CN107014843B - 一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法。将白蚁放置于特制风洗装置中，风洗后投入特制辅助抽真空装置中，进行抽真空操作使白蚁下沉，先前固定再解剖，并先后在体视镜视野下和超声清洗仪中前漂洗，再进行后固定和后漂洗及逐级梯度脱水，接着放入特制滤纸筒中并封闭放入临界点干燥框进行临界点干燥，在体视镜下贴台粘样，对部分样品进一步解剖下目标组织、二次粘样，并将非二次粘样样品用导电银胶将样品非目标观察区域与粘样胶带进行连接，待银胶干燥后进行全方位喷金处理。本发明有效解决了样品表面污染、在固定液中难以下沉、样品皱缩变形以及样品组织不同部位相互遮挡、在电镜中观察时样品充放电等背景技术中提到的多方面技术问题，解决问题的成本低，具有较大的应用价值。

Description

一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法

技术领域

本发明涉及了一种生物样品处理方法，尤其是涉及一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法。

背景技术

白蚁是世界五大害虫之一,可对房屋建筑、绿化及经济林木、水库堤坝、农林作物、名胜古迹、地下电缆、船舶桥梁、文物档案、家具衣服等造成破坏，不仅造成严重的经济损失，还给人们的生命安全带来严重威胁。目前全世界已知白蚁近3000种，我国已知白蚁近500种，近几十年来，随着全球气候不断变暖，我国白蚁危害也日趋严重，每年因白蚁危害造成的经济损失重大。

白蚁的头部着生有触角、下颚须、下唇须等重要的感觉附肢，在白蚁感受外界各种机械及化学信息、觅食、取食等行为过程中起着重要作用，然而目前对于白蚁感觉器官的研究较少，相关方法也尚需进一步完善。虽然扫描电镜的样品处理技术已比较成熟，但在利用扫描电镜技术对我国几种主要危害白蚁的触角及口器进行研究过程中，我们仍然遇到了许多技术问题。

首先，是样品表面污染的问题：(1)白蚁一般营土栖或木栖的穴居生活，生活环境相对密闭，在将其从木材或泥土取出过程中，白蚁身体表面都可能存有污秽；(2)按照传统的昆虫样品扫描电镜技术处理路线，一般活体昆虫在被杀死或麻痹后需立即在固定液中解剖下所需部位，而后投入醛类固定剂中进行固定，而刚刚死亡或处于麻痹状态的白蚁，在被解剖下头部及相关感觉附肢后，体内溢出物都非常多，很容易污染样品表面，从而极大地影响实验结果和数据统计。

其次，是样品在固定液中难以下沉的问题：无论是白蚁整体还是其局部解剖组织，在将其放入醛类固定剂中进行前固定时，总是漂浮在固定剂液面之上，即使对其进行抽真空操作，也很难下沉，而且在对样品进行抽真空操作环节，时间过长将不利于样品的固定。

第三，是样品组织不同部位相互遮挡以及由此而衍生的相关问题：在以白蚁头部为样本载体，对白蚁触角及主要口器感觉附肢下颚须及下唇须进行背面及腹面场观察统计时，发现下颚须及下唇须容易相互遮挡，下颚须、下唇须及触角容易被各自毗连组织及头部其他部位不同程度地遮挡，因此，若要对白蚁下颚须、下唇须及触角感器进行全面详细的背腹面场观察统计，必需将其分别从头部解剖下来。但经过解剖脱离头部的下颚须、下唇须及触角，却更加难以沉入固定液中，同时由于失去了头部的位置参考，在对样品进行贴台操作时，样品的背腹面场更加难以区分。

第四，是样品皱缩、变形的问题：白蚁触角呈念珠状，在样品处理及干燥过程中，由于固定不够充分或样品临界点干燥过程中操作不当，极有可能导致触角扭曲及样品表皮及附属感器变形，影响样品的微观表面形貌，从而影响对样品表面细节的高清观察，给实验观察及统计带来不便。

第五，是在扫描电子显微镜中进行高倍观察时样品充放电的问题：由于观察对象是白蚁感觉附肢及其上突起悬空的各种感器，因此在较高放大倍数下对表面细节进行高清观察时，感器悬空部分由于没有导电介质的连接而很容易产生严重充放电现象。

发明内容

为克服现有技术中存在的缺点，本发明提供了一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法，有效解决了样品表面污染、在固定液中难以下沉、样品皱缩变形以及样品组织不同部位相互遮挡、在电镜中观察时样品充放电等背景技术中提到的多方面技术问题。

本发明采用的技术方案是：

1)将白蚁放置于两面通风的特制风洗装置中，用冷风源向特制风洗装置吹风进行风洗以除去白蚁体表的浮沉和污秽；

2)将经风洗的白蚁投入盛有醛类固定液的特制辅助抽真空装置中，进行抽真空操作，使得白蚁下沉到电镜样品处理前固定液中；

3)将已沉入前固定液中的白蚁置于4℃下进行充分前固定，前固定结束后取出虫体在冰上进行解剖，然后将解剖后获得的目的组织放入0－4℃缓冲液中在体视镜视野中进行漂洗，漂洗至在体视镜视野下观察不到白蚁样品表面存有体内溢出物质；

4)将漂洗后的样本放入0－4℃的缓冲液中，用超声清洗仪进行脱气清洗，期间更换新的缓冲液重复多次，直到将白蚁样品表面清洗干净，同时又不损伤样品为宜；

5)将白蚁样品进行后固定，后固定至样品经干燥后形态饱满又不易发生断裂为宜，再经后漂洗及逐级脱水处理后放入特制滤纸筒中并封闭特制滤纸筒，再将特制滤纸筒放入临界点干燥框中并使之与临界点干燥框内壁牢固紧贴，进行临界点干燥；

6)放样前分别将滤纸筒、临界点干燥框下部用纯脱水剂浸润，以保持白蚁样品在纯脱水剂处理后一直处于纯脱水剂浸润状态；

7)在体视镜下对充分干燥后的白蚁样品进行贴台粘样，并用精细解剖镊和精细解剖针根据需要对目标组织进一步解剖、二次粘样；

8)用精细解剖针蘸取导电银胶将白蚁样品非目标观察区域与粘样胶带进行连接；

9)待银胶干燥后，对白蚁样品及样品台进行偶数次对称喷金处理，从而完成白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理。

所述步骤3)中的充分前固定的时间为24h－7d。

所述步骤7)和8)中的精细解剖针为据实验所需选用不同型号昆虫针用不同目数砂纸磨制而成。

所述步骤9)喷金处理具体是：将样品台依次沿东、南、西、北四个方向倾斜放置，每个方向倾斜放置的喷涂时间为预设总时间的1/4。

所述的特制装置包括筒体、筛网和手柄，筒体的两端端面均设置有筛网，筒体侧面连接有用于手握的手柄。

所述的特制辅助抽真空装置包括锥形管、管盖、中空圆台、透气耐水表面洁净平整的可折叠材料、液面和通孔，锥形管从顶端到底端直径逐渐变小，锥形管底端封闭，锥形管顶端开口并连接有管盖，管盖上开有用于抽真空的通孔，锥形管内盛有电镜样品处理前固定液，白蚁或其头部感觉附肢置于前固定液；锥形管内还置有两端开口的中空圆台，两端开口的中空圆台底端覆有透气耐水表面洁净平整的可折叠材料，透气耐水表面洁净平整的可折叠材料与前固定液的液面相平齐接触。

所述的两端开口的中空圆台大端朝下并覆有透气耐水表面洁净平整的可折叠材料，小端朝上并开口。

所述的透气耐水表面洁净平整的可折叠材料采用滤纸、无尘纸或者擦镜纸。

所述的特制滤纸筒是由滤纸通过折卷而成，滤纸沿短边方向卷曲成具有中空内腔的筒状结构，然后再两端向中间弯折使得中空内腔与外界不直接相通。

本发明的有益效果是：

本发明有效解决了样品表面污染、在固定液中难以下沉、样品皱缩变形以及样品组织不同部位相互遮挡、在电镜中观察时样品充放电等背景技术中提到的多方面技术问题，能够使得白蚁样品在处理过程中表面不发生污染、通过特制辅助抽真空装置使样品在前固定液中容易下沉、样品不会皱缩变形、样品组织不同部位不会因相互遮挡而无法计数、样品组织不会因解剖而无法区分背腹面、不会产生严重充放电现象而影响观察，解决问题的成本低，具有较大的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中的特制风洗装置结构示意图。

图2为本发明实施例中的特制辅助抽真空装置结构示意图。

图3为本发明特制滤纸筒的原始滤纸状态示意图。

图4为本发明特制滤纸筒卷曲后的状态示意图。

图5为本发明特制滤纸筒弯折后的状态示意图。

图中：特制风洗装置1、筒体11、筛网12、手柄13；特制辅助抽真空装置2、锥形管21、管盖22、中空圆台23、透气耐水表面洁净平整的可折叠材料24、液面25、通孔26；特制滤纸筒3、滤纸31。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的具体实施例及其实施过程是：

1)首先挑取实验所需白蚁，将白蚁放置于如图1所示的两面通风的特制风洗装置1的筒体11内，白蚁被封闭在两端的筛网12中，手握着手柄13用冷风源进行风洗，除去白蚁体表的浮沉、污秽等。

2)将经过初步风洗的白蚁投入如图2所示的盛有醛类固定液的特制辅助抽真空装置2中，进行抽真空操作，具体实施锥形管21与两端开口的中空圆台23为成套定制，两端开口的中空圆台23两端半径有不同型号，分别可卡在锥形管1/4、1/3、1/2处，透气耐水表面洁净平整的可折叠材料24采用滤纸：

先将醛类固定液倒入到锥形管中，醛类固定液液面25高度占1/3的锥形管长度。然后将通风清洗处理后的白蚁投入盛有醛类固定液的锥形管中，白蚁会漂浮在液面25表面，放入两端开口的中空圆台23，并使得两端开口的中空圆台23底面大端的滤纸与醛类固定液的液面25相平齐，白蚁位于滤纸与液面25之间。

最后盖上管盖22，放入真空干燥器中进行抽真空操作，抽真空3-5min，白蚁即下沉到醛类固定液内到离心管的底部。

3)将沉入前固定液中的白蚁置于4℃冰箱进行前固定4d，再取出白蚁的虫体放在冰上进行解剖，解剖下颚连带下颚须、下唇连带下唇须或头部连带触角等组织，同时将解剖下的组织放入0-4℃冰冷的0.1mol/L PBS缓冲液中进行漂洗，漂洗时通过体视镜观察直至在体视镜视野范围内肉眼观察不到样品表面存有体内溢出物质。

4)将经过前固定、解剖和初步前漂洗的样本放入0-4℃冰冷的0.1mol/L PBS缓冲液中，用超声清洗仪脱气前漂洗样品30s，然后更换新的缓冲液，重复2次，每次30s。

5)后固定：将样品按常规处理步骤进行后固定，并控制后固定时间为45min，后固定完成后进行后漂洗和脱水。

7)将如图3所示的已经剪裁成长椭圆形的滤纸31沿短边方向卷曲成具有中空内腔的筒状结构，如图2所示，并用纯脱水剂浸润，将经过脱水处理的白蚁样品通过中空内腔的筒状结构的两端放入中间部位，然后将两端向中间弯折使得中空内腔与外界不直接相通，如图3所示，使其封闭制成特制滤纸筒3。

8)将滤纸筒(3)迅速转移入底部浸泡于纯脱水剂中的临界点干燥框内并使之与临界点干燥框内壁牢固紧贴，放入临界点干燥仪中进行临界点干燥。

9)取出充分干燥的白蚁样品在双筒解剖镜下进行贴台和粘样：

先将样品在显微镜下进行背腹面场的充分辨认，然后直接将其粘附在样品台的双面导电胶上，并用精细解剖针蘸取适量银导电胶将白蚁样品的非目标观察区域与双面导电胶进一步连接。同时将部分已经按照背面场及腹面场进行贴台的样品的下颚、下唇、触角用精细解剖针轻轻解剖下来，将脱离下颚须、下唇须及头部的下颚、下唇及触角粘附在解剖针上，分别按照背腹面场进行贴台。粘样时，所有白蚁样品的目标观察区域朝上。

10)待银导电胶干燥后，将样品放入离子溅射仪中进行喷金处理，喷金时将样品台倾斜放置，将样品台依次沿东、南、西、北四个方向倾斜放置，每个方向倾斜放置的喷涂时间为20s。

11)最后在场发射电镜中适当选用低倍电压在适当的工作距离进行观察拍照。

最终，本发明实施例有效解决了样品表面污染、在固定液中难以下沉、样品皱缩变形以及样品组织不同部位相互遮挡、在电镜中观察时样品充放电等多方面技术问题，能够使得白蚁样品在处理过程中表面不发生污染、通过特制辅助抽真空装置使样品在前固定液中容易下沉、样品不会皱缩变形、样品组织不同部位不会因相互遮挡而无法计数、样品组织不会因解剖而无法区分背腹面、不会产生严重充电现象而影响观察。

Claims (6)

1.一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于方法包括以下步骤：

1)将白蚁放置于两面通风的特制风洗装置(1)中，用冷风源向特制风洗装置(1)吹风进行风洗以除去白蚁体表的浮沉和污秽；

2)将经风洗的白蚁投入盛有醛类固定液的特制辅助抽真空装置(2)中，进行抽真空操作，使得白蚁下沉到电镜样品处理前固定液中；

3)将已沉入前固定液中的白蚁置于4℃进行充分前固定，前固定结束后取出虫体在冰上进行解剖，然后将解剖后获得的目的组织放入0－4℃缓冲液中在体视镜视野中进行漂洗，漂洗至在体视镜视野下观察不到白蚁样品表面存有体内溢出物质；

4)将漂洗后的样本放入0－4℃的缓冲液中，用超声清洗仪进行脱气清洗，期间更换新的缓冲液重复多次，直到将白蚁样品表面清洗干净；

5)将白蚁样品进行后固定，再经后漂洗及逐级脱水处理后放入特制滤纸筒(3)中并封闭特制滤纸筒(3)，再将特制滤纸筒(3)放入临界点干燥框中并与临界点干燥框内壁牢固紧贴，进行临界点干燥；

6)放样前，滤纸筒(3)和临界点干燥框下部先用纯脱水剂浸润；

7)在体视镜下对充分干燥后的白蚁样品进行贴台粘样，用解剖镊和解剖针解剖下样品的目标组织二次粘样；

8)用精细解剖针蘸取导电银胶将非二次粘样样品的非目标观察区域与粘样胶带进行连接；

9)待银胶干燥后，对白蚁样品及样品台进行偶数次对称喷金处理；

所述的特制风洗装置(1)包括筒体(11)、筛网(12)和手柄(13)，筒体(11)的两端端面均设置有筛网(12)，筒体(11)侧面连接有用于手握的手柄(13)；

所述的特制辅助抽真空装置(2)包括锥形管(21)、管盖(22)、中空圆台(23)、透气耐水表面洁净平整的可折叠材料(24)、液面(25)和通孔(26)，锥形管(21)从顶端到底端直径逐渐变小，锥形管(21)底端封闭，锥形管(21)顶端开口并连接有管盖(22)，管盖(22)上开有用于抽真空的通孔(26)，锥形管(21)内盛有电镜样品处理前固定液，白蚁或其头部感觉附肢置于前固定液；锥形管(21)内还置有两端开口的中空圆台(23)，两端开口的中空圆台(23)底端覆有材料(24)，材料(24)与前固定液的液面(25)相平齐接触；

所述的特制滤纸筒(3)是由滤纸(31)通过折卷而成，滤纸(31)沿短边方向通过弯折或者卷曲成具有中空内腔的筒状结构，然后再两端向中间弯折使得中空内腔与外界不直接相通。

2.根据权利要求1所述的一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于：所述步骤3)中的充分前固定的时间为24h－7d。

3.根据权利要求1所述的一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于：所述步骤7)和8)中的精细解剖针为据实验所需选用不同型号昆虫针用不同目数砂纸磨制而成。

4.根据权利要求1所述的一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于：所述步骤9)喷金处理具体是将样品台依次沿东、南、西、北四个方向倾斜放置，每个方向倾斜放置的喷涂时间为预设总时间的1/4。

5.根据权利要求1所述的一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于：所述的两端开口的中空圆台(23)大端朝下并覆有透气耐水表面洁净平整的可折叠材料(24)，小端朝上并开口。

6.根据权利要求1所述的一种白蚁头部感觉附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于：所述的透气耐水表面洁净平整的可折叠材料(24)采用滤纸、无尘纸或者擦镜纸。