CN113252413B - 一种硅藻检验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硅藻检验方法，包括以下步骤：(1)将待检测样品于逆王水中加热消解制成消化液；再将消化液冷却至多余的油脂析出，并在去除析出的表层油脂后转移至离心管中备用；(2)在离心管中的消化液析出形成油脂膜后进行离心；离心后，保留油脂膜，去除清液；再将油脂膜用有机溶剂于离心管中充分溶解；(3)将溶解有油脂膜的离心管进行离心，并在离心后去除上清液，取沉淀物制片，用于镜检。上述方案能解决目前法医学硅藻检验方法所存在的要么污染大，制片过程硅藻流失率大，要么因消解液存在大量油脂与未完全消解组织而影响制片、制片失败，要么因仪器昂贵、操作复杂和成本及维护费用高而无法广泛应用于基层法医学实验室检验的问题。

Description

一种硅藻检验方法
技术领域
本发明涉及法医学检测技术领域，尤其涉及一种硅藻检验方法。
背景技术
水中腐败尸体的溺死诊断是法医学领域中最大的难题之一，硅藻种类丰富(全世界约16000多种)，体积小(体长在1微米至200微米之间)，难以被破坏(细胞壁硅质含量高，抵抗力强)，在自然界水域中广泛存在，可由循环系统进入多个脏器，因此硅藻检验是解决水中尸体的死因问题的一种可靠手段，被公认为最佳方法。
目前报道的硅藻检验方法很多，实践中，公安部GA/T 813—2008标准(《人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验》)组织消解时间短、消解完全、程序简单、成本低，因而在法医学实践中应用最为普遍；但是，该方法反应剧烈，反应过程放出恶臭气体，严重的污染使得检验工作条件恶劣并严重影响周边，而且反复离心导致硅藻的损失较高，消解不彻底使得残存的组织残渣、油脂等会影响后续检验。
专利号为“CN101776623B”的中国专利公开了一种法医学硅藻检验方法，其采用微波消化-真空抽滤-自动化扫描电镜方案进行检验，具有检测灵敏度高、能有效避免污染、定性定量分析准确的优点；但是，该方案还存在仪器昂贵、操作复杂、成本较高、维护费用高等缺点，进而导致该检验方法无法广泛应用于基层法医学实验室。
而给出的替代方案-混合酸消解法(勒福特王水水浴加热消解)，确有其独到之处；但在实践中，其仍存在组织消解不充分及大量油脂存在的问题，而存在大量油脂与未完全消解组织的消解液无论离心还是抽滤都是大问题，若离心则大量油脂与未完全消解的组织混合成糊状沉淀而无法滴片，若抽滤则会堵孔(即便组织消解完全，消解液中存在的油脂在稀释消解液时遇纯水冷却仍会析出大量脂肪微粒而依旧会造成堵塞)；为了解决前述问题，只能通过较少的取材才可能改善该状况，但取材量过少又会影响检出率，特别是使用光镜进行镜检的时候！
另外，真空抽滤-镜检的方法也存在问题，一是目前的材料无法完全透明，使得光镜下辨识较为困难，二来真空抽滤方法虽然在理论上能够最大限度地截留硅藻，但同时也会最大限度地截留住无法消化的无机质以及消化不完全的残渣等杂质，进而在材料量少的情况下不会影响镜下观察，而一旦量多则会导致硅藻被覆盖而无法观察，该度不好掌控；因此，该方法容易制片失败，且制片失败则无法挽回。
发明内容
本发明公开一种硅藻检验方法，以解决目前法医学硅藻检验方法所存在的要么污染大，制片过程硅藻流失率大，要么因消解液存在大量油脂与未完全消解组织而影响制片、制片易失败，要么因仪器昂贵、操作复杂和成本及维护费用高而无法广泛应用于基层法医学实验室检验的问题。
为了解决上述问题，本发明采用下述技术方案：
一种硅藻检验方法，其包括以下步骤：
(1)将待检验样品于逆王水之中加热至完全消解制备得到消化液；再将所述消化液冷却至多余油脂析出，并在去除析出的表层油脂后将所述消化液转移至离心管之中静置备用；
(2)取步骤(1)中的所述离心管，并在所述离心管之中的消化液析出形成油脂膜后进行离心；离心后，保留所述离心管之中消化液析出形成的油脂膜，并去除清液；再将所述油脂膜用有机溶剂于离心管之中充分溶解；
(3)将步骤(2)中溶解有所述油脂膜的离心管进行离心，并在离心后去除上清液，取沉淀物进行制片，用于镜检。
可选地，所述步骤(2)中，将承载器具插入所述离心管之中，将所述离心管之中消化液析出形成的油脂膜附着于所述承载器具上进行保留；之后，再用所述有机溶剂将附着与所述承载器具上的所述油脂膜洗入离心管之中进行溶解。
可选地，所述承载器具为吸管、滴管或玻璃棒。
可选地，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿或乙二醇。
可选地，所述逆王水添加有过氧化氢。
可选地，所述待检验样品为肺组织10-30g、肝组织10-30g、肾组织10-30g、骨髓10-30g或现场水样10-30ml。
本发明采用的技术方案能够达到以下有益效果：
本发明公开的硅藻检验方法对现有的混合酸消解法(勒福特王水水浴加热消解)进行了改进；其中，通过步骤(1)中的逆王水经加热使得待检验样品完全消解制成消化液，再经冷却析出，并去除消化液中的过量油脂；通过步骤(2)使得消化液中硅藻等微粒与脂质聚成的较大颗粒通过静置离心有效富集保留于油脂膜中，再去除清液将富集有硅藻的油脂膜用有机溶剂重新溶解于离心管之中；通过步骤(3)使得有机溶剂中的硅藻沉降形成沉淀物，脂质则溶于有机溶剂在上清液中被弃去，将沉淀物制片用于镜检；因此，相较于现有方法，本发明可以有效地避免因消化液中未完全消解组织与大量油脂对硅藻的制片和镜检观察的影响，避免制片过程中硅藻的大量损失，制片易成，硅藻回收率高，制得的片子硅藻完整、纹理清晰、极易观察；同时，可以适用于光学显微镜的制片观察，避免了电子显微镜的使用，有效地降低了检验成本及维修费用，从而可以广泛地应用于基层法医学实验室检验。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
主要设备耗材：可调功率电炉，离心机，光学显微镜，剪刀，托盘，天平，500ml烧杯，表面皿，50ml量筒，载玻片和盖玻片，一次性吸管，50ml离心管，硝酸(分析纯)，盐酸(分析纯)，30％过氧化氢溶液(分析纯)，75％～100％乙醇(分析纯)，2mol/L氢氧化钠溶液。
待检验样品：待检验样品取材参照中华人民共和国公共安全行业标准GA/T813—2008人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验提取相应检材；如肺组织约20g、肝组织约20g、肾组织约20g、骨髓约20g或现场水样约20ml，并分别置于500ml烧杯。
硅藻检验方法包括以下步骤：
(1)往盛装有待检验样品的烧杯中加入6ml的盐酸和18ml的硝酸(即使盐酸和硝酸按1:3的比例形成逆王水溶液)；然后，加入3ml的过氧化氢溶液；
(2)将烧杯置于电炉上加热至消化液开始冒泡，再加入3ml的过氧化氢溶液；随后调整电炉功率，使消化液保持微微冒小泡状态至消化液澄清，从而使得待检验样品完全消解，此时消化液应呈亮金色；
(3)小心往烧杯中补加12ml左右的纯硝酸继续加热至液体充分融合微沸，从而通过补液既可以防止溶液体积较少而影响待检验样品的溶解，又可以防止发生烧干，并在多个烧杯一起实验时可以使各个烧杯液面一致；
(4)取下烧杯，盖上表面皿让其自然冷却至油脂析出，从而使得高温状态下过量融于消化液中的油脂在冷凝时析出；然后，弃去析出的表层油脂以达到去除过量油脂的目的，并将消化液转移至50ml的离心管之中于阴凉处静置备用(置于冰箱中冷藏过夜更佳)；
(5)观察离心管中消化液的表面析出油脂形成油脂膜，并在离心管的管壁有析出的油脂附着时即可准备离心，将离心管放入离心机中，以4000r/min离心15min；离心后，用吸管轻轻探入消化液，用吸管表面附着消化液液面油脂析出形成的油脂膜的方法保留这层膜，由于离心管内部表面析出形成的油脂膜对硅藻有很强的黏附作用，这使得消化液中的硅藻得以黏附富集于油脂膜而被很大程度地保留；同时，轻轻吸去、倒尽清液(弃去的清液用等体积氢氧化钠溶液中和后按危废液处理)，再用20ml左右75％-100％的乙醇将吸管表面附着物尽数洗入离心管，盖上管盖轻晃，使离心管中的油脂充分溶于乙醇；
(6)将溶解有油脂的离心管放入离心机中，以4000r/min离心15min；然后，弃去离心后的上清液，取沉淀物，尽量薄且均匀地涂布在载玻片上，烘干，再盖上盖玻片，并以环氧树脂封闭完成制片，以备镜检；
(7)镜检时，可以以10倍物镜搜寻硅藻，并记录所有涂片上的硅藻数；如不能确定，则可以再以40倍物镜确定。
相较于现有的法医学硅藻检验方法，本发明所公开的硅藻检验方法可以有效地避免因消化液中未完全消解组织与大量油脂对硅藻的制片和镜检观察的影响，避免制片过程中硅藻的大量损失，制片易成，硅藻回收率高，最终所制得的片子硅藻完整，纹理清晰，极易观察，并具有操作简便明了、操作环境友好、成本低的优点，还克服了待检验样品量对检验方法的限制，即使待检验样品取量大仍可以正常完成检验。
该方法在镜检时可以适用于光学显微镜的制片观察，从而避免了电子显微镜的使用，进而使得该方法具有检验成本低的优点，可以广泛地应用于基层法医学实验室检验。
其中，本发明公开的硅藻检验方法中，在逆王水中还加入了过氧化氢溶液，从而通过过氧化氢的作用可以加快，促进待检验样品的消解，更好地提高了待检验样品的消解效果；优选地，过氧化氢的用量与盐酸的比例为1:1，并如上述步骤分步加入。
上述步骤(5)中，还可以选用其他有机溶剂替代乙醇将吸管表面附着物尽数洗入离心管中，并用于油脂溶解，如甲醇、丙酮、氯仿或乙二醇等；但是，由于乙醇不仅能溶解油脂，而且其密度比水小还利于硅藻微粒的凝聚沉降，因此，该步骤中可以优选为乙醇。
上述步骤(5)中，还可以通过其他的承载器具伸入离心管中，以将离心管中消化液液面油脂析出形成的油脂膜附着于其表面，如滴管或玻璃棒等具有承载表面的器具；并且，相较于真空抽滤的方式，该步骤通过承载器具直接将富集有硅藻的油脂膜附着于其上，从而相较于真空抽滤的方式可以避免因硅藻与消化液中杂质同时被截留而导致的制片困难及制片失败则无法挽回的问题。
需要说明的是，本发明实施例还对步骤(4)中弃去的油脂以及步骤(5)中吸去、倒尽的清液进行了硅藻检验，发现其中基本无硅藻，进而说明消化液中的硅藻在上述方法中基本黏附富集于步骤(5)中的油脂膜，再次说明本发明所公开的硅藻检验方法有效地减少了硅藻的流失，保证了硅藻的检出率和硅藻检验结果的准确性。
同时，若待检验样品为现场水样时，可以在现场水样中加入适量的油脂，以利用油脂的黏附作用，根据本发明公开的硅藻检验方法使得现场水样中的硅藻可以于上述步骤(5)中被析出形成的油脂膜黏附富集，并按相应的步骤操作完成现场水样中的硅藻检验。
当然，根据实际检测需要可以对待检测样品的检测用量进行适应性调整；例如，肺组织的检测用量也可以为10g或30g等，肝组织的检测用量也可以为10g或30g等，肾组织的检测用量也可以为10g或30g等，骨髓的检测用量也可以为10g或30g等，现场水样的检测用量也可以为10ml或30ml等。
本发明上文实施例中重点描述的是各个实施例之间的不同，各个实施例之间不同的优化特征只要不矛盾，均可以组合形成更优的实施例，考虑到行文简洁，在此则不再赘述。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (6)

1.一种硅藻检验方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待检验样品于逆王水之中加热至完全消解，制备得到消化液；再将所述消化液冷却至多余油脂析出，并在去除析出的表层油脂后将所述消化液转移至离心管之中静置备用；
(2)取步骤(1)中的所述离心管，并在所述离心管之中的消化液析出形成油脂膜后进行离心；离心后，保留所述离心管之中消化液析出形成的油脂膜，并去除清液；再将所述油脂膜用有机溶剂于离心管之中充分溶解；
(3)将步骤(2)中溶解有所述油脂膜的离心管进行离心，并在离心后去除上清液，取沉淀物进行制片，用于镜检。
2.根据权利要求1所述的硅藻检验方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将承载器具插入所述离心管之中，将所述离心管之中消化液析出形成的油脂膜附着于所述承载器具上进行保留；之后，再用所述有机溶剂将附着与所述承载器具上的所述油脂膜洗入离心管之中进行溶解。
3.根据权利要求2所述的硅藻检验方法，其特征在于，所述承载器具为吸管、滴管或玻璃棒。
4.根据权利要求2所述的硅藻检验方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿或乙二醇。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的硅藻检验方法，其特征在于，所述逆王水添加有过氧化氢。
6.根据权利要求5所述的硅藻检验方法，其特征在于，所述待检验样品为肺组织10-30g、肝组织10-30g、肾组织10-30g、骨髓10-30g或现场水样10-30ml。
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