CN107843609B - 一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，具体步骤为：将肌肉放入前固定液中固定，吸出前固定液，再加入NaOH溶液震荡，清洗；将样品放入单宁酸溶液中固定，清洗后用四氧化锇固定，清洗后再用冷冻保护剂溶液冲洗；接着用甲醇按浓度梯度由低到高顺序脱水；将脱水样品放入甲醇溶液中，用液氮快速冻结，切样，用叔丁醇进行置换；再将样品冷冻干燥；最后将干燥好的样品进行拍照记录。有益效果为：本发明方法能保证样品在去除细胞质后结构完整，不会使结缔组织随细胞质溶解或部分溶解，保持结缔组织的完整性，使得扫描电镜观察的结缔组织结构清晰、图像立体感强，能更好地观察到较好的细微结构特征。
Description
技术领域
本发明涉及显微观察样品技术领域，尤其是涉及一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法。
背景技术
扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）已广泛地应用于生物学、医学、化学、环境、材料、石油地质、矿物等众多领域。随着扫描电子显微镜分辨率的不断提高和样品制备技术的逐渐完善，尤其在生物学研究中发挥了巨大作用，具有重要的实用价值。在植物学方面，观察叶表皮、种子、花粉、袍子囊和袍子等，解决形态解剖及分类问题，研究基因工程对植物的影响；在植物病理学方面，观察病原菌形态、生长状况和侵染宿主的过程，观察真菌抱子的萌发、菌丝生长，寄主植物与病原菌的相互作用，生防菌的抬抗作用等；在微生物方面，为微生物资源的利用，微生物生物技术、遗传工程、环境保护等提供了大量直观的、有科研价值的形态学依据；在动物学研究方面，观察细胞组织表面特征结构、培养细胞的形态等，研究形态与功能的关系，但在水生生物方面的研究存在一定的限制，特别对鲤鱼肌肉细胞外结缔组织显微结构观察之前的样品制备研究技术尚不成熟，通过常规的制备扫描电镜观察样品的方法获得的样品，在预处理时经常出现结缔组织随细胞质溶解或部分溶解，观察时存在结缔组织纤维结构不完整、图像不清晰的问题。
现有技术如授权公告号为CN 102607908 B的中国发明专利，公开了一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法，具体方法为：一、固定液配制；二、样品固定；三、样品台准备；四、样品滴片；五、样品镀膜，即完成淡水鱼类精子扫描电镜样品制备。上述制备方法简便、易操作，精子完整率高、分布密度适中，技术成本低，但是该制备方法会使结缔组织随细胞质溶解或部分溶解，使得扫描电镜照片不完整或不清晰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，该制备方法能够保证样品在处理时去除细胞质后扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察的结缔组织结构清晰，图像立体感强。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，包括前固定、后固定、脱水、割断和置换、冷冻干燥、观察，制备的具体步骤为：
前固定：将鲤鱼背部肌肉避开隔膜切成块，放入前固定液中固定4-5d，每22-24h更换一次固定液，然后吸出前固定液，加入1.8-2.2M NaOH溶液震荡3-4d，每22-24h更换一次NaOH溶液，吸出NaOH溶液，再用0.09-0.11M的磷酸缓冲液清洗10-14h，即得前固定样品，上述前固定液中仲甲醛浓度为1.9-2.1%、戊二醛浓度为2.3-2.6%、磷酸缓冲液浓度为0.09-0.11M，前固定液的pH为7.0-7.3，用戊二醛和仲甲醛进行前固定效果远远好于单一戊二醛固定，穿透能力强，能更好地凝固组织细胞中的蛋白成分，利于组织坚硬，稳定细胞膜结构，使得在后续脱水过程中不易产生收缩，同时NaOH溶液的加入能除去弹性纤维和细胞质，减少杂质对结缔组织的影响，进而提高扫描电镜的清晰度，而且不会使结缔组织细胞随细胞质溶解或部分溶解，保持结缔组织细胞的完整性；
后固定：将前固定后样品放入浓度为1.8-2.1%的单宁酸溶液中固定1.5-2.5h，然后用0.09-0.11M磷酸缓冲液清洗9-12min，反复清洗3-4次，再用浓度为0.8-1.1%的四氧化锇固定1.5-2.5h，最后用0.09-0.11M磷酸缓冲液清洗9-12min，反复清洗3-4次，然后用2-3%的冷冻保护剂溶液清洗9-12min，反复清洗3-4次，即得后固定样品，上述冷冻保护剂为海藻糖和糖苷，其重量比为1:0.6-0.8，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:83-92，冷冻干燥过程中，左旋糖苷和右旋糖苷的合理比例能增加溶液的粘度，使得糖苷在结缔组织的蛋白质分子之间产生位阻，同时提高样品的玻璃化转变温度，能更好地抑制冰晶的形成，控制冷冻过程中的pH值的变化，保证冷冻干燥中结缔组织的稳定性，此外还能保护脱水步骤中的结缔组织不受破坏，该保护剂的加入不仅增大了水分子的表面张力，促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用，使得蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对较少的保护剂分子，保护结缔组织的天然构象，而且保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了结缔组织的天然结构和功能的完整性，该步骤中的单宁酸和锇酸能使脂肪酸和脂蛋白得以固定，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定，提高固定效果，同时由于固定彻底、渗透均匀，可以很好的保存组织结构，也不会造成样品发脆，此外，金属锇被结合在细胞表面，起到电子染色的作用，减少样品充放电效应，提高二次电子发射率，在电镜观察时不再出现由于脂类析出而覆盖于组织表面或损伤组织结构的现象，明显提高图像质量；
脱水：将后固定样品用体积浓度为50-90%的甲醇按浓度梯度由低到高顺序逐次脱水14-16min，最后用98-100%甲醇反复脱水3-4次，每次脱水14-16min，即得脱水样品，该步骤采用梯度甲醇脱水，在能除去样品中的水分的同时能保持样品的原状，不会使细胞体积或表面结构发生变化，从而确保扫描电镜的照片为其正常生活状态下的真实形态，且照片的分辨率高，不会使观察结果出现误差或失真，进而能更好地观察到较好的细微结构特征；
割断和置换：将脱水样品放入98-100%甲醇溶液中，利用液态氮快速冻结，冻结的试样用刀片迅速切断，放入叔丁醇中进行置换3-4次，每次14-16min，即可，该步骤中冻结试样的切割性能都比较好，不易使样品表面出现波浪型条纹，提高观察效果，同时以叔丁醇为升华介质，在冰冻后形成非晶体固态，不会产生冰晶，可避免冰晶和表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构，且能以最快的速度从固态升华，大为缩短了干燥时间；
冷冻干燥：将割断、置换后的样品利用冻结干燥装置进行冷冻干燥处理，即得干燥样品，该步骤能使水分从固态直接转化为气态，不经过液态阶段，因而避免了气相和液相之间表面张力对样品的损伤，从而达到完全干燥的目的，同时冷冻干燥能较好地保持鲤鱼肌肉细胞外结缔组织的原状，提高样品的完整性，而且经过深度冷冻后形成断裂面，观察生物体的内部结构；
观察：将干燥好的样品粘附在样品台上，进行喷金处理，然后用扫描电子显微镜进行拍照记录，观察样品的表面和内部结构，通过观察发现扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察的结缔组织结构清晰，图像立体感强，能更好地观察到较好的细微结构特征。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明制备方法能够保证样品在处理时去除细胞质后扫描电镜样品结构完整，不会使结缔组织随细胞质溶解或部分溶解，保持结缔组织的完整性，扫描电镜观察的结缔组织结构清晰，图像立体感强，能更好地观察到较好的细微结构特征；2）本发明采用二次固定，能使脂肪酸和脂蛋白得以固定，提高固定效果，同时由于固定彻底、渗透均匀，可以很好的保存组织结构，也不会造成样品发脆，明显提高图像质量；3）该制备方法能除去样品中的水分的同时保持样品的原状，确保扫描电镜的照片为其正常生活状态下的真实形态，且照片的分辨率高，不会使观察结果出现误差或失真；4）本发明干燥方法能较好地保持鲤鱼肌肉细胞外结缔组织的原状，提高样品的完整性，能以最快的速度从固态升华，大为缩短了干燥时间。
附图说明
图1为本发明实施例3的扫描电镜图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，包括前固定、后固定、脱水、割断和置换、冷冻干燥、观察，制备的具体步骤为：
1）前固定：将鲤鱼背部肌肉避开隔膜切成5×5×10mm块，放入前固定液中固定4d，每24h更换一次固定液，然后避开样品，用胶头滴管吸出前固定液，加入1.8M NaOH溶液震荡4d，每22h更换一次NaOH溶液，再避开样品，用胶头滴管吸出NaOH溶液，再用0.11M的磷酸缓冲液清洗10h，即得前固定样品，上述前固定液中仲甲醛浓度为2.1%、戊二醛浓度为2.3%、磷酸缓冲液浓度为0.11M，前固定液的pH为7.0，用戊二醛和仲甲醛进行前固定效果远远好于单一戊二醛固定，穿透能力强，能更好地凝固组织细胞中的蛋白成分，利于组织坚硬，稳定细胞膜结构，使得在后续脱水过程中不易产生收缩，同时NaOH溶液的加入能除去弹性纤维和细胞质，减少杂质对结缔组织的影响，进而提高扫描电镜的清晰度，而且不会使结缔组织细胞随细胞质溶解或部分溶解，保持结缔组织细胞的完整性；
2）后固定：将前固定后样品放入浓度为2.1%的单宁酸溶液中固定1.5h，然后用0.11M磷酸缓冲液清洗9min，反复清洗4次，再用浓度为0.8%的四氧化锇固定2.5h，最后用0.11M磷酸缓冲液清洗9min，反复清洗4次，然后用2-3%的冷冻保护剂溶液清洗9min，反复清洗4次，即得后固定样品，上述冷冻保护剂为海藻糖和糖苷，其重量比为1:0.6，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:92，冷冻干燥过程中，左旋糖苷和右旋糖苷的合理比例能增加溶液的粘度，使得糖苷在结缔组织的蛋白质分子之间产生位阻，同时提高样品的玻璃化转变温度，能更好地抑制冰晶的形成，控制冷冻过程中的pH值的变化，保证冷冻干燥中结缔组织的稳定性，此外还能保护脱水步骤中的结缔组织不受破坏，该保护剂的加入不仅增大了水分子的表面张力，促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用，使得蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对较少的保护剂分子，保护结缔组织的天然构象，而且保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了结缔组织的天然结构和功能的完整性，该步骤中的单宁酸和锇酸能使脂肪酸和脂蛋白得以固定，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定，提高固定效果，同时由于固定彻底、渗透均匀，可以很好的保存组织结构，也不会造成样品发脆，此外，金属锇被结合在细胞表面，起到电子染色的作用，减少样品充放电效应，提高二次电子发射率，在电镜观察时不再出现由于脂类析出而覆盖于组织表面或损伤组织结构的现象，明显提高图像质量；
3）脱水：将后固定样品用体积浓度为50%、60%、70%、80%、90%的甲醇按浓度梯度由低到高顺序逐次脱水16min，最后用100%甲醇反复脱水3次，每次脱水16min，即得脱水样品，该步骤采用梯度甲醇脱水，在能除去样品中的水分的同时能保持样品的原状，不会使细胞体积或表面结构发生变化，从而确保扫描电镜的照片为其正常生活状态下的真实形态，且照片的分辨率高，不会使观察结果出现误差或失真，进而能更好地观察到较好的细微结构特征；
4）割断和置换：将脱水样品放入98%甲醇溶液中，利用液态氮快速冻结，冻结的试样用刀片迅速切断，放入叔丁醇中进行置换4次，每次14min，即可，该步骤中冻结试样的切割性能都比较好，不易使样品表面出现波浪型条纹，提高观察效果，同时以叔丁醇为升华介质，在冰冻后形成非晶体固态，不会产生冰晶，可避免冰晶和表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构，且能以最快的速度从固态升华，大为缩短了干燥时间；
5）冷冻干燥：将割断、置换后的样品利用型号为JFD-320的冻结干燥装置进行冷冻干燥处理，即得干燥样品，该步骤能使水分从固态直接转化为气态，不经过液态阶段，因而避免了气相和液相之间表面张力对样品的损伤，从而达到完全干燥的目的，同时冷冻干燥能较好地保持鲤鱼肌肉细胞外结缔组织的原状，提高样品的完整性，而且经过深度冷冻后形成断裂面，观察生物体的内部结构；
6）观察：将干燥好的样品粘附在样品台上，进行喷金处理，然后用扫描电子显微镜进行拍照记录，观察样品的表面和内部结构，通过观察发现扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察的结缔组织结构清晰，图像立体感强，能更好地观察到较好的细微结构特征。
实施例2：
一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，制备的具体步骤为：
1）将鲤鱼背部肌肉避开隔膜切成块，放入前固定液中固定5d，每23h更换一次固定液，然后吸出前固定液，加入含有2.1M NaOH和0.01mM三聚氯氰溶液震荡3d，每23h更换一次NaOH溶液，吸出NaOH溶液，再用0.09M的磷酸缓冲液清洗14h，即得前固定样品，上述前固定液中仲甲醛浓度为1.9%、戊二醛浓度为2.5%、磷酸缓冲液浓度为0.09M，前固定液的pH为7.3，NaOH和三聚氯氰能相互协同，彻底地除去结缔组织细胞外的蛋白多糖和胶原蛋白，有效地减少胞外基质和弹性纤维等杂质对结缔组织的影响，进而提高扫描电镜的清晰度，而且不会使结缔组织细胞随细胞质溶解或部分溶解，保持结缔组织细胞的完整性；
2）将前固定后样品放入浓度为1.9%的单宁酸溶液中固定2.5h，然后用0.09M磷酸缓冲液清洗12min，反复清洗4次，再用浓度为1.1%的四氧化锇固定1.5h，最后用0.09M磷酸缓冲液清洗12min，反复清洗4次，然后用2.8%的冷冻保护剂溶液清洗12min，反复清洗4次，即得后固定样品，上述冷冻保护剂为海藻糖和糖苷，其重量比为1:0.8，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:85；
3）将后固定样品用体积浓度为50%、60%、70%、80%、90%的甲醇按浓度梯度由低到高顺序逐次脱水16min，最后用98%甲醇反复脱水4次，每次脱水16min，即得脱水样品；
4）将脱水样品放入98%甲醇溶液中，利用液态氮快速冻结，冻结的试样用刀片迅速切断，放入叔丁醇中进行置换4次，每次14min，即可；
5）将割断、置换后的样品利用冻结干燥装置进行冷冻干燥处理，即得干燥样品；
6）将干燥好的样品粘附在样品台上，进行喷金处理，然后用扫描电子显微镜进行拍照记录，观察样品的表面和内部结构，通过观察发现扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察的结缔组织结构清晰，图像立体感强，能更好地观察到较好的细微结构特征。
实施例3：
一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法为：
将鲤鱼背部肌肉避开隔膜切成5×5×10mm块，放入前固定液中固定5d，每24h更换一次固定液，前固定液中仲甲醛浓度为2%、戊二醛浓度为2.5%、磷酸缓冲液浓度为0.1M，前固定液的pH为7.2，然后吸出前固定液，加入2M NaOH溶液，每24h更换一次NaOH溶液，震荡3d，吸出NaOH溶液，再用0.1M磷酸缓冲液清洗12h，即得前固定样品；将前固定后样品放入浓度为2%的单宁酸溶液中固定2h，然后用0.1M磷酸缓冲液清洗10min，反复清洗3次，再用1%四氧化锇固定2h，最后用0.1M磷酸缓冲液清洗10min，反复清洗3次，然后用2.5%的冷冻保护剂溶液清洗10min，反复清洗3次，冷冻保护剂为重量比为1:0.7的海藻糖和糖苷，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:88，即得后固定样品；将后固定样品用体积浓度为50%、60%、70%、80%、90%的甲醇按浓度梯度由低到高顺序逐次脱水15min，最后用99%甲醇反复脱水3次，每次脱水15min，即得脱水样品；将脱水样品放入99%甲醇溶液中，利用液态氮快速冻结，冻结的试样用刀片迅速切断，放入叔丁醇中进行置换15min/次，重复3次，即可；将割断、置换后的样品利用冻结干燥装置进行冷冻干燥处理，即得干燥样品；将干燥好的样品粘附在样品台上，进行喷金处理，然后用扫描电子显微镜进行拍照记录。
本实施例鲤鱼肌肉细胞外结缔组织的扫描电镜图如图1所示，扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察的结缔组织结构清晰，图像立体感强，能更好地观察到较好的细微结构特征，图中鲤鱼肌肉细胞外结缔组织呈现蜂窝状结构，并且蜂窝孔的大小相同，表明本实施例制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法较好。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，包括前固定、后固定、脱水、割断和置换、冷冻干燥、观察，其特征在于：
所述的前固定步骤为：将鲤鱼背部肌肉避开隔膜切成块，放入前固定液中固定，然后吸出前固定液，再加入NaOH溶液震荡，吸出NaOH溶液，最后用磷酸缓冲液清洗；
所述的后固定步骤为：将前固定后样品放入单宁酸溶液中固定，然后用0.09-0.11M磷酸缓冲液清洗9-12min，反复清洗3-4次，再用四氧化锇固定，最后用0.09-0.11M磷酸缓冲液清洗9-12min，反复清洗3-4次，再用冷冻保护剂溶液清洗9-12min，反复清洗3-4次，即得后固定样品；
所述的脱水步骤为：将后固定样品用体积浓度为50-90％的甲醇按浓度梯度由低到高顺序逐次脱水14-16min，最后用98-100％甲醇反复脱水3-4次，每次脱水14-16min；
所述的割断和置换步骤为：将脱水样品放入98-100％甲醇溶液中，利用液态氮快速冻结，冻结的试样用刀片迅速切断，放入叔丁醇中进行置换3-4次，每次14-16min；
所述的冷冻干燥步骤为：将割断、置换后的样品利用冻结干燥装置进行冷冻干燥处理，即得干燥样品；
所述的观察步骤为：将干燥好的样品粘附在样品台上，进行喷金处理，然后用扫描电子显微镜进行拍照记录，观察样品的表面和内部结构；
所述的前固定步骤中NaOH溶液浓度为1.8-2.2M，震荡3-4d，每22-24h更换一次NaOH溶液；
所述的后固定步骤中冷冻保护剂的浓度为2-3％，冷冻保护剂为海藻糖和糖苷，其重量比为1:0.6-0.8；
所述的后固定步骤中糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:83-92。
2.根据权利要求1所述的一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，其特征在于：所述的前固定步骤中前固定液中仲甲醛浓度为1.9-2.1％、戊二醛浓度为2.3-2.6％、磷酸缓冲液浓度为0.09-0.11M，pH为7.0-7.3，前固定液固定4-5d，每22-24h更换一次固定液。
3.根据权利要求1所述的一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，其特征在于：所述的前固定步骤中磷酸缓冲液的浓度为0.09-0.11M，清洗10-14h。
4.根据权利要求1所述的一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，其特征在于：所述的后固定步骤中单宁酸溶液的浓度为1.8-2.1％，固定1.5-2.5h，四氧化锇的浓度为0.8-1.1％，固定1.5-2.5h。
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