CN110487830A - 一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法 - Google Patents

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裴艳艳
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Abstract

一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法，包括如下步骤：取新鲜植物材料用FAA固定液浸泡固定24h以上，将已固定的材料用系列梯度酒精脱水，把经脱水后的材料逐步置于用无水乙醇和纯TO透明剂配成不同比例配置的试剂中进行透明。脱水透明的每个步骤操作均采用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟。最后一次抽气完成后，将材料从纯TO透明剂中取出放入培养皿中静置至材料中TO透明剂挥发完，即可置于扫描电镜下观察。该方法能较好的保持不同植物包括成熟的及幼嫩组织中细胞的形态。

Description

一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法
技术领域
本发明属于电镜样品制备方法的技术领域，涉及一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法。
背景技术
应用扫描电镜观察生物样品表面的微小形态特征，以获得比光学显微镜观察结果更为详尽、细微的结构特征，是生物学研究的重要手段之一。而能否获得真实、清晰、理想的扫描电镜观察结果，样品的制备过程是关键。用于常规的扫描电镱观察的样品必须是经过彻底干燥处理的。含水高的样品在扫描电镜真空的镜筒中会造成不良的后果，如图像模糊，出现雾状，或者根本不能成像；或者在真空中容易发生形态损伤，使研究特征皱缩、变形；造成物镜、镜头、光阑等的污染；灯丝碰到水蒸气而氧化变质甚至熔断等等。
生物样品不同于矿物和金属，它具有柔软多水的特点，因此，在高真空的扫描电镜中进行观察时，必须对样品进行一系列的干燥处理，常规的处理方法是：样品采后立即置于锇酸或戊二醛固定液中固定，然后再用丙酮或酒精逐级脱水，脱水后对样品表面进行喷金或喷碳处理，以保证样品具有良好的导电性。除了以上方法还有自然干燥法、烘干干燥法、临界点干燥法、真空干燥法等干燥方法，这些干燥方法各有优缺点，且适合不同的生物样品种类，通过这样处理以后可以得到生物样品表面形貌的清晰图象，但同时也存在许多的缺陷，主要表现为制样过程复杂繁琐冗长，另一方面，样品经过一系列的处理后，样品本身会发生不同程度的收缩变形，特别是幼嫩的及水生植物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法。该方法主要采用从低浓度乙醇逐级脱水并采用TO透明剂最后替换乙醇，用TO透明剂可以防止制片材料收缩变形、变硬变脆的特点，且与水不相溶，具有挥发性，还具有透明的特点，同时从固定到脱水整个过程所用药品均无毒，整个操作简单易行，处理后的幼嫩生物样品表面形貌没有发生体积变化、结构皱缩或干裂等变形的现象，图像清晰，且干燥彻底。
本发明的技术方案是：一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法，包括如下步骤：
(1)、将新鲜植物材料放入试管中，加入FAA固定液中固定24h以上，若植物组织过于幼嫩，可用50％乙醇配置固定液用于固定；
(2)、将已固定的材料用系列梯度乙醇进行脱水处理；
(3)、把经脱水后的材料逐步置于用无水乙醇和纯TO透明剂配成不同比例的试剂中进行透明处理；
脱水、透明的每个步骤操作均采用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟；
(4)、最后一次抽气完成后，将材料从纯TO透明剂中取出放入培养皿中静置至材料中TO透明剂挥发完，即可置于扫描电镜下进行电镜观察。
所述FAA固定液是指按l50％乙醇90m+福尔马林5ml+冰乙酸5ml比例配置成的固定液。
所述TO透明剂是指TO型生物制片透明剂。
所述用系列梯度乙醇进行脱水处理是指用30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％系列梯度乙醇进行脱水处理。
所述无水乙醇和纯TO透明剂配成不同比例的试剂为：2/3无水乙醇+1/3纯To透明剂→1/2无水乙醇+1/2纯To透明剂→1/3无水醇+2/3纯To透明剂→纯ToⅠ透明剂→纯ToⅡ透明剂。
本发明的突出优点在于：
分别用冷冻真空干燥方法以及系列梯度乙醇脱水和TO透明剂透明处理香蕉愈伤组织材料时发现，经常规冷冻真空干燥方法处理的材料在扫描电镜下观察到的薄壁细胞有模糊、破损现象，而经过脱水透明处理的材料观察到的薄壁细胞更为清晰和完整，用TO透明剂可以防止制片材料收缩变形、变硬变脆的特点，且与水不相溶，具有挥发性，还具有透明的特点，同时从固定到脱水整个过程所用药品均无毒，整个操作简单易行，适用于各类材料，处理后的幼嫩生物样品表面形貌没有发生体积变化、结构皱缩或干裂等变形的现象，图像清晰，且干燥彻底。
用TO透明剂制片有以下特点：
1.TO透明剂无毒。
2.TO透明剂可以防止制片材料收缩变形，变硬变脆，如柔软的植物组织和动物、人体器官的空心组织，用其作透明剂制片容易获得好的切片。
3.TO透明剂对水汽不敏感，在相对湿度较大的条件下制片，制片材料不易吸水。
附图说明
图1-1、图2-1、图3-1、图3-2、图3-3为本发明所述的方法脱水透明处理的材料在扫描电镜下观察到的图像。
图1-2为自然干燥法处理的材料在扫描电镜下观察到的图像。
图2-2、图3-4为冷冻真空干燥法处理的材料在扫描电镜下观察到的图像。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进行进一步的说明。
实施例1
本实施例为本发明所述的用于扫描电镜观察的幼嫩植物的制样方法的一个实例，包括如下步骤：
(1)、取地宝兰合蕊柱置入装有FAA固定的试管中固定24h以上，固定液采用50％乙醇配置。
(2)、将固定好的材料逐步置于30％乙醇→40％乙醇→50％乙醇→55％乙醇→60％乙醇→65％乙醇→70％乙醇→75％乙醇→80％乙醇→85％乙醇→90％乙醇→95％乙醇→100％乙醇进行脱水处理。每个步骤均是利用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟。
(3)、把脱水后的材料逐步置于2/3无水乙醇+1/3纯To透明剂→1/2无水乙醇+1/2纯To透明剂→1/3无水醇+2/3纯To透明剂→纯To透明剂I→纯To透明剂II进行透明处理。每一步均是利用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟。
(4)、将材料从纯To透明剂II中取出放置于培养皿中静置一夜直至TO挥发完毕后即可置于扫描电镜下进行电镜扫描见图1-1。图1-2为自然干燥法处理的材料在扫描电镜下观察到的图像。
实施例2
本实施例为本发明所述的用于扫描电镜观察的幼嫩植物的制样方法的另一个实例，包括如下步骤：
(1)、取一定大小香蕉愈伤组织置入装有FAA固定的试管中固定24h以上，固定液采用50％乙醇配置。
(2)、将固定好的材料逐步置于30％乙醇→40％乙醇→50％乙醇→55％乙醇→60％乙醇→65％乙醇→70％乙醇→75％乙醇→80％乙醇→85％乙醇→90％乙醇→95％乙醇→100％乙醇进行脱水处理。每个步骤均是利用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟。
(3)、把脱水后的材料逐步置于2/3无水乙醇+1/3纯To透明剂→1/2无水乙醇+1/2纯To透明剂→1/3无水醇+2/3纯To透明剂→纯To透明剂I→纯To透明剂II进行透明。每一步均是利用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟。
(4)、将材料从纯ToII中取出放置于培养皿中静置一夜直至TO挥发完毕后即可置于扫描电镜下进行电镜扫描，见图2-1。图2-2为冷冻真空干燥法处理的材料在扫描电镜下观察到的图像。
实施例3
本实施例为本发明所述的用于扫描电镜观察的幼嫩植物的制样方法的再一个实例，包括如下步骤：
(1)、将一段海藻置入装有FAA固定的试管中固定24h以上，固定液采用50％乙醇配置。
(2)、将固定好的材料逐步置于30％乙醇→40％乙醇→50％乙醇→55％乙醇→60％乙醇→65％乙醇→70％乙醇→75％乙醇→80％乙醇→85％乙醇→90％乙醇→95％乙醇→100％乙醇进行脱水处理。每个步骤均是利用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟。
(3)、把脱水后的材料逐步置于2/3无水乙醇+1/3纯To透明剂→1/2无水乙醇+1/2纯To透明剂→1/3无水醇+2/3纯To透明剂→纯To透明剂I→纯To透明剂II进行透明。每一步均是利用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟。
(4)、将材料从纯ToII中取出放置于培养皿中静置一夜直至TO挥发完毕后即可置于扫描电镜下进行电镜扫描见图3-1，图3-2，图3-3。图3-4为冷冻真空干燥法所处理的材料在扫描电镜下观察到的图像。
本发明的突出效果是精简了用于扫描电镜观察的幼嫩植物的制样方法的步骤，使幼嫩植物的制样变得更加简单快捷，缩短了制样所用的时间，同时经此制样方法处理后能在扫描电镜下观察到清晰完整的幼嫩植物表面形貌，提高了幼嫩生物材料的扫描电镜观察样品的质量。并且该方法适用于不同种类生物样品的处理。

Claims (5)

1.一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、将新鲜植物材料放入试管中，加入FAA固定液中固定24h以上，若植物组织过于幼嫩，可用50％乙醇配置固定液用于固定；
(2)、将已固定的材料用系列梯度乙醇进行脱水处理；
(3)、把经脱水后的材料逐步置于用无水乙醇和纯TO透明剂配成不同比例配置的试剂中进行透明处理；
脱水、透明的每个步骤操作均采用真空抽气机抽气20分钟,室内自然条件静置30分钟；
(4)、最后一次抽气完成后，将材料从纯TO透明剂中取出放入培养皿中静置至材料中TO透明剂挥发完，即可置于扫描电镜下进行电镜观察。
2.根据权利要求1所述的用于扫描电镜观察的幼嫩植物的制样方法，其特征在于，所述FAA固定液是指按50％乙醇90ml+福尔马林5ml+冰乙酸5ml比例配置成的固定液。
3.根据权利要求1所述的用于扫描电镜观察的幼嫩植物的制样方法，其特征在于，所述TO透明剂是指TO型生物制片透明剂。
4.根据权利要求1所述的用于扫描电镜观察的幼嫩植物的制样方法，其特征在于，所述用系列梯度乙醇进行脱水处理是指用30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％系列梯度乙醇进行脱水处理。
5.根据权利要求1所述的用于扫描电镜观察的幼嫩植物的制样方法，其特征在于，所述无水乙醇和纯TO型生物制片透明剂配成不同比例的试剂为：2/3无水乙醇+1/3纯TO透明剂→1/2无水乙醇+1/2纯TO透明剂→1/3无水醇+2/3纯TO透明剂→纯TO透明剂Ⅰ→纯TO透明剂Ⅱ。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111208161A (zh) * 2020-01-13 2020-05-29 安徽骆华生物科技有限公司 生物样品表面形貌超高倍分辨率观察测定技术

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102967493A (zh) * 2012-10-27 2013-03-13 山西农业大学 植物组织快速石蜡制片的方法
CN104374626A (zh) * 2014-12-08 2015-02-25 刘永英 一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法
CN105973673A (zh) * 2016-06-30 2016-09-28 中国林业科学研究院热带林业研究所 一种桉树组织的石蜡切片方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102967493A (zh) * 2012-10-27 2013-03-13 山西农业大学 植物组织快速石蜡制片的方法
CN104374626A (zh) * 2014-12-08 2015-02-25 刘永英 一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法
CN105973673A (zh) * 2016-06-30 2016-09-28 中国林业科学研究院热带林业研究所 一种桉树组织的石蜡切片方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘虹等: "《植物学实验》", 30 June 2014, 华中科技大学出版社 *
孙广宇等: "《植物病理学实验技术》", 31 August 2002, 中国农业出版社 *
广西壮族自治区科学技术委员会: "《广西科技产业化指南》", 31 January 1993, 广西科学技术出版社 *
王丽等: "《植物学实验指导》", 31 March 2013, 中国农业大学出版社 *
王伯沄等: "《病理学技术》", 30 June 2000, 人民卫生出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111208161A (zh) * 2020-01-13 2020-05-29 安徽骆华生物科技有限公司 生物样品表面形貌超高倍分辨率观察测定技术

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