CN104374626A

CN104374626A - 一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法

Info

Publication number: CN104374626A
Application number: CN201410738733.5A
Authority: CN
Inventors: 刘永英; 赵建成; 张含笑; 牛景彦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2015-02-25

Abstract

一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其包括：分拣：由生物结皮中分拣藓类植株材料，清洗后，剥离叶片；固定：将叶片置于戊二醛溶液中固定，然后用缓冲液冲洗；脱水：使用梯度浓度酒精逐级脱水；置换：将叶片置于乙醇-乙酸异戊酯混合液中置换，再置于乙酸异戊酯溶液中置换；临界点干燥；以及装台。本发明制备藓类植物扫描电镜观察材料的方法简单易行、效果甚加，一方面通过选用戊二醛作固定液，对多糖、糖蛋白、微管等有较好的固定作用，并不会使组织细胞固定后变脆；另一方面通过采用临界点干燥法可避免叶片细胞表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。因而可以为制备较为理想的藓类样品提供借鉴，填补国内相关领域的技术空白。

Description

一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及扫描电镜观察材料制备领域，尤其是指一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法。

背景技术

藓类植物微形态学特征常常是分类的重要依据，如蒴齿表面疣的有无、疣的分布形式、疣的形态，孢子表面纹饰，叶细胞表面疣的有无、疣的数目、形态，芽胞结构、假根上疣的有无以及叶中肋上丝体或栉片等特殊附属结构，这些特征在分类群（如科、属、种）间区分度明显，且在分类群内稳定。由于形态微小，扫描电镜就成为重要的观察工具。扫描电镜观察生物样品必须经过干燥和导电处理，在这一过程中存在样品缩水问题。对于藓类植物的蒴齿结构及孢子等观察样品的处理相对简单，因为这些结构细胞壁厚，表面较为坚硬，自然风干即可。但对于叶、假根和芽胞等含水量较高的幼嫩器官自然风干后，细胞易出现收缩、塌陷等变形，致使这些重要结构严重失真。藓类植物细胞有细胞壁不同于动物组织的处理方法。样品形态微小，叶由单层细胞组成，假根由单列细胞组成，所以也区别于其他高等植物组织的处理方法。

中国发明专利（申请号：201410251628.9，公开号CN 104020030A）披露了一种扫描电镜用的昆虫样品的制备方法，其包括昆虫材料清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金等步骤，并且组织固定是将昆虫材料浸于固定液中并于微波炉中加热一段时间，再分别于室温和低温下各固定一段时间。以上方法可获得更为清晰的昆虫表面结构的扫描电镜图像，能更好地保持整体昆虫形态结构，不易发生变形、皱缩及塌陷。以上专利文献虽然提供了一种针对于制备动物扫描电镜观察材料的可行性方案，然而，由于动物细胞没有细胞壁，因而将其转用到制备植物电镜观察材料基本无法实现，而国内要制备一种能够较为理想地保留样品微细结构的植物电镜观察材料较为少见，特别是制备藓类样品，国内相关技术仍处于空白。

发明内容

本发明提供一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法，其主要目的在于克服现有在制备藓类植物电镜观察材料过程中存在的细胞易出现收缩、塌陷等变形，致使样品微细结构严重失真的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，包括以下步骤：a、分拣：由生物结皮中分拣藓类植株材料，清洗后，从该藓类植株材料上剥离复数片带丝体的叶片；b、固定：将步骤a中获得的叶片置于戊二醛溶液中固定，固定温度为0～10摄氏度，固定时间为1～5小时，固定后用缓冲液冲洗；c、脱水：使用梯度浓度酒精逐级脱水；d、置换：将脱水后的叶片置于乙醇-乙酸异戊酯混合液中置换，之后再置于乙酸异戊酯溶液中置换；e、临界点干燥；f：装台。

进一步的，步骤a中的所述藓类植株材料为流苏藓植株材料。

进一步的，步骤b中戊二醛溶液的浓度为2%～3%，固定条件为：在4摄氏度下固定3h。

进一步的，步骤b中戊二醛溶液的浓度为2.5%，并且通过0.2M·L-1的磷酸缓冲液配制而成。

进一步的，步骤b中包括固定后用pH=7.2的0.1 M·L-1磷酸缓冲液冲洗3次，每次5 min。

进一步的，步骤c的逐级脱水包括使用50%、70%、80%、90%浓度的酒精各脱水5min，之后使用100%、100%、100%浓度的酒精分别脱水5min、10min、20min。

进一步的，步骤d中所述乙醇-乙酸异戊溶液中乙醇和乙酸异戊溶液的体积比例为1：1，置换时间为15min，步骤d中所述乙酸异戊溶液的置换时间为两次且每次置换20min或者为过夜置换。

进一步的，步骤e包括将步骤d获得的叶片移入内面铺有滤纸的钢网篮中，用临界点干燥仪液化CO₂干燥2 h。

进一步的，步骤f包括将步骤e获得的叶片移到贴有双面胶带的金属台上，经离子溅射仪喷金。

一种采用上述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法制备而成的藓类植物扫描电镜观察材料。

和现有技术相比，本发明产生的有益效果在于:

本发明制备藓类植物扫描电镜观察材料的方法简单易行、效果甚加，一方面通过选用戊二醛作固定液，对多糖、糖蛋白、微管等有较好的固定作用，并不会使组织细胞固定后变脆；另一方面通过采用临界点干燥法可避免叶片细胞表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。因而可以为制备较为理想的藓类样品提供借鉴，填补国内相关领域的技术空白。

附图说明

图1为经本发明中藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法制得的厚肋流苏藓叶片上丝体样品照片。

图2为常规的厚肋流苏藓叶片上丝体样品照片。

具体实施方式

本发明公开了一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，包括以下步骤：

a、分拣：由生物结皮中分拣藓类植株材料，清洗后，从该藓类植株材料上剥离复数片带丝体的叶片，本步骤中的所述藓类植株材料优选为流苏藓植株材料。

b、固定：将步骤a中获得的叶片置于戊二醛溶液中固定，固定温度为0～10摄氏度，固定时间为1～5小时，固定后用pH=7.2的0.1 M·L-1磷酸缓冲液冲洗3次，每次5 min。本步骤中，戊二醛溶液的浓度优选为2%～3%，更优选为2.5%，并且通过0.2M·L-1的磷酸缓冲液配制而成。本步骤的固定条件优选为：在4摄氏度下固定3h。

c、脱水：使用梯度浓度酒精逐级脱水；其中逐级脱水优选包括使用50%、70%、80%、90%浓度的酒精各脱水5min，之后使用100%、100%、100%浓度的酒精分别脱水5min、10min、20min。

d、置换：将脱水后的叶片置于乙醇-乙酸异戊酯混合液中置换，之后再置于乙酸异戊酯溶液中置换；本步骤中所述乙醇-乙酸异戊溶液中乙醇和乙酸异戊溶液的体积比例优选为1：1，置换时间优选为15min，并且所述乙酸异戊溶液的置换时间优选为两次且每次置换20min或者为过夜置换。

e、临界点干燥：将步骤d获得的叶片移入内面铺有滤纸的钢网篮中，用临界点干燥仪液化CO₂干燥2 h。

f：装台：将步骤e获得的叶片移到贴有双面胶带的金属台上，经离子溅射仪喷金。

以下结合图1和图2列出本发明的一个较佳实施方案。

本较佳实施方案的材料与方法

一、材料

采自陕西省神木县（中科院水利部水土保持研究所侵蚀与环境试验站）生物结皮中厚肋流苏藓[Crossidium crassinerve (De Not.) Jur.] 标本装入密封袋中低温下带回实验室， 4°C冰箱保存。

二、方法

第一步、分拣：在体视显微镜下从生物结皮中分拣出厚肋流苏藓，用清水冲洗去沙粒等杂质，用吸水纸吸干植物表面水分。在体视显微镜下从植株上剥离30-40片带丝体的完好叶片。

第二步、固定：将叶片放于盛有2.5%戊二醛溶液（0.2 M·L-1磷酸缓冲液配制)的青霉素小瓶中，密封小瓶，反复抽取气体使叶片下沉，以便叶片完全浸于固定液中，4°C条件下固定3 h。再用pH=7.2的0.1 M·L-1磷酸缓冲液冲洗3次，每次5 min。

第三步、脱水：使用梯度浓度酒精逐级脱水：50%、70%、80%、90%各5 min，100%共3次，分别为5 min、10 min和20 min。

第四步、置换：放入乙醇：乙酸异戊酯（1：1）的溶液中15 min以及乙酸异戊酯中20 min置换2次或过夜。抽取气体或适当摇动使材料充分接触液体。

第五步、临界点干燥：将厚肋流苏藓叶移入内面铺有滤纸的钢网篮中，用HITACHI HCP-2型临界点干燥仪液化CO2干燥2 h。

第六步、装台：在体式显微镜下，用小号毛刷将叶片移到贴有双面胶带的金属台上，经E-1020型离子溅射仪喷金。

第七步、观察：用HITACHI S-4800型扫描电子显微镜观察拍照。

三、结果与讨论

其中图1为经本发明中藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法制得的厚肋流苏藓叶片上丝体样品照片。图2为常规的厚肋流苏藓叶片上丝体样品照片。结果显示：叶中肋腹面中上部着生分枝或不分枝的丝体，丝体由2～7个细胞组成，末端细胞圆柱形至圆锥形，长10.3～19.2 μm，有2～4个疣，有时光滑。丝体细胞结构完整、形态饱满、表面光滑，丝体末端细胞的疣清晰可辨，观察效果理想，以此可区分该种与属内其它种。图2是未经临界点干燥处理的样品扫描电镜照片，可见细胞和疣极度皱缩、塌陷，无法辨别疣的形状及数量。

根据藓类植物细胞主要成分，在样品制备中选用了戊二醛作固定液，对多糖、糖蛋白、微管等有较好的固定作用，并不会使组织细胞固定后变脆。固定时要使材料充分接触液体，否则，漂浮于固定液上面的材料，因细胞结构没有被“固定”，即使后续处理过程正常也无法避免细胞出现皱缩现象。由于细胞壁对固定液的渗透有一定的阻碍作用，时间不可过短，但藓类植物器官多为单层细胞（如叶、苞叶）或单列细胞（如假根）组成，易与固定液接触，固定时间也无需太长，经试验认为固定3 h为宜。

样品从乙酸异戊酯中移入钢网篮后，不可久置于空气中，否则会使乙酸异戊酯挥发，因空气干燥而造成样品发生形变，使随后进行的CO2临界点干燥失去意义，但样品中残留过多的乙酸异戊酯会使样品干燥后仍有残余，从而影响干燥效果。所以，以样品半干时放入临界点干燥仪为宜。

干燥后的样品较脆弱，转移时要“轻取轻放”，避免用镊子等硬物碰触，以防细胞破碎，影响观察效果，最好选用小号的软毛刷贴台。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims

1.一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、分拣：由生物结皮中分拣藓类植株材料，清洗后，从该藓类植株材料上剥离复数片带丝体的叶片；b、固定：将步骤a中获得的叶片置于戊二醛溶液中固定，固定温度为0～10摄氏度，固定时间为1～5小时，固定后用缓冲液冲洗；c、脱水：使用梯度浓度酒精逐级脱水；d、置换：将脱水后的叶片置于乙醇-乙酸异戊酯混合液中置换，之后再置于乙酸异戊酯溶液中置换；e、临界点干燥；f：装台。

2.如权利要求1所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于：步骤a中的所述藓类植株材料为流苏藓植株材料。

3.如权利要求2所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于：步骤b中戊二醛溶液的浓度为2%～3%，固定条件为：在4摄氏度下固定3h。

4.如权利要求3所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于：步骤b中戊二醛溶液的浓度为2.5%，并且通过0.2M·L-1的磷酸缓冲液配制而成。

5.如权利要求1所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于：步骤b中包括固定后用pH=7.2的0.1 M·L-1磷酸缓冲液冲洗3次，每次5 min。

6.如权利要求1所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于：步骤c的逐级脱水包括使用50%、70%、80%、90%浓度的酒精各脱水5min，之后使用100%、100%、100%浓度的酒精分别脱水5min、10min、20min。

7.如权利要求1所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于：步骤d中所述乙醇-乙酸异戊溶液中乙醇和乙酸异戊溶液的体积比例为1：1，置换时间为15min，步骤d中所述乙酸异戊溶液的置换时间为两次且每次置换20min或者为过夜置换。

8.如权利要求1所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于：步骤e包括将步骤d获得的叶片移入内面铺有滤纸的钢网篮中，用临界点干燥仪液化CO₂干燥2 h。

9.如权利要求1所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，其特征在于：步骤f包括将步骤e获得的叶片移到贴有双面胶带的金属台上，经离子溅射仪喷金。

10.一种藓类植物扫描电镜观察材料，其特征在于：采用如权利要求1-9中任意一项所述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法制备而成。