KR20220105139A - Igsf4의 막 관통 도메인을 발현하는 t 세포 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IGSF4((immunoglobulin superfamily member 4)의 막 관통(transmembrane, TM) 도메인을 발현하는 T 세포, 이를 포함하는 흑색종의 예방 또는 치료용 조성물 및 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 IGSF4의 TM 도메인을 발현하는 T 세포는 TCR 결합활성(avidity)이 증가함에 따라 CD69 발현 및 사이토카인 방출이 증가하고, 세포 독성 활성이 증가하며, 전이성 콜로니 및 종양 크기를 감소시키는 바, 악성 종양의 예방 또는 치료 용도로 제공할 수 있다.

Description

IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포 및 이의 이용{T cells expressing the transmembrane domain of IGSF4 and use thereof}

본 발명은 IGSF4((immunoglobulin superfamily member 4)의 막 관통(transmembrane, TM) 도메인을 발현하는 T 세포, 이를 포함하는 흑색종의 예방 또는 치료용 조성물 및 세포치료제에 관한 것이다.

최근 활발히 연구되고 있는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)-조작된 T 세포는 특정 B 세포 악성 종양(malignancies)의 치료에 대한 현저한 결과를 나타내나, 이러한 접근법은 적격 종양 관련 항원 및 강력한 면역 억제성 종양 미세환경의 부족으로 인해 고형 종양에 대해 아직 성공적이지 않다. 또한 CAR은 세포 표면 구조만 인식하도록 제한되는 단점이 있다.

이와 대조적으로, TCR(T cell receptor)은 처리, 전달 및 제시되는 세포 표면 상의 펩티드/주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, p-MHC)로서 잠재적인 세포내 단백질의 전체 어레이를 허용할 수 있다. 따라서, 종양-침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)의 재활성화는 암 면역 요법에 대한 한가지 접근법이 될 수 있으며, T 세포가 종양 세포를 직접 죽이는 것을 목표로 한다(Lee HJ, et al. Expansion of tumor-infiltrating lymphocytes and their potential for 526 application as adoptive cell transfer therapy in human breast cancer. Oncotarget (2017) 527 8:113345-113359.). 그러나, TIL은 반응 속도 충분하지 않은 단점이 있으므로, TIL의 항 종양 활성을 강화시키는 새로운 메커니즘을 개발하는 것이 큰 관심의 대상이다.

TIL-기반 면역 요법의 주요 장애는 대부분의 종양 항원이 자가 기원이며 종종 돌연변이 되지 않는 것이다. TCR과 p-MHC 사이의 친화성은 일반적으로 항원 인식에서 가장 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 옴에 따라, TCR의 친화성 변형은 방향이 재지정된 T 세포의 항 종양 반응을 증가시키는 도구로 간주되어 왔다. 그러나, 친화성이 변형된 TCR의 치료적 적용은 임상 시험에서 예상치 못한 독성을 초래하였다. 따라서, 고친화성 TCR이 항 종양 활성을 매개하는데 입양 세포 요법(adoptive cell therapy, ACT)을 보다 효과적으로 만들 수 있는지는 회의적이다.

특히 문제가 되는 점은 TCR이 p-MHC에 대한 친화성이 매우 낮음에도 불구하고 T 세포가 어떻게 항원에 대한 높은 감도를 갖는지에 대한 것이다. 면역학자들은 TCR이 TCR 나노 클러스터라는 나노 크기 구조로 구성될 수 있다는 점을 고려하여 이 문제점을 해결하려고 노력했다. 이와 관련하여, TCR 나노 클러스터가 항원 자극 이전 T 세포보다 항원-경험 또는 기억 세포 상에 더 많이 존재한다는 것이 입증되었으며, 이는 사전-클러스터링에 의한 강력한 TCR 신호 전달의 기반을 시사하고, 더 나아가 항원성이 비교적 열악한 조건에서 TCR의 친화성보다는 결합활성이 TCR 신호 전달의 더 중요한 결정 인자임을 의미한다. 이전 연구에서는 TCR의 증가된 결합활성이 활성화된 T 세포에서 TCR의 가교 결합의 증가에 기인한다는 것을 입증하였다(Fahmy TM, et al. Increased TCR avidity after T cell 583 activation: A mechanism for sensing low-density antigen. Immunity (2001) 14:135-584 143.).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 세포내 부착 분자 패밀리의 한 멤버인 IGSF4(immunoglobulin superfamily member 4)이 막 관통(transmembrane, TM) 도메인을 통해 동종 이량체를 형성할 뿐만 아니라 세포 표면에서 IGSF4-CD3 ζ 다중-조립을 초래하는 CD3 ζ-쇄에 결합하며, IGSF4의 TM 도메인이 TCR 나노 클러스터를 증가시켜 결합활성(avidity)을 조절함으로써 TCR 신호를 향상시킴을 확인하였다. 뿐만 아니라, 이에 따라 IGSF4 TM 도메인에 의한 TCR 결합활성 조절이 in vitro 및 in vivo에서 CD8+ T 세포의 항 종양 활성을 강화하는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 IGSF4(immunoglobulin superfamily member 4)의 막 관통(transmembrane) 도메인을 발현하는 T 세포를 포함하는 흑색종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 흑색종의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 조성물 또는 상기 세포치료제 중 어느 하나를 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 흑색종의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 IGSF4(immunoglobulin superfamily member 4)의 막 관통(transmembrane, TM) 도메인을 발현하는 T 세포를 포함하는 흑색종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "IGSF4(immunoglobulin superfamily member 4)"는 세포내 부착 분자 패밀리의 한 멤버이다. 최초 보고에서, IGSF4는 비-소세포 폐암에서 종양 억제인자로 동정되었으며, 이후의 연구에서 정자형성세포(spermatogenic cells)의 세르톨리 세포 및 비만세포(mast cells)의 섬유아세포로의 부착에서 기능하고, 신경세포의 시냅스 형성을 촉진하는 것이 밝혀졌다. IGSF4 내 3개의 세포 외 도메인(domain)은 Ca2+-비의존적으로 동질적(homophilic) 또는 이질적(heterophilic) 상호작용을 매개한다. 세포질(cytoplasmic, CT) 도메인은 액틴 섬유와 연결하는 결합 모티프를 포함하지만, 막 관통(transmembrane, TM)의 기능은 알려져 있지 않다. 나아가, APC(antigen presenting cell) 상에서 IGSF4는 활성화된 세포 독성(cytotoxic) T 세포에서 주로 발현되는 수용체인 CRTAM(MHC class Irestricted T cellassociated molecule; Arase, etal., 2005)의 리간드로서 기능하고 활성화된 CD8+ T 세포에 의한 IFN- 및 IL-22 발현을 조절하는 것으로 알려져 있지만, T 세포와 관련된 IGSF4의 기능은 아직까지 규명되어 있지 않다.

본 발명에서 상기 IGSF4는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 동물 유래 IGSF4일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드/단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 아미노산 서열과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한없이 포함될 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 아미노산은 서열번호 1 및 상기 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 단백질' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 발명에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 IGSF4의 TM 도메인은 IGSF4에서 세포 외 도메인이 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 IGSF4의 TM 도메인은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드/단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명자들은 상기 IGSF4의 TM 도메인이 IGSF4-CD3 ζ 이량체(dimers)를 형성하는 His177 및 Asp36 간의 상호 작용을 통해 IGSF4가 CD3 ζ-쇄에 결합할 수 있도록 하며, GxxVA 모티프를 통해 동종 이량체(homo-dimer)를 형성하여 큰 TCR(T cell receptor) 클러스터를 구성함을 확인하고, IGSF4의 TM 도메인을 발현하는 T 세포를 제작하여 이의 항 종양 활성을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.

본 발명에서 상기 T 세포는 당업계에 알려진 T 세포라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 구체적으로 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포일 수 있고, 보다 구체적으로 CD8+ T 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포 외 도메인이 결여된 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포는 TCR 나노 클러스터를 증가시켜 이에 따라 T 세포 반응의 질에 있어 중요한 요소인 TCR의 결합활성(avidity)이 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "결합활성(avidity)"은 단백질 수용체와 이의 리간드 사이와 같은 개별적인 비공유 결합 상호 작용의 다중 친화도의 축적된 강도를 말하며, 일반적으로 기능적 친화도로 지칭된다. 상기 결합활성은 단일 상호 작용의 강도를 나타내는 친화도(affinity)와 구별된다.

상기 세포 외 도메인이 결여된 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포는 CD69 발현 및 사이토카인 방출이 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 사이토카인은 IFN-γ 또는 TNF-α 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포 외 도메인이 결여된 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포는 세포 독성 활성이 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 세포 외 도메인이 결여된 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포를 포함함에 따라, 전이성 콜로니를 감소시키거나 종양 크기를 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, IGSF4의 막 관통 도메인 유전자(IG4△EXT_GFP)를 포함하는 벡터로 형질전환되어 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 CD8+ T 세포(OTI(OT-I) IG4△EXT-CD8+ T 세포)를 OVA+-B16F10 흑색종 세포와 배양한 후 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 및 CD69 발현을 평가한 결과 CD69 발현 및 사이토카인 방출이 유의하게 상향 조절되고(도 4B), 세포 독성 활성이 향상되었음을 확인하였다(도 4C).

또한, OVA+-B16F10 흑색종 세포를 투여하여 제작한 전이 동물 모델에 OTI IG4△EXT-CD8+ T 세포를 투여한 결과 전이성 콜로니의 현저한 감소를 확인하였으며(도 4D), 동일한 방법으로 제작한 고형 종양 동물 모델에 OTI IG4△EXT-CD8+ T 세포를 투여한 결과 마우스의 평균 종양 무게가 감소한 것을 확인하였다(도 4E).

상기의 결과에서 CD8+ T 세포의 항 종양 활성이 강화된 것은 IGSF4 TM 도메인이 과발현됨에 따라 TCR 나노 클러스터가 증가되어 TCR 결합활성이 상향 조절되었기 때문이며, 이를 통해 IGSF4 TM 도메인을 과발현시킴으로써 생체 내에서 CD8+ T 세포의 항 종양 활성을 강화시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "흑색종(malignant melanoma)"은 멜라닌 색소를 만들어 내는 멜라닌 세포의 악성화로 생긴 종양을 의미한다. 상기 흑색종은 멜라닌세포가 존재하는 부위에서는 어디에서나 발생할 수 있으며 피부, 안구, 점막, 중추신경계에 발생할 수 있으나, 피부에서 발병하는 경우가 가장 많다. 상기 흑색종은 피부에 발생하는 암 가운데 악성도가 가장 높은 것으로 알려져 있다. 일반적으로 피부에 처음 발생하는 흑색종을 모양, 발생양상, 분포 등의 특성에 따라 악성 흑색점 흑색종, 표재확산 흑색종, 말단 흑색점 흑색종 또는 결절흑색종의 임상유형으로 분류할 수 있다. 흑색종은 피부암 중 전이를 가장 많이 일으키며 림프절, 뼈, 폐, 간, 비장, 중추신경계 등 어느 장기들로도 전이될 수 있으며 주위 피부로 전이될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 흑색종의 "예방(prevention)" 및/또는 "치료(treatment)"의 용도를 갖는다. 예방적 용도에 있어, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 기술된 질환 또는 증상을 가지고 있거나 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 개체에 투여될 수 있다. 치료적 용도에 있어, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 기술된 질환을 이미 앓고 있는 환자와 같은 개체에 본 발명에 기술된 질병 또는 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 위해 충분한 양으로 투여된다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질환 또는 증상의 심각도 및 경과, 이전의 치료, 개체의 건강 상태와 약물에 대한 반응성 및 의사 또는 수의사의 판단에 따라 달려있을 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포는 1 Х 10⁶ 내지 1 Х 10⁸ 개를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 조성물은 흑색종의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고 투여 가능하다. 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 상기 약학적 조성물은 정맥 내, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 0.001 내지 1,000 mg/kg의 농도, 구체적으로는 0.05 내지 1,000 mg/kg의 농도, 보다 구체적으로는 1 내지 100 mg/kg의 농도로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태는 상기 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 흑색종의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.

여기에서 사용된 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "세포 치료(Cell therapy)"는 살아있는 세포를 환자에게 직접 주입하는 치료를 의미하며, "세포치료제(Cell therapeutics)"는 상기 세포 치료에 사용하는 살아있는 세포를 의미한다. 상기 세포치료제는 의약품 등의 안전에 관한 규칙에서는 살아있는 자가세포, 동종세포 또는 이종세포를 체외에서 배양, 증식하거나 선별하는 등 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품으로 규정된다.

본 발명의 세포치료제는 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 세포치료제에 포함되는 유효성분 및 상기 유효성분에 포함되는 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 세포치료제 총 중량에 대하여 유효성분은 1 중량% 내지 100 중량%, 바람직하게는 10 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있으며, 상기 유효성분 내 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포는 1 Х 10⁶ 내지 1 Х 10⁸ 개를 포함할 수 있다.

상기 세포치료제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 세포치료제의 제제화에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 세포치료제는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있으며 단일 또는 다중 투여할 수 있다.

상기 세포치료제는 정맥 내, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 세포치료제는 일반적으로 0.001 내지 1,000 mg/kg의 농도, 구체적으로는 0.05 내지 1,000 mg/kg의 농도, 보다 구체적으로는 1 내지 100 mg/kg의 농도로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 약학적 조성물 또는 상기 세포치료제 중 어느 하나를 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 흑색종의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "개체"는 흑색종이 발생하였거나 발생할 수 있는 가능성이 있는 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물을 흑색종의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 개체는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 동물, 조류 및 어류 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 흑색종의 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 상기 약학적으로 유효한 양은 전술한 바와 같다.

본 발명에 따른 IGSF4의 TM 도메인을 발현하는 T 세포는 TCR 나노 클러스터를 증가시키고, 이에 따라 TCR 결합활성(avidity)이 증가함에 따라 CD69 발현 및 사이토카인 방출이 증가하고, 세포 독성 활성이 증가하며, 전이성 콜로니 및 종양 크기를 감소시키는 바, 악성 종양의 예방 또는 치료 용도로 제공할 수 있다.

도 1 (A)는 야생형 또는 IGSF4 Tg 마우스로부터의 나이브(Naive) OTII(OT-II) TCR CD4+ T 세포를 지시된 농도의 OVA 펩티드 323-339로 자극하였다. 상청액 중의 IL-2 및 IFN-γ 분비 수준은 자극 후 24 시간에 ELSA에 의해 평가되었다. 데이터는 3 가지 실험의 평균±SEM을 나타낸다. *P <0.001 대 야생형(+/+). (B)는 IGSF4_GFP를 발현하는 Jurkat T 세포를 GFP 강도에 기초한 유세포 분석법에 의해 JTlow, JTmiddle 및 JThigh로 분류하고 공초점 현미경으로 확인한 각 세포주의 형광 및 DIC(differential interference contrast) 이미지이다. (C)는 (B)로부터의 각 세포주를 항-CD3/28로 자극한 후, pCD3 ζ 또는 t-CD3 ζ(Top)에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅 결과이다. (D)는 항-CD3/28로 각 세포주를 자극 후 상청액에서의 IL-2 분비 수준을 평가한 결과이다. 데이터는 3 가지 실험의 평균±SEM을 나타낸다. *P <0.001 vs. GFP
도 2 (A)의 왼쪽은 IGSF4의 결실 및 교환 돌연변이체를 보여주는 개략도이며, TM의 흑색 및 주황색은 각각 IGSF4(IG4) 및 CD43의 TM 영역을 나타낸다. 중간은 빈 벡터(EV), wt-IG4 또는 HEK293T 세포에서 공동 발현 된 CD3 ζ를 포함하는 돌연변이체의 면역 침전 및 면역 블롯팅 결과이다. 오른쪽은 항-CD3/28로 자극된 Jurkat T 세포로부터 분비되는 IL-2 mRNA 수준을 실시간 정량적 PCR에 의해 분석한 결과이다. 데이터는 3 가지 실험의 평균±SEM을 나타낸다. *P <0.001 vs. EV. (B)의 상단은 IGSF4 TM, CD43 TM 및 그 돌연변이체(M1-M4)의 아미노산 서열을 나타낸 도이다. 돌연변이체의 적색 잔기는 아미노산이 치환되었음을 나타낸다. 하단은 HEK293T 세포에서 CD3 ζ와 공발현된 IGSF4 TM, CD43 TM 및 그 돌연변이체(M1-M4)의 면역 침전 및 면역 블롯팅 결과를 나타낸 도이다. (C) (B)의 IGSF4 TM, CD43 TM 및 그 돌연변이체(M1-M4)를 과발현하는 Jurkat T 세포를 항-CD3/28로 자극하고, IL-2 mRNA 수준을 실시간 정량적 PCR에 의해 평가한 결과이다. 데이터는 3 가지 실험의 평균±SEM을 나타낸다. *P<0.001 vs. EV. (D)는 IG4△EXT 또는 M2 돌연변이체를 발현하는 Jurkat T 세포를 SEE가 담지된 Raji B 세포와 함께 배양하거나(적색) 항-CD3으로 코팅된 커버 슬립 위에 놓고 공초점 분석한 결과이다. 항-CD3 상의 이미지는 3 차원 이미지로 재구성되었다. c=접촉 영역, o=반대 영역. 각 점은 단일 측정을 나타내며 50 개 이상의 세포를 분석하였다. 데이터는 3 가지 실험의 평균±SEM을 나타낸다. *P <0.001 대 IG4△EXT. (E)는 IG4△EXT를 포함하는 CD3 ζ 돌연변이체(D36A 또는 D36L)의 면역 침전 및 면역 블롯팅 결과이다.
도 3 (A)의 위는 GxxVx 모티프 및 돌연변이(빨간색으로 표시) 또는 삭제된 영역을 표시한 IGSF4 TM(IG4TM) 서열이며, 아래는 HEK293T 세포에서 공동 발현 된 wt-IG4_Myc를 갖는 (A) 돌연변이체의 면역 침전 및 면역 블롯팅 결과이다. (B) (A) 돌연변이체를 포함하는 세포를 항-CD3/28로 자극 한 다음, p-CD3 ζ 또는 t-CD3 ζ에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과이다. (C)의 위는 다양한 세포주에서 IGSF4 mRNA 발현에 대한 실시간 PCR 측정 결과이고, 아래는 스크램블링되거나 siRNA 표적화 IGSF4로 형질 감염된 MT4 T 세포에서 외인성 CD3 ζ_GFP 클러스터링을 공초점 현미경으로 분석한 결과이다. (D) HEK293T 세포에서 공발현된 wt-IG4_Myc를 갖는 IGSF4의 결실 및 교환 돌연변이체의 면역 침전 및 면역 블롯팅 결과이다. (E)는 IGSF4 TM 도메인의 구조 및 기능에 대한 모식도이다.
도 4 (A)는 OTI 마우스의 CD8+ T 세포에서 EV 또는 IG4△EXT의 레트로 바이러스 형질 도입의 효율을 나타낸 도이다. (B) EV- 또는 IG4△EXT-OTI CD8+ T 세포를 9 시간 동안 OVA 257-265의 존재 또는 부재하에 B16F10과 함께 배양한 후의 CD69의 표면 발현을 측정한 결과이다. IFN-γ 및 TNF-α는 OVA 펩티드의 존재 또는 부재하에 B16F10과 24 시간 인큐베이션 한 후에 측정되었다. *P <0.001 대 EV-OTI CD8+ T 세포. (C) (B)로부터의 표적 세포를 7-AAD(7-amino-actinomycin D)로 염색하고 죽은 세포를 유세포 분석법에 의해 계수한 결과이다. *P <0.001 vs. EV-OTI CD8+ T 세포. (D)는 전이 동물 모델 제작 과정을 나타낸 개략도, PBS, EV- 또는 IG4△EXT-OTI CD8+ T 세포를 정맥 주사한 C57BL/6 마우스의 폐 전이 사진, 전이성 콜로니를 정량화한 그래프이다. *P <0.001 대 PBS, **P <0.005 대 EV-OTI CD8+ T 세포. (E) 고형 종양 동물 모델 제작 과정을 나타낸 개략도, PBS, EV- 또는 IG4△EXT-OTI CD8+ T 세포를 정맥 주사한 C57BL/6 마우스(n=6)의 고형 종양 사진, 각 고형 종양의 무게를 나타낸 그래프이다. *P<0.001 대 PBS, **P<0.005 대 EV-OTI CD8+ T 세포, ***P<0.005 대 EV-OTI CD8+ T 세포.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실험예 1. 시약 및 항체

토끼 다클론성(polyclonal) 항-녹색형광단백질(GFP) 및 항-Myc 항체는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다. 마우스 단클론성(monoclonal) 항-CD3 ζ-사슬은 Santa Cruz Biotechnology(Dantas, Texas, USA)에서 구매하였다. HRP(horseradish peroxidase)-접합된 항-마우스 IgG 및 항-토끼 IgG는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 인간 IL-2, 마우스 IL-2, IFN-γ, TNF-α, 마우스 항-p-CD3 ζ 및 마우스 CD3+ T 세포 농축 컬럼을 위한 듀오 세트 ELISA 키트(Duo Set ELISA kits)는 R&D systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구매하였다. OVA 펩타이드 단편(323-339 및 257-264)은 GeneScript (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. APC(antigen-presenting cells)-접합된 CD69는 eBioscience(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 하이 브리도마(Hybridoma) 세포주 145-2C11(마우스 항-CD3), PV1(마우스 항-CD28) 및 OKT3(인간 항-CD3)은 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 프리믹스 및 제한 효소는 Enzynomics (Daejeon, Korea)에서 구입하였다. 플라스미드 DNA 정제 키트 및 WEST-ZOL 웨스턴 블롯 검출 키트는 iNtRON Biotechnology(Seongnam, Korea)에서 구입하였다. PrimeSTAR HS DNA 중합 효소는 TaKaRa Bio Inc. (Shiga, Japan)에서 구입하였다. PLL(Poly- L-Lysine)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. IGSF4를 표적화하는 siRNA 및 스크램블된(scrambled) siRNA는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 세포 트레커 CMFDA 그린(Cell Tracker CMFDA green), 세포 트레커 CMRA 오렌지 및 Lipofectamine 2000 시약은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.

실험예 2. 세포

Jurkat T, HEK293T, Molt 4 및 B16F10 세포주는 ATCC에서 구입하였다. 성인 백혈병 세포주, MT2 및 MT4는 CellBank Australia(Westmead, NSW, Australia)에서 구입하였다. 레트로 바이러스 생태영양 패키징 세포주 백금-E(retroviral ecotrophic packaging cell line Platinum-E)는 Cell biolabs (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 세포는 RPMI-1640 또는 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum)가 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지에서 배양하였다. 막-결합 OVA(B16F10-OVA)를 발현하는 안정한 B16F10 세포주를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약을 사용하여 pCL-neo-mOVA(Addgene, Cambridge, MA)로 일시적 형질 감염시키고 G418(InvivoGen, San Diego, 캘리포니아, 미국). 나이브(Naive) CD3+ T 세포를 T-세포 농축 컬럼(R&D Systems)을 사용하여 음성 선택에 의해 마우스 비장 및 림프절로부터 정제하였다. 나이브 CD4+, CD8+ T 세포 및 CD11C+ 수지상세포(dendritic cells, DC)를 EasySep 자기 분리 시스템(Stemcell Technologies; Vancouver, Canada)을 사용하여 음성 선택에 의해 마우스 비장 및 림프절로부터 정제하였다. 마우스 T- 세포 블라스트(blasts)를 생성하기 위해, 분리된 T 세포를 100 U/mL rIL-2가 첨가된 2 μg/mL 항-CD3/28 코팅된 배양 플레이트에서 48 시간 동안 배양하고 100 U/mL rIL-2에서 추가 3 일 동안 배양하였다. 유세포 분석에 의해 각 집단의 순도는 95 % 이상인 것으로 확인되었다.

실험예 3. 동물

IGSF4 트랜스제닉 마우스(transgenic mouse)(B6.Cg-Tg (CAG-Cadm1))는 RIKEN BioResource Research center에서 입수하였다. C57BL/6 야생형 마우스, OTI 및 OTII TCR 트랜스제닉 마우스(C57BL/6 유래)는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였다. IGSF4 Tg 마우스를 OTII 마우스와 교배시켜 OVA-특이적 TCR 트랜스제닉 세대를 생성하였다. 모든 마우스 라인의 유전자 형질은 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 확인되었으며, 모든 마우스는 특정 병원체가 없는 조건에 수용되었고, 모든 실험은 광주과학기술원 생명과학부 동물 관리 이용위원회의 승인을 받았다.

실험예 4. 플라스미드 구조물(constructs)

모든 IGSF4 결실, 키메라 또는 도메인 교환 돌연변이체 및 CD3 ζ 키메라(도 2A)를 중첩 PCR(overlapping PCR)에 의해 생성하고, 생성물을 pEGFP-N1, dsRed_N1(CMV 프로모터; Takara Bio Inc.), pCS4-Myc(Addgene) 또는 변형된 pHJ1 렌티 바이러스(lentiviral) 벡터에 포함시켰다. 표적화된 아미노산 돌연변이 또는 막 관통(transmembrane, TM) 도메인 교환은 도 2에 기재되어 있다. 마우스 1 차 T 세포로의 레트로 바이러스 형질 도입을 위해, wt-IG4 및 IG4△EXT 유전자를 변형된 pRV-IRES-GFP 벡터에 서브 클로닝하였다. 모든 키메라 돌연변이체는 발현 벡터에서 DNA를 시퀀싱함으로써 확인되었다.

실험예 5. RT-PCR 및 실시간 정량적 PCR

TRI 시약®(TRI Reagent®, Molecular Research center)을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 분리하고 프라이머(인간 IL-2, 5'-CACGTCTTGCACTTGTCAC-3'(서열번호 5) 및 5'-CTTCTTGGGC-ATGTAAAACT-3'(서열번호 6); 인간 GAPDH, 5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'(서열번호 7) 및 5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'(서열번호 8); 인간 IGSF4, 5'-AAGTAGTCCTGAAG GACAGAAACT-3'(서열번호 9) 및 5'-ATAAATCAGCATAAGTTTTCCACA-3'(서열번호 10))를 이용하여 RT-PCR 프리믹스를 사용하여 역전사시켰다.

IGSF4 및 hIL-2의 발현 수준을 정량적 PCR(quantitative PCR)에 의해 평가하였다. cDNA/제어 및 유전자-특이적 프라이머의 총 부피 10 μL에서 연속적인 형광 검출을 위해 SYBR 프리믹스 Ex Taq(TaKaRa Bio)를 사용하여 StepOne 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems; Norwalk, CT, USA)에서 증폭하였다. 표적 유전자의 mRNA 수준은 하기 식을 사용하여 Gapdh에 비해 정규화되었다.

상대적 mRNA 발현 = 2- (표적 유전자의 △Ct-GAPDH의 △Ct)

Ct는 역치 사이클 값.

각각의 샘플에서, 분석된 유전자의 발현은 Gapdh의 발현으로 정규화되었고 Gapdh에 대한 mRNA 수준으로서 기술되었다.

실험예 6. 세포 형질 감염 및 바이러스 감염

MT4 세포로의 일시적 형질 감염은 인간 T 세포주 핵 형성기 키트 V(human T cell line nucleofector kit V, Lonza)를 사용하여 Amaxa 기술에 의해 수행되었다.

IGSF4 녹다운의 경우, 10 nM siRNA를 표적 세포에 도입하고 사용하기 전에 48 시간 동안 배양하였다.

구조물 발현을 위한 HEK293T 세포로의 형질 감염은 리포펙타민 2000을 사용하여 수행되었다. 안정한 세포주를 확립하기 위해, pHJ-1 렌티 바이러스 벡터의 cDNA를 렌티 바이러스 패키징 벡터(pHDM-Hgpm2, pRC/CMV-Rev1b 및 pHDM.G)와 HEK293T 세포로 공동 형질 감염시켰다. 이어서, 상청액을 수집하고 8 μg/mL 폴리브렌(polybrene)의 존재하에 25 ℃에서 2,000Хg에서 원심 분리하여 Jurkat T 세포 내로 스핀-감염(spin-infected)시켰다.

레트로 바이러스 감염을 위해, 총 1Х10⁶ 개의 레트로 바이러스 패키징 세포(Plat-E; Cell Biolabs)를 6 cm² 디쉬에 밤새 시딩(seed)하였다. 레트로 바이러스 입자는 리포펙타민 2000을 사용하여 레트로 바이러스 벡터(EV, wt-IG4 및 IG4△EXT) 및 pCL-Eco 패키징 벡터로 형질 감염시킴으로써 생성되었다. 48 시간 후, 바이러스 상청액(2.5 mL)을 수확하고, 20 μg/mL 레트로넥틴(retronectin)으로 코팅된 12-웰 플레이트에서 1Х10⁶ 개의 마우스 T 세포와 혼합하고, rIL-2 100 U/ml를 첨가하여 25 ℃에서 90 분 동안 22,000Хg에서 원심 분리 하였다.

형질 도입된 T 세포를 rIL-2를 갖는 새로운 배지로 유지시키고 3 일 동안 배양하였다. 감염 후 48 시간 뒤에 GFP를 발현하는 세포의 백분율을 측정하였다. 레트로 바이러스 형질 도입을 위해, 마우스 CD8+ T 세포를 48 시간 동안 rIL-2 100 U/mL와 함께 2 μg/mL 항-CD3/28- 코팅된 플레이트에서 배양하였다.

실험예 7. T 세포 자극

Jurkat T 세포 및 마우스 T 세포는 플레이트-코팅된 항-CD3(인간은 10 μg/mL OKT3; 마우스는 10 μg/mL 145-2C11)/ 2 μg/mL CD28로 자극되었다. 초항원(superantigen) 자극을 위해, Jurkat T 세포를 1 μg/mL SEE-펄스화된 Raji B 세포와 함께 배양하였다. OTII-교차 마우스로부터 유래한 CD4+ T 세포를 1 μg/mL OVA-펄스화된 CD11C+ DC와 함께 배양하였다. RV, wt-IG4 또는 IG4△EXT를 발현하는 CD8+ T 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 OVA 펩티드(257-264, 1 μg/mL)의 존재 또는 부재 하에 B16F10과 함께 배양하였다.

실험예 8. 컨쥬게이션(Conjugation) 분석

B16F10 세포를 30 분 동안 세포 트레커 CMRA 오렌지로 염색하고, 세척한 후 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다. 컨쥬게이션을 위해, 동일한 세포 수의 T 세포를 암 세포와 37 ℃에서 30 분 동안 OVA 펩티드(257-264, 1 μg/mL)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다. 각 튜브에서 녹색, 주황색 및 녹색-오렌지 발생의 상대적인 비율은 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) Canto(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하는 2색 유세포 분석법(two-color flow cytometry)으로 측정하고 FlowJo 소프트웨어(Treestar, San Carlos, CA)로 분석하였다. 샘플 당 게이트 이벤트(gated events) 수는 10,000 이상이었다. 접합된 T 세포의 백분율은 이중-표지(GFP 및 CMRA-양성)된 수를 GFP-양성 T 세포의 수로 나눈 것으로 산출하였다.

실험예 9. 효소면역측정법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

각각 1Х10⁶ 개/샘플인 Jurakt T 세포, CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 전술 한 바와 같이 자극되었다. 24~48 시간 후, 각 조건에 대해 3 개의 복제물로부터의 상청액 중 IL-2 및 IFN-γ의 양을 IL-2 및 IFN-γ용 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다.

실험예 10. 면역 침강(Immunoprecipitation)

HEK293T 세포를 형질 감염 후 48 시간 후에 수확하고, 차가운 PBS(Phosphate-buffered saline)에서 1 회 빠르게 세척한 뒤 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 컴플리트 프로테아제 억제제(Complete protease inhibitors, Roche) 1 정 및 포스파타제 억제제(phosphatase inhibitors cocktails I 및 II; Sigma-Aldrich)를 함유하는 1 % Triton X-100 용해 완충액에서 용해시켰다. 동등한 단백질 함량을 갖는 세포 용해물을 세파로스(Sepharose) 4B(GE Healthcare)에서 4 ℃에서 1 시간 동안 precleared하였다. GFP-융합 IGSF4 및 돌연변이 단백질을 항-GFP-접합된 세파로스 4B로 면역 침전시켰다. 면역 침전물을 상응하는 1 % Triton X-100 용해 완충액으로 2 회, 세제 없이 용해 완충액으로 2 회 세척하였다. 단백질을 10-12 % SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

실험예 11. 웨스턴 블로팅

세포를 얼음상에서 15 분 동안 빙냉 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, containing 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, and one tablet of complete protease inhibitors)에서 용해시켰다. 세포 용해물을 4 ℃에서 16,000Хg에서 30 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 SDS 샘플 완충액(100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, and 20% glycerol with bromophenol blue)에 용해한 후 5 분 동안 가열하였다. 단백질을 10-15 % 겔에서 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 옮겼다. 막을 5 % 탈지유에서 1 시간 동안 블로킹하고(blocked) 세척한 후 밤새 0.1 % 트윈 20 (TBS-T) 및 0.5 % 탈지유를 함유하는 TBS에서 적절한 항체와 함께 배양하였다. 이어서 과량의 1 차 항체를 TBST에서 막을 3 회 세척하여 제거하였다. 이어서, 막을 0.1 ㎍/mL 퍼옥시다제(peroxidase)-접합된 이차 항체(항-토끼 또는 항-마우스)와 함께 1 시간 동안 배양하였다. TBST로 3 회 세척한 후, 웨스턴 블로팅 검출 시약을 사용하여 밴드를 가시화한 다음 X-선 필름(코닥, 로체스터, 뉴욕)에 노출시켰다.

실험예 12. 공초점 현미경

전위 분석을 위해, wt-IG4_GFP를 발현하는 Jurkat T 세포 또는 다른 돌연변이체를 30 분 동안 세포 트래커 오렌지 CMRA로 염색된 SEE-펄스화된 Raji B 세포와 함께 배양하고 PLL-코팅된 커버 슬립 위에 놓거나 30 분 동안 항-CD3 항체 코팅된 커버 슬립 위에 놓았다. T 세포-APC 접촉 부위 또는 항-CD3-코팅된 표면에서 wt-IG4_GFP 또는 다른 돌연변이체의 축적은 접촉 부위(Fcon = c)에서의 형광 강도 대 반대 부위(Foppo = o)에서의 형광 강도의 비로서 계산되었다. MT4 세포에서 CD3 ζ 클러스터링을 평가하기 위해, 스크램블된 또는 IGSF4 siRNA-처리된 세포를 Amaxa를 사용하여 CD3 ζ_GFP로 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 24 시간 뒤에 PLL에 놓고 레이저-스캐닝 공초점 현미경(laser-scanning confocal microscope)에서 100Х, NA 1.40 오일 침지 대물 렌즈를 사용하여 영상화하였다. 데이터는 FLUOVIEW 소프트웨어에 의해 획득, 처리 및 분석되었다. 형광 강도는 최저 강도를 나타내는 청색 및 최고 강도를 나타내는 적색을 갖는 강도 프로파일로 나타내었다.

실험예 13. 유세포 분석

CD69의 레트로 바이러스 형질 도입 효율 및 표면 발현을 유세포 분석에 의해 분석하였다. CD8+ T 세포(1 Х 10⁶ 개/샘플)를 T 세포 자극 섹션에서 전술한 바와 같이 자극하고, 2 % FBS를 함유하는 PBS에 현탁시켰다. 이후 실온에서 10 분 동안 APC-접합된 CD69로 염색하고, PBS로 세척하였다. 이어서 세포를 FACS Canto 기기에서 평가하고 데이터를 FlowJo 소프트웨어(Treestar)로 분석하였다.

실험예 14. 시험관 내 세포 독성 분석

B16F10을 세포 추적자 오렌지 CMRA로 염색하고 바이러스 형질 도입된 OTI CD8+ T 세포를 암 세포와 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에서 5 : 1 비율로 OVA 펩티드(257-264, 1 μg/mL)의 존재 또는 부재 하에 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 10 μL의 5 μg/mL 7-AAD(7-amino-actinomycin D) 용액을 10 분 동안 실온에서 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포를 FACS Canto에서 평가하고 데이터를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다.

실험예 15. 종양 모델

고형 또는 전이 종양 모델은 B16F10-OVA 세포 3Х10⁵ 개를 각각 피하 및 정맥을 통해 C57BL/6 수용 마우스 8 주령의 등 측면 영역에 접종하여 제작하였다. 종양 세포 접종 후 7, 10 일 및 13 일 후에 EV(empty vector), wt-IG4 또는 세포 외 도메인이 결여된 IGSF4(IG4△EXT)를 갖는 OTI CD8+ T 세포(각각 1 Х 10⁷ 개)를 정맥 내(intravenous, i.v.) 주사하고, 종양 세포 접종 후 21 일에 마우스를 희생시켰다. 실험이 끝날 무렵, 종양을 분리하고 무게를 측정하여 총 이미지를 촬영하였다.

실험예 16. 통계 분석

상이한 날에 수행 된 3 회 이상의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이터를 사용하여 평균값을 계산하였다. 프리즘 소프트웨어를 사용하여 독립된 스튜던트 t-검정 및 일원 분산 분석(모든 쌍별 비교에 대해 수정)을 수행하였다. P <0.05 일 때 그룹 간의 차이가 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 1. IGSF4와 TCR- 매개 신호 전달 및 T 세포 활성화 간의 관련성 검정

IGSF4-트렌스제닉 마우스부터 분리된 OTII TCR T 세포는 동일한 밀도의 항원(OVA 323-339)으로 자극시 야생형 OTII TCR T 세포보다 대략 10 배 높은 감도를 나타내었다(도 1A).

이를 통해 IGSF4가 TCR 신호의 증폭에 관여함을 알 수 있다.

저, 중, 고 수준의 IGSF4_GFP(IG4G)를 발현하는 Jurkat T(JT) 세포를 생성하고(도 1B), IGSF4의 발현 수준이 TCR 신호 전달의 크기에 영향을 미치는지 여부를 실험한 결과 포스포(phospho)-CD3 ζ-쇄의 수준은 IGSF4 발현 수준과 강한 상관 관계가 있음을 확인하였다(도 1C).

또한, Jurkat T 세포로부터 방출되는 IL-2의 양은 IGSF4의 발현 수준과 상관 관계가 있음을 확인하였다(도 1D).

상기 결과를 통해 IGSF4가 TCR-매개 신호 및 이에 따른 T 세포 활성화에 직접 관여함을 알 수 있다.

실시예 2. IGSF4의 TM 도메인과 CD3 ζ-쇄의 결합 및 TCR 신호 전달 간의 관련성 검정

다양한 IGSF4 돌연변이체(도 2A)를 사용하여 CD3 ζ-쇄에 대한 결합 능력을 평가한 결과, 다양한 돌연변이체 중에서, TM 도메인을 포함하는 돌연변이체는 CD3 ζ-쇄에만 결합할 수 있음을 확인하였다. 또한, 중앙 초분자 활성화 클러스터(central supramolecular activation clusters, c-SMAC)에서 배제된 것으로 알려진 CD43 TM과 IGSF4의 도메인 교환 결과 CD43 TM 도메인은 CD3 ζ-쇄에 결합하지 않았다(도 2A).

이를 통해 IGSF4의 TM 도메인이 CD3 ζ-쇄와 IGSF4의 상호 작용을 매개하는데 중요함을 알 수 있다.

또한, IGSF4의 세포 외 도메인 결실 돌연변이체(IG4△EXT)의 과발현은 hIL2 mRNA 발현을 유의하게 증가시켰으나, 그 수준은 야생형 IGSF4(wt-IG4) 또는 세포질(cytoplasmic) 도메인 (IG4△CT)의 결실 돌연변이체보다 낮았다(도 2A).

다음으로 TM 영역에서 어떤 아미노산이 IGSF4와 CD3 ζ-쇄 사이의 상호 작용을 매개하는 데 중요한지 확인한 결과, 4 개의 돌연변이체 중에서 His177Ile(M1), His177Leu(M2) 또는 CD43TM(M3)과 전면 IGSF4TM의 교환은 CD3 ζ-쇄에 결합하지 않아(도 2B), CD3 ζ- 쇄에 대한 결합에 His177 잔기가 중요하다는 것을 확인하였다.

또한, 3 개의 돌연변이체(M1, M2 및 M3)는 hIL2 mRNA 발현의 현저한 감소를 나타내었으며(도 2C), M1 또는 M2 돌연변이체는 면역학적 시냅스(immunological synapse, IS)에서 축적되는 능력을 상실하였다(도 2D).

한편, 히스티딘의 이미다졸 측쇄가 부분적으로 양성자화되었기 때문에, 이 잔기가 CD3 ζ-쇄 TM 도메인의 아스파르트산과 상호 작용할 수 있는지 확인하기 위해 CD3 ζ-쇄의 Asp36을 Ala 또는 Leu와 교환하여 D36A 또는 D36L을 제조하여 실험한 결과, Asp36에서의 돌연변이는 IGSF4와 CD3 ζ-쇄 사이의 상호 작용을 완전히 느슨하게 하는 것을 확인하였다(도 2E).

이를 통해 IGSF4 TM의 His177과 CD3 ζ-쇄 TM의 Asp36 사이의 상호 작용이 IGSF4-CD3 ζ 이량체를 형성하는 데 중요함을 알 수 있다.

실시예 3. IGSF4와 TCR 나노 클러스터 증가 간의 관련성 검정

CD3 ζ-쇄는 TM에서 이량체 모티프(LxxxxGVxxT)를 보유함으로써 CD3γδ TM 도메인과의 TCR/CD3 복합체 어셈블리를 매개하는 것으로 알려져 있다. IGSF4 TM는 GxxVx 서열을 포함하는데, 이는 Ltk(마우스 백혈구 티로신 키나제; GxxVx)와 같은 티로신 키나제 성장 인자 수용체의 TM 도메인에서의 이량체화 모티프와 유사하다. 이에, 해당 모티프를 제거하고 LxxLL 또는 GLLLA를 생성하기 위해 해당 부위를 류신으로 치환한 결과, wt-IG4에 의한 면역 침전에 의해 확인된 바와 같이 2 개의 돌연변이체가 이량체화되지 않았으며, GxxVx 모티프의 제거는 또한 IGSF4 TM 도메인의 이량체 능력을 상실시켰다(도 3A). 대조적으로, GGVVA에서 GVGVA로의 돌연변이는 TM-TM 상호 작용을 변경시키지 않았다.

또한, 도 3B에 도시 된 바와 같이, LLL 및 결실 돌연변이체는 TCR 활성화에 반응하여 감소된 CD3 ζ 인산화를 나타냈다.

이를 통해 Gly181 및 Val184는 IGSF4 TM-TM 상호 작용에 중요한 아미노산임을 알 수 있다.

다음으로 IGSF4가 TCR 클러스터의 크기 증가에 관여하는지를 확인하기 위해 높은 수준의 IGSF4를 발현하지만 낮은 수준의 TCR 및 CD45 발현을 나타내는 MT2 또는 MT4 세포를 선택하고 실험한 결과, CD3 ζ-쇄의 과발현은 눈물점(puncta)-유사 CD3 ζ 클러스터를 증가시키나 IGSF4를 표적으로 하는 siRNA는 이를 감소시키는 것을 확인하였다(도 3C).

이를 통해 IGSF4가 TCR 사전 클러스터링을 중재하는 데 중요함을 알 수 있다.

또한, His177 돌연변이가 동종-이량체 TM-TM 상호 작용을 방해할 수 있는지 여부를 확인한 결과, His177 돌연변이는 TM-TM 상호 작용에 영향을 미치지 않았으며, CD43F(M3) 또는 CD43 TM 돌연변이체의 TM-TM 상호 작용의 상실은 GxxVx 모티프가 TM 도메인에서 자가 이량체화에 중요함을 나타내었다(도 3D).

상기 결과와 같이, IGSF4는 TM 도메인에서 GxxVx 모티프를 통해 시스(cis)-이량체화되고, 또한 히스티딘 잔기의 전하-상호 작용에 의해 CD3 ζ- 쇄와 상호 작용함을 확인하였다. 이러한 IGSF4의 과발현은 TCR 결합활성(avidity)을 향상시키는 TCR 클러스터링을 증가시킬 수 있다(도 3E).

실시예 4, IG4△EXT의 과발현에 의한 in vitro 및 in vivo에서의 CD8+ T 세포의 항 종양 활성 검정

IGSF4의 TM 도메인이 TCR 신호를 향상시킴으로써 CD8+ T 세포의 항 종양 활성에 영향을 줄 수 있는지 조사하기 위해, GFP(EV) 또는 IG4△EXT_GFP를 포함하는 OTI TCR CD8+ T 세포를 제작한 결과, GFP 및 IG4△EXT_GFP는 모두 마우스 OTI TCR CD8+ T 세포에서 높게 발현됨을 확인하였다(도 4A).

다음으로 OTI TCR CD8+ T 세포를 OVA+-B16F10 흑색종 세포와 배양한 후 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 및 CD69 발현을 평가한 결과, IG4△EXT_GFP를 발현하는 OTI TCR CD8+ T 세포(OTI IG4△EXT-CD8+ T 세포)는 CD69 발현 및 사이토카인 방출이 유의하게 상향 조절되었음을 확인하였다(도 4B).

또한, 세포 독성 활성은 IG4△EXT_GFP를 발현하는 OTI TCR CD8+ T 세포에서도 향상되었다(도 4C).

상기 결과를 통해 TCR 결합활성이 in vitro에서 항 종양 반응을 긍정적으로 조절함을 알 수 있다.

한편, in vivo 조건에서 OTI IG4△EXT-CD8+ T 세포의 효과를 확인하기 위해, OVA+-B16F10 흑색종 세포를 2 개의 독립적인 동물 모델에 투여하였다.

첫 번째의 전이 동물 모델은 도 4D에 나타낸 바와 같다. 구체적으로, OVA+-B16F10 세포를 정맥 주사 후 7일 뒤, OTI IG4△EXT-CD8+ T 세포를 3회 i.v. 주사하였다. 최초 주사 후 14 일째에 전이성 콜로니를 평가한 결과, OTI IG4△EXT-CD8 + T 세포가 주사된 마우스에서 전이성 콜로니의 현저한 감소가 확인되었다.

두 번째의 고형 종양 동물 모델은 도 4E에 나타낸 바와 같다. 유선 지방 부위에 OVA+-B16F10 세포가 이식된 C57BL/6 암컷 마우스 중 OTI IG4△EXT-CD8+ T 세포가 주사된 마우스의 평균 종양 무게는 OTI EV-CD8+ T 세포가 주사된 마우스의 평균 종양 무게보다 낮았으며, wt-IG4-CD8+ T 세포의 투여 또한 B16F10에 의한 종양 크기를 감소시켰다.

상기의 결과를 통해, IGSF4 TM 도메인의 과발현에 따라 TCR 결합활성을 직접 상향 조절할 수 있으며, 이를 통해 생체 내에서 CD8+ T 세포의 항 종양 활성을 강화시킬 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Gwangju Institute of Science and Technology NATIONAL CANCER CENTER <120> T cells expressing the transmembrane domain of IGSF4 and use thereof <130> KPA200634-KR-P1 <150> KR 10-2021-0007397 <151> 2021-01-19 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 442 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> IGSF4 AA <400> 1 Met Ala Ser Val Val Leu Pro Ser Gly Ser Gln Cys Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Phe Ser Ala Ala Ala Leu Ile Pro Thr Gly Asp Gly Gln Asn Leu Phe 35 40 45 Thr Lys Asp Val Thr Val Ile Glu Gly Glu Val Ala Thr Ile Ser Cys 50 55 60 Gln Val Asn Lys Ser Asp Asp Ser Val Ile Gln Leu Leu Asn Pro Asn 65 70 75 80 Arg Gln Thr Ile Tyr Phe Arg Asp Phe Arg Pro Leu Lys Asp Ser Arg 85 90 95 Phe Gln Leu Leu Asn Phe Ser Ser Ser Glu Leu Lys Val Ser Leu Thr 100 105 110 Asn Val Ser Ile Ser Asp Glu Gly Arg Tyr Phe Cys Gln Leu Tyr Thr 115 120 125 Asp Pro Pro Gln Glu Ser Tyr Thr Thr Ile Thr Val Leu Val Pro Pro 130 135 140 Arg Asn Leu Met Ile Asp Ile Gln Lys Asp Thr Ala Val Glu Gly Glu 145 150 155 160 Glu Ile Glu Val Asn Cys Thr Ala Met Ala Ser Lys Pro Ala Thr Thr 165 170 175 Ile Arg Trp Phe Lys Gly Asn Thr Glu Leu Lys Gly Lys Ser Glu Val 180 185 190 Glu Glu Trp Ser Asp Met Tyr Thr Val Thr Ser Gln Leu Met Leu Lys 195 200 205 Val His Lys Glu Asp Asp Gly Val Pro Val Ile Cys Gln Val Glu His 210 215 220 Pro Ala Val Thr Gly Asn Leu Gln Thr Gln Arg Tyr Leu Glu Val Gln 225 230 235 240 Tyr Lys Pro Gln Val His Ile Gln Met Thr Tyr Pro Leu Gln Gly Leu 245 250 255 Thr Arg Glu Gly Asp Ala Leu Glu Leu Thr Cys Glu Ala Ile Gly Lys 260 265 270 Pro Gln Pro Val Met Val Thr Trp Val Arg Val Asp Asp Glu Met Pro 275 280 285 Gln His Ala Val Leu Ser Gly Pro Asn Leu Phe Ile Asn Asn Leu Asn 290 295 300 Lys Thr Asp Asn Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Ala Ser Asn Ile Val Gly 305 310 315 320 Lys Ala His Ser Asp Tyr Met Leu Tyr Val Tyr Asp Pro Pro Thr Thr 325 330 335 Ile Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 340 345 350 Thr Ile Leu Thr Ile Ile Thr Asp Ser Arg Ala Gly Glu Glu Gly Ser 355 360 365 Ile Arg Ala Val Asp His Ala Val Ile Gly Gly Val Val Ala Val Val 370 375 380 Val Phe Ala Met Leu Cys Leu Leu Ile Ile Leu Gly Arg Tyr Phe Ala 385 390 395 400 Arg His Lys Gly Thr Tyr Phe Thr His Glu Ala Lys Gly Ala Asp Asp 405 410 415 Ala Ala Asp Ala Asp Thr Ala Ile Ile Asn Ala Glu Gly Gly Gln Asn 420 425 430 Asn Ser Glu Glu Lys Lys Glu Tyr Phe Ile 435 440 <210> 2 <211> 1329 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> IGSF4 NT <400> 2 atggcgagtg tagtgctgcc gagcggatcc cagtgtgcgg cggcagcggc ggcggcggcg 60 cctcccgggc tccggctccg gcttctgctg ttgctcttct ccgccgcggc actgatcccc 120 acaggtgatg ggcagaatct gtttacgaaa gacgtgacag tgatcgaggg agaggttgcg 180 accatcagtt gccaagtcaa taagagtgac gactctgtga ttcagctact gaatcccaac 240 aggcagacca tttatttcag ggacttcagg cctttgaagg acagcaggtt tcagttgctg 300 aatttttcta gcagtgaact caaagtatca ttgacaaacg tctcaatttc tgatgaagga 360 agatactttt gccagctcta taccgatccc ccacaggaaa gttacaccac catcacagtc 420 ctggtcccac cacgtaatct 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gggcagtgga tcatgccgtg 180 atcggtagga gggtggcggt ggtggtgttc gccatgctgt gcttgctcat cattctgggg 240 cgctattttg ccagacataa aggtacatac ttcactcatg aagccaaagg agccgatgac 300 gcagcagacg cagacacagc tataatcaat gcagaaggag gacagaacaa ctccgaagaa 360 aagaaagagt acttcatcta g 381 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IL-2_F <400> 5 cacgtcttgc acttgtcac 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IL-2_R <400> 6 cttcttgggc atgtaaaact 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH_F <400> 7 cggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH_R <400> 8 agccttctcc atggtggtga agac 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IGSF4_F <400> 9 aagtagtcct gaaggacaga aact 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IGSF4_R <400> 10 ataaatcagc ataagttttc caca 24

Claims (9)

1. IGSF4(immunoglobulin superfamily member 4)의 막 관통(transmembrane) 도메인을 발현하는 T 세포를 포함하는 흑색종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포인, 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 세포 외 도메인이 결여된 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포는 TCR 결합활성(avidity)이 증가하는 것인, 약학적 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 세포 외 도메인이 결여된 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포는 CD69 발현 및 사이토카인 방출이 증가하는 것인, 약학적 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 세포 외 도메인이 결여된 IGSF4의 막 관통 도메인을 발현하는 T 세포는 세포 독성 활성이 증가하는 것인, 약학적 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 전이성 콜로니를 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 종양 크기를 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
8. 제1항의 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 흑색종의 예방 또는 치료용 세포치료제.
   
9. 제1항의 조성물 또는 제8항의 세포치료제 중 어느 하나를 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 흑색종의 예방 또는 치료방법.

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