JP2006068010A - レチノイドx受容体相互作用性ポリペプチドならびに関連する分子および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)(i)あるタンパク質の結合部位に機能的に結合させたレポーター遺伝子と、(ii)タンパク質結合部位に特異的に結合することができる結合部分に共有結合したレチノイドX受容体タンパク質を含む第一の融合タンパク質を発現する第一の融合遺伝子と、(iii)遺伝子活性化部分に共有結合した被験タンパク質を含む第二の融合タンパク質を発現する第二の融合遺伝子とを含む、宿主細胞を提供すること、および(b)該被験タンパク質がレチノイドX受容体タンパク質と相互作用する能力を有する否かを示す指標として、被験タンパク質がレポーター遺伝子の発現を増強させるか否かを判定すること。また、レチノイドX受容体-相互作用性タンパク質をコードする精製されたDNA、およびこのようなDNAから発現するポリペプチドも提供する。
【選択図】図3
Description
本発明は受容体タンパク質に関する。
第一の局面において、本発明は一般的に、被験タンパク質がレチノイドX受容体(RXR)タンパク質と相互作用することができるか否かを判定する方法を特徴とする。本方法には、(a)(i)あるタンパク質の結合部位と機能的に結合させたレポーター遺伝子と、(ii)タンパク質結合部位に特異的に結合することができる結合部分に共有結合したレチノイドX受容体タンパク質を含む第一の融合タンパク質を発現する第一の融合遺伝子と、(iii)遺伝子活性化部分に共有結合した被験タンパク質を含む第二の融合タンパク質を発現する第二の融合遺伝子とを含む宿主細胞の提供、および(b)被験タンパク質がレチノイドX受容体タンパク質と相互作用しうるか否かを示す指標としての、被験タンパク質がレポーター遺伝子の発現を増強させるか否かの判定、が含まれる。
本出願者らは、レチノイドX受容体および、特にヒトRXRαのリガンド結合ドメインと身体内で相互作用するタンパク質を同定し単離するためにインビボ相互作用トラップ系を用いた。これらのタンパク質をRXR-相互作用性タンパク質(またはRIP)と命名する。RIPの単離および特徴分析の具体例を以下に示す。
最近、タンパク質‐タンパク質相互作用の同定および特徴分析のために、いくつかの遺伝学的手法が用いられている(例えば、「Fieldsら、Nature 340:245〜246,1989」;「Gyurisら、Cell 75:791〜803,1993」)。これらの系の中心となる概念は、真核生物の転写アクチベーターにおいて、転写活性化およびDNA結合は極めて異なる機能であり、一般に2つの離れたドメインに局在することである。非相同的な活性化ドメインに付着した、あるタンパク質のDNA結合ドメインを含むキメラ型転写アクチベーターの機能例の特徴分析は数多く行われている(「Greenら、Nature 325:75〜78,1987」;「Maら、Cell 51:113〜119,1987」)。この付着が単一のタンパク質の離れたドメインの共有結合によるものではなく、タンパク質‐タンパク質相互作用により生じた間接的なものであることが選択の基盤となる。相互作用トラップと呼ばれる、この種類の系の一型を用いて、Max(Zervosら、Cell 72:223〜232, 1993)、Cdc2(Gyurisら、Cell 75:791〜803, 1993)、およびRAG-1(Coumoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 印刷中、1994)を含む種々の異なる標的と相互作用する新たなタンパク質がいくつか単離されている。
RIPクローンと、RAR、TR、グルココルチコイド受容体(GR)、および本研究所において単離したオーファン受容体であるMB67(Baesら、Mol. Cell. Biol. 14:1544〜1552, 1994)を含む、スーパーファミリーのその他のメンバーとの相互作用も、一連の適したLexA融合体を用いて検討した。特に、表1に示した実験は以下のようにして実施した。LexA結合部位の制御を受けているlacZレポーター遺伝子を含む酵母形質転換体に、指定されたB42-およびLexA-融合タンパク質の発現ベクターを、X-galを含むガラクトース-Ura−His−Trp−プレート上にてトランスフェクションし、2日間インキュベートした。β-ガラクトシダーゼ活性の相対値を算出し、以下に従って記述した。B=青(強い相互作用)、LB=薄い青(弱い相互作用)、W=無色(相互作用せず)、nt=未検。相互作用の検査では、各プレートについて少なくとも3つの別々のコロニーを対象とした。リガンドの作用を検討するために、細胞接種の直前に、適したリガンドの10−6M溶液100μlをプレート上に塗布した(RXRに対しては9-cis-RA、TRにはT3、RARには全trans-RA)。B42-PPARについては、スクリーニングによって単離したプラスミドを用いた。RARの全長型および切断型のそれぞれをLexAと融合して検討したところ、全長の融合体のみを用いて検討したB42-110を除き、B42融合体のすべてと結果は同一であった。
本明細書に説明した通りのノーザンブロット解析により、マウスでは、RIP14が主に約1.8〜2.2kbの幅広いバンドとして肝臓および腎臓のみに発現することが示された(図2)。量ははるかに少ないが、これより分子量の高い分子種も3〜4種類認められた。これに対して、約2.3kbのRIP15 mRNAは多くの組織で普遍的に発現していた。これらのmRNAの全長クローンを得るために、マウス肝臓cDNAライブラリーを構築し、RIP14およびRIP15をプローブとして用いる通常のハイブリダイゼーション法によってスクリーニングを行った。RIP14については8種の異なるクローンが得られ、RIP15については4種が得られた。
RIP14およびRIP15はいずれも、リガンド依存的転写活性化に関連したC端保存配列(Danielianら、EMBO J. 11:1025〜1033, 1992)を含むその他のオーファン受容体および通常の受容体(「Seagravesら、Gene & Dev. 4:204〜219, 1990」;「Ameroら、Mol. Endocrinol 6:3〜8, 1992」;「Laudetら、EMBO J 11:1003〜1013, 1992」)の、推定されるリガンド結合および二量体化(E)ドメインに存在する保存配列モチーフのすべてと一致する部分を含む。Cドメインの場合と同じく、リガンド/二量体化ドメインに基づく全体的な比較の結果、RIP14およびRIP15はエクジソン受容体も含まれる異なるサブグループに位置づけられた。この領域内において、RIP14とRIP15およびエクジソン受容体との同一性はそれぞれ42%および37%であり、RIP15とエクジソン受容体との同一性は42%であった。全体的には、これらの3つのタンパク質には、TRとRARとの関係と同様に、互いに密接な関連がみられた。
各々のオーファン受容体によって認識されるDNA配列を同定するために、インビトロ翻訳によって得たタンパク質を用いてゲルシフト分析を行った。これらはエクジソン受容体との配列類似性が高いため、研究が進んでいるショウジョウバエhsp27プロモーターのエクジソン反応要素(EcRE)(Riddioloughら、EMBO J. 6:3729〜3734, 1987)と、2つのオーファン受容体との結合を、RXRの存在下または非存在下において検討した。この要素は、受容体結合性の共通配列AGGTCAを、1つの塩基対を境にして逆方向反復させたもの(IR-1)と一致する2つの六量体から成る。図8のパネルAに示した通り、RIP14-1は、RXRの存在下においてのみEcREと結合した。ほぼ等しい量のRIP14タンパク質を用いた場合には、RIP14-2アイソフォームとこの要素との結合は、RIP14-1のそれよりも弱かった。RIP15は、RXRの有無にかかわらず、EcREと結合しなかった。ヒトRARβ2アイソフォーム(βRARE)のプロモーターから得られたレチノイン酸反応要素(de Theら、Nature 343:177〜180, 1990)を含むその他のいくつかのDNA要素も、ゲルシフト分析により検討した。RXRの存在下では、βRAREはRIP14アイソフォームおよびRIP15のいずれとも結合した(図8、パネルB)。さらに、ほぼ等しい量のRIP14タンパク質を用いた場合には、RIP14-2/RXRヘテロ二量体の結合性は、RIP14-1/RXRヘテロ二量体よりも弱かった(図8、パネルB、レーン10および14)。EcREについて得た結果とは対照的に、RIP14-1はRXRの非存在下においてもβRAREと一定の結合を示した。
RIP14およびRIP15のDNA結合特異性が少なくとも部分的には重複していることは、それらのDNA結合ドメインに類似性がみられることと一致しており、機能的な役割も重複していることが示唆される。いずれもβRAREと相互作用するため、これらの機能にレチノイドに対する複雑な反応が含まれる可能性もある。しかし、一過性トランスフェクションを行った際に、この2つのオーファン受容体の完全型およびキメラ型がいずれも不活性であったことは、両者とも、まだ同定されていないリガンドとの結合またはその他の過程による活性化を必要とすることを示している。
RIP14-1、RIP14-2、およびRIP15の転写活性を調べるため、それぞれを発現するベクターを、TKプロモーターの上流にβRAREの3コピーを挿入したルシフェラーゼレポータープラスミド(Baesら、Mol. Cell. Biol. 14:1544〜1552, 1994、本明細書に記載)とともにHepG2細胞に同時トランスフェクションした。このレポーターの発現は、レチノイン酸の存在下ではRARにより100倍以上にトランス活性化され、構成的と思われるオーファン受容体MB67により20〜50倍にトランス活性化される(Baseら、Mol, Cell. Biol. 14:1544〜1552)。いずれの試験条件においても、RIP14の2つのアイソフォームおよびRIP15はいずれもβRAREレポーターをトランス活性化しなかった(図9)。これは、甲状腺ホルモン受容体(TR)のA/BおよびDNA結合(C)ドメインに、それぞれのオーファン受容体のヒンジ(D)およびリガンド結合(E)ドメインを融合させたキメラ体を用いて確認した。これらのキメラ体を、合成パリンドロームT3反応要素(TREpal)(Brentら、Mol. Endocrinol. 3:1996〜2004, 1989)の2コピーを含む類似のレポータープラスミドとともに同時トランスフェクションした際には、TR-RIP14キメラ体ではCDMベクター単独の場合と有意の差はみられなかった。TR-RIP15キメラ体では、種々の条件において2〜3倍の活性化が認められた。しかし、この効果は、T3の存在下においてTRによって50倍の活性化が認められたことに比べると極めてわずかである。
標準的手法によってRIP110およびRIP13のcDNAの塩基配列を決定し、同じく標準的手法により、それから導き出されるアミノ酸配列を決定した。これらの配列を図10および11に示した。
菌株およびプラスミド
LexA融合タンパク質は、完全型のLexAタンパク質を発現するLexA融合ベクターの誘導物(LexA(1-202)+PL)(Gyurisら、Cell 75:791〜803, 1993)から発現させた。LexA-RXRおよびLexA-TR融合体は、DNA結合ドメインのC端部分からC末端までヒトRXRαおよびラットTRβの配列を含む。LexAのRAR、MB67、およびGRとの類似の融合体は、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を用いて作製した。LexA-RARについては、さらに完全型のRARαを融合させたものも作製した。B42融合タンパク質は、以下に説明するcDNAライブラリーから単離するか、標準的手順を用いてベクターpJG4-5の誘導物(Gyurisら、Cell 75:791〜803, 1993)に挿入した。インビトロ翻訳のために、すでに報告されているバクテリオファージT7プロモーター発現ベクター(Carterら、Mol. Cell. Biol. 印刷中、1994)に適切な断片をクローニングし、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを用いて発現させた。哺乳類発現ベクターにはCDMの誘導物(Seed, Nature 329:840〜842, 1987)を、レポータープラスミドには、ヘルペスウイルスTKプロモーターがルシフェラーゼの発現を引き起こすようにしたpTKlucの誘導物(Carterら、Mol. Cell. Biol. 印刷中)を用いた。
標準的手順を用いて、B42発現ベクターpJG4-5の誘導物であるプラスミドcgatrp2(TRP1+の選別のため)内に、オリゴ(dT)をプライマーとしたマウス肝臓cDNAライブラリーを構築した(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Assoc. New York, 1994)。このプラスミドは、P3プラスミドを含む大腸菌の菌株に形質転換を施した後に、cgatrp2のみ(宿主酵母に存在するその他の2つのプラスミドではなく)を再び取り出すために用いることができるtRNAサプレッサー遺伝子supFも含む。ライブラリーを増幅し、これを用いて、LexA-RXRを発現しているEGY48誘導物に形質転換を施した。3×106個の酵母一次形質転換体をグルコース-Ura−His−Trp−プレートから採取し、これまでに記載された方法に従って回収した(Gyurisら、Cell 75:791〜803, 1993)。この細胞の2×107個を、9-cis-RAの存在下または非存在下のそれぞれの条件で、ガラクトース-Ura−His−Trp−Leu−プレートに平板培養した。LEU2を発現している約100コロニーを選別し、ガラクトース-Ura−His−Trp−プレート上にてX-gal試験を行った。さらに分析を進めるために、Leu−プレート上での増殖およびβ-ガラクトシダーゼの発現の両方に関して安定したガラクトース依存性を示すか否かに基づいて40コロニーを選別した(「Gyurisら、Cell 75:791〜803, 1993」;「Zervosら、Cell 72:223〜232, 1993」)。cDNAプラスミドを大腸菌MC1063/P3の形質転換によって回収し、相互作用の特異性を検討するために、LexA-RXR、LexA単独、またはLexA-Cdc2などのその他のキメラ体を発現している宿主菌株に再導入した(Gyurisら、Cell 75:791〜803, 1993)。LexA-RXRと特異的に相互作用する候補を選び出し、標準的なジデオキシヌクレオチド法により、プライマーを用いてB42転写ドメインの融合部位からの塩基配列を決定した。塩基配列情報および制限酵素分解パターンに基づき、候補となるクローンをいくつかのクラスに分類した。いくつかの場合では、さらに広範囲の塩基配列情報を入手した。こうして得た塩基配列を用いて、配列データベースを検索した。RIP14およびRIP15の全長のcDNAを含むクローンを単離するために、ランダムプライミング法によって[32P]標識化したRIP14およびRIP15の断片を用いる通常のハイブリダイゼーション法により、標準的手順を用いてCDM8プラスミド内に構築されたマウス肝臓DNAライブラリーのスクリーニングを行った。
8H18-34 lacZレポータープラスミドを含むEGY48誘導物に対して、LexAおよびB42-融合タンパク質発現ベクターによる形質転換を施すことにより、それぞれのLexA融合体およびB42融合体を同時発現する一連の菌株を作製することができる。それぞれの同時発現菌株に対して、グルコース-Ura−His−Trp−プレートから得た少なくとも2つの別個のコロニーを無作為に選択し、B42融合タンパク質の発現を誘導するためにガラクトース-Ura−His−Trp−液体培地に接種した(Gyurisら、Cell 75:791〜803, 1993)。記載された方法(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Assoc., New York, 1994)に従って、培養物中のβ-ガラクトシダーゼの量を測定した。
指定の組織(Clontech, Inc. Palo Alto, CA)から採取した2μgのポリA+mRNAを含むノーザンブロットを、標準的手順によるランダムプライミング法(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Assoc. New York, 1994)を用いて標識したプローブとハイブリダイズさせた。
10%牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地にて、HepG2細胞を増殖させた。トランスフェクションは、記載された方法により(Baesら、Mol. Cell. Biol. 14:1544〜1552, 1994)、同じ培地中または活性炭吸着血清を添加した培地中において、リン酸カルシウム沈殿を用いて実施した。HepG2細胞を6穴培養プレート上に平板培養し、完全型のRIPを発現するプラスミド1μg、RXRαベクター0.25μg(添加または非添加のいずれか)、およびβRAREを3コピー含むレポータープラスミド1.5μg(Baesら、Mol. Cell. Biol. 14:1544〜1552, 1994)による同時トランスフェクションを行い、内部標準として2μgのpTKGHを加えた。pTKGHから発現した成長ホルモンの量により、ルシフェラーゼ活性を標準化した。トランスフェクションはそれぞれ2回ずつ行った。
T7プロモーターの後に続いてRIP遺伝子を含む発現ベクターを用いて、インビトロ翻訳(Promega TNT, Madison, WT)により、RIP14およびRIP15を産生させた。全長のRIP14-2構築物を作製するために、Eドメインの中央部から3'端までの領域を含む、RIP14-1のクローン15から得た断片によって、RIP14-2のクローン3または12のそれぞれの対応領域を置換した。DNA塩基配列決定法によって塩基配列を決定した。バクテリオファージT7プロモーターをベースとする細菌発現ベクターを用いて、大腸菌内でヒトRXRαタンパク質を発現させた(Carterら、Mol. Cell. Biol. 印刷中、1994)。ゲルシフト分析に用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである。β-RARE、5' gatccgggtagGGTTCAccgaaAGTTCActcga 3'(配列番号:11)、5' ctagacaagGGTTCAaTGCACTtgtccatcg 3'(配列番号:12)。AGGTCA(配列番号:13)共通配列の1本鎖またはその相補鎖と適合する六量体を利用した。[32P]ATPおよびキナーゼを用いて2本鎖オリゴヌクレオチドを末端標識化し、ゲル濾過法によって遊離ヌクレオチドを除去した。タンパク質は、20μlのゲルシフト分析用緩衝液(10mM トリス(pH8.0)、40mM KCl、0.05% NP-40、10%グリセリン、1mM DTT、2.5mM MgCl2およびポリdI-dC 5ng)中にて、氷上で10分間プレインキュベートした。この混合物に指定の標識プローブを添加し、室温で20分間インキュベートした。プローブとともに特異的または非特異的な競合性オリゴマーも添加した。この混合物を、4℃の0.5X トリス-ホウ酸-EDTA緩衝液(TBE)を用いる6%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
RXR-相互作用性タンパク質をコードするcDNAを単離することにより、それらのリガンドの同定および単離が可能になる。
RXR-相互作用性タンパク質を同定することにより、そのDNA結合部位の同定も容易になる。一つの手法としては、ゲルシフト分析、例えば、RIP14およびRIP15の結合部位の同定のために用いた上記の方法などによってDNA結合部位を同定してもよい。また、トランス活性化解析を用いることもできる。簡単にいえば、候補となるDNA結合部位を、その発現を測定することができる標的遺伝子の上流に挿入し、下流の遺伝子の発現を活性化する能力として、RXR-相互作用性タンパク質がDNA部位に結合する能力を解析する。
新規な特性を有する受容体を産生するために、RXR-相互作用性タンパク質の機能ドメインを、核内ホルモン受容体ファミリーのその他のメンバーのドメインと交換することができる(例えば、Evansら、国際公開公報第90/11273号;Evans, Science 240:889, 1988を参照)。例えば、あるRXR-相互作用性タンパク質のDNA結合ドメインと、グルココルチコイド受容体のリガンド結合ドメインおよび遺伝子活性化ドメインとを融合することにより、RIP結合部位の下流にある遺伝子のホルモン性調節が可能になると考えられる。また、RXR-相互作用性タンパク質のDNA結合ドメインと、トランス抑制性ドメイン(例えば、Evansら、国際公開公報第90/14356号)とを融合することにより、RIP結合部位の上流にある遺伝子の発現の基底レベルが抑制される。キメラ型RIP受容体に含めることができる受容体ドメインの例は、Evansら(国際公開公報第90/15815号)およびEvansら(Science 240:889, 1988)に記載されている。受容体融合遺伝子の構築は、分子生物学の標準的手法を用いて行った。
RIPの正常な活性を妨げるRXR-相互作用性タンパク質の変異体を作製することができる。このような変異体は「ドミナントネガティブ」と呼ばれ、少なくとも2つのクラスに分類される。(a)DNA結合部位に結合する(それにより、野生型のRXR-相互作用性タンパク質が同一部位に結合することを妨げる)が、リガンド依存的な遺伝子発現を活性化しないもの、および(b)その他の受容体(例えば、RXR)とヘテロ二量体を形成するが、野生型のヘテロ二量体に伴ってみられる生体反応を促進しないもの。
RXR-相互作用性タンパク質をコードする遺伝子を単離することにより、RIPの発現を増強または低下させる分子の同定も容易になる。一つの方法として、候補となる分子(例えば、細胞抽出物、哺乳類血清、または哺乳類細胞を培養していた増殖培地などから見いだされた、ペプチドまたは非ペプチド分子など)を種々の濃度で、RIP mRNAを発現する細胞を含む培地に添加する。それから、ハイブリダイゼーション用プローブとしてRIP cDNAを用いる、標準的なノーザンブロット解析(Ausubelら、前記)によってRIPの発現を測定する。候補分子の存在下におけるRIPの発現レベルを、候補分子の非存在下における同一培地中の同じ細胞の発現レベルと比較する。RIPの発現の増強または低下を促進した分は、本発明において利用可能であると考えられる。
一般的に、本発明に関するRXR-相互作用性タンパク質は、適した宿主細胞に対して、RXR-相互作用性タンパク質をコードするcDNA断片(例えば、上記のcDNA)の全体または一部を適した発現用媒体に収めたものによって形質転換を施すことにより、産生することができる。
ヒトRXR-相互作用性タンパク質(または免疫原性の断片もしくは類似体)を、本発明に有用な抗体を作製するために用いることができる。このようなポリペプチドは、組換えまたはペプチド合成技術によって産生することができる(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 前記およびAusubelら、前記を参照)。このペプチドは、Ausubelら(前記)に記載されているKLHなどの輸送タンパク質と結合したものでもよい。KLH-ポリペプチドは、フロイントアジュバントと混合し、モルモット、ラット、または好ましくはウサギに注入する。ペプチド抗原アフィニティクロマトグラフィーによって、抗体を精製することもできる。
本明細書に記載したタンパク質は、レチノイドX受容体と相互作用し、これにより、RXRの機能を媒介または調節すると考えられる。特殊な例において、RIP14およびRIP15はRXR依存的なβRARE結合遺伝子の活性化を阻害し、そのようなタンパク質(またはこれらのタンパク質に由来するペプチド、特にRXRと相互作用することができる短いペプチド)により、RXR機能の薬理学的調節因子の産生が容易になると考えられる。本発明のこのような治療用ポリペプチドは、RXRの機能を調節するために有効な用量で、例えば静脈内投与などのいかなる適した経路によっても投与することができる。
その他の態様において、本発明は、ヒトRXR-相互作用性タンパク質(図4、5、10、および11;配列番号:1〜5)と実質的に同一な、いかなるタンパク質をも含む。このような相同体は、その他の実質的に純粋な天然の哺乳類RXR-相互作用性タンパク質(例えば、ヒトRXR-相互作用性タンパク質)のほか、対立遺伝子変異体、天然変異体、誘導変異体、極めて厳しい条件または厳しさの低い条件(例えば、少なくとも40ヌクレオチド長のプローブとともに40℃で2X SSCにより洗浄)において、図4、5、10、11に示したRXR-相互作用性タンパク質のDNA配列(配列番号:6〜9、14)のいずれかとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質、およびRXR-相互作用性タンパク質に対する抗血清、特にRXR-相互作用性タンパク質のRXR結合ドメインに対する抗血清に特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質を含む。また、この用語(相同体)は、RXR-相互作用性タンパク質の断片を含むキメラ型タンパク質を含む。
Claims (18)
- 実質的に純粋なRXR-相互作用性タンパク質。
- (a)図4に示すRIP14-1のアミノ酸配列(配列番号:1)、
(b)図4に示すRIP14-2のアミノ酸配列(配列番号:2)、
(c)図5に示すRIP15のアミノ酸配列(配列番号:3)、
(d)図10に示すRIP110のアミノ酸配列(配列番号:4)、または
(e)図11に示すRIP13のアミノ酸配列(配列番号:5)
と実質的に同一なアミノ酸配列を含む、請求項1記載のタンパク質。 - ポリペプチドが哺乳類由来のものである、請求項1記載のタンパク質。
- 哺乳類がヒトである、請求項3記載のタンパク質。
- ポリペプチドが、RXRの存在下においてβ-RAREと結合する、またはRXRの存在下においてEcRE部位と結合する、請求項1記載のタンパク質。
- 請求項1記載のタンパク質をコードする配列を含む精製されたDNA。
- DNAがヒトRXR-相互作用性タンパク質をコードする、請求項6記載の精製されたDNA。
- (a)図4に示すRIP14-1のDNA配列(配列番号:6)、
(b)図4に示すRIP14-2のDNA配列(配列番号:14)、
(c)図5に示すRIP15のDNA配列(配列番号:7)、
(d)図10に示すRIP110のDNA配列(配列番号:8)、または
(e)図11に示すRIP13のDNA配列(配列番号:9)
と実質的に同一なDNA配列を含む、請求項6記載のDNA。 - 請求項6記載の精製されたDNAを含むベクター。
- 請求項6記載の精製されたDNAを含む細胞。
- 細胞内において発現する位置にあるRXR-相互作用性タンパク質をコードするDNAによって形質転換された細胞を提供すること、DNA発現条件下において該形質転換細胞を培養すること、および該組換えRXR-相互作用性タンパク質を単離することを含む組換えRXR-相互作用性タンパク質の作製方法。
- 請求項6記載の精製されたDNAの発現によって産生されるRXR-相互作用性タンパク質。
- (a)(i)タンパク質結合部位に機能的に結合させたレポーター遺伝子と、
(ii)該タンパク質結合部位に特異的に結合することができる結合部分に共有結合したレチノイドX受容体タンパク質を含む第一の融合タンパク質を発現する第一の融合遺伝子と、
(iii)遺伝子活性化部分に共有結合した該被験タンパク質を含む第二の融合タンパク質を発現する第二の融合遺伝子とを含む宿主細胞を提供すること、
(b)該被験タンパク質が該レチノイドX受容体タンパク質と相互作用しうるか否かを示す指標として、該被験タンパク質が該レポーター遺伝子の発現を増強するか否かを判定することを含む、被験タンパク質にレチノイドX受容体(RXR)タンパク質と相互作用する能力があるか否かを判定する方法。 - レチノイドX受容体と結合するリガンドで宿主細胞を処理すること、および該細胞の該リガンドによる処理後にレポーター遺伝子の発現を増強する能力によってリガンド依存的相互作用性タンパク質を同定することをさらに含む、請求項13記載の方法。
- レチノイドX受容体と結合するリガンドで宿主細胞を処理すること、および該リガンドの処理下および非処理下の両方においてレポーター遺伝子の発現を増強する能力によってリガンド非依存的相互作用性タンパク質を同定することをさらに含む、請求項13記載の方法。
- レチノイドX受容体と結合するリガンドで宿主細胞を処理すること、および該リガンドの処理下ではなく、非処理下において、レポーター遺伝子の発現を増強する能力によってリガンド感受性相互作用性タンパク質を同定することをさらに含む、請求項13記載の方法。
- 遺伝子活性化部分がB42の遺伝子活性化部分である、請求項13記載の方法。
- リガンドが9-cis-RAである、請求項14記載の方法。
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