CN102607908A - 一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法 - Google Patents

Abstract

一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法，它涉及一种淡水鱼精子扫描电镜样品制备方法。方法：一、固定液配制；二、样品固定；三、样品台准备；四、样品滴片；五、样品镀膜，即完成淡水鱼类精子扫描电镜样品制备。本发明优点在于：1)可避免因表面张力变化而引起精子断裂、开裂或龟裂等表面结构破坏；2)样品电镜观察时更清晰；3)精子分散均匀、密度适中，利于获得单个精子完整形态观察结果；4)可避免样品受到外力机械损伤；5)可避免样品层太厚影响观察效果；6)可避免电镜观察时精子头部与鞭毛光线反差过大。本发明的技术特点是方法简便、易操作，精子完整率高、分布密度适中，技术成本低，可应用于淡水鱼类精子扫描电镜样品的制备。

Description

一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法

技术领域

本发明涉及一种淡水鱼精子扫描电镜样品制备方法。

背景技术

在鱼类的人工繁育过程中，人们主要关注卵子的质量，对精子质量没引起足够的重视。然而鱼类个体之间精子质量差异较大，如个体大小、养殖温度和模式、营养状况和催产药物使用情况等会影响到精子的质量，鱼类精子活力和质量是人工繁殖的基本保证，关系到苗种生产的成败，因此研究精子的超微结构对于获得高质量雄性配子、确保人工繁殖成功具有重要意义。这项工作需要借助电子显微镜的应用，通过扫描电镜对精子形态进行观察，可以了解精子表面的结构细节，阐明光镜未能观察到的精子超微结构。从20世纪七十年代开始，陆续有学者对鱼类精子形态及微细结构开展研究。鱼类精子一般由头部、颈部和较长的尾部组成，各部位的结构和含水量不相同，在传统方法脱水、干燥、粘样等过程中，容易因表面张力变化和外力机械损伤而引起精子开裂或龟裂、断裂等，使得表面结构被破坏，导致观察效果差和难于作微细形态学分析。贵阳医学院学报2008年10月第33卷第5期刊登的“人精子扫描电镜样品的制备与观察”，提供了一种用于人精子扫描电镜样品的制备方法。该方法应用在鱼类精子扫描电镜中存在的不足有：1)乙醇脱水、干燥过程使鱼类精子变脆、易造成断裂等机械损伤；2)精子样品密度难以控制；3)用玻璃刀裁切含有样品部位不易操作。由于精子是非常特殊的游离细胞，不易进行常规电镜制样处理，且精液中含有较多的精浆成分，会影响电镜观察。为了适应鱼类精子扫描电镜的要求，更好的显露表面形态结构，在制样过程中必须进行特殊处理，才能制备保持高度完整性和良好形态结构特征的鱼类精子扫描电镜观察样品。

发明内容

本发明目的是提供一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法。

淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法按以下步骤实现：

一、固定液配制：

用0.2M磷酸氢二钠溶液的母液A和0.2M磷酸二氢钠溶液的母液B按体积比为18∶7的比例混合并用纯水稀释成pH7.2、0.1M的PBS磷酸盐缓冲液，然后用该PBS磷酸盐缓冲液稀释戊二醛溶液，使戊二醛终浓度为2.5％，获得固定液；

二、样品固定：

将新采集的成熟雄鱼精液于4℃、2500r/min条件下离心3min，弃去上清液，加入2倍体积的固定液，30min后于2500r/min条件下离心3min、弃上清液，加入固定液，获得精子固定样品，置于4℃条件下备用；

三、样品台准备：

在金属样品台上贴好镀碳导电胶布，清洗裁剪后规格为0.5cm×1.5cm的盖玻片、擦干后粘贴到镀碳导电胶布上，每块玻片的位置做好标识；

四、样品滴片：

将精子固定样品用配制的PBS磷酸盐缓冲液冲洗2～3次，然后加入配制的PBS磷酸盐缓冲液稀释成浓度数量级为10⁶～10⁷个/ml，混合均匀后用10μl微量加样枪贴近步骤三中样品台上的玻片逐滴滴片，用无菌注射器针头从滴液中心向四周做发散状划线，静置1～2min后，用滤纸轻轻吸干玻片上的液体，放入干燥器干燥1～2天，获得干燥好的样品台；

五、样品镀膜：

将干燥好的样品台用离子溅射镀膜仪喷金90～110s，在精子样品表面均匀镀上一层厚度为9～11nm的金膜，完成镀金的精子样品可在扫描电子显微镜下观察，即完成淡水鱼类精子扫描电镜样品制备。

本发明对精子样品未进行脱水前处理，原理：1)鱼类精子内部几乎完全由遗传物质组成，含水量很少，远低于其它需要进行脱水干燥的生物样品(70％～80％)。含水量较低的生物样品(如毛发、牙齿、角质等)可以直接镀膜观察；含水量高的样品如果放入镜体直接观察，由于水分蒸发样品就会收缩变形较大，表面微细结构被破坏，并且水蒸气污染物镜、光阑等重要零部件，影响观察效果。因此，含水量较少的鱼类精子样品可以不脱水处理。2)鱼类精子的外层是细胞质膜，与其它生物样品有细胞壁或纤维组织保持形态不同，经脱水干燥后精子变脆，很容易发生断裂、开裂或龟裂等表面结构破坏。

本发明的优点在于：1)精子固定后的样品不经过乙醇脱水、干燥，可避免因表面张力变化而引起精子断裂、开裂或龟裂等表面结构破坏；2)精液固定后经PBS磷酸盐缓冲液冲洗2～3次，可去除精浆等其它成分，使样品电镜观察时更清晰；3)精子滴片前用PBS磷酸盐缓冲液稀释成浓度数量级为10⁶～10⁷个/ml，使精子分散均匀、密度适中，利于获得单个精子完整形态观察结果；4)先粘贴盖玻片、后滴片，可避免样品受到外力机械损伤；5)滴片时采用微量加样枪，并用针头分散滴液，可避免样品层太厚影响观察效果；6)镀膜仪喷金时间控制在90～110s，使精子样品表面金膜厚度为9～11nm，可避免电镜观察时精子头部与鞭毛光线反差过大。

本发明的技术特点是方法简便、易操作，精子完整率高、分布密度适中，技术成本低，可应用于淡水鱼类精子扫描电镜样品的制备。

附图说明

图1为实施例中所得鱼类精子扫描电镜样品放大2500倍的扫描电镜图；图2为实施例中所得鱼类精子扫描电镜样品放大1800倍的扫描电镜图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法按以下步骤实现：

一、固定液配制：

用0.2M磷酸氢二钠溶液的母液A和0.2M磷酸二氢钠溶液的母液B按体积比为18∶7的比例混合并用纯水稀释成pH7.2、0.1M的PBS磷酸盐缓冲液，然后用该PBS磷酸盐缓冲液稀释戊二醛溶液，使戊二醛终浓度为2.5％，获得固定液；

二、样品固定：

将新采集的成熟雄鱼精液于4℃、2500r/min条件下离心3min，弃去上清液，加入2倍体积的固定液，30min后于2500r/min条件下离心3min、弃上清液，加入固定液，获得精子固定样品，置于4℃条件下备用；

三、样品台准备：

在金属样品台上贴好镀碳导电胶布，清洗裁剪后规格为0.5cm×1.5cm的盖玻片、擦干后粘贴到镀碳导电胶布上，每块玻片的位置做好标识；

四、样品滴片：

将精子固定样品用配制的PBS磷酸盐缓冲液冲洗2～3次，然后加入配制的PBS磷酸盐缓冲液稀释成浓度数量级为10⁶～10⁷个/ml，混合均匀后用10μl微量加样枪贴近步骤三中样品台上的玻片逐滴滴片，用无菌注射器针头从滴液中心向四周做发散状划线，静置1～2min后，用滤纸轻轻吸干玻片上的液体，放入干燥器干燥1～2天，获得干燥好的样品台；

五、样品镀膜：

将干燥好的样品台用离子溅射镀膜仪喷金90～110s，在精子样品表面均匀镀上一层厚度为9～11nm的金膜，完成镀金的精子样品可在扫描电子显微镜下观察，即完成淡水鱼类精子扫描电镜样品制备。

本实施方式步骤一中戊二醛溶液为市售的质量浓度25％的戊二醛溶液。

本实施方式步骤二中精子的来源：繁殖季节挑选成熟度好的雄淡水鱼，进行促黄体素释放激素A₂(LHRH-A₂)和绒促性素(HCG)混合激素催熟，使用剂量为LHRH-A₂4μg/kg，HCG200IU/kg，腹腔一次注射，调节水温22～24℃，10h后可采到活力良好的新鲜精子样品。

本实施方式步骤三中样品台准备的具体过程：在金属样品台上贴好镀碳导电胶布，每隔1～1.5cm用刀切割1～2mm的分割线，将盖玻片用镊子和刀片裁剪成0.5cm×1.5cm的小块，清洗、擦干后粘贴到镀碳导电胶布上，每块玻片的位置做好标识。

本实施方式步骤四中精子固定样品用配制的PBS磷酸盐缓冲液冲洗2～3次，可去除精浆等其它成分，使样品电镜观察时更清晰。

本实施方式步骤四中加入配制的PBS磷酸盐缓冲液稀释成浓度数量级为10⁶～10⁷个/ml，使精子分散均匀、密度适中，利于获得单个精子完整形态观察结果。

本实施方式步骤五中离子溅射镀膜仪的型号为日产E-1010(HITACHI)型。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤四中将精子固定样品用配制的PBS磷酸盐缓冲液冲洗2次，然后加入配制的PBS磷酸盐缓冲液稀释成浓度数量级为10⁶个/ml。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是，步骤五中将干燥好的样品台用离子溅射镀膜仪喷金100s，在精子样品表面均匀镀上一层厚度为10nm的金膜。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

实施例：

淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法按以下步骤实现：

一、固定液配制：

用0.2M磷酸氢二钠溶液的母液A和0.2M磷酸二氢钠溶液的母液B按体积比为18∶7的比例混合并用纯水稀释成pH7.2、0.1M的PBS磷酸盐缓冲液，然后用该PBS磷酸盐缓冲液稀释戊二醛溶液，使戊二醛终浓度为2.5％，获得固定液；

二、样品固定：

将新采集的成熟雄鱼精液于4℃、2500r/min条件下离心3min，弃去上清液，加入2倍体积的固定液，30min后于2500r/min条件下离心3min、弃上清液，加入固定液，获得精子固定样品，置于4℃条件下备用；

三、样品台准备：

在金属样品台上贴好镀碳导电胶布，清洗裁剪后规格为0.5cm×1.5cm的盖玻片、擦干后粘贴到镀碳导电胶布上，每块玻片的位置做好标识；

四、样品滴片：

将精子固定样品用配制的PBS磷酸盐缓冲液冲洗3次，然后加入配制的PBS磷酸盐缓冲液稀释成浓度数量级为10⁶个/ml，混合均匀后用10μl微量加样枪贴近步骤三中样品台上的玻片逐滴滴片，用无菌注射器针头从滴液中心向四周做发散状划线，静置2min后，用滤纸轻轻吸干玻片上的液体，放入干燥器干燥2天，获得干燥好的样品台；

五、样品镀膜：

将干燥好的样品台用离子溅射镀膜仪喷金100s，在精子样品表面均匀镀上一层厚度为10nm的金膜，完成镀金的精子样品可在扫描电子显微镜下观察，即完成淡水鱼类精子扫描电镜样品制备。

本实施例步骤一中戊二醛溶液为市售的质量浓度25％的戊二醛溶液。

本实施例步骤二中精子的来源：繁殖季节挑选成熟度好的雄鲤鱼，进行促黄体素释放激素A₂(LHRH-A₂)和绒促性素(HCG)混合激素催熟，使用剂量为LHRH-A₂4μg/kg，HCG200单位/kg，腹腔一次注射，调节水温22～24℃，10h后可采到活力良好的新鲜精子样品。

本实施例步骤五中离子溅射镀膜仪的型号为日产E-1010(HITACHI)型。

本实施例与常用方法优缺点对比：见表1。

表1扫描电镜常用制样方法与本实施例方法优缺点

本实施例制备所得鱼类精子扫描电镜样品，用S-3400N(HITACHI)扫描电镜观察，电镜参数设置：图像模式为SE，束流70nA，工作距10mm，样品台倾斜0，亮度对比度为自动加手动，焦距为手动，加速电压为5.00KV，放大倍数1.50K～2.50K。结果如图1和2所述，在扫描电子显微镜下，精子形态完整、发生断裂的较少，分散均匀、易获得单个清晰的精子扫描图片。

Claims (3)

1.一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法，其特征在于：淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法按以下步骤实现：

一、固定液配制：

用0.2M磷酸氢二钠溶液的母液A和0.2M磷酸二氢钠溶液的母液B按体积比为18∶7的比例混合并用纯水稀释成pH7.2、0.1M的PBS磷酸盐缓冲液，然后用该PBS磷酸盐缓冲液稀释戊二醛溶液，使戊二醛终浓度为2.5％，获得固定液；

二、样品固定：

将新采集的成熟雄鱼精液于4℃、2500r/min条件下离心3min，弃去上清液，加入2倍体积的固定液，30min后于2500r/min条件下离心3min、弃上清液，加入固定液，获得精子固定样品，置于4℃条件下备用；

三、样品台准备：

在金属样品台上贴好镀碳导电胶布，清洗裁剪后规格为0.5cm×1.5cm的盖玻片、擦干后粘贴到镀碳导电胶布上，每块玻片的位置做好标识；

四、样品滴片：

将精子固定样品用配制的PBS磷酸盐缓冲液冲洗2～3次，然后加入配制的PBS磷酸盐缓冲液稀释成浓度数量级为10⁶～10⁷个/ml，混合均匀后用10μl微量加样枪贴近步骤三中样品台上的玻片逐滴滴片，用无菌注射器针头从滴液中心向四周做发散状划线，静置1～2min后，用滤纸轻轻吸干玻片上的液体，放入干燥器干燥1～2天，获得干燥好的样品台；

五、样品镀膜：

将干燥好的样品台用离子溅射镀膜仪喷金90～110s，在精子样品表面均匀镀上一层厚度为9～11nm的金膜，完成镀金的精子样品可在扫描电子显微镜下观察，即完成淡水鱼类精子扫描电镜样品制备。

2.根据权利要求1所述的一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法，其特征在于：步骤四中将精子固定样品用配制的PBS磷酸盐缓冲液冲洗2次，然后加入配制的PBS磷酸盐缓冲液稀释成浓度数量级为10⁶个/ml。

3.根据权利要求1或2所述的一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法，其特征在于：步骤五中将干燥好的样品台用离子溅射镀膜仪喷金100s，在精子样品表面均匀镀上一层厚度为10nm的金膜。

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