KR100492514B1 - 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를가지는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법 - Google Patents

레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를가지는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100492514B1
KR100492514B1 KR10-2002-0024474A KR20020024474A KR100492514B1 KR 100492514 B1 KR100492514 B1 KR 100492514B1 KR 20020024474 A KR20020024474 A KR 20020024474A KR 100492514 B1 KR100492514 B1 KR 100492514B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
retinoic acid
cell line
reporter gene
luciferase
gene
Prior art date
Application number
KR10-2002-0024474A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20030086102A (ko
Inventor
서판길
류성호
신금주
김선희
Original Assignee
학교법인 포항공과대학교
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 학교법인 포항공과대학교 filed Critical 학교법인 포항공과대학교
Priority to KR10-2002-0024474A priority Critical patent/KR100492514B1/ko
Publication of KR20030086102A publication Critical patent/KR20030086102A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100492514B1 publication Critical patent/KR100492514B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 레티노산 (retinoic acid)에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트, 그의 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산 유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법에 관한 것으로, 본 발명의 검색방법은 레티노산에 민감하게 반응하는 형질전환 세포주를 이용하므로 레티노산 유사물질에 의한 리포터 유전자 발현량의 증가와 저해물질에 의한 리포터 유전자 발현량의 감소를 통해 레티노산 유사물질 및 저해물질을 적은 비용으로 신속하고 간단하게 검색하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 가지는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산 유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법{TRANSFORMANT HAVING A RECOMBINANT REPORTER GENE WHOSE EXPRESSION BEING REGULATED BY RETINOIC ACID AND METHOD FOR SCREENING ANALOGUE AND INHIBITOR OF RETINOIC ACID USING SAME}
본 발명은 레티노산 (retinoic acid)에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트, 그의 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산 유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법에 관한 것이다.
레티노산 (retinoic acid, RA)은 망막 기능 조절과 상피세포 성장 및 분화 그리고 면역기전 조절 작용을 하는 비타민 A의 전구체로서 항균 작용과 항암 작용 효과를 가지고 있어 실제 질병 치료에 이용되고 있는 물질이다 (Kasza A, et al., Biol. Chem. Hoppe. Seyler, 375(11):779-783, 1994; Bulengo-Ransby S. M., et al., Engl. J. Med. 328(20):1438-1443, 1993; Nehme A, et al., Br. J. Cancer 84(11):1571-1576, 2001). 그러나, 과다한 레티노산의 인체 유입에 의해 식욕부진, 피부 붉은 반점 및 건조, 과칼슘증, 간 장애를 유발할 수 있으며, 특히 발달과정에서 레티노산에 지나치게 노출될 경우 중추 신경계 이상, 뇌수종 등의 기형을 유발할 수 있다 (Burney I. A., et al., J. Pak. Med. Assoc. 48(2):54-55, 1998; Bernstein A. L., et al., Ann. Intern. Med. 124(2):227-228, 1996).
레티노이드는 천연 및 합성 화합물을 포함하는, 비타민 A와 구조적으로 관련되어 있는 화합물의 한 계열이다. 일련의 레티노이드들은 피부학적 및 종양학적 질환의 치료에 임상적으로 유용한 것으로 밝혀져 있다. 레티노산 및 그의 레티노이드 유사체 (9-시스 RA, 모두 트랜스 형태의 3,4-디데하이드로 [didehydro] RA, 4-옥소 RA 및 레티놀)는 광범위한 염증세포, 면역세포 및 구조세포의 구조와 기능을 조절하는 다형질발현성 조절 화합물이다. 이들은 폐 상피세포의 증식, 분화 및 형태형성의 중요한 조절자로서, 스테로이드/티로이드 수용체 상군 (superfamily)에 속하는 리간드 유도성 전사 인자들인 일련의 핵 수용체들을 통해 생물학적 활성을 발휘한다. 레티노이드 수용체는 2가지 군, 즉 레티노산 수용체 (RAR) 군 및 레티노이드 X 수용체 (RXR) 군으로 분류되는데, 이들 군은 각각 3개의 구별되는 서브타입 (α, β 및 γ)으로 구성되어 있다. 레티노산 수용체 (retinoic acid receptor, RAR) 군의 각 서브타입의 유전자는 2개의 일차 RNA 전사물의 특이한 분할에서 생성되는 여러 아이소폼 (isoform)을 암호화한다. 모두-트랜스 형태의 레티노산 (all-trans retinoic acid; ATRA 또는 RA)은 RAR의 생리학적 호르몬이며, 상기 3가지 RAR 서브타입 모두에 대해 대략 동일한 친화성으로 결합한다. 레티노이드 X 수용체는 모두-트랜스 형태의 레티노산에 결합하지 않지만, 대신 레티노산의 9-시스 이성질체에 결합한다.
레티노이드 수용체에 대해 길항 활성을 갖는 레티노이드 (레티노이드 길항제)는 세포 증식의 저해, 세포 분화의 유도 및 혈관생성의 저해에서와 같이, 레티노이드 수용체에 대해 작용 활성을 갖는 레티노이드 (레티노이드 작용제)의 수많은 특성들을 상쇄시키는데 효과적이며 (Bollag et al., Int. J. Cancer 70:470-472, 1997), 레티노이드 작용제의 독성 효과를 억제하는데 효과적이다 (Standeven et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 138:169-175, 1996).
따라서, 망막의 기능, 상피세포의 성장과 분화, 면역기전의 조절 작용을 하는 레티노산과 유사한 작용을 하는 물질은 이들 생리현상을 조절하는 유용한 물질로 활용이 가능하다. 반면, 레티노산이 과도한 경우에는 피부의 붉은 반점 및 건조, 과칼슘증, 간 장애 및 발달과정에서 중추 신경계 이상, 뇌수종 등의 기형을 유발할 수 있으므로 이와 유사한 작용을 나타내는 환경 오염물질을 확인하는 것은 이들 물질의 독성 파악 및 작용기전의 이해에 도움이 될 것이다. 또한, 레티노산 작용을 억제할 수 있는 저해물질을 검색함으로써 과량의 레티노산에 의해 나타나는 병리현상을 억제하는데 활용될 수 있다.
본 발명자들은 독성이 매우 강한 환경 오염물질인 다이옥신류 및 다양한 내분비계 장애를 일으키는 에스트로겐 유사물질을 검출하는데 있어서, 각각 리포터 유전자가 결합된 다이옥신 반응성 서열 및 에스트로겐 반응성 서열을 포함하는 형질전환 세포주를 이용하여 다양한 환경시료 중에 존재하는 다이옥신류 및 에스트로겐 유사물질을 분석하는 생물학적 검색방법을 개발한 바 있다 (대한민국 특허공개 제 2001-46920 호 및 제 2001-81766 호).
이에, 본 발명자들은 레티노산과 유사한 작용기전으로 세포 내 유전자 발현을 유도하는 유사물질 또는 레티노산에 의한 유전자 발현을 억제하는 저해물질 및 내분비계 장애물질 (일명, 환경호르몬)을 검색할 수 있는 생물학적 검색방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 레티노산 수용체에 루시퍼라제 유전자가 결합되어 레티노산에 의해 발현이 조절되면서 발현된 단백질의 양을 쉽게 측정할 수 있는 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 제작하고, 이를 형질전환시킨 세포주에 다양한 화합물을 처리한 후 레티노산에 의해 유도된 루시퍼라제의 발현을 효소활성을 통해 측정하여 레티노산에 대한 유사물질 및 저해물질을 용이하게 선별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 여러 생리 현상에 관련되어 있는 레티노산에 대한 유사물질 및 저해물질을 간단하고 경제적으로 선별할 수 있는 생물학적 검색방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 포함하는 형질전환 세포주를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 이용하여 레티노산에 대한 유사물질 및 저해물질을 선별하는 생물학적 검색방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
우선, 본 발명에서는 레티노산에 의하여 발현이 조절되는 단백질의 조절 영역에 존재하는 레티노산 반응 요소 (retinoic acid response element, RARE)를 발현정도를 측정하기 용이한 리포터 유전자와 융합시켜 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 제작한다.
레티노산은 세포 내에 있는 수용체 (retinoic acid receptor)와 결합하여 DNA의 특정 염기 서열 즉, RARE를 인식하여 결합한다 (Zhang X. K., et al., Cancer Res. 54(21):5663-5669, 1994; Chu F. F., et al., J. Nutr. 129(10):1846-1854, 1999). 이러한 유전자와 단백질의 결합은 특정 단백질의 전사를 증가시키고 이를 통해 레티노산에 의한 세포반응을 유도한다 (Chu F. F., et al., J. Nutr. 129(10):1846-1854, 1999; Kogai T, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15):8519-8524, 2000). 그러므로, RARE에 의해 조절되는 유전자의 발현량을 측정함으로써 레티노산 유사물질 및 저해물질을 검색할 수 있다. 즉, 레티노산 유사물질은 유전자의 발현량을 증가시킬 것이고 저해물질은 레티노산에 의한 유전자 발현량을 감소시킬 것이며, 이를 통해 이들 물질의 생물체에 미치는 영향을 간접적으로 예측할 수 있다.
이에 본 발명에서는 레티노산이 세포 내 수용체와 결합한 후 인식하게 되는 DNA 특정 염기서열 중 TREpal (palindromic TRE) 부분을 레티노산에 의해 발현이 조절될 수 있는 유전자로 선택하였다. 상기 TREpal은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지며 프로모터라기보다는 증진자 (enhancer)로서 작용한다.
본 발명의 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트에 사용될 수 있는 리포터 유전자로는 루시퍼라제 (luciferase), 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase), CAT (Chloramphenicol acetyl transferase) 또는 갈락토시다아제 (galactosidase) 등이 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 TREpal 유전자에 루시퍼라제 유전자를 결합시켜 TREpal-루시퍼라제 재조합 유전자 컨스트럭트를 제작한다 (도 2a 참조).
또한, 본 발명은 상기 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 포함하는 형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명의 형질전환 세포주는 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트, 바람직하게는 TREpal-루시퍼라제 유전자 컨스트럭트를 포함하고 있어 레티노산의 유사물질 및 저해물질의 선별에 유용하게 사용될 수 있다.
즉, 상기 형질전환 세포주에 다양한 화합물을 처리하여 배양한 후 이로부터 분리한 단백질에 루시퍼라제의 기질을 첨가하면 루시퍼라제의 발현량에 비례하여 효소-기질 반응에 의한 발광반응이 나타나게 되고, 발광반응의 증감을 통해 대상 화합물이 레티노산의 유사물질인지 저해물질인지를 검색할 수 있다.
생물체에 유입된 레티노산 유사물질 및 저해물질은 레티노산 수용체에 작용하여 그 효과를 나타내므로 본 발명의 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트가 형질전환될 숙주 세포주는 레티노산 수용체를 과량으로 발현하는 세포주로서 인체 신경아세포, 인체의 간세포, 원숭이 신장세포 등이 사용될 수 있고, 특히 인체 신경아세포주가 바람직하다.
구체적으로, 상기 형질전환 세포주는 본 발명의 TREpal-루시퍼라제 결합 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 포함하는 플라스미드와 세포주 선별을 용이하게 하는 항생제 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를 전기천공 (electrophoration) 방법으로 인체 신경아세포주에 동시-형질전환한 후 상기 플라스미드가 세포 내로 들어간 것을 항생제 내성으로 확인하여 선별한다. 이와 같이 선별된 본 발명의 형질전환 세포주는 SK-N-Be(2)C/pTRE-Luc라 명명되어 2001년 11월 16일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁되었다 (수탁번호: KCTC 10117BP).
아울러, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 이용하여 레티노산에 대한 유사물질 및 저해물질을 선별하는 생물학적 검색방법을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 과정으로 제작된 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 세포주를 이용하여 레티노산을 처리하였을 때 리포터 유전자의 단백질 산물의 발현 정도를 측정함으로써 특정 화합물이 레티노산의 유사물질 또는 저해물질로 작용하는지를 검색할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 검색방법은
1) 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트 및 이를 포함하는 형질전환 세포주를 제조하는 단계;
2) 상기 형질전환 세포주에 레티노산과 검색 대상 화합물을 처리하여 배양하는 단계;
3) 상기 배양액으로부터 단백질을 분리하는 단계;
4) 분리된 단백질에 리포터 유전자의 기질을 첨가하여 효소-기질 반응을 유도하는 단계; 및
5) 상기 효소-기질 반응에 의해 생성된 발광정도를 측정하는 단계를 포함한다 (도 1 참조).
생물체로 유입된 레티노산 유사물질 또는 저해물질은 레티노산 수용체에 작용하여 그 효과를 나타내게 되므로 단계 1)에서는 레티노산 수용체를 과량 발현하도록 유전자 조작된 형질전환 세포주를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 유전자 재조합 기술을 이용하여 레티노산 수용체가 인지하는 유전자 서열인 TREpal에 루시퍼라제 리포터 유전자를 융합시켜 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 제작하고 이를 인체 신경아세포에 형질전환한 후 레티노산에 특이적으로 반응하는 세포군을 선택적으로 증식시켜 형질전환 세포주를 선별한다.
선별된 형질전환 세포주에 검색 대상물질을 처리하여 배양한 후 이들 세포로부터 분리한 단백질에 루시퍼라제의 기질을 첨가하여 생성된 빛의 세기를 측정함으로써 루시퍼라제의 발현량을 조사하여 검색 대상물질이 레티노산의 유사물질인지 혹은 저해물질인지를 검색한다.
본 발명에서는 바람직한 일예로서 모두-트랜스 형태의 레티노산을 이용하여 상기 검색방법을 검증한다. DMSO (dimethylsulfoxide)에 용해시킨 상기 레티노산을 배양액에 희석하여 형질전환 세포주에 24시간 동안 처리한 후 원심분리하여 세포를 회수하고 계면활성제로 세포막을 용해시키고 균질화하여 단백질만을 분리한다. 분리된 단백질에 루시퍼라제의 기질인 루시페린을 첨가하여 효소-기질 반응에 의해 생성되는 빛을 광측정기 (luminometer)로 측정함으로써 레티노산의 처리 농도에 따라 루시퍼라제의 발현량이 증가함을 확인한다.
이와 같이 본 발명의 형질전환 세포주를 이용한 레티노산 유사물질 및 저해물질 검색방법은 조작이 단순하고 간편하며 검색 비용이 저렴하다. 특히, 한번에 수백 내지 수만 개의 물질을 검색할 수 있으므로 방대한 물질 검색에 적당하고 레티노산 유사물질 및 저해물질의 세포 내 작용 기전을 이용하므로 생물체에 미치는 영향을 동시에 예측할 수 있는 이점을 가지고 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트의 제작
레티노산 수용체가 인지하는 유전자 서열로서 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 TREpal 올리고뉴클레오티드를 주문 제작하였고 (제노텍사), 루시퍼라제 유전자는 pGL2-프로모터 벡터 (Promega사)에 제한효소 SmaI을 처리하여 얻은 DNA 절편을 송아지 소장 알칼라인 포스파타아제 (calf intestinal alkaline phosphatase)로 처리하여 평활 말단 (blunt end)으로 만들었다. 상기 두 유전자를 연결 (ligation)하여 TREpal-루시퍼라제 융합 유전자를 포함하는 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트 pTREpal-Luc.를 만들었다. 이를 제한효소 Ⅱ를 이용한 절단 분석 (digestion analysis)으로 TREpal 유전자와 루시퍼라제 유전자가 연결되었음을 확인하였다 (도 2a).
<실시예 2> 형질전환 세포주의 제조
(2-1) 인체 신경아세포의 배양
인체 신경아세포주인 SK-N-Be(2)C 세포 (ATCC CRL-2268)를 10% BCS (bovine calf serum)를 포함한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Biowhittaker사)을 배양액으로 37℃, 5% CO2가 유지되는 세포 배양기에서 배양하였다. 배양액은 이틀에 한 번씩 교체하고 세포를 분주할 때에는 0.25% 트립신 (trypsin)-EDTA를 넣고 배양접시에서 떼어낸 후 2 내지 4개로 나누었다.
(2-2) pTREpal-Luc.를 가지는 형질전환 세포주의 제조
실시예 (2-1)에서와 같이 배양된 인체 신경아세포 1 ×107 세포에 상기 실시예 1에서 제작된 플라스미드 pTREpal-Luc. 30 ㎍과 플라스미드 pcDNA 3.1(+) (Invitrogen사) 3 ㎍을 칼슘 인산 동시-침전방법 (calcium phosphate coprecipitation, Hofman K., et al., Mol. Cell Endocrinol. 25;168(1-2):21-9, 2000)으로 동시-형질감염시켰다. 이때, 플라스미드 pcDNA 3.1(+)는 형질전환 세포주의 선별을 용이하게 하기 위하여 네오마이신 저항성 유전자 (neomycin resistant gene)를 포함한다. 37℃, 5% CO2 조건하에 48시간 동안 배양한 후 750 ㎍/㎖의 G418 (neomycin) (Calbiochem사)을 처리하여 재조합 유전자로 형질감염되지 않은 세포를 제거하였다. 재조합 유전자가 삽입된 세포는 pcDNA 3.1(+)에 있는 네오마이신 저항성 유전자로 인해 살아 남게 된다.
단일 세포가 만든 세포군을 얻어 96 웰 플레이트 (well plate)로 옮겨 증식시킨 후 세포수가 증가하면 각 세포군을 두 개의 새로운 웰에 나누고 DMSO (0.1%), 5 μM 모두-트랜스 레티노산 (Sigma사)을 각각 24시간 동안 처리한 후 세포 단백질을 얻어 루시퍼라제 효소 활성 측정을 통해 pTREpal-Luc. 유전자가 세포 내로 들어가 기능을 발휘하는 세포군만을 선별하였다.
이와 같이 선별된 재조합 리포터 유전자를 포함하는 본 발명의 형질전환 세포주는 SK-N-Be(2)C/pTRE-Luc라 명명되어 2001년 11월 16일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁되었다 (수탁번호: KCTC 10117BP).
<실시예 3> 레티노산 유사물질의 검색
본 발명의 형질전환 세포주를 이용하여 레티노산 유사물질을 검색할 수 있는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
(3-1) 레티노산 처리에 따른 루시퍼라제 발현량의 변화
상기 실시예 2에서 선별된 형질전환 세포주 1×104 세포/㎖를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 24시간 동안 배양한 후 DMSO (0.1%)에 각각 10-10, 10-9, 10 -8, 10-7, 10-6, 10-5 및 10-4 M 농도로 용해시킨 모두-형태의 레티노산을 24시간 동안 처리하였다. 처리 후 배양액을 흡입 제거하고 DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 2회 세척하였다. 여기에 50 ㎕의 완충용액 (비이온성 계면활성제, 1% Triton X-100, 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM DTT)을 넣고 세포를 용해시켰다. 이 중 10 ㎕를 취해 12×75 보로실리케이트 (borosilicate) 튜브에 넣고 루시퍼라제의 기질인 루시페린 (Pharmacia사) 50 ㎕와 혼합하여 효소-기질반응을 일으킨 후 생성되는 빛을 광측정기로 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 재조합 리포터 유전자를 포함하는 본 발명의 형질전환 세포주는 레티노산의 처리에 의해 루시퍼라제의 발현량이 농도의존적 양상으로 증가됨을 알 수 있다.
(3-2) 레티노산 유사물질 검색
본 발명의 형질전환 세포주를 이용하여 레티노산 유사물질을 검색하기 위해 DMSO, 폴리염화페닐 (3,3,4,4-tetrachlorobiphenyl), 지람 (ziram), 사이람 (thiram), 아미트롤 (amitrol), 비스페놀 에이 (bisphenol A), 벤조 플로란텐 (benzo(k)fluoranthene) 및 아카세틴 (acacetin) 등의 검색 대상물질을 10 μM의 농도로 용매 DMSO에 용해시켜 24시간 동안 처리한 후 배양액을 흡입 제거하고 DPBS로 2회 세척하였다. 이 후 과정은 상기 실시예 (3-1)과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 검색 대상물질 중 폴리염화페닐 (3,3,4,4-tetrachlorobiphenyl)과 아카세틴 (acacetin)이 레티노산의 유사물질로 작용함을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 형질전환 세포주를 이용한 레티노산 유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법은 1) 조작이 간단하고 고가의 장비가 필요하지 않아 기본적인 세포 배양기술과 효소활성 측정 시스템만 있으면 쉽게 이용할 수 있고, 2) 저렴한 비용으로 일시에 다수의 물질을 검색할 수 있으며, 3) 레티노산 유사물질 및 저해물질을 모두 검색할 수 있고, 4) 레티노산과 유사작용을 나타내는 환경 오염물질의 세포독성을 확인할 수 있으며, 5) 감도가 매우 높은 특징을 갖는다.
도 1은 레티노산에 의해 발현이 조절되는 본 발명의 재조합 리포터 유전자를 가지는 형질전환 세포주를 이용하여 레티노산 유사물질 및 저해물질을 검색하는 과정을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에서 제작된 재조합 리포터 유전자 컨스트럭트를 포함하는 플라스미드 pTREpal-Luc.의 유전자 지도를 나타낸 것이고,
도 3은 레티노산에 의해 발현이 조절되는 본 발명의 재조합 리포터 유전자를 가지는 형질전환 세포주에서 모두-트랜스 레티노산 (all-trans retinoic acid)의 농도에 따른 루시퍼라제 발현량을 조사한 것이고,
도 4는 레티노산에 의해 발현이 조절되는 본 발명의 재조합 리포터 유전자를 가지는 형질전환 세포주를 이용하여 레티노산 유사물질 및 저해물질을 검색한 결과이다.
<110> Pohang University of Science & Technology <120> TRANSFORMANT HAVING A RECOMBINANT REPORTER GENE WHOSE EXPRESSION BEING REGULATED BY RETINOIC ACID AND METHOD FOR SCREENING ANALOGUE AND INHIBITOR OF RETINOIC ACID USING SAME <130> FPD/200111-0002 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> palindromic TRE oligonucleotide <400> 1 agctctcagg tcatgacctg aagct 25

Claims (10)

1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 TREpal (palindromic TRE)과 리포터 유전자가 융합된 유전자 컨스트럭트를 레티노산 수용체를 발현하는 세포주에 도입하여 형질전환 세포주를 제조하는 단계;
2) 상기 형질전환 세포주에 레티노산과 검색 대상 화합물을 처리하여 배양하는 단계;
3) 상기 배양액으로부터 단백질을 분리하는 단계;
4) 분리된 단백질에 리포터 유전자의 기질을 첨가하여 효소-기질 반응을 유도하는 단계; 및
5) 상기 효소-기질 반응에 의해 생성된 발광정도를 측정하는 단계를 포함하는, 레티노산 유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
리포터 유전자가 루시퍼라제 (luciferase), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase), CAT (Chloramphenicol acetyl transferase) 및 갈락토시다아제 (galactosidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검색방법.
제 1항에 있어서,
유전자 컨스트럭트가 도 2에 기재되는 유전자 지도를 갖는 TREpal-루시퍼라제인 것을 특징으로 하는 검색방법.
제 1항에 있어서,
단계 1)의 세포주는 TREpal-루시퍼라제가 형질전환된 인체 신경아세포주인 것을 특징으로 하는 검색방법.
제 1항에 있어서,
단계 4)의 기질이 루시퍼라제에 대한 루시페린인 것을 특징으로 하는 검색방법.
제 1항에 있어서,
단계 5)는 레티노산 유사물질 또는 저해물질에 의해 증가 또는 감소되는 루시퍼라제의 효소활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 검색방법.
서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 TREpal과 리포터 유전자가 융합된 유전자 컨스트럭트를 포함하고 도 2의 유전자 지도를 갖는 재조합 플라스미드 pTREpal-Luc.
TREpal-루시퍼라제 재조합 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 pTREpal-Luc.로 형질전환된 인체 신경아세포주 (수탁번호: KCTC 10117BP).
KR10-2002-0024474A 2002-05-03 2002-05-03 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를가지는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법 KR100492514B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0024474A KR100492514B1 (ko) 2002-05-03 2002-05-03 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를가지는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0024474A KR100492514B1 (ko) 2002-05-03 2002-05-03 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를가지는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030086102A KR20030086102A (ko) 2003-11-07
KR100492514B1 true KR100492514B1 (ko) 2005-06-03

Family

ID=32381470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-0024474A KR100492514B1 (ko) 2002-05-03 2002-05-03 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를가지는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100492514B1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR940014779A (ko) * 1992-12-21 1994-07-19 알퐁스 아아르 노에 레티노이드 x수용체 주동질 또는 길항질을 스크리닝하는 신규한 방법
WO1996021677A1 (en) * 1995-01-13 1996-07-18 The General Hospital Corporation Retinoid x receptor-interacting polypeptides and related molecules and methods
KR970009951A (ko) * 1995-08-10 1997-03-27 데니스 쉬미트 복합 활주 사접(斜接)톱의 오버라이드 분할 기구
US5707800A (en) * 1991-03-18 1998-01-13 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid response elements and assays employing same
US6027875A (en) * 1989-10-25 2000-02-22 The Salk Institute For Biological Studies Receptor infection assay

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6027875A (en) * 1989-10-25 2000-02-22 The Salk Institute For Biological Studies Receptor infection assay
US5707800A (en) * 1991-03-18 1998-01-13 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid response elements and assays employing same
KR940014779A (ko) * 1992-12-21 1994-07-19 알퐁스 아아르 노에 레티노이드 x수용체 주동질 또는 길항질을 스크리닝하는 신규한 방법
WO1996021677A1 (en) * 1995-01-13 1996-07-18 The General Hospital Corporation Retinoid x receptor-interacting polypeptides and related molecules and methods
KR970009951A (ko) * 1995-08-10 1997-03-27 데니스 쉬미트 복합 활주 사접(斜接)톱의 오버라이드 분할 기구

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030086102A (ko) 2003-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Townsley et al. Cyclic di-AMP acts as an extracellular signal that impacts Bacillus subtilis biofilm formation and plant attachment
Kedersha et al. Vaults. II. Ribonucleoprotein structures are highly conserved among higher and lower eukaryotes.
US5928888A (en) Methods and compositions for sensitive and rapid, functional identification of genomic polynucleotides and secondary screening capabilities
Heaslip et al. The motility of a human parasite, Toxoplasma gondii, is regulated by a novel lysine methyltransferase
Swevers et al. A cell‐based high‐throughput screening system for detecting ecdysteroid agonists and antagonists in plant extracts and libraries of synthetic compounds
Nakashima et al. Cycloheximide-induced phase shifting of circadian clock of Neurospora
JP2001314193A (ja) Ｉｃｒａｃ変調物質をスクリーニングする方法および組成物
St Leger et al. Second messenger involvement in differentiation of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae
WO2004016639A1 (en) Bmp-2 estrogen responsive element and methods of using the same
Caro et al. Plate-based transfection and culturing technique for genetic manipulation of Plasmodium falciparum
CN107164527B (zh) 一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法
Cao et al. The dissection of snares reveals key factors for vesicular trafficking to the endosome-like compartment and apicoplast via the secretory system in Toxoplasma gondii
Knudsen et al. Retinoid signaling in skeletal development: Scoping the system for predictive toxicology
CA2100582A1 (en) Response element compositions and assays employing same
Dolnick et al. A novel function for the rTS gene
Logan et al. Effects of ecdysone and juvenile hormone on DNA metabolism of imaginal disks of Drosophila melanogaster
KR100492514B1 (ko) 레티노산에 의해 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를가지는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 레티노산유사물질 및 저해물질의 생물학적 검색방법
KR100951656B1 (ko) 프로베네시드를 포함하는 ｔｒｐｖ２ 활성제
Fallon et al. Depletion of host cell riboflavin reduces Wolbachia levels in cultured mosquito cells
Kulkarni et al. Form II of D1 is important during transition from standard to high light intensity in Synechococcus sp. strain PCC 7942
Harrington et al. Chondrocyte terminal differentiation, apoptosis, and type X collagen expression are downregulated by parathyroid hormone
Fallon Optimization of gene transfer in cultured insect cells
CN102181439B (zh) 细胞周期s期报告基因
Yokoyama et al. A lipochito‐oligosaccharide, Nod factor, induces transient calcium influx in soybean suspension‐cultured cells
Liu et al. Yersinia ruckeri strain SC09 restrains innate immunity to promote infection process in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) via the type IV secretion system (T4SS)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20090526

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee