CN102507585A - 一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法，包括光学显微镜检验和扫描电镜检验，其中光学显微镜检验至少包括以下步骤：（1）空白试验；（2）混合酸消解：在待检样品中加入浓硝酸、浓盐酸和过氧化氢溶液，以水浴加热方式消解；（3）离心沉淀；（4）涂片并以环氧树脂封闭；（5）硅藻定性定量分析；扫描电镜检验至少包括以下步骤：（1）空白试验；（2）混合酸消解：在待检样品中加入浓硝酸、浓盐酸和过氧化氢溶液，以水浴加热方式消解；（3）真空抽滤；（4）扫描电镜自动拍照并存储图像；（5）硅藻定性定量分析。本发明灵敏度高，高效、安全、环保、定性定量分析准确，在法医学溺死诊断实践中具有良好的应用前景。

Description

一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法

技术领域

本发明涉及法医学检验领域，具体地说，涉及一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法。

背景技术

水中腐败尸体的溺死诊断是法医学领域中最大的难题之一，硅藻检验一直以来被公认为最佳方法。目前，文献报道的硅藻检验方法有很多，如强酸消解法、灰化法、Soluene – 350消解法、硅胶梯度离心法、酶消解法和PCR法等。

与其它检验方法相比，强酸消解法具有组织消解时间短、消解完全、程序简单、成本低等优点，因而在法医学实践中应用最为普遍。如GA/T 813—2008标准（《人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验》）中，利用浓硝酸和无水乙醇（或乙醚），在电炉加热条件使组织器官消解，消解充分后，将消化液倒入离心管经反复离心后制片；最后采用光镜观察法，以10倍或40倍物镜检查硅藻。

然而目前的强酸消解法存在的不足表现为：一、消解过程剧烈，存在强酸喷出灼伤人体的危险，且对硅藻产生一定程度的破坏，导致硅藻损失；二、组织需求量和酸消耗量大，大量的强酸与法医学实践中的腐败检材在消解过程中释放出二氧化氮和恶臭气体，不仅污染环境而且导致检验工作条件恶劣；三、组织消解时间长，工作效率低；四、消解不彻底，存在部分组织残渣、油脂等，影响后续硅藻检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测灵敏度高、能有效避免污染、定性定量分析准确，改善工作环境、降低劳动强度的法医学硅藻检验方法。

为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法，包括光学显微镜检验和扫描电镜检验两方面，其特征在于包括以下步骤：

所述光学显微镜检验包括如下步骤：

（1）空白试验

通过光学显微镜检验，确认所有试剂、工具、器皿不含硅藻。

（2）混合酸消解

于通风橱内，取待检验样品（肺、肝、肾、骨髓等脏器组织及现场水样）置一次性塑料试管内，依次加入浓硝酸、浓盐酸和过氧化氢溶液，静置后以水浴加热方式消解；

（3）离心处理

将消解液倒入离心管中，以重蒸水平衡，离心，用吸管吸去上清液，再加重蒸水平衡后离心，重复该步骤，直至上清液pH值约为中性。

（4）涂片

吸去离心后的上清液，取沉淀物1-2滴，尽量薄且均匀地涂布在载玻片上，烘干。换载玻片，重复该步骤，直至所有沉淀物涂片完毕；盖上盖玻片，以环氧树脂封闭，以备镜检。

（5）镜检

在光学显微镜下搜寻硅藻，记录所有涂片上的硅藻数及硅藻种类。

所述扫描电镜检验包括如下步骤：

（1）空白试验

通过扫描电子显微镜检验，确认所有试剂、工具、器皿不含硅藻。

（2）混合酸消解

于通风橱内，取待检验样品（肺、肝、肾、骨髓等脏器组织及现场水样）置一次性塑料试管内，依次加入浓硝酸、浓盐酸和过氧化氢溶液，静置后以水浴加热方式消解；

（3）真空抽滤

采用单联或多联真空抽滤装置，对消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤以去除滤膜水分；

（4）扫描电镜自动拍照并存储图像

在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金膜或铂膜，使其具有导电性，然后在扫描电镜一定放大倍数下，将滤膜含样品区域化分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，对每个视场进行自动拍照并存储其图像；

（5）硅藻定性定量分析

采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄视场图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。

在上述检验方法中，本发明混合酸消解步骤具体为：所述待检验样品为1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样；取待检验样品置一次性塑料试管内，依次加入5-20ml浓硝酸和2-6ml的浓盐酸，使浓硝酸的体积为浓盐酸的2-6倍；静置2-5min后，用塑料滴管以1-3滴/10s的速度滴加30%过氧化氢，静置10-20min，再将样品放置水浴锅内，60-95℃条件下恒温水浴30min-90min；上述所使用的酸均为分析级。

法医学硅藻检验中，既要将组织消解彻底，又不能对硅藻形态造成大的破坏，因此必须选择合适的消解体系和反应条件，本发明的混和酸消解体系和反应条件的选择和确定针对法医学硅藻检验的特点设计，实验证明，所采用的消解体系和反应条件可有效地将有机物质消解彻底，且不会对硅藻结构造成明显的破坏。

鉴于法医学硅藻检验实践中除肺组织外，其它脏器中硅藻含量通常较低，为避免污染，本发明在消解步骤前设有防止污染影响的空白试验步骤，以确认所有试剂、工具、器皿不含硅藻。

本发明的离心处理步骤中离心速度为2000-4000r/min，离心作用时间为10-25min，反复离心的次数为3-6次，最终上清液酸碱度为6.5-7.5。实验证明，采用该条件的离心处理可较大程度地避免硅藻的损失。

传统的采用硝酸乙醇法消解的组织消解液，通常含有未完全消解的组织残留物，在进行真空抽滤时容易堵塞滤膜，使抽滤无法进行，因此只能采用离心处理提取硅藻。本发明采用的混合酸法消解，组织消解更加彻底，适用真空抽滤处理。与反复离心的处理步骤相比，真空抽滤大大简化了处理过程，减少硅藻损失，提高了回收率。本发明的真空抽滤步骤的真空度为100-800mmHg，所采用滤膜为有机滤膜，直径10-50cm，孔径0.1-1.0μm。所述真空抽滤步骤中采用单联或多联真空抽滤装置进行真空抽滤。真空抽滤装置包括滤杯、有机滤膜、抽滤接口、滤液收集瓶、抽真空管和真空泵。所述多联真空抽滤装置的真空管道包括总管和与总管相连的若干个支管，总管与真空泵连接，各个支管与每个抽滤接口连接，实现同时真空抽滤功能。本发明中的真空度、滤膜材质和孔径范围综合考虑到了抽滤效率和抽滤的效果，避免了真空度过高导致滤膜破和真空度过低导致过滤效率低的情形。本发明采用的多联式真空抽滤装置具有简单、高效、应用灵活、成本低等优点。

本发明的光学显微镜检验硅藻，采用的放大倍数为400-1000X，在此放大倍数条件下，可有效避免硅藻的漏检、误检。

更进一步，采用扫描电镜自动扫描检测硅藻，在所设定的放大倍数下自动拍摄样品区域每个视场的图片，避免以人工方式逐个区域拍照，大大降低劳动强度；具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm²-20×20 mm²的矩形区域。硅藻定性定量分析步骤采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。

 

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

1、灵敏度高。本发明采用混合酸消解组织，主要消解过程在水浴环境下进行，消解过程相对温和，对硅藻破坏小，减少了硅藻损失；且本发明在扫描电镜检验硅藻方面，采用真空抽滤步骤回收硅藻，相对于离心处理，可最大程度减少硅藻损失，提高硅藻回收率。

2、高效性、安全性和环保性。本发明消解组织彻底、消解时间短，可批量处理多个样品，工作效率高；与传统消解过程相比，消解过程温和，安全性好；组织量和强酸消耗量小，腐败脏器和强酸在消解过程中释放的恶臭气体和二氧化氮气体大大减少，减少了对环境的污染，可较大程度上改善工作环境。

3、同时满足光镜和扫描电镜检验硅藻的需要。本发明采用混合酸消解组织，组织消解液经不同的处理步骤后，可分别用光镜和扫描电镜进行硅藻检测。所采用的光镜放大倍数条件，可有效避免硅藻的漏检、误检。所采用的扫描电镜硅藻检测方式，较传统光镜检测方式，提高了硅藻定性定量分析的准确性，并大大降低了劳动强度。

具体实施方式

本发明采用的基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法，包括光学显微镜检验和扫描电镜检验两方面，具体步骤为：

光学显微镜检验：

（1）空白试验

通过光学显微镜检验，确认所有试剂、工具、器皿不含硅藻。

（2）混合酸消解

于通风橱内，分别取1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样于一次性塑料试管内，依次加入5-20ml浓硝酸和2-6ml的浓盐酸，使浓硝酸的体积为浓盐酸的2-6倍；静置2-5min后，用塑料滴管以1-3滴/10s的速度滴加30%过氧化氢，静置10-20min，再将样品放置水浴锅内，60-95℃条件下恒温水浴30min-90min；上述所使用的酸均为分析级。

（3）离心处理

将消解液倒入离心管中，以重蒸水平衡，2000-4000r/min转速下离心10-25min，用吸管吸去上清液，再加重蒸水平衡后离心，重复该步骤3-6次，直至上清液PH值约为6.5-7.5。

（4）涂片

吸去离心后的上清液，取沉淀物1-2滴，尽量薄且均匀地涂布在载玻片上，烘干。换载玻片，重复该步骤，直至所有沉淀物涂片完毕；盖上盖玻片，以环氧树脂封闭，以备镜检。

（5）镜检

在400-1000X的光学显微镜放大倍数条件下搜寻硅藻，记录所有涂片上的硅藻数及硅藻种类。

扫描电镜检验：

（1）空白试验

通过扫描电子显微镜检验，确认所有试剂、工具、器皿不含硅藻。

（2）混合酸消解

于通风橱内，分别取1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样于一次性塑料试管内，依次加入5-20ml浓硝酸和2-6ml的浓盐酸，使浓硝酸的体积为浓盐酸的2-6倍；静置2-5min后，用塑料滴管以1-3滴/10s的速度滴加30%过氧化氢，静置10-20min，再将样品放置水浴锅内，60-95℃条件下恒温水浴30min-90min；上述所使用的酸均为分析级。

（3）真空抽滤

采用单联或多联真空抽滤装置对组织消解液进行真空抽滤，真空度100-800mmHg，有机滤膜（如尼龙滤膜）直径10-50cm，孔径为0.1-1.0μm。将消解液抽滤完全后，继续加50-100ml超纯水使滤膜表面接近中性，再加5-10ml乙醇去除滤膜内水分。

（4）滤膜导电处理

在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金或铂膜，使其具有导电性。

（5）扫描电镜自动拍照和图像存储

采用扫描电镜，在一定放大倍数下，将滤膜含样品区域分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，通过计算机程序驱动扫描电镜样品台自动移动，逐个拍摄所划分视场的图像，并对图像进行存储。具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm²-20×20 mm²的矩形区域。

（6）硅藻定性定量分析

采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄视场图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。在人工识别方式下，如某些视场中的微型硅藻，由于放大倍数所限，不能满足种属鉴定的要求，则回访相应视场，增大放大倍数观察硅藻细微结构并确认其种属。

Claims (10)

1.一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法，包括光学显微镜检验和扫描电镜检验，其特征在于包括以下步骤：

所述光学显微镜检验包括如下步骤：

（1）空白试验

通过光学显微镜检验，确认所有试剂、工具和器皿不含硅藻；

（2）混合酸消解

于通风橱内，取待检验样品置一次性塑料试管内，依次加入浓硝酸、浓盐酸和过氧化氢溶液，静置后以水浴加热方式消解；

（3）离心处理

将消解液倒入离心管中，以重蒸水平衡，离心，用吸管吸去上清液，再加重蒸水平衡后离心，重复该步骤，直至上清液pH值为中性；

（4）涂片

吸去离心后的上清液，取沉淀物1-2滴，均匀地涂布在载玻片上，烘干；换载玻片，重复该步骤，直至所有沉淀物涂片完毕；盖上盖玻片，以环氧树脂封闭，以备镜检；

（5）镜检

在光学显微镜下搜寻硅藻，记录所有涂片上的硅藻数及硅藻种类；

所述扫描电镜检验包括如下步骤：

（1）空白试验

通过扫描电子显微镜检验，确认所有试剂、工具、器皿不含硅藻；

（2）混合酸消解

于通风橱内，取待检验样品置一次性塑料试管内，依次加入浓硝酸、浓盐酸和过氧化氢溶液，静置后以水浴加热方式消解；

（3）真空抽滤

采用单联或多联真空抽滤装置，对消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤以去除滤膜中的水分；

（4）扫描电镜自动拍照并存储图像

在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金膜或铂膜，使其具有导电性，然后在扫描电镜一定放大倍数下，将滤膜含样品区域化分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，对每个视场进行自动拍照并存储其图像；

（5）硅藻定性定量分析

采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄视场图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。

2.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于，所述待检验样品为脏器组织或现场水样。

3.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述混合酸消解步骤为：

所述待检验样品为1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml现场水样； 

取待检验样品置一次性塑料试管内，依次加入5-20ml浓硝酸和2-6ml的浓盐酸，使浓硝酸的体积为浓盐酸的2-6倍；静置2-5min后，用塑料滴管以1-3滴/10s的速度滴加30%过氧化氢，静置10-20min，再将样品放置水浴锅内，60-95℃条件下恒温水浴30min-90min；前述所使用的酸均为分析级。

4.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述离心处理步骤中离心速度为2000-4000r/min，离心作用时间为10-25min，反复离心的次数为3-6次，最终上清液酸碱度为6.5-7.5。

5.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述镜检步骤，所采用的放大倍数为400-1000X。

6.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述真空抽滤步骤的真空度为100-800mmHg，所采用滤膜直径10-50cm，孔径为0.1-1.0μm。

7.根据权利要求6所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述真空抽滤步骤中采用单联或多联真空抽滤装置进行真空抽滤，单联真空抽滤装置，每次只对一个样品进行抽滤；多联真空抽滤装置，每次可同时对多个样品进行抽滤处理。

8.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于，所述真空抽滤装置包括滤杯、有机滤膜、抽滤接口、滤液收集瓶、抽真空管和真空泵；所述多联真空抽滤装置的真空管道包括总管和与总管相连的若干个支管，总管与真空泵连接，各个支管与每个抽滤接口连接，实现同时真空抽滤功能。

9.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于，在扫描电镜一定放大倍数下，将滤膜含样品区域分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，通过计算机程序驱动扫描电镜样品台自动移动，逐个拍摄所划分视场的图像，并对图像进行存储；具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm²-20×20 mm²的矩形区域。

10.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于硅藻定性定量分析步骤采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。