ｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイ系の一部）を、各々、２
４−または１２−または２４−ウエルプレートの各ウエルに添加した。プレート
をロータリーシェーカー上に１５分間置いた。２０μｌの溶解物をアッセイした
。ルシフェラーゼ活性は、製造業者の指令に従い、Ｐｒｏｍｅａｇ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセ
イ系を用いて測定した。β−ガラクトシダーゼは、製造業者の指令に従い、ＴＲ
ＯＰＩＸからのＧａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ（商標）アッセイキットを用いて測定
した。全てのルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性は、標準としてＲ
ｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用いて正規化した。活性倍率（ｆｏｌｄ ａｃｔ
ｉｖｉｔｙ）は、リガンド処理細胞における正規化相対光単位（「ＲＬＵ」）を
ＤＭＳＯ処理細胞における正規化ＲＬＵ（未処理対照）で割ることによって計算
した。 これらの実験の結果を以下の表に掲げる。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
【表４】
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
【表６】
【０１１５】 出願人の結果は、非ステロイドエクジソンアゴニストＮ−（２−エチル−３−
メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒ
ｔ−ブチルヒドラジンおよびＮ’−（３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−
２−メチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅ
ｒｔ−ブチルヒドラジンは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ
ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）と比較して、ＣｆＥｃＲのより優れたアクチベータであ
ることを示す（表１〜４参照）。また、テストした哺乳動物細胞系では、ＭｍＲ
ＸＲはＣｆＥｃＲについてのヘテロダイマーパートナーとしてＣｆＵＳＰよりも
良好に機能した（表１〜４参照）。加えて、出願人の誘導性遺伝子発現調整系は
、系が内因性ＲＸＲレベルのみに依拠する場合よりも外因性ＭｍＲＸＲを用いる
場合に良好に機能した（表１〜４参照）。 また、出願人の結果は、ＣｆＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現系において、
非ステロイドエクジソンアゴニストが、ステロイドリガンド、ポナステロンＡお
よびムリステロンＡと比較して、低濃度でレポーター遺伝子発現を誘導したこと
を示す（表５および６参照）。 テストした１０のＥｃＲベースの遺伝子スイッチのうち、ＧＡＬ４ＥｃＲ／Ｖ
Ｐ１６ＲＸＲスイッチ（スイッチ１．１）は調べた全ての４つの細胞系において
いずれの他のスイッチよりも良好な性能であり、ステロイドよりも非ステロイド
に対してより感受性であった。また、結果は、２つのパートナーの内の１つの上
にＡＤおよびＤＮＡＢＤを一緒に置くのと比較すると、２つのパートナーの各々
上に活性化ドメイン（ＡＤ）およびＤＮＡ−結合ドメイン（ＤＮＡＢＤ）を置く
のがバックグラウンドを低下させることを示す。従って、ＡＤおよびＤＮＡＢＤ
を２つのパートナーの間で分離した場合のスイッチ様式が、ＥｃＲ−ベースの遺
伝子スイッチ適用でよく働く。 加えて、ＭｍＲＸＲ／ＥｃＲ−ベースのスイッチは、リガンドの不存在下にお
いてＭｍＲＸＲ／ＥｃＲスイッチよりも高いバックグラウンド活性を有するＣｆ
ＵＳＰ／ＥｃＲ−ベースのスイッチよりも良好な性能であった。 最後に、ＧＡＬ４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＲＸＲスイッチ（スイッチ１．１）はステ
ロイドリガンドよりも非ステロイドリガンドに対して感受性であった（表５およ
び６参照）。特に、ステロイドリガンドは５０μＭの濃度でトランス活性化を開
始し、他方、非ステロイドリガンドは１μＭ未満の（サブマイクロモラー）の濃
度でトランス活性化を開始した。
【０１１６】 実施例２ 本実施例は、本発明の改良されたＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現系におけ
るトランケーテッドＥｃＲおよびＲＸＲポリペプチドの出願人のさらなる分析を
記載する。ａ）リガンドの存在下におおける最大誘導、ｂ）リガンドの不存在下
における最小バックグラウンド、ｃ）リガンド濃度に対する高い感受性、および
ｄ）リガンドおよび受容体の中での最小クロス−トークをスイッチに与える２つ
の受容体の最良の組合せおよび長さを同定するために、出願人は、ＮＩＨ３Ｔ３
細胞においてＣｆＥｃＲおよびＭｍＲＸＲ受容体ポリペプチドのいくつかのトラ
ンケーション突然変異を行い分析した。 簡単に述べると、ＥｃＲまたはＲＸＲ受容体をコードするポリヌクレオチドを
Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦドメインの接合においてトランケートし、実施例１
に記載するように、ＣｆＥｃＲについてはポリヌクレオチド（配列番号：４１）
をコードするＧＡＬ４ ＤＮＡ−結合ドメイン、またはＭｍＲＸＲについてはポ
リヌクレオチド（配列番号：４５）をコードするＶＰ１６活性化ドメインのいず
れかに融合させた。得られた受容体トランケーション／融合ポリペプチドをＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞においてアッセイした。ルシフェラーゼポリペプチドをコードする
プラスミドｐＦＲＬＵＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をレポーター遺伝子構築体と
して用い、構成的ＴＫプロモーターの制御下にあるＲｅｎｉｌｌａルシフェラー
ゼポリペプチドをコードするｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、前記した
ようにトランスフェクションを正規化した。分析はトリプリケートで行い、平均
ルシフェラーゼカウントを前記したように測定した。
【０１１７】 トランケーテッドエクジソン受容体ポリペプチドをコードする遺伝子発現カセ
ット ＧＡＬ４ ＤＮＡ−結合ドメイン（配列番号：４１）に融合した全長またはト
ランケーテッドＣｆＥｃＲポリペプチドいずれかをコードするポリヌクレオチド
を含む遺伝子発現カセット：ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ（全長ＣｆＥｃ
ＲＡ／ＢＣＤＥＦ、配列番号：４９）、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（ＣｆＥｃ
ＲＣＤＥＦ、配列番号：１）、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ（ＣｆＥｃＲ
１／２ＣＤＥＦ、配列番号：２）、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ（ＣｆＥｃＲＤＥ
Ｆ、配列番号：３）、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ（ＣｆＥｃＲＥＦ、配列番号：４
）およびＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥ（ＣｆＥｃＲＤＥ、配列番号：５）を、ＶＰ１
６ＭｍＲＸＲＤＥＦ（実施例１．１におけるように構築した、図１１）またはＶ
Ｐ１６ＭｍＲＸＲＥＦ［ＭｍＲＸＲＤＥＦをＭｍＲＸＲＥＦ（配列番号：２３）
を置き換える以外は実施例１．１におけるように構築した、図１２］、およびｐ
ＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトラン
スフェクトした。トランスフェクトした細胞を０，１，５または２５μＭのＮ−
（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’（３，５−ジメチルベンゾイル
）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンまたはＰｏｎＡの存在下で４８時間増殖
させた。細胞を回収し、溶解させ、細胞溶解物中でルシフェラーゼレポーター活
性を測定した。全ハエルシフェラーゼ相対光単位が示される。各棒線の頂部の数
は、その処理についての最大誘導倍率である。
【０１１８】 出願人の結果は、ＭｍＲＸＲのＥＦドメインが十分であり、この受容体のＤＥ
Ｆドメインよりも良好な性能であることを示す（図１１および１２参照）。また
、出願人は、一般に、ＥｃＲ／ＲＸＲ受容体の組合せがＰｏｎＡに対して感受性
でないことも示した（図１１および１２参照）。図１１および１２に示すように
、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦハイブリッドポリペプチド（配列番号：７）はい
ずれかの他のＣｆＥｃＲハイブリッドポリペプチドよりも良好な性能であった。
【０１１９】 トランケーテッドレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする遺伝子発現カ
セット ＶＰ１６トランス活性化ドメイン（配列番号：４５）に融合させた全長または
トランケーテッドＭｍＲＸＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
細胞発現カセット：ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＡ／ＢＣＤＥＦ（全長ＭｍＲＸＲＡ／Ｂ
ＣＤＥＦ、配列番号：５３）、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＣＤＥＦ（ＭｍＲＸＲＣＤＥ
Ｆ、配列番号：２１）、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥＦ（ＭｍＲＸＲＤＥＦ、配列番
号：２２）、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ（ＭｍＲＸＲＥＦ、配列番号：２３）、Ｖ
Ｐ１６ＭｍＲＸＲＢａｍ−ＥＦ（「ＭｍＲＸＲＢａｍ−ＥＦ」または「ＭｍＲＸ
Ｒ−トランケーテッドＥＦ」、配列番号：２４）、およびＶＰ１６ＭｍＲＸＲＡ
Ｆ２ｄｅｌ（「ＭｍＲＸＲＡＦ２ｄｅｌ」または「ＭｍＲＸＲ−Ｅ」、配列番号
：２５）構築体を、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（実施例１．１におけるように
構築した、図１３）またはＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ［ＣｆＥｃＲＣＤＥＦをＣ
ｆＥｃＲＤＥＦ（配列番号：３）で置き換える以外は実施例１．１におけるよう
に構築した、図１４］、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共に
前記したようにＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトさ
れた細胞を０，１，５および２５μＭのＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾ
イル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒド
ラジンまたはＰｏｎＡの存在下で４８時間増殖させた。細胞を回収し、溶解させ
、細胞溶解物中でレポーター活性を測定した。全ハエルシフェラーゼ相対光単位
が示される。各棒線の頂部の数は、その処理における最大誘導倍率である。 テストしたＭｍＲＸＲの全てのトランケーションの内、出願人の結果は、Ｍｍ
ＲＸＲＥＦ受容体がＣｆＥｃＲについての最良のパートナーであることを示す（
図１３および１４）。ＣｆＥｃＲＣＤＥＦは、ＭｍＲＸＲＥＦを用いるＣｆＥｃ
ＲＤＥＦよりも良好な誘導を示した。ＡＦ２（「ＥＦ−ＡＦ２ｄｅｌ」と略する
）またはＥドメインのラセン１−３の欠失（「ＥＦ−Ｂａｍｄｅｌ」と略する）
の結果、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（図１３）またはＣｆＥ
ｃＲＤＥＦ（図１４）いずれかとパートナーを組むと遺伝子誘導およびリガンド
感受性を低下させるＲＸＲ受容体が得られた。一般に、ＣｆＥｃＲ／ＲＸＲ−ベ
ースのスイッチは、ステロイドＰｏｎＡに対するよりも非ステロイドＮ−（２−
エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−
Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンに対してかなり感受性であった。
【０１２０】 実施例３ 本実施例は、リガンド結合活性またはリガンド感受性のいずれかまたは双方に
影響するトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲ受容体ポリペプチドをコードする
遺伝子発現カセットの出願人のさらなる分析を記載する。簡単に述べれば、実施
例１および２に記載したように構築したキメラ受容体対の６つの異なる組合せを
、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において単一の実験でさらに分析した。これらの６つの受容
体対の組合せおよびそれらの対応する試料の数を表７に示す。
【０１２１】
【表７】
【０１２２】 レポータープラスミドｐＦＲＬｕｃと共に前記した受容体構築体対を前記した
ようにＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。６つのＣｆＥｃＲトランケー
ション受容体組み合わせを２つの群に複製し、ステロイド（図１５のＸ−軸上の
奇数）または非ステロイド（図１５のＸ−軸上の偶数）いずれかで処理した。特
に、細胞は０，１，５または２５μＭのＰｏｎＡ（ステロイド）またはＮ−（２
−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）
−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（非ステロイド）リガンドを含有する培地
中で増殖させた。レポーター遺伝子活性を測定し、全ＲＬＵを示す。各棒線の頂
部の数はその処理についての最大誘導倍率であり、３つの複製の平均である。 図１５に示すように、ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ／ＭｍＲＸＲＥＦ受容体組み合わせ
は、全ＲＬＵおよび倍誘導の双方の項目において最良のスイッチ対であった（欄
１〜６を欄７〜１２と比較されたい）。これは、実施例２に記載した出願人の先
の知見を確認する（図１１〜１４）。また、トランケーテッドＥｃＲおよびＲＸ
Ｒポリペプチドをコードする同一遺伝子発現カセットをヒト肺癌腫細胞系Ａ５４
９（ＡＴＣＣ）においてアッセイし、同様の結果が観察された（データは示さず
）。
【０１２３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｃ
ｆＥｃＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよ
びＶＰ１６ＡＤ−ＭｍＲＸＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺伝
子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．１
）である。
【図２】 図２は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｃ
ｆＥｃＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよ
びＶＰ１６ＡＤ−ＣｆＵＳＰＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺伝
子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．２
）である。
【図３】 図３は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｍ
ｍＲＸＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよ
びＶＰ１６ＡＤ−ＣｆＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺
伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．
３）である。
【図４】 図４は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｍ
ｍＲＸＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよ
びＶＰ１６ＡＤ−ＤｍＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺
伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．
４）である。
【図５】 図５は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｃ
ｆＵＳＰＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよ
びＶＰ１６ＡＤ−ＣｆＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺
伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．
５）である。
【図６】 図６は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｃ
ｆＥｃＲＤＥＦ−ＶＰ１６ＡＤキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発
現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．６）で
ある。
【図７】 図７は、実施例１に記載したように調製した、ＶＰ１６ＡＤ−Ｃｆ
ＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットを含
むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．７）である。
【図８】 図８は、実施例１に記載したように調製した、ＶＰ１６ＡＤ−Ｄｍ
ＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよ
びＭｍＲＸＲポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジ
ソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．８）である。
【図９】 図９は、実施例１に記載したように調製した、ＶＰ１６ＡＤ−Ｃｆ
ＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよ
びＭｍＲＸＲポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジ
ソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．９）である。
【図１０】 図１０は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ
−ＣｆＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセッ
トを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．１０）である。
【図１１】 図１１は、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫ
ＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＧＡＬ
４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃ
Ｒ１／２ＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ、ＧＡ
Ｌ４ＣｆＥｃＲＤＥトランケーション突然変異体の発現データである。
【図１２】 図１２は、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲ
ＬプラスミドＤＮＡと共に３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＧＡＬ４ＣｆＥ
ｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２
ＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ、ＧＡＬ４Ｃｆ
ＥｃＲＤＥトランケーション突然変異体の発現データである。
【図１３】 図１３は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐ
ＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＶ
Ｐ１６ＭｍＲＸＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＣＤＥＦ、ＶＰ１６Ｍｍ
ＲＸＲＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＢａｍ−ＥＦ、Ｖ
Ｐ１６ＭｍＲＸＲＡＦ２ｄｅｌ構築体の発現データである。
【図１４】 図１４は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴ
ＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＶＰ
１６ＭｍＲＸＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＣＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲ
ＸＲＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＢａｍ−ＥＦ、ＶＰ
１６ＭｍＲＸＲＡＦ２ｄｅｌ構築体の発現データである。
【図１５】 図１５は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴ
ＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされた種々
のトランケーテッドＣｆＥｃＲおよびＭｍＲＸＲ受容体対の発現データである。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ａ６１Ｋ 48/00 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 48/00 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カピツカヤ，マリアンナ・ジノブジェブナ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19454， ノース・ウェールズ，ウェックスフォー ド・ロード・59 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AB03 AD08 4B024 AA20 BA63 CA01 CA02 DA02 DA03 HA20 4B065 AA90Y AA91X AA91Y AA93X AB01 CA24 4C084 AA06 AA13 CA53 CA56 ZC781 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 CA51 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (71)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ） ｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する応答
    エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、および ｉｉ）核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、
    を含む、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細
    胞で発現させることができる第１の遺伝子発現カセットと、 ｂ） ｉ）トランス活性化ドメイン、および ｉｉ）ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）以外の核受容体からのリガンド結合ド
    メインを含むリガンド結合ドメイン、 を含む、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細
    胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセットと、 を含み、 トランス活性化ドメインがエクジソン受容体、レチノイドＸ受容体、またはウ
    ルトラスピラクル受容体以外の核受容体からのものであり、および、第１のポリ
    ペプチドおよび第２のポリペプチドからのリガンド結合ドメインが異なり、二量
    体化することを特徴とする遺伝子発現調整系。
  2. 【請求項２】 さらに ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、 ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプ
    ロモーター、および ｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、 を含む第３の遺伝子発現カセットを含む請求項１記載の遺伝子発現調整系。
  3. 【請求項３】 第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインがエクジソン受
    容体ポリペプチドである請求項１記載の遺伝子発現調整系。
  4. 【請求項４】 第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインがレチノイドＸ
    受容体ポリペプチドである請求項１記載の遺伝子発現調整系。
  5. 【請求項５】 ａ） ｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する応答
    エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、および ｉｉ）エクジソン受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ド
    メイン、 を含む、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細
    胞で発現することができる第１の遺伝子発現カセットと、 ｂ） ｉ）トランス活性化ドメイン、および ｉｉ）レチノイドＸ受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合
    ドメイン、 を含む、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細
    胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセットと、 を含み、 第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからのリガンド結合ドメインが
    異なり、二量体化することを特徴とする遺伝子発現調整系。
  6. 【請求項６】 さらに、 ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、 ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプ
    ロモーター、および ｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、 を含む第３の遺伝子発現カセットを含む請求項５記載の遺伝子発現調整系。
  7. 【請求項７】 第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：
    １、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６
    、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群
    から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされた請求項５
    記載の遺伝子発現調整系。
  8. 【請求項８】 第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：
    １１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配
    列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番
    号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５記載の遺伝子発
    現調整系。
  9. 【請求項９】 第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：
    ２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配
    列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番
    号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコ
    ードされた請求項５記載の遺伝子発現調整系。
  10. 【請求項１０】 第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号
    ：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、
    配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列
    番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５記載の遺伝子
    発現調整系。
  11. 【請求項１１】 ａ） ｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する応
    答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、および ｉｉ）レチノイドＸ受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合
    ドメイン、 を含む、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細
    胞で発現させることができる第１の遺伝子発現カセットと、 ｂ） ｉ）トランス活性化ドメイン、および ｉｉ）エクジソン受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ド
    メイン、 を含む、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細
    胞で発言させることができる第２の遺伝子発現カセットと、 を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからのリガンド結合ドメ
    インが異なり、二量体化することを特徴とする遺伝子発現調整系。
  12. 【請求項１２】 さらに、 ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、 ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプ
    ロモーター、および ｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、 を含む第３の遺伝子発現カセットを含む請求項１１記載の遺伝子発現調整系。
  13. 【請求項１３】 第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号
    ：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、
    配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列
    番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによって
    コードされた請求項１１記載の遺伝子発現調整系。
  14. 【請求項１４】 第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号
    ：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、
    配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列
    番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１１記載の遺伝
    子発現調整系。
  15. 【請求項１５】 第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号
    ：１、配列番号：２、配列番号：３、配列版語：４、配列番号：５、配列番号：
    ６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる
    群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされた請求項
    １１記載の遺伝子発現調整系。
  16. 【請求項１６】 第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号
    ：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、
    配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列
    番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１１記載の遺伝
    子発現調整系。
  17. 【請求項１７】 ＤＮＡ−結合ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結
    合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
    み、ＤＮＡ−結合ドメインがエクジソン受容体以外の核受容体からのものである
    遺伝子発現カセット。
  18. 【請求項１８】 ＤＮＡ−結合ドメインがＧＡＬ４ ＤＮＡ−結合ドメイン
    またはＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合ドメインである請求項１８記載の遺伝子発現カセ
    ット。
  19. 【請求項１９】 ＤＮＡ−結合ドメインおよびレチノイドＸ受容体リガンド
    結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
    含み、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインがレチノイドＸ受容体以外の核受容体から
    のものであることを特徴とする遺伝子発現カセット。
  20. 【請求項２０】 ＤＮＡ−結合ドメインがＧＡＬ４ ＤＮＡ−結合ドメイン
    またはＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合ドメインである請求項１９記載の遺伝子発現カセ
    ット。
  21. 【請求項２１】 トランス活性化ドメインおよびエクジソン受容体リガンド
    結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
    含み、トランス活性化ドメインがエクジソン受容体以外の核受容体からのもので
    ある遺伝子発現カセット。
  22. 【請求項２２】 トランス活性化ドメインがＶＰ１６トランス活性化ドメイ
    ンである請求項２１記載の遺伝子発現カセット。
  23. 【請求項２３】 トランス活性化ドメインおよびレチノイドＸ受容体リガン
    ド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    を含み、トランス活性化ドメインがレチノイドＸ受容体以外の核受容体からのも
    のである遺伝子発現カセット。
  24. 【請求項２４】 トランス活性化ドメインがＶＰ１６トランス活性化ドメイ
    ンである請求項２２記載の遺伝子発現カセット。
  25. 【請求項２５】 ＧＡＬ４ ＤＢＤ（配列番号：４１）またはＬｅｘＡ Ｄ
    ＢＤ（配列番号：４３）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオ
    チドによってコードされたＤＮＡ−結合ドメイン、および配列番号：１、配列番
    号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号
    ：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択さ
    れる核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたエクジソン受容体リ
    ガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チドを含む遺伝子発現カセット。
  26. 【請求項２６】 ＧＡＬ４ ＤＢＤ（配列番号：４２）またはＬｅｘＡ Ｄ
    ＢＤ（配列番号、４４）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ−
    結合ドメイン、および配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列
    番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１
    ８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配
    列を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチ
    ドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
  27. 【請求項２７】 ＧＡＬ４ ＤＢＤ（配列番号：４１）またはＬｅｘＡ Ｄ
    ＢＤ（配列番号：４３）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオ
    チドによってコードされたＤＮＡ−結合ドメイン、および配列番号：２１、配列
    番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２
    ６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よ
    りなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされた
    レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
  28. 【請求項２８】 ＧＡＬ４ ＤＢＤ（配列番号：４２）またはＬｅｘＡ Ｄ
    ＢＤ（配列番号、４４）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ−
    結合ドメイン、および配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列
    番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配
    列を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプ
    チドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
  29. 【請求項２９】 配列番号：４５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによっ
    てコードされたトランス活性化ドメイン、および配列番号：１、配列番号：２、
    配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配
    列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択される核酸
    配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたエクジソン受容体リガンド結
    合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
    む遺伝子発現カセット。
  30. 【請求項３０】 配列番号：４６のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメ
    イン、および配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１
    ４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列
    番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む
    エクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコー
    ドするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
  31. 【請求項３１】 配列番号：４５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによっ
    てコードされたトランス活性化ドメイン、および配列番号：２１、配列番号：２
    ２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列
    番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群
    から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたレチノイ
    ドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする
    ポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
  32. 【請求項３２】 配列番号：４６のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメ
    イン、および配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３
    ４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列
    番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む
    レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
  33. 【請求項３３】 トランケーション突然変異を含むエクジソン受容体ポリペ
    プチドまたはレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチドであって、トランケーション突然変異がエクジソン受容体ポリペプチド
    またはレチノイドＸ受容体ポリペプチドのリガンド結合活性を低下させる単離さ
    れたポリヌクレオチド。
  34. 【請求項３４】 トランケーション突然変異を含むエクジソン受容体ポリペ
    プチドまたはレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチドであって、トランケーション突然変異がエクジソン受容体ポリペプチド
    またはレチノイドＸ受容体ポリペプチドのステロイド結合活性を低下させる単離
    されたポリヌクレオチド。
  35. 【請求項３５】 トランケーション突然変異を含むエクジソン受容体ポリペ
    プチドまたはレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチドであって、トランケーション突然変異がエクジソン受容体ポリペプチド
    またはレチノイドＸ受容体ポリペプチドの非ステロイド結合活性を低下させる単
    離されたポリヌクレオチド。
  36. 【請求項３６】 トランケーション突然変異を含むエクジソン受容体ポリペ
    プチドまたはレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチドであって、トランケーション突然変異がエクジソン受容体ポリペプチド
    またはレチノイドＸ受容体ポリペプチドのリガンド結合活性を増強させる単離さ
    れたポリヌクレオチド。
  37. 【請求項３７】 トランケーション突然変異を含むエクジソン受容体ポリペ
    プチドまたはレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチドであって、トランケーション突然変異がエクジソン受容体ポリペプチド
    またはレチノイドＸ受容体ポリペプチドのステロイド結合活性を増強させる単離
    されたポリヌクレオチド。
  38. 【請求項３８】 トランケーション突然変異を含むエクジソン受容体ポリペ
    プチドまたはレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチドであって、トランケーション突然変異がエクジソン受容体ポリペプチド
    またはレチノイドＸ受容体ポリペプチドの非ステロイド結合活性を増強させるこ
    とを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
  39. 【請求項３９】 トランケーション突然変異を含むレチノイドＸ受容体ポリ
    ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、トランケーション
    突然変異がレチノイドＸ受容体ポリペプチドのリガンド感受性を増加させること
    を特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
  40. 【請求項４０】 トランケーション突然変異を含むレチノイドＸ受容体ポリ
    ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、トランケーション
    突然変異がヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させ、ヘテロダイマーが該レ
    チノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二量体化パートナーを含むことを特徴とす
    る単離されたポリヌクレオチド。
  41. 【請求項４１】 二量体化パートナーがエクジソン受容体ポリペプチドであ
    る請求項４０記載の単離されたポリヌクレオチド。
  42. 【請求項４２】 トランケーテッドエクジソン受容体ポリペプチドをコード
    する単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号：１
    、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、
    配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群か
    ら選択される核酸配列を含む該単離されたポリヌクレオチド。
  43. 【請求項４３】 請求項４２記載の単離されたポリヌクレオチドによってコ
    ードされた単離されたポリペプチド。
  44. 【請求項４４】 配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列
    番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１
    ８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配
    列を含む単離されたトランケーテッドエクジソン受容体ポリペプチド。
  45. 【請求項４５】 トランケーテッドレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコー
    ドする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号：
    ２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配
    列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番
    号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含む該単離されたポリヌクレオチ
    ド。
  46. 【請求項４６】 請求項４５記載の単離されたポリヌクレオチドによってコ
    ードされた単離されたポリペプチド。
  47. 【請求項４７】 配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列
    番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配
    列を含む単離されたトランケーテッドレチノイドＸ受容体ポリペプチド。
  48. 【請求項４８】 調整されるべき遺伝子を含む宿主細胞において遺伝子の発
    現を調整する方法であって、 ａ）請求項１記載の遺伝子発現調整系を宿主細胞に導入する工程、および ｂ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインと
    独立に組み合わされるリガンドを宿主細胞に導入する工程を含み、 発現されるべき遺伝子が： ｉ）第１のポリペプチドからのＤＮＡ−結合ドメインが結合すべき応答エレメ
    ント、 ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプ
    ロモーター、および ｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、 を含むキメラ遺伝子の構成要素であり、 それにより、リガンド、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む
    複合体が形成され、およびそれにより、複合体が宿主細胞における遺伝子の発現
    を調整する方法。
  49. 【請求項４９】 リガンドが式： 【化１】 （式中、 Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含有す
    るシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり、 Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣ
    ｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、
    Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、
    シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまた
    はＳＣＨＦ２であり、 Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、
    ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、
    ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、
    ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、
    ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２Ｃ
    Ｆ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ
    、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、あるいはＲ３と、Ｒ２ およびＲ３が結合するフェニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェ
    ニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接す
    る酸素を持つジヒドロピリル環を形成し、 Ｒ３は、Ｈ、Ｅｔであるか、あるいはＲ２と、Ｒ２およびＲ３が結合するフェ
    ニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を
    持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリ
    ル環を形成し、 Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル
    、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、
    Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ
    またはＳＥｔである） の化合物である請求項４８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 調整されるべき遺伝子を含む宿主細胞において遺伝子の発
    現を調整する方法であって、 ａ）請求項５記載の遺伝子発現調整系を宿主細胞に導入する工程、および ｂ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインと
    独立に組み合わされるリガンドを宿主細胞に導入する工程を含み、 発現されるべき遺伝子が： ｉ）第１のポリペプチドからのＤＮＡ−結合ドメインが結合すべき応答エレメ
    ント、 ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプ
    ロモーター、および ｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、 を含むキメラ遺伝子の構成要素であり、 それにより、リガンド、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む
    複合体が形成され、およびそれにより、複合体が宿主細胞における遺伝子の発現
    を調整する方法。
  51. 【請求項５１】 リガンドが式： 【化２】 （式中、 Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含有す
    るシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり、 Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣ
    ｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、
    Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、
    シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまた
    はＳＣＨＦ２であり、 Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、
    ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、
    ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、
    ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、
    ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２Ｃ
    Ｆ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ
    、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、あるいはＲ３と、Ｒ２ およびＲ３が結合するフェニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェ
    ニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接す
    る酸素を持つジヒドロピリル環を形成し、 Ｒ３は、Ｈ、Ｅｔであるか、あるいはＲ２と、Ｒ２およびＲ３が結合するフェ
    ニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を
    持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリ
    ル環を形成し、 Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル
    、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、
    Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ
    またはＳＥｔである） の化合物である請求項５０記載の方法。
  52. 【請求項５２】 調整されるべき遺伝子を含む宿主細胞において遺伝子の発
    現を調整する方法であって、 ａ）請求項１１記載の遺伝子発現調整系を宿主細胞に導入する工程、および ｂ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインと
    独立に組み合わされるリガンドを宿主細胞に導入する工程を含み、 発現されるべき遺伝子が： ｉ）第１のポリペプチドからのＤＮＡ−結合ドメインが結合すべき応答エレメ
    ント、 ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプ
    ロモーター、および ｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、 を含むキメラ遺伝子の構成要素であり、 それにより、リガンド、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む
    複合体が形成され、およびそれにより、複合体が宿主細胞における遺伝子の発現
    を調整する方法。
  53. 【請求項５３】 リガンドが式： 【化３】 （式中、 Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含有す
    るシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり、 Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣ
    ｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、
    Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、
    シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまた
    はＳＣＨＦ２であり、 Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２ 、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２Ｃ
    Ｎ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃ
    ｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、Ｎｅｔ２、ＳＭ
    ｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−
    Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、あるいはＲ３と、
    Ｒ２およびＲ３が結合するフェニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、
    フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣
    接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し、 Ｒ３は、Ｈ、Ｅｔであるか、あるいはＲ２と、Ｒ２およびＲ３が結合するフェ
    ニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を
    持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリ
    ル環を形成し、 Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル
    、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、
    Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ
    またはＳＥｔである） の化合物である請求項５２記載の方法。
  54. 【請求項５４】 請求項１記載の遺伝子発現調整系が導入されている単離さ
    れた宿主細胞。
  55. 【請求項５５】 宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動
    物細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される請求項５４記載の単離され
    た宿主細胞。
  56. 【請求項５６】 宿主細胞が植物細胞、マウス細胞、またはヒト細胞である
    請求項５５記載の単離された宿主細胞。
  57. 【請求項５７】 請求項５記載の遺伝子発現調整系が導入されている単離さ
    れた宿主細胞。
  58. 【請求項５８】 宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動
    物細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される請求項５７記載の単離され
    た宿主細胞。
  59. 【請求項５９】 宿主細胞が植物細胞、マウス細胞、またはヒト細胞である
    請求項５８記載の単離された宿主細胞。
  60. 【請求項６０】 請求項１１記載の遺伝子発現調整系が導入されている単離
    された宿主細胞。
  61. 【請求項６１】 宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動
    物細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される請求項６０記載の単離され
    た宿主細胞。
  62. 【請求項６２】 宿主細胞が植物細胞、マウス細胞、またはヒト細胞である
    請求項６１記載の単離された宿主細胞。
  63. 【請求項６３】 請求項１記載の遺伝子発現調整系が導入されている宿主細
    胞を含む非ヒト生物。
  64. 【請求項６４】 非ヒト生物が細菌、真菌、酵母、植物、動物および哺乳動
    物よりなる群から選択される項６３記載の非ヒト生物。
  65. 【請求項６５】 非ヒト生物が植物、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ
    、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サルおよびチンパンジーよりなる群から選
    択される請求項６４記載の非ヒト生物。
  66. 【請求項６６】 請求項５記載の遺伝子発現調整系が導入されている宿主細
    胞を含む非ヒト生物。
  67. 【請求項６７】 非ヒト生物が細菌、真菌、酵母、植物、動物および哺乳動
    物よりなる群から選択される請求項６６記載の非ヒト生物。
  68. 【請求項６８】 非ヒト生物が植物、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ
    、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サルおよびチンパンジーよりなる群から選
    択される請求項６７記載の非ヒト生物。
  69. 【請求項６９】 請求項１１記載の遺伝子発現調整系が導入されている宿主
    細胞を含む非ヒト生物。
  70. 【請求項７０】 非ヒト生物が細菌、真菌、酵母、植物、動物および哺乳動
    物よりなる群から選択される請求項６９記載の非ヒト生物。
  71. 【請求項７１】 非ヒト生物が植物、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ
    、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サルおよびチンパンジーよりなる群から選
    択される請求項７０記載の非ヒト生物。
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