CN104020030B - 一种扫描电镜用的昆虫样品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种扫描电镜用的昆虫样品的制备方法，包括昆虫材料清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金等步骤，所述组织固定是将昆虫材料浸于固定液中并于微波炉中加热一段时间，再分别于室温和低温下各固定一段时间。本发明的制备昆虫材料扫描电镜样品的方法快速、简单易行，可获得更为清晰的昆虫表面结构的扫描电镜图像，能更好地保持整体昆虫形态结构，不易发生变形、皱缩及塌陷。具有较大的实际应用价值。

Description

一种扫描电镜用的昆虫样品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种扫描电镜用的昆虫样品的制备方法。

背景技术

昆虫是动物界重要组成部分，研究昆虫结构时广泛用到扫描电子显微镜：在昆虫生理、昆虫解剖和昆虫系统学等方面扫描电子显微镜都有着较为广泛的应用。大量的相关文献及实践操作表明，昆虫样品的制备，直接影响着观察部位的客观性和真实性。

昆虫样品一般需经样品清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金等步骤制备而成。由于整体昆虫材料较大，且昆虫外表皮均有一定程度的骨化，因此固定液不容易浸透昆虫体内器官组织。而整体昆虫材料各部位的超微结构是否能清晰地在电镜观察中显示出来,主要取决于昆虫样品的制作过程中变形、皱缩及塌陷程度的高低。因此，要使这些细微结构清楚的在电镜下呈现出来,组织固定是极为重要的环节。电镜制样中的组织固定一般是用2%-3%戊二醛，但有时图像仍会呈现皱缩程度较高的不良现象，这可能与戊二醛穿透速度慢有关,在样品稍大及样品表面有保护层时，易出现组织深部固定不良，同时，昆虫体内体液含量高，因此样品较易发生变形、皱缩及塌陷，不利于样品较为隐蔽之处的观察。所以需要找到更适合、简单易行、易于掌握的昆虫材料制备方法。

发明内容

本发明提供了一种扫描电镜用昆虫样品的制备方法。该方法能更好地保持整体昆虫形态结构，不易发生变形、皱缩及塌陷。

本发明提供一种扫描电镜用昆虫样品的制备方法，包括昆虫材料清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金等步骤，所述组织固定是将昆虫材料浸于固定液中并于微波炉中加热一段时间，再分别于室温和低温下各固定一段时间。

加热一段时间能够使固定液更快速的浸透昆虫体内器官组织。

优选地，所述组织固定是将昆虫材料浸于固定液中置于微波炉中高火加热3-5次，每次8-12s，将固定液加热至热而不烫的程度，每次加热前换入新的固定液。

优选地，所述固定液由2.5-3%戊二醛溶液和吐温-80组成。

进一步地，所述固定液是在每20ml 2.5-3%戊二醛中加12-15μl吐温-80配制而成。

优选地，所述固定液中还有NaCl。

进一步地，所述固定液是在每20ml2.5-3%戊二醛中加0.018gNaCl，12-15μl吐温-80配制而成。

本发明的第二个目的是提供应用上述方法制备得到的扫描电镜用昆虫样品。

本发明的第三个目的是提供一种昆虫样品固定液，所述固定液由2.5-3%戊二醛溶液和吐温-80组成；作为优选，所述固定液是在每20ml 2.5-3%戊二醛中加12-15μl吐温-80配制而成。

优选地，所述固定液中还有NaCl。

进一步地，所述固定液是在每20ml2.5-3%戊二醛中加0.018gNaCl，12-15μl吐温-80配制而成。

本发明利用微波固定技术，可加速戊二醛在组织中的渗透，使戊二醛与组织蛋白在瞬间均匀热交联固定，组织内的超微结构形态位置不发生改变。吐温-80，有利于稳定戊二醛单体在磷酸缓冲溶液中的存在状态和样品固定。氯化钠的加入使得固定液的浓度接近于昆虫体液的浓度，进一步防止了在加入固定液后昆虫的皱缩。本发明提供了一种能更好保存昆虫形态结构的组织固定的方法。本发明的制备昆虫材料扫描电镜样品的方法快速、简单易行，可获得更为清晰的昆虫表面结构的扫描电镜图像，能更好地保持整体昆虫形态结构，不易发生变形、皱缩及塌陷。具有较大的实际应用价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为应用现有技术方法（即对比例）得到的桃蛀螟幼虫腹部扫描电镜图像（方法a）；

图2为应用现有技术方法（即对比例）得到的桃蛀螟幼虫腹部扫描电镜放大图像（方法a）；

图3为采用本发明实施例3的方法得到的桃蛀螟幼虫腹部侧面扫描电镜图像（方法b）；

图4为采用本发明实施例3的方法得到的桃蛀螟幼虫腹部腹面扫描电镜图像（方法b）；

图5为采用本发明实施例3的方法得到的桃蛀螟幼虫胸部及腹部扫描电镜图像（方法b）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例中的百分比浓度均为质量百分比浓度。

对比例

现有技术中扫描电镜用昆虫样品的制备方法步骤如下：

1)用洗耳球轻拂桃蛀螟幼虫虫体表面，随后用0.1M磷酸缓冲溶液（pH7.2）洗涤幼虫三次；

2)将幼虫浸于3%戊二醛固定液中固定,随后于5℃冰箱中固定12h；

3)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫5遍，每次8min；

4)用1%锇酸再固定1.5h；

5)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫10遍，每次8min；

6)依次经30%，50%，70%，80%, 90%，95%, 100%梯度乙醇脱水，每次8min；

7)用100%丙酮置换3 次，每次8min；

8)用英国K-850型临界点干燥仪干燥；

9) 将样品粘于样品台上；

10)用日立E-1010型离子溅射仪镀膜；

11)用TESCAN5136 型扫描电子显微镜观察并摄相，加速电压10kV。

摄像结果参见图1和2。该方法的扫描结果显示：桃蛀螟幼虫腹部各节及节间有较多的皱褶，皱缩程度较高，对观察桃蛀螟幼虫体表结构及其分布有一定的影响。

实施例1（与对比例的不同在步骤2）

本发明的扫描电镜用昆虫样品的制备方法步骤如下：

1)用洗耳球轻拂桃蛀螟幼虫虫体表面，随后用0.1M磷酸缓冲溶液（pH7.2）洗涤幼虫三次；

2) 将幼虫浸于固定液中（固定液为3%戊二醛），于解剖镜下将幼虫两体侧各轻刺三个小孔，转移至1.5ml离心管中，离心管中有固定液约1ml。将离心管置于离心管架于微波炉中高火加热8s，此时离心管热而不烫。于离心管内重新换入固定液后重复加热2次,随后于5℃冰箱中固定12h；

3)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫5遍，每次8min；

4)用1%锇酸再固定1.5h；

5)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫10遍，每次8min；

6)依次经30%，50%，70%，80%, 90%，95%, 100%梯度乙醇脱水，每次8min；

7)用100%丙酮置换3 次，每次8min；

8)用英国K-850型临界点干燥仪干燥；

9) 将样品粘于样品台上；

10)用日立E-1010型离子溅射仪镀膜；

11)用TESCAN5136 型扫描电子显微镜观察并摄相，加速电压10kV。

由摄像结果可以看出，桃蛀螟幼虫腹部各节及节间较对比例皱褶变少，皱缩程度降低，但还是有皱褶存在。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：

（2）将幼虫浸于固定液中，固定液是在每20ml 2.5%戊二醛中加入12μl吐温-80配制而成，于解剖镜下将幼虫两体侧各轻刺三个小孔，转移至1.5ml离心管中，离心管中有固定液约1ml。将离心管置于离心管架于微波炉中高火加热8s，此时离心管热而不烫。于离心管内重新换入固定液后重复加热2次,随后于5℃冰箱中固定12h。

其余步骤均与实施例1相同。由摄像结果可以看出，桃蛀螟幼虫腹部各节及节间与实施例1相比无明显皱褶，皱缩程度进一步的降低。

实施例3

桃蛀螟幼虫扫描电镜样品的制备方法包括以下步骤：

1)用洗耳球轻拂桃蛀螟幼虫虫体表面，随后用0.1M磷酸缓冲溶液（pH7.2）洗涤幼虫三次；

2)将幼虫浸于固定液中（固定液是在每20ml 2.5%戊二醛中加0.018gNaCl，12μl吐温-80配制而成），于解剖镜下将幼虫两体侧各轻刺三个小孔，转移至1.5ml离心管中，离心管中有固定液约1ml。将离心管置于离心管架于微波炉中高火加热8s，此时离心管热而不烫。于离心管内重新换入固定液后重复加热2次,随后于5℃冰箱中固定12h；

3)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫5遍，每次8min；

4)用1%锇酸再固定1.5h；

5)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫10遍，每次8min；

6)依次经30%，50%，70%，80%, 90%，95%, 100%梯度乙醇脱水，每次8min；

7)用100%丙酮置换3 次，每次8min；

8)用英国K-850型临界点干燥仪干燥；

9) 将样品粘于样品台上；

10)用日立E-1010型离子溅射仪镀膜；

11)用TESCAN5136 型扫描电子显微镜观察并摄相，加速电压10kV。摄像结果参见图3-图5。由图可见幼虫体表较平整，各节之间皱缩程度较低，无明显凹陷。

实施例4

桃蛀螟幼虫扫描电镜样品的制备方法包括以下步骤：

1)用洗耳球轻拂桃蛀螟幼虫虫体表面，随后用0.1M磷酸缓冲溶液（pH7.2）洗涤幼虫3次；

2)将幼虫浸于固定液中（固定液是在每20ml 3%戊二醛中加0.018gNaCl，14μl吐温-80配制而成），于解剖镜下将幼虫两体侧各轻刺3个小孔，转移至1.5ml离心管中，离心管中有固定液约1ml。将离心管置于离心管架于微波炉中高火加热10s，此时离心管热而不烫。于离心管内重新换入固定液后重复加热3次,随后于5℃冰箱中固定12h；

3)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫5遍，每次8min；

4)用1%锇酸再固定1.5h；

5)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫10遍，每次8min；

6)依次经30%，50%，70%，80%, 90%，95%, 100%梯度乙醇脱水，每次8min；

7)用100%丙酮置换3 次，每次8min；

8)用英国K-850型临界点干燥仪干燥；

9) 将样品粘于样品台上；

10)用日立E-1010型离子溅射仪镀膜；

11)用TESCAN5136 型扫描电子显微镜观察并摄相，加速电压10kV。

实施例5

桃蛀螟幼虫扫描电镜样品的制备方法包括以下步骤：

1)用洗耳球轻拂桃蛀螟幼虫虫体表面，随后用0.1M磷酸缓冲溶液（pH7.2）洗涤幼虫三次；

2)将幼虫浸于固定液中（固定液是在每20ml 2.8%戊二醛中加0.018gNaCl，15μl吐温-80配制而成），于解剖镜下将幼虫两体侧各轻刺三个小孔，转移至1.5ml离心管中，离心管中有固定液约1ml。将离心管置于离心管架于微波炉中高火加热12s，此时离心管热而不烫。于离心管内重新换入固定液后重复加热4次,随后于5℃冰箱中固定12h；

3)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫5遍，每次8min；

4)用1%锇酸再固定1.5h；

5)用磷酸缓冲溶液洗涤幼虫10遍，每次8min；

6)依次经30%，50%，70%，80%, 90%，95%, 100%梯度乙醇脱水，每次8min；

7)用100%丙酮置换3 次，每次8min；

8)用英国K-850型临界点干燥仪干燥；

9) 将样品粘于样品台上；

10)用日立E-1010型离子溅射仪镀膜；

11)用TESCAN5136 型扫描电子显微镜观察并摄相，加速电压10kV。

实施例6

本实施例与实施例3的不同之处在于： 本实施例采用的样品为双翅目：黄潜蝇幼虫。

实施例7

本实施例与实施例3的不同之处在于： 本实施例采用的样品为双翅目：蚊子。

实施例8

本实施例与实施例3的不同之处在于： 本实施例采用的样品为同翅目：飞虱。

实施例9

本实施例与实施例3的不同之处在于： 本实施例采用的样品为同翅目：蚜虫。

实施例10

本实施例与实施例3的不同之处在于： 本实施例采用的样品为体型稍大、样品表面有保护层及体液含量高的昆虫：鞘翅目：金龟子。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种扫描电镜用昆虫样品的制备方法，包括昆虫材料清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金步骤，其特征在于：所述组织固定是将昆虫材料浸于固定液中并于微波炉中加热一段时间，再分别于室温和低温下各固定一段时间；所述组织固定是将昆虫材料浸于固定液中置于微波炉中高火加热3-5次，每次8-12s，将固定液加热至热而不烫的程度，每次加热前换入新的固定液；所述固定液由2.5-3%戊二醛溶液和吐温-80组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定液是在每20ml 2.5-3%戊二醛中加12-15μl吐温-80配制而成。

3.一种扫描电镜用昆虫样品的制备方法，包括昆虫材料清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金步骤，其特征在于：所述组织固定是将昆虫材料浸于固定液中并于微波炉中加热一段时间，再分别于室温和低温下各固定一段时间；所述组织固定是将昆虫材料浸于固定液中置于微波炉中高火加热3-5次，每次8-12s，将固定液加热至热而不烫的程度，每次加热前换入新的固定液；所述固定液由2.5-3%戊二醛溶液和吐温-80、NaCl组成。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述固定液是在每20ml 2.5-3%戊二醛中加0.018gNaCl，12-15μl吐温-80配制而成。

5.应用权利要求1-4任一所述的方法制备得到的扫描电镜用昆虫样品。