CN105158518A

CN105158518A - 一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法

Info

Publication number: CN105158518A
Application number: CN201510611888.7A
Authority: CN
Inventors: 白波; 曾智; 胡娜; 索有瑞; 徐恒
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明提供了一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法：样品固定时，用至少两种不同浓度的戊二醛溶液依次处理样品，且后一次戊二醛的浓度高于前一次戊二醛的浓度。本发明方法没有应用剧毒的锇酸，创新性地应用了梯度浓度戊二醛多次固定，固定效果好，安全便捷，为毛癣菌的扫描电镜制样提供了一种新的方法。

Description

一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

样品的前处理是电镜观察的必备过程，其处理效果的好坏直接关系到电镜观察的结果。

由于毛癣菌的菌丝均呈团状，且有些较厚，在样品处理过程中，存在着与试剂接触不充分的现象，导致样品处理不均匀，结果无法准确判断。通过多次的重复实验发现，电镜制样过程中最重要的一步是固定，若是固定效果不好，后续处理也不能起到很好地改善作用。

目前最常用的方法为戊二醛-锇酸(四氧化锇)双重固定，但锇酸是剧毒物品，接触或吸入可导致头痛、呼吸道炎症、眼病、支气管病、肺炎等，对实验人员的健康构成严重的潜在威胁，有必要研究一种低毒的固定方法以代替传统的双重固定法。也有研究单用戊二醛固定，但易使菌体皱缩，效果不能使人满意。

发明内容

本发明研究了一种毛癣菌扫描电镜(SEM)样品的制备方法，它的精髓在于，样品固定时，用至少两种不同浓度的戊二醛溶液依次处理样品，且后一次戊二醛的浓度高于前一次戊二醛的浓度。

其中，首次处理的戊二醛浓度为2％。

进一步地，第二次处理的戊二醛的浓度为2.5％。

优选地，在4℃条件下，2％戊二醛溶液处理1h，然后2.5％戊二醛溶液处理1h。

2.5％戊二醛溶液处理1h后，继续在4℃条件下过夜处理，进入后续常规处理步骤。

此外，在2.5％戊二醛溶液处理1h后，还可以进行第三次固定处理，第三次固定处理的戊二醛的浓度为3％。

优选地，在4℃条件下，2％戊二醛溶液处理1h，然后2.5％戊二醛溶液处理1h，接着3％戊二醛溶液处理1h。

3％戊二醛溶液处理1h后，继续在4℃条件下过夜处理，进入后续常规处理步骤。

上述处理方法可应用于各种毛癣菌，用于须癣毛癣菌效果更优。

通常微生物菌丝用于扫描电镜样品的制备包括菌丝活化、样品准备、固定、清洗、脱水、喷金等各种步骤。

本发明集中于解决其中最核心的问题，即样品的固定问题，其他各步骤可参照一般的样品处理方法。

本发明方法没有应用剧毒的锇酸，创新性地应用了梯度浓度戊二醛多次固定，固定效果好，安全便捷，为毛癣菌的扫描电镜制样提供了一种新的方法。

附图说明

图1各不同固定处理SEM观察结果

具体实施方式

实施例1：须癣毛癣菌扫描电镜样品的制备

1材料与试剂：

1.1实验材料：须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)

1.2试剂：蛋白胨、葡萄糖、琼脂、PH7.2的磷酸缓冲液(PBS)、25％戊二醛、乙醇、丙酮、叔丁醇

1.3主要实验仪器：超净工作台、培养箱、移液器、冰箱、高压灭菌锅，冷冻干燥仪，离子溅射仪，场发射扫描电镜(FESEM)。

1.4样品准备

1.4.1菌丝活化

SDA平板配制：称取蛋白胨10g、葡萄糖20g、琼脂18g，定容至1L，121℃、灭菌30min，在培养基凝固之前倒平板，备用；

菌种活化：将菌种接种于平板上，在30℃的培养箱中培养5～7天，备用。

1.4.2样品准备：取活化的菌种接种于无菌的SD培养基(除去SDA培养基中的琼脂即可)中，30℃的培养箱中培养5～7天，备用。

1.5制样方法：

(1)取样：取适量同一生长周期的菌丝于2mL的EP管中，用纯水清洗2～3次，除去菌丝表面的培养基及其它杂质；

(2)固定：将上述清洗后的菌丝分别按照表1中戊二醛的浓度进行固定处理，A～C分别加入各自浓度的戊二醛，放到4℃的冰箱过夜即可；J，K和L按表1中的流程处理，即每一个梯度分别在4℃的冰箱中处理1h，直至处理的终浓度，最后放到4℃的冰箱过夜；

操作流程见表1：

表1各组固定处理步骤

组别	戊二醛浓度
		A	0
B	2％
		C	2.5％
D	3％
		E	3.5％
F	2％→2.5％
		G	2％→2.5％→3％
H	2％→2.5％→3％→3.5％

(3)清洗：取出固定后的菌丝，用纯水清洗3次，除去固定液及固定液中的磷酸盐；

(4)脱水：依次用30％、50％、70％、80％、90％、95％的乙醇脱水15～20min，然后再用100％的乙醇处理三次，30min/次；

(5)置换：叔丁醇∶乙醇＝1∶3、2∶2、3∶1分别处理10～15min，1次；然后用100％的叔丁醇处理三次，第三次叔丁醇处理结束时保存于-20℃冰箱；

(6)冷冻干燥：待叔丁醇冻至雪花状，即可取出置于预冷的冷冻干燥仪的样品池中进行冷冻干燥；

(7)喷金：将干燥的样品取出，用导电胶粘到样品台上，并用吹风机吹掉未粘好的多余样品，防止将样品台放到电镜样品室中观察时样品掉到电镜中，损坏电镜，然后利用离子溅射仪对粘好的样品进行喷金；

(8)观察：将处理完的样品放到SEM中观察，并记录观察结果。

2实验结果

图中A是未用戊二醛固定的对照组，B、C、D、E分别为用不同浓度的戊二醛固定处理的样品所观察的结果，。由图可见：A中几乎所有的菌素都处于皱缩状态；B中绝大部分菌丝为皱缩状态，很小一部分呈饱满状态；C中约有一小半的菌丝很饱满，呈现了其正常状态，约一大半菌丝出现了皱缩现象；D中菌丝饱满，出现皱缩的比C组要少得多，程度较轻；E中仅有一部分菌丝比较饱满，比D中菌丝整体皱缩程度高得的多，且皱缩程度更为严重。由此可见，戊二醛单次固定的浓度不宜过高。

由于前面的处理中，均是用戊二醛单次固定，虽然得到了D组这种效果较好的处理，但还是不够理想。

F、G两组，即分别用2％-2.5％、2％-2.5％-3％戊二醛进行固定处理的组，菌丝仍仅有小部分皱缩，整体效果较其他各组有明显的优势；尤其是F组，菌丝明显饱满得多；H中菌丝皱缩比较严重，效果反而不如E组(H组与E组终浓度相同)。对各组图片中饱满的菌丝进行统计比较，结果见表2：

表2各处理组菌丝正常形态的比例

组别	正常形态的比例
		不经过固定处理(A)	≤2％
2％戊二醛固定(B)	≥25％
		2.5％戊二醛固定(C)	≥43％
3％戊二醛固定(D)	≥64％
		3.5％戊二醛固定(E)	≥38％
2％-2.5％戊二醛梯度固定(F)	≥85％
		2％-2.5％-3％戊二醛梯度固定(G)	≥80％
2％-2.5％-3％-3.5％戊二醛梯度固定(H)	≥28％

由表2可见，2％-2.5％戊二醛梯度固定(F)、2％-2.5％-3％戊二醛梯度固定(G)这两组处理结果明显优于其他各组，说明2～3个不同浓度梯度的戊二醛固定菌丝的效果明显优于其他处理，取得了意料不到的技术效果。

Claims

1.一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法，其特征在于：样品固定时，用至少两种不同浓度的戊二醛溶液依次处理样品，且后一次戊二醛的浓度高于前一次戊二醛的浓度。

2.根据权利要求1所述的浓度，其特征在于：首次处理的戊二醛浓度为2％。

3.根据权利要求2所述的浓度，其特征在于：第二次处理的戊二醛的浓度为2.5％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在4℃条件下，2％戊二醛溶液处理1h，然后2.5％戊二醛溶液处理1h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：2.5％戊二醛溶液处理1h之后，继续在4℃条件下过夜处理，进入后续常规处理步骤。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：2.5％戊二醛溶液处理1h之后，还可以进行第三次固定处理，第三次固定处理的戊二醛的浓度为3％。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在4℃条件下，2％戊二醛溶液处理1h，然后2.5％戊二醛溶液处理1h，接着3％戊二醛溶液处理1h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：3％戊二醛溶液处理1h后，继续在4℃条件下过夜处理，进入后续常规处理步骤。

9.根据权利要求1～8所述的方法，其特征在于：所述的毛癣菌为须癣毛癣菌。