CN101782538B - 一种法医学硅藻检验的自动化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种法医学硅藻检验的自动化方法，包括依次进行的硅藻扫描电镜图像数据库的建立、硅藻自动化识别系统的建立和水样和尸体脏器组织中硅藻自动化检测过程。其中水样和尸体脏器组织中硅藻自动化检测过程包括：(1)对水样和脏器组织进行微波消解和真空抽滤；(2)采用自动化扫描电镜对样品所划分的视场图像进行逐个拍摄；(3)对所拍摄的样品视场扫描电镜图像，采用Gabor滤波器、灰度阈值分割处理和数学形态学处理方法进行图像增强、图像分割和二值化处理；提取形态结构特征，并在硅藻形态结构特征数据库中进行检索匹配和统计计算。本发明具有简单、高效、环保、定性定量分析准确的特点，在法医学溺死诊断实践中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及法医学检验领域，特别涉及一种法医学硅藻检验的自动化方法。
背景技术
水中尸体的死因分析一直是法医学实践中的难点之一。尽管人们对硅藻检验的诊断价值仍存在分歧，但在法医学实践中，硅藻检验仍被认为是一种相对可靠的溺死诊断手段，尤其对于水中腐败尸体死亡原因的鉴定，被视为最佳的鉴定方法。法医学硅藻检验中，有必要对现场水样和尸体脏器内硅藻进行定性定量分析。对于硅藻定量分析，法医学工作者一般借助于光学显微镜以人工方式逐个观察每个视野下的硅藻并计数，工作强度很大；而硅藻定性分析需要较高的分类专业技术水平，通常由硅藻学专家完成，因此硅藻定性定量分析的结论一般由法医学专家和硅藻学专家共同作出。
目前，文献报道的硅藻检验方法有很多，如强酸消解法、灰化法、Soluene-350消解法、硅胶梯度离心法、酶消解法和PCR法等。由于传统法消解得到的组织消解液中含有大量的未消解组织残余物，因此法医学实验室大多只能采用光学显微镜对消解后组织内的硅藻进行定性定量分析，严重限制其对于自动化扫描电镜自动化分析技术的应用。
而硅藻形态特征各异，如采用图像处理技术对其显微图像处理分析，并建立相应的数据库，可以实现对其种类的计算机自动识别和鉴定。但是由于现有硅藻检验方法的局限性，一直难以建立清晰而有效的硅藻鉴定专家系统的数据库图像，因此也限制了硅藻鉴定专家系统的进一步发展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，设计一种检测灵敏度高、定性定量清晰准确，又能改善了工作环境、降低劳动强度的法医学硅藻检验的自动化方法。
为了实现上述技术目的，本发明包括如下技术特征：
一种法医学硅藻检验的自动化方法，其特征在于包括依次进行的硅藻扫描电镜图像数据库的建立、硅藻自动化识别系统的建立和水样和尸体脏器组织中硅藻自动化检测过程；
所述硅藻扫描电镜图像数据库建立过程包括如下步骤：
A1、采集不同地理位置(江河、湖泊、海洋等)的水样；A2、对水样进行硅藻检验，所述水样硅藻检验包括微波消解、真空抽滤和扫描电镜图像拍摄步骤；A3、对硅藻扫描电镜图像进行分析，根据硅藻壳面的形态结构(轮廓特征和纹理特征)，建立不同种类硅藻的扫描电镜图像数据库；
所述硅藻自动化识别系统的建立过程包括如下步骤：
B1、硅藻扫描电镜图像的预处理，包括：采用Gabor滤波器、灰度阈值分割处理和数学形态学处理方法进行图像增强、图像分割和二值化处理；
B2、将硅藻壳面的特征形态结构(轮廓和纹理特征，包括圆度、椭圆度、三角度、矩形度、长宽比、对称性等)从预处理后的图像中提取出来，建立不同种属硅藻形态结构特征的数据库；
B3、采用基于人工神经网络和统计决策理论的决策树方法，根据硅藻形态结构特征，对不同种属硅藻进行分类识别。
所述水样和尸体脏器组织中硅藻自动化检测过程包括：
C1、对水样和脏器组织进行硅藻检验，所述水和脏器组织硅藻检验包括微波消解、真空抽滤和扫描电镜图像自动拍摄步骤；
C2、对所拍摄扫描电镜图像，采用Gabor滤波器、灰度阈值分割处理和数学形态学处理方法进行图像增强、图像分割和二值化处理；提取形态结构特征，并在硅藻形态结构特征数据库中进行检索匹配和统计计算。
本发明所述步骤A2和步骤C1中对水样和组织器官进行硅藻检验至少包括以下步骤：
(1)微波消解：
将待检验样品加至微波消解罐内，加入浓硝酸和过氧化氢溶液后进行微波消解，消解后加入超纯水稀释消解液；将消解液转移后，消解罐用NaOH溶液浸泡，再用超纯水清洗；
(2)真空抽滤：
采用真空抽滤装置，将稀释后的消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤以去除滤膜水分；
(3)扫描电镜自动拍照并存储图像：
在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金属膜，使其具有导电性，然后在扫描电镜放大下，将滤膜含样品区域化分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，对每个视场进行自动拍照并存储其图像。
在微波消解步骤前设有防止污染影响的空白试验步骤，以确认所有试剂、工具、器皿以及消解罐不含硅藻。
其中，所述微波消解步骤具体为：
所述待检验样品为1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样；取待检验样品置微波消解仪的消解罐内，加入1-10ml浓硝酸和1-5ml的30％过氧化氢，然后将消解罐置于微波消解仪内进行微波消解；微波消解仪消解条件为：5-10min内将微波功率由0升至600-1000W，保持该功率10-20min后停止微波辐射，通风冷却，直至消解罐外部温度降至30-50℃，然后加入30-60mL超纯水以稀释组织消解液的酸度；将稀释后的消解液转移至试管中；用1-5NNaOH溶液浸泡消解罐，并用超纯水洗净。
由于法医学硅藻检验中，既要将组织消解彻底，又不能对硅藻形态造成大的破坏，因此必须选择合适的消解体系和微波消解条件，本发明的消解体系和微波消解条件的选择和确定针对法医学硅藻检验的特点设计，实验证明，该条件下的微波消解会导致单个长链状硅藻(如直链藻)被分离为多个形态完整的硅藻，但不会破坏直链藻、小环藻、桥弯藻等单个硅藻的硅质外壳特征，因此不影响硅藻的检测和种属的鉴定。鉴于硅藻检验中除肺组织外，其它脏器中硅藻含量通常较低，为避免污染，本发明微波消解步骤前除设有防止污染影响的空白试验步骤外，微波消解后消解罐用1-5NNaOH溶液浸泡，再用超纯水洗净。
本发明的真空抽滤步骤中真空度为100-800mmHg，所采用滤膜直径10-50cm，孔径为0.1-1.0μm。所述真空抽滤步骤中采用单联或多联真空抽滤装置进行真空抽滤，所述单联真空抽滤装置每次只对一个样品进行抽滤；所述多联真空抽滤装置，每次可同时对多个样品进行抽滤处理。进一步的，所述真空抽滤装置包括滤杯、滤膜、抽滤接口、滤液收集瓶、抽真空管、真空泵；所述滤杯下设滤膜，滤膜下设抽滤接口和滤液收集瓶，真空泵通过抽真空管与抽滤接口连接，真空泵抽真空后滤液通过滤膜进入滤液收集瓶；所述多联真空抽滤装置的抽真空管道包括总管和与总管相连的若干个支管，总管与真空泵连接，各个支管与每个抽滤接口连接，实现同时真空抽滤功能。
传统的采用硝酸乙醇法消解的组织消解液，通常含有未完全消解的组织残留物，在进行真空抽滤时容易堵塞滤膜，使抽滤无法进行，因此不宜将硝酸乙醇法与真空抽滤相结合用于脏器组织内硅藻的提取。本发明采用的微波消解法消解组织更加完全，因此适用真空抽滤处理。与传统的反复多次离心步骤程序相比，真空抽滤过程大大简化了处理过程，而且减少硅藻损失，提高了回收率。本发明中的真空度、滤膜材质和孔径范围综合考虑到了抽滤效率和抽滤的效果，避免了真空度过高导致滤膜破和真空度过低导致过滤效率低的情形。本发明的多联式真空抽滤具有有简单、高效、应用灵活、成本低等优点。
更进一步，本发明在扫描电镜放大倍数下，将滤膜含样品区域分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，通过计算机程序驱动扫描电镜样品台自动移动，逐个拍摄所划分视场的图像，并对图像进行存储，具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm2-20×20mm2的矩形区域。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
1、灵敏度高、抗污染能力强。本发明的微波消解和真空抽滤步骤，避免了传统技术中硝酸乙醇法消解对部分硅藻的破坏，以及重复多次离心加速制片导致硅藻的损失。微波消解对硅藻破坏程度的评价研究结果表明，所采用的微波消解条件对硅藻的破坏只限于将长链状硅藻的长链打断，不影响硅藻的检测，因此，通过微波消解和真空抽滤对硅藻的提取回收率更高，而且微波消解等步骤都在密封环境下进行的，抗污染能力强。
2、高效性、安全性和环保性。微波消解技术是近几年来发展起来的一种先进、高效的样品消解技术，它利用微波的穿透性和激活反应能力加热密闭容器内试剂和样品使反应容器内压力增加，温度提高，从而大大提高反应速率，缩短样品消解时间，具有快速、分解完全、酸消耗少、环境污染小等优点。与传统电热板加热的硝酸消解法相比，微波消解法消解有机质更彻底，消解过程更加安全、方便，强酸使用量少因而更加环保。微波消解所需时间约为硝酸乙醇法的1/5，而且组织消解更加完全。与硝酸乙醇法相比，微波消解酸消耗少，且在密闭环境下进行，因而更加安全、环保。又由于微波消解对样品的取样要求简单，样品处理过程简单、直接，由于组织消解过程在密闭环境中进行、酸使用量少、组织消解彻底，因而腐败脏器和强酸在消解过程中释放的恶臭气体和二氧化氮气体大大减少，减少了对环境的污染，极大程度地改善了工作环境。
3、定性定量分析准确性、劳动强度低。传统法医学硅藻检验中，采用光镜以人工方式进行硅藻检测，准确性差且劳动强度大。扫描电镜景深大、分辨率高，是硅藻检测和种属分类最有效的技术手段。本发明通过自动化扫描电镜、硅藻扫描电镜图像数据库及硅藻自动识别系统实现法医学硅藻检验的自动化，结果准确可靠，并显著降低了分析人员的劳动强度。
附图说明
图1为本发明的操作步骤图；
图2为本发明多联式真空抽滤装置的结构示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图1和图2对具体实施方式进行说明。
本发明的法医学硅藻检验的自动化方法包括如下步骤：硅藻扫描电镜图像数据库的建立、硅藻自动化识别系统的建立以及水样和尸体脏器组织中硅藻自动化检测。
所述硅藻扫描电镜图像数据库建立过程包括如下步骤：
A1、广泛采集不同地理位置(江河、湖泊、海洋等)的水样；A2、对水样进行硅藻检验，所述水样硅藻检验包括微波消解、真空抽滤和扫描电镜图像拍摄步骤；A3、对硅藻扫描电镜图像进行分析，根据硅藻壳面的形态结构(轮廓特征和纹理特征)，建立不同种类硅藻的扫描电镜图像数据库；
所述硅藻自动化识别系统的建立过程包括如下步骤：
B1、硅藻扫描电镜图像的预处理，包括：采用Gabor滤波器、灰度阈值分割处理和数学形态学处理方法进行图像增强、图像分割和二值化处理；
B2、将硅藻壳面的特征形态结构(轮廓和纹理特征，包括圆度、椭圆度、三角度、矩形度、长宽比、对称性等)从预处理后的图像中提取出来，建立不同种属硅藻形态结构特征的数据库；
B3、采用基于人工神经网络和统计决策理论的决策树方法，根据硅藻形态结构特征，对不同种属硅藻进行分类识别。
所述水样和尸体脏器组织中硅藻自动化检测过程包括：
C1、对水样和脏器组织进行硅藻检验，所述水和脏器组织硅藻检验包括微波消解、真空抽滤和扫描电镜图像自动拍摄步骤；
C2、对所拍摄扫描电镜图像，采用Gabor滤波器、灰度阈值分割处理和数学形态学处理方法进行图像增强、图像分割和二值化处理；提取形态结构特征，并在硅藻形态结构特征数据库中进行检索匹配和统计计算。
本发明主要解决的技术问题是法医学硅藻检验过程中的样品前处理过程和硅藻自动化检测识别的实现方式，使得本发明具有灵敏度高、抗污染能力、高效、安全、环保和准确。本发明步骤A2和步骤C1中对水样和组织器官进行硅藻检验至少包括以下步骤：
(1)微波消解：
将待检验样品加至微波消解罐内，加入浓硝酸和过氧化氢溶液后进行微波消解，消解后加入超纯水稀释消解液；将消解液转移后，消解罐用NaOH溶液浸泡，再用超纯水清洗；
(2)真空抽滤：
采用真空抽滤装置，将稀释后的消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤以去除滤膜水分；
(3)扫描电镜自动拍照并存储图像：
在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金属膜，使其具有导电性，然后在扫描电镜放大下，将滤膜含样品区域化分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，对每个视场进行自动拍照并存储其图像。
在微波消解步骤前设有防止污染影响的空白试验步骤，以确认所有试剂、工具、器皿以及消解罐不含硅藻。
其中，所述微波消解步骤具体为：
所述待检验样品为1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样；取待检验样品置微波消解仪的消解罐内，加入1-10ml浓硝酸和1-5ml的30％过氧化氢，然后将消解罐置于微波消解仪内进行微波消解；微波消解仪消解条件为：5-10min内将微波功率由0升至600-1000W，保持该功率10-20min后停止微波辐射，通风冷却，直至消解罐外部温度降至30-50℃，然后加入30-60mL超纯水以稀释组织消解液的酸度；将稀释后的消解液转移至试管中；用1-5NNaOH溶液浸泡消解罐，并用超纯水洗净。
由于法医学硅藻检验中，既要将组织消解彻底，又不能对硅藻形态造成大的破坏，因此必须选择合适的消解体系和微波消解条件，本发明的消解体系和微波消解条件的选择和确定针对法医学硅藻检验的特点设计，实验证明，该条件下的微波消解会导致单个长链状硅藻(如直链藻)被分离为多个形态完整的硅藻，但不会破坏直链藻、小环藻、桥弯藻等单个硅藻的硅质外壳特征，因此不影响硅藻的检测和种属的鉴定。鉴于硅藻检验中除肺组织外，其它脏器中硅藻含量通常较低，为避免污染，本发明微波消解步骤前除设有防止污染影响的空白试验步骤外，微波消解后消解罐用1-5NNaOH溶液浸泡，再用超纯水洗净。
本发明的真空抽滤步骤中真空度为100-800mmHg，所采用滤膜直径10-50cm，孔径为0.1-1.0μm。实验的具体设备包括：(1)Anton Parr MW3000微波消解仪；(2)单联或多联真空抽滤装置(自行研制，如图2所示，包括滤杯1、滤膜2、抽滤接口3、滤液收集瓶4、抽真空管5、真空泵6；所述滤杯1下设滤膜2，滤膜2下设抽滤接口3和滤液收集瓶4，真空泵6通过抽真空管5与抽滤接口3连接，真空泵6抽真空后滤液通过滤膜2进入滤液收集瓶4；所述多联真空抽滤装置的抽真空管道5包括总管51和与总管51相连的若干个支管52，总管51与真空泵6连接，各个支管52与每个抽滤接口3连接，实现同时真空抽滤功能。其中滤膜规格为直径25mm孔径0.45μm的尼龙滤膜，抽滤区域的直径为9mm)；(3)FEI Quanta600型扫描电镜；(4)扫描电镜专用样品座(公安部物证鉴定中心生产)，；(5)分析级浓硝酸；(6)分析级30％过氧化氢。
传统的采用硝酸乙醇法消解的组织消解液，通常含有未完全消解的组织残留物，在进行真空抽滤时容易堵塞滤膜，使抽滤无法进行，因此不宜将硝酸乙醇法与真空抽滤相结合用于脏器组织内硅藻的提取。本发明采用的微波消解法消解组织更加完全，因此适用真空抽滤处理。与传统的反复多次离心步骤程序相比，真空抽滤过程大大简化了处理过程，而且减少硅藻损失，提高了回收率。本发明中的真空度、滤膜材质和孔径范围综合考虑到了抽滤效率和抽滤的效果，避免了真空度过高导致滤膜破和真空度过低导致过滤效率低的情形。本发明的多联式真空抽滤具有有简单、高效、应用灵活、成本低等优点。
更进一步，本发明在扫描电镜放大倍数下，将滤膜含样品区域分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，通过计算机程序驱动扫描电镜样品台自动移动，逐个拍摄所划分视场的图像，并对图像进行存储，具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm2-20×20mm2的矩形区域。
Claims (7)
1.一种法医学硅藻检验的自动化方法，其特征在于包括依次进行的硅藻扫描电镜图像数据库的建立、硅藻自动化识别系统的建立和水样和尸体脏器组织中硅藻自动化检测过程：
所述硅藻扫描电镜图像数据库建立包括如下步骤：
A1、采集不同地理位置的水样；A2、对水样进行硅藻检验，所述水样硅藻检验包括微波消解、真空抽滤和扫描电镜图像自动拍摄步骤；A3、对硅藻扫描电镜图像进行分析，根据硅藻壳面的形态结构，建立不同种类硅藻的扫描电镜图像数据库；
所述硅藻自动化识别系统的建立过程包括如下步骤：
B1、硅藻扫描电镜图像的预处理，包括：采用Gabor滤波器、灰度阈值分割处理和数学形态学处理方法进行图像增强、图像分割和二值化处理；
B2、将硅藻壳面的特征形态结构从预处理后的图像中提取出来，建立不同种属硅藻形态结构特征的数据库；
B3、采用基于人工神经网络和统计决策理论的决策树方法，根据硅藻形态结构特征，对不同种属硅藻进行分类识别；
所述水样和尸体脏器组织中硅藻自动化检测过程包括：
C1、对水样和脏器组织进行硅藻检验，所述水和脏器组织硅藻检验包括微波消解、真空抽滤和扫描电镜图像自动拍摄步骤；
C2、对所拍摄扫描电镜图像，采用Gabor滤波器、灰度阈值分割处理和数学形态学处理方法进行图像增强、图像分割和二值化处理；提取形态结构特征，并在硅藻形态结构特征数据库中进行检索匹配和统计计算；
步骤A2和C1中所述微波消解步骤为：
所述待检验样品为1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的水样；
取待检验样品置微波消解仪的消解罐内，加入1-10ml浓硝酸和1-5ml的30％过氧化氢，然后将消解罐置于微波消解仪内进行微波消解；微波消解仪消解条件为：5-10min内将微波功率由0升至600-1000W，保持该功率10-20min后停止微波辐射，通风冷却，直至消解罐外部温度降至30-50℃，然后加入30-60mL超纯水以稀释组织消解液的酸度；将稀释后的消解液转移至试管中；用1-5NNaOH溶液浸泡消解罐，并用超纯水洗净。
2.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验的自动化方法，其特征在于所述步骤A2和步骤C1中对水样和组织器官进行硅藻检验至少包括以下步骤：
(1)微波消解：
将待检验样品加至微波消解罐内，加入浓硝酸和过氧化氢溶液后进行微波消解，消解后加入超纯水稀释消解液；将消解液转移后，消解罐用NaOH溶液浸泡，再用超纯水清洗；
(2)真空抽滤：
采用真空抽滤装置，将稀释后的消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤以去除滤膜水分；
(3)扫描电镜自动拍照并存储图像：
在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金属膜，使其具有导电性，然后在扫描电镜放大下，将滤膜含样品区域化分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，对每个视场进行自动拍照并存储其图像。
3.根据权利要求2所述的法医学硅藻检验的自动化方法，其特征在于微波消解步骤前设有防止污染影响的空白试验步骤，以确认所有试剂、工具、器皿以及消解罐不含硅藻。
4.根据权利要求2所述的法医学硅藻检验的自动化方法，其特征在于所述真空抽滤步骤的真空度为100-800mmHg，所采用滤膜直径10-50cm，孔径为0.1-1.0μm。
5.根据权利要求2所述的法医学硅藻检验的自动化方法，其特征在于所述真空抽滤步骤中采用单联或多联真空抽滤装置进行真空抽滤，所述单联真空抽滤装置每次只对一个样品进行抽滤；所述多联真空抽滤装置，每次可同时对多个样品进行抽滤处理。
6.根据权利要求5所述的法医学硅藻检验的自动化方法，其特征在于所述真空抽滤装置包括滤杯、滤膜、抽滤接口、滤液收集瓶、抽真空管、真空泵；所述滤杯下设滤膜，滤膜下设抽滤接口和滤液收集瓶，真空泵通过抽真空管与抽滤接口连接，真空泵抽真空后滤液通过滤膜进入滤液收集瓶；
所述多联真空抽滤装置的抽真空管道包括总管和与总管相连的若干个支管，总管与真空泵连接，各个支管与每个抽滤接口连接，实现同时真空抽滤功能。
7.根据权利要求2所述的法医学硅藻检验的自动化方法，其特征在于在扫描电镜放大倍数下，将滤膜含样品区域分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，通过计算机程序驱动扫描电镜样品台自动移动，逐个拍摄所划分视场的图像，并对图像进行存储，具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm2-20×20mm2的矩形区域。
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| CN2256290Y (zh) * | 1996-07-04 | 1997-06-18 | 李延阁 | 法医用硅藻检查破机罐 |
-
2010
- 2010-02-11 CN CN2010101157280A patent/CN101782538B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN2256290Y (zh) * | 1996-07-04 | 1997-06-18 | 李延阁 | 法医用硅藻检查破机罐 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HIROSHI MATSUMOTO.A SIMPLE METHOD FOR DIATOM DETECTION IN DROWNING.《Forensic Science International》.1993,第60卷第91-95页. * |
| 吴德清等.硅藻的检验现状.《中国法医学杂志》.2004,第19卷(第增刊期),第13-15页. * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101782538A (zh) | 2010-07-21 |
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