CN101776623A - 一种法医学硅藻检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及法医学检验领域，为一种法医学硅藻检验方法。其至少包括以下步骤：(1)微波消解：在检验样品中加入浓硝酸和过氧化氢溶液后进行微波消解；(2)真空抽滤：将消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤去除滤膜水分；(3)扫描电镜自动拍照并存储图像；(4)硅藻定性定量分析：采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄视场图像中的硅藻进行检查、分类和统计处理。本发明检测灵敏度高，能有效避免污染，简单、高效、环保、定性定量分析准确，大大改善了法医学硅藻检验技术人员的工作环境、降低了劳动强度，在法医学溺死诊断实践中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及法医学检验领域，特别涉及一种通过检验脏器组织器官中硅藻种类及含量鉴定水中尸体死因的法医学硅藻检验方法。
背景技术
水中尸体的死因分析一直是法医学实践中的难点之一。20世纪40年代以来，许多法医学者在溺死者尸体上证实，硅藻可进入大循环的各脏器。尽管理论上对硅藻检验的诊断价值仍存在分歧，但在法医学实践中，硅藻检验仍被认为是一种相对可靠的溺死诊断手段，尤其对于水中腐败尸体死亡原因的鉴定，被视为最佳的鉴定方法。在能防止污染的情况下，从肺边缘组织、肝、肾、骨髓等多个脏器中检出与现场水样相同种类的较多硅藻，一般可作出溺死的鉴定。目前，文献报道的硅藻检验方法有很多，如强酸消解法、灰化法、Soluene-350消解法、硅胶梯度离心法、酶消解法和PCR法等。
与其它检验方法相比，强酸消解法具有组织消解时间短、消解完全、程序简单、成本低等优点，因而在法医学实践中应用最为普遍。如GA/T 813-2008标准(《人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验》)中，利用浓硝酸和无水乙醇(或乙醚)，在电炉加热条件使组织器官消解，消解充分后，将消化液倒入离心管经反复离心后制片；最后采用光镜观察法，以10倍或40倍物镜检查硅藻。
传统的强酸消解法是敞开式的，消解过程中存在强酸喷出灼伤人体的危险，而且大量的强酸与法医学实践中的腐败检材在消解过程中释放出二氧化氮和恶臭气体，不仅污染环境而且使法医检验人员的工作环境异常恶劣；而且传统强酸消解法一般在采取重复多次离心后再制片观察，反复的离心处理过程将导致硅藻的损失，实验表明离心一次导致大约10％的硅藻损失，增加离心速度不能显著提高硅藻的回收率，因此导致脏器组织中硅藻提取回收率低。
目前法医学实验室大多只采用光学显微镜对消解后组织内的硅藻进行定性定量分析，然而光学显微镜分析工作强度大，而且受放大倍数的限制，对于微型硅藻容易出现漏检或无法准确鉴定其种属。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，设计一种检测灵敏度高、能有效避免污染、定性定量分析准确，改善工作环境、降低劳动强度的法医学硅藻检验方法。
为了实现上述技术目的，本发明包括如下技术特征：一种法医学硅藻检验方法，其至少包括如下几个步骤：
一种法医学硅藻检验方法，其特征在于至少包括以下步骤：
(1)微波消解：
将待检验样品加至微波消解罐内，加入浓硝酸和过氧化氢溶液后进行微波消解，消解后加入超纯水稀释消解液；将消解液转移后，消解罐用NaOH溶液浸泡，再用超纯水清洗；
(2)真空抽滤：
采用真空抽滤装置，将稀释后的消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤以去除滤膜水分；
(3)扫描电镜自动拍照并存储图像：
在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金属膜，使其具有导电性，然后在扫描电镜放大下，将滤膜含样品区域化分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，对每个视场进行自动拍照并存储其图像；
(4)硅藻定性定量分析：
对所拍摄视场图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。
本发明在微波消解步骤前设有防止污染影响的空白试验步骤，以确认所有试剂、工具、器皿以及消解罐不含硅藻。
本发明的微波消解步骤具体为：所述待检验样品为1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样；将待检验样品置微波消解仪的消解罐内，加入1-10ml浓硝酸和1-5ml的30％过氧化氢，然后将消解罐置于微波消解仪内进行微波消解；微波消解仪消解条件为：5-10min内将微波功率由0升至600-1000W，保持该功率10-20min后停止微波辐射，通风冷却，直至消解罐外部温度降至30-50℃，然后加入30-60mL超纯水以稀释组织消解液的酸度；将稀释后的消解液转移至试管中；用1-5NNaOH溶液浸泡消解罐，并用超纯水洗净。
由于法医学硅藻检验中，既要将组织消解彻底，又不能对硅藻形态造成大的破坏，因此必须选择合适的消解体系和微波消解条件，本发明的消解体系和微波消解条件的选择和确定针对法医学硅藻检验的特点设计，实验证明，该条件下的微波消解会导致单个长链状硅藻(如直链藻)被分离为多个形态完整的硅藻，但不会破坏直链藻、小环藻、桥弯藻等单个硅藻的硅质外壳特征，因此不影响硅藻的检测和种属的鉴定。鉴于硅藻检验中除肺组织外，其它脏器中硅藻含量通常较低，为避免污染，本发明微波消解步骤前除设有防止污染影响的空白试验步骤外，微波消解后消解罐用1-5NNaOH溶液浸泡，再用超纯水洗净。
本发明的真空抽滤步骤中真空度为100-800mmHg，所采用滤膜直径10-50cm，孔径为0.1-1.0μm。所述真空抽滤步骤中采用单联或多联真空抽滤装置进行真空抽滤，所述单联真空抽滤装置每次只对一个样品进行抽滤；所述多联真空抽滤装置，每次可同时对多个样品进行抽滤处理。进一步的，所述真空抽滤装置包括滤杯、滤膜、抽滤接口、滤液收集瓶、抽真空管、真空泵；所述滤杯下设滤膜，滤膜下设抽滤接口和滤液收集瓶，真空泵通过抽真空管与抽滤接口连接，真空泵抽真空后滤液通过滤膜进入滤液收集瓶；所述多联真空抽滤装置的抽真空管道包括总管和与总管相连的若干个支管，总管与真空泵连接，各个支管与每个抽滤接口连接，实现同时真空抽滤功能。
传统的采用硝酸乙醇法消解的组织消解液，通常含有未完全消解的组织残留物，在进行真空抽滤时容易堵塞滤膜，使抽滤无法进行，因此不宜将硝酸乙醇法与真空抽滤相结合用于脏器组织内硅藻的提取。本发明采用的微波消解法消解组织更加完全，因此适用真空抽滤处理。与传统的反复多次离心步骤程序相比，真空抽滤过程大大简化了处理过程，而且减少硅藻损失，提高了回收率。本发明中的真空度、滤膜材质和孔径范围综合考虑到了抽滤效率和抽滤的效果，避免了真空度过高导致滤膜破和真空度过低导致过滤效率低的情形。本发明的多联式真空抽滤具有有简单、高效、应用灵活、成本低等优点。
更进一步，本发明在扫描电镜放大倍数下，将滤膜含样品区域分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，通过计算机程序驱动扫描电镜样品台自动移动，逐个拍摄所划分视场的图像，并对图像进行存储，具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm2-20×20mm2的矩形区域。
本发明硅藻定性定量分析步骤采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
1、灵敏度高。本发明的微波消解和真空抽滤步骤，避免了传统技术中硝酸乙醇法消解对部分硅藻的破坏，以及多次离心处理过程所导致硅藻的损失。微波消解对硅藻破坏程度的评价研究结果表明，所采用的微波消解条件对硅藻的破坏只限于将长链状硅藻(如直链藻)的长链打断，不影响硅藻的检测，因此，与传统强酸消解法相比，通过微波消解和真空抽滤从脏器中提取硅藻，回收率更高。
2、高效性、安全性和环保性。微波消解技术是近几年来发展起来的一种先进、高效的样品消解技术，它利用微波的穿透性和激活反应能力加热密闭容器内试剂和样品使反应容器内压力增加，温度提高，从而大大提高反应速率，缩短样品消解时间，具有快速、分解完全、酸消耗少、环境污染小等优点。研究表明：微波消解法所需时间约为传统硝酸乙醇法的1/5，而且组织消解更加完全。采用真空抽滤处理，避免了繁琐的离心处理过程；微波消解过程是在密闭环境下进行的，安全性好，而且酸使用量少、组织消解彻底，因而腐败脏器和强酸在消解过程中释放的恶臭气体和二氧化氮气体大大减少，减少了对环境的污染，极大程度地改善了工作环境。
3、定性定量分析准确性、劳动强度低。目前，法医学实验室普遍采用光学显微镜对消解后组织内的硅藻进行定性定量分析，而进入溺死尸体内部器官中的硅藻一般个体小，含量低，光镜检验由于放大倍数限制(最大1000X左右)容易出现漏检，或无法准确判断微型硅藻种属，因此有必要使用更高分辨率的显微镜检测组织脏器中的硅藻。扫描电镜景深大、分辨率高，是硅藻检测和种属分类最有效的技术手段。本发明通过微波消解和真空抽滤处理后的样品适合用扫描电镜分析，相对于光学显微镜以人工方式对每个视野中的硅藻进行检测，自动化扫描电镜以自动方式拍摄并存储每个视场图像，根据高分辨图像进行硅藻定性定量分析，结果更加准确，并显著减少了分析人员的劳动强度。
附图说明
图1为本发明多联式真空抽滤装置的结构示意图。
具体实施方式
本发明采用所建立的检验硅藻方法，过程分为四步：
(1)空白试验步骤：通过光学显微镜或扫描电子显微镜确认所有试剂、工具、器皿以及微波消解罐不含硅藻。
(2)微波消解：
分别取1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样置微波消解罐内；加入1-10ml浓硝酸和1-5ml的30％过氧化氢，然后在微波消解仪内进行消解；微波消解条件为：5-10min内将微波功率由0升至600-1000W，保持该功率10-20min后停止微波辐射，通风冷却，直至消解罐外部温度降至30-50℃，然后加入30-60mL超纯水以稀释组织消解液的酸度。将稀释后的消解液转移至塑料试管中。用1-5NNaOH溶液浸泡消解罐，用超纯水洗净。
(3)真空抽滤：
采用单联或多联真空抽滤装置对微波消解后的组织消解液进行真空抽滤，真空度100-800mmHg，有机滤膜(如尼龙滤膜)直径10-50cm，孔径为0.1-1.0μm。将消解液抽滤完全后，继续加50-100mL超纯水使滤膜表面接近中性，再加5-10mL乙醇去除滤膜内水分
由于微波消解仪对每一个消解罐内的样品处理量有限制，且在实际溺死案例中肝和肾组织中硅藻含量通常较低或不含硅藻，因此对于肝或肾检材，可一次取多份样品分别消解，消解后将消解液合并，再进行上述的真空抽滤处理步骤。
(4)滤膜导电处理
在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金属(金、铂)膜，使其具有导电性
(5)扫描电镜自动拍照和图像存储：
采用扫描电镜，在一定放大倍数下，将滤膜含样品区域分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，通过计算机程序驱动扫描电镜样品台自动移动，逐个拍摄所划分视场的图像，并对图像进行存储。具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm2-20×20mm2的矩形区域。
(6)硅藻定性定量分析：
采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄视场图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。在人工识别方式下，如某些视场中的微型硅藻，由于放大倍数所限，不能满足种属鉴定的要求，则回访相应视场，增大放大倍数观察硅藻细微结构并确认其种属。
本发明也可以简称为MD-VF-Auto SEM法。其中，MD代表MicrowaveDigestion，即微波消解，VF代表Vacuum Filtration，即真空抽滤，Auto SEM代表Automated Scanning Electron Microscopy，即自动化扫描电镜。与传统方法相比，本发明具有灵敏度高、高效、安全、环保、准确、劳动强度低的优点。
为了进一步说明，本发明还包括如下具体实施例：
实施例一，本发明的实验实施例
一、实验取材和设备
取30只新西兰大白兔由广东省动物实验中心提供，雌雄不限，体重1.0～3.0kg，随机分成2组：溺死组(n＝15)和死后入水组(n＝15)。选择珠江广州市海珠大桥处中央位置作为实验地点。将溺死组兔置兔笼中，沉入水下0.5m处，1min后提出水面，30s后重新沉入相同水深处，重复数次使大白兔缓慢溺死，死后在水中浸泡30min；死后入水组实验兔采用空气栓塞方法处死后，置于相同地点相同深度浸泡30min后取出。提取实验兔肺、肝、肾、股骨骨髓并提取现场水样作硅藻检验。
为评价本发明方法在水中腐败尸体硅藻检验中的优越性，取2例实际案例中的水中高度腐败人体尸体的肺脏。
实验的具体设备包括：MW3000微波消解系统：Anton Parr公司生产；单联或多联真空抽滤装置为自行研制，如图1所示，真空抽滤装置包括滤杯1、滤膜2、抽滤接口3、滤液收集瓶4、抽真空管5、真空泵6；所述滤杯1下设滤膜2，滤膜2下设抽滤接口3和滤液收集瓶4，真空泵6通过抽真空管5与抽滤接口3连接，真空泵6抽真空后滤液通过滤膜2进入滤液收集瓶4；所述多联真空抽滤装置的抽真空管道5包括总管51和与总管51相连的若干个支管52，总管51与真空泵6连接，各个支管52与每个抽滤接口3连接，实现同时真空抽滤功能。其中滤膜规格为直径25mm孔径0.45μm的尼龙滤膜，抽滤区域的直径为9mm；FEI Quanta600型扫描电镜配EDAX Genesis7000型能谱仪：分别由FEI公司和EDAX公司生产，具有自动分析功能，自动分析过程由能谱分析系统驱动；射击残留物提取器：公安部物证鉴定中心，其表层为保护膜，里层为强粘性的碳导电胶；分析级浓硝酸：广州化学试剂厂；分析级30％过氧化氢：广州化学试剂厂。
分别采用所本发明的方法和基于传统的硝酸乙醇消解、离心处理、自动化扫描电镜检测的方法(传统处理法)对溺死组和死后入水组共30例实验兔脏器组织和现场水样进行硅藻检验。
二、实验方法
2.1、实验兔脏器组织和现场水样中的硅藻检验
1、按照本发明方法进行实验
(1)微波消解：分别取2g肺、肝、肾组织、1/2股骨骨髓(0.5～1.0g)和2mL现场水样置消解罐内，加入8mL浓硝酸和2mL30％过氧化氢后进行微波消解，每批同时消解8个样品，消解条件如下：5min内将微波功率由0升至800W，保持该功率10min后停止微波辐射，通过强风冷却方式使消解罐外部温度降至50℃。在消解罐内加入40mL不含硅藻的超纯水以稀释组织消解液的酸度，然后进行下一步真空抽滤处理。由于密闭微波消解对每一个消解罐内的样品量有限制，且在许多实际溺死案例中肝和肾组织中不含硅藻或含量较低，因此对于每一例实验兔肝和肾组织，按每份2g各取5份分别消解，消解后将消解液合并作下一步处理。为防止污染，首先做空白实验，确认所有试剂、工具、器皿以及消解罐不含硅藻后再进行微波消解实验。消解后按中的方法，立即加2NNaOH至消解罐浸泡24h，然后用超纯水清洗。
(2)真空抽滤：设置真空度为200mmHg。将消解液倒入滤杯内抽滤；抽滤完后加50mL超纯水继续抽滤使滤膜表面接近中性，最后加10mL乙醇抽滤以去除滤膜内水分。抽滤完成后，取出滤膜，剪取滤膜与消解液接触部分，在离子溅射仪中镀金膜后用自动化扫描电镜分析。
(3)自动化扫描电镜分析：扫描电镜参数：加速电压20kV，放大倍数600X，图像分辨率1024×800。设定将所剪取滤膜包含在内的约10×10mm2的矩形区域为扫描范围，设定放大倍数为600X，将扫描范围分成21×27个相邻视场(Field)，每个视场大小为0.472×0.368mm2，设定每个视场图像采集时间为10s。分析开始后，系统自动扫描并存储每一个视场的图像，分析所需总时长约1.5小时。
(4)硅藻定性定量分析：对每一个视场图像中的硅藻进行定性定量分析，如所设定的放大倍数不能满足某些微型硅藻种属鉴定的要求，回访相应视场，增大放大倍数观察硅藻细微结构以确定硅藻种属，并可通过仪器自带的XT Docu分析软件对硅藻尺寸进行准确测量。
2.传统处理法的对比实验
参考GA/T 813-2008标准，采用硝酸乙醇法对2g实验兔肺(硝酸10mL，乙醇3mL)、10g肝(硝酸25mL，乙醇3mL)、10g肾组织(硝酸25mL，乙醇3mL)、剩余的1/2股骨骨髓(硝酸10mL，乙醇3mL)进行消解；现场水样取2mL，4000转/min离心15min，吸去上层液，往沉淀中加入硝酸5mL，使之充分反应。消解液按[8]中的方法，2500rpm下离心25min，倒去上层液，加入超纯水，重复该过程3次，最后在3000rpm下离心，去掉上层液后，取沉淀液置扫描电镜铝样品座上，烘干镀金膜后用自动化扫描电镜按上述方法设置参数后自动分析。
2.2、微波消解对硅藻破坏程度的评价
分别取2份2mL现场水样，一份按上述微波消解-真空抽滤的方法处理，另一份直接进行真空抽滤。两种处理方法得到的滤膜镀金膜后用扫描电镜检测。通过比较两者的硅藻检验结果，评价微波消解对硅藻的破坏程度。
2.3、微波消解法与硝酸乙醇法消解时间与消解效果实验
按上述的微波消解法和硝酸乙醇法分别消解2g溺死实验兔肺、肝、肾组织，记录溶液变为澄清透明时所需的时间。组织消解液均采用上述真空抽滤处理，通过扫描电镜观察微孔滤膜上组织残留物评价两种方法的消解效果。
2.4、离心处理对硅藻回收率的影响实验
采用微波消解法消解2g溺死实验兔肺组织，将组织消解液分为两等份，分别在3000rpm和10000rpm下离心30min，小心吸取上层液置干净塑料试管内，保留2mL下层液；对上层液和下层液真空抽滤后，用扫描电镜进行硅藻分析。硅藻回收率计算公式如下：
R＝D下层液/(D上层液+D下层液)×100％
式中R代表硅藻回收率，D上层液、D下层液分别代表上层液和下层液中所含的硅藻数量。
2.5、MW-VF-Auto SEM法在水中腐败人体尸体硅藻检验中的优越性评价
按上述的微波消解-真空抽滤处理方法和硝酸乙醇消解-离心处理方法对2g水中高度腐败人体尸体的肺组织进行处理。从样品处理步骤繁简、消解液体恶臭程度、污染气体排放量等方面评价MW-VF-Auto SEM法在水中腐败人体尸体硅藻检验中的优越性。
2.6、自动化扫描电镜与光学显微镜检测硅藻效果比较
分别用扫描电镜和光学显微镜检测现场水样中的硅藻。两种检测方法分别如下：自动化扫描电镜检测：按上述MW-VF-Auto SEM法检测2mL现场水样中的硅藻；光学显微镜检测：将2mL现场水样按上述微波消解及反复离心处理后，取沉淀液1滴至2滴，尽量薄且均匀地涂布在载玻片上，烘干，盖上盖玻片，用环氧树脂封闭，以人工方式镜检。
三、统计学处理
应用SPSS 13.0统计学软件对实验数据进行方差分析等统计学处理，P＜0.05为有显著性差异。
四、实验结果
4.1实验兔脏器组织中硅藻检验
1、定量分析结果
采用MW-VF-Auto SEM法和传统处理法检测现场水样和溺死组实验兔各脏器组织中的硅藻，定量分析结果如表1所示，对定量分析数据的统计学分析结果如表2所示，采用以上两种方法，从死后入水组实验兔肺、肝、肾及骨髓中均未检测出硅藻。
表1溺死组各脏器组织和现场水样的硅藻定量分析结果
*：D代表硅藻数量
Δ：A代表MW-VF-Auto SEM法
#：B代表传统处理法
表2溺死组各脏器硅藻检验结果的统计学分析结果
Δ：A代表MW-VF-Auto SEM法
#：B代表传统处理法
2、定性分析结果
采用MW-VF-Auto SEM法和传统处理法从现场水样和脏器组织内提取的硅藻种类相同。
现场水样中主要含有直链藻、小环藻、辐环藻、菱形藻、舟形藻，所含比例较少的硅藻种类有针杆藻、、曲壳藻、布纹藻、冠盘藻、卵形藻、海链藻、菱板藻，硅藻大小相差很大，小的如卵形藻纵轴只有7μm，大的直链藻可长达1mm。
肺组织中硅藻种类较丰富，含有现场水样中的大多数种类硅藻，主要种类有：直链藻、小环藻、辐环藻、舟形藻、菱形藻、曲壳藻，最常见硅藻大小约10-20μm，极少超过80μm。
肝、肾、股骨骨髓中硅藻种类很少，通常只有1-3种硅藻，常见的种类有小环藻、舟形藻、曲壳藻，大小约7-30μm。
除硅藻外，现场水样和少数溺死实验兔脏器组织中还检出鱼鳞藻(属金藻门)的鳞片，其大小为3-4μm，死后入水组实验兔脏器组织中则未发现有该藻类的鳞片。
4.2微波消解对硅藻破坏程度的评价
未消解的水样中含有大量的长链状直链藻，最长的可达到1mm；微波消解后的水样中则只含有短的直链藻；未消解的水样中还含有少量的长链状小环藻，微波消解后如直链藻一样，长链被打断，从而分离成多个小环藻。水样中的其它属的硅藻如菱形藻、针杆藻、舟形藻在微波消解后形态均保持完整。由此可见，合适条件下的微波消解只会导致单个长链状硅藻被分离为多个形态完整的硅藻，因此不影响硅藻的检测和种属鉴定。
4.3组织消解所需时间和消解效果比较
两种方法消解2g脏器组织所需时间如表3所示。
采用硝酸乙醇法消解得到的组织消解液中含有大量未消解完全的组织残留物，同种组织经微波消解后，则较少见有未消解完全的组织残留物。
表3两种方法消解2g脏器组织所需时间(x±s)
*P＜0.01
4.4离心过程对硅藻回收率的影响
3000rpm和10000rpm离心处理的硅藻回收率如表4所示。离心后上层液中硅藻的尺寸大多为7-20μm。
表4离心处理对硅藻回收率的影响
4.5MW-VF-Auto SEM法在水中腐败尸体硅藻检验中的优越性
从样品处理步骤繁简、消解液体恶臭程度、污染气体排放量、处理后样品有无臭味等方面对MW-VF-Auto SEM法和传统处理法进行比较的结果如表5所示。
表5两种方法在水中高度腐败尸体硅藻检验中的比较
| 比较内容 | MW-VF-AutoSEM法 | 传统处理法 |
| 样品处理步骤繁简 | 组织无需剪碎直接消解、真空抽滤过程简单 | 需将组织剪碎消解，消解后需进行多次离心处理，步骤繁琐 |
| 消解液体恶臭程度 | 轻 | 重 |
| 污染气体排放量 | 极少 | 大量 |
| 处理后样品有无臭味 | 滤膜上的最终样品无明显臭味 | 扫描电镜样品座上的最终样品无明显臭味 |
4.6自动化扫描电镜与光学显微镜检测硅藻效果比较
光学显微镜检测时，受分辨本领限制，微型的舟形藻、卵形藻、曲壳藻等硅藻容易被漏检，即使被检测到，亦无法根据硅藻表面纹饰鉴别其种属；而且因为光学显微镜景深小，在进行高倍(如1000X)观察时，需反复调焦。扫描电镜分辨本领高，可观察硅藻的细微结构，有利于对硅藻进行种属鉴定，而且景深大，在对每个视场自动扫描时，不需要反复聚焦，加快了样品分析的速度。相对于光学显微镜以人工方式对每个视野中的硅藻进行检测，自动化扫描电镜以自动方式拍摄并存储每个视场图像，根据图像再进行硅藻定性定量分析，结果更加准确，并大大减少了分析人员的劳动强度。
五、试验实施例有益效果
5.1灵敏度与抗污染能力
在能防止污染的情况下，从肺边缘组织、肝、肾、骨髓等多个脏器中检出与现场水样相同种类的较多硅藻，一般可作出溺死的鉴定。
本文实验结果表明，采用MW-VF-Auto SEM法从溺死实验兔各脏器组织(肺、肝、肾、股骨骨髓)中检出硅藻的比例均高于传统处理法。溺死组(n＝15)中，13例实验兔肺及内部器官组织(肝、肾、骨髓)中均检出硅藻(硅藻检验阳性)，占86.7％，而采用传统处理法，该比例为66.7％(共10例)，另一方面，采用MW-VF-Auto SEM法检测的硅藻含量均显著高于传统处理法(表2)，因此，微波消解-自动化扫描电镜法具有更高的硅藻提取回收率。死后入水组实验兔脏器组织硅藻检验呈阴性，进一步证明硅藻检验在法医学溺死诊断中的合理性，同时亦表明，所建立的新方法能有效避免污染。
5.2高效性、安全性和环保性
微波消解技术是近几年来发展起来的一种先进、高效的样品消解技术，它利用微波的穿透性和激活反应能力加热密闭容器内试剂和样品使反应容器内压力增加，温度提高，从而大大提高反应速率，缩短样品消解时间，具有快速、分解完全、酸消耗少、环境污染小等优点。微波消解过程中，既要将组织消解彻底，又不能对硅藻形态造成大的破坏，因此必须选择合适的消解体系和微波消解条件，硝酸-过氧化氢消解法被认为能减轻传统强酸消解对硅藻的破坏[10]，因此本研究采用以硝酸-过氧化氢作为消解体系，所使用的微波消解条件为经实验优化得到的较佳条件。微波消解对硅藻破坏程度的评价研究结果表明，所采用的微波消解条件对硅藻的破坏只限于将长链状硅藻的长链打断，不影响硅藻的检测。
由表3可知，对于2g脏器组织，微波消解所需时间约为硝酸乙醇法的1/5，而且组织消解更加完全。与硝酸乙醇法相比，微波消解酸消耗少，且在密闭环境下进行，因而更加安全、环保。
表4表明，离心一次导致大约10％的硅藻损失，增加离心速度并不能显著提高硅藻回收率。所建立的MW-VF-Auto SEM法，避免了传统硅藻检验中的反复离心过程，采用更直接的真空抽滤方式，将组织消解液中的硅藻富集于微孔滤膜，最大程度地减少硅藻损失。采用硝酸乙醇法的组织消解液，由于含有未完全消解的组织残留物，在进行真空抽滤时容易堵塞滤膜，并影响硅藻的检测，因此不宜将硝酸乙醇法与真空抽滤相结合用于脏器组织内硅藻的提取。本研究中，为使MW-VF-Auto SEM法更具高效性，研制了一种多联真空抽滤抽滤装置，该装置具有简单、应用灵活、成本低等优点，具有实用价值。
在对水中高度腐败尸体进行硅藻检验时，与传统处理方法相比，微波消解和真空抽滤相结合的硅藻提取技术具有独特的优势：样品处理过程简单、直接，由于组织消解过程在密闭环境中进行、酸使用量少、组织消解彻底，因而腐败脏器和强酸在消解过程中释放的恶臭气体和二氧化氮气体大大减少，减少了对环境的污染，极大程度地改善了工作环境。
5.3硅藻定性定量分析的准确性及劳动强度
进入溺死尸体内部器官中的硅藻一般个体小，含量低。本研究中发现，溺死实验兔脏器组织内中心纲硅藻最小直径约7μm，羽纹纲硅藻纵轴最短约8μm。因此，应使用较高的放大倍数检测脏器组织内的硅藻。扫描电镜景深大、分辨率高，可能是硅藻检测和种属分类最有效的技术手段。本研究中采用扫描电镜还从溺死实验兔脏器组织中检测到来自于现场水样的大小为3-4μm鱼鳞藻鳞片。相对于光学显微镜以人工方式对每个视野中的硅藻进行检测，自动化扫描电镜以自动方式拍摄并存储每个视场图像，根据图像进行硅藻定性定量分析，结果更加准确，并显著减少了分析人员的劳动强度。
实施例二
典型的刑事案例一：3岁女童谢某失踪，3个月后，在一住宅小区的蓄水池中发现其尸体。因尸体已经高度腐败，尸表检查后难以确定死因和案件性质。硅藻检验时采用硝酸乙醇法消解和光学显微镜观察，结果从肺中检出与蓄水池中相同类型的硅藻，含量为550个/10g肺组织，肝脏和肾脏组织硅藻检验呈阴性。采用MW-VF-Auto SEM法检验，从死者肺、肝、肾中均检出与蓄水池水样中相同类型的硅藻，含量分别为720个/10g肺组织、3个/10g肝组织、2个/10g肾组织，因此诊断死因为溺死。结合其它调查结果，最后证实死者为意外落水死亡。
实施例三
典型的刑事案例二：事主黄某被绑架勒索100万元。10日后在郊区一湖里发现其已高度腐败的尸体。为证实死者是在生前被抛入水中溺死还是死后被抛尸入水，尸体解剖后取肺、肝和肾组织，采用硝酸乙醇法消解，消解液经离心处理后用自动化扫描电镜进行硅藻检测，仅在肺中检出与现场水样相同类型的硅藻，含量为2030个/10g肺组织，而肝、肾组织的硅藻检验呈阴性，因此无法作出明确的溺死诊断结论。后采用MW-VF-Auto SEM法检验，从肺、肝中均检出与现场水样相同类型的硅藻，其中肺组织中硅藻含量为2580个/10g肺组织，肝组织中硅藻含量为5个/10g肝组织，根据该该检验结论，诊断死因为溺死。案件侦破后证实：犯罪嫌疑人将事主绑架后，因害怕事主反抗和其家属报案，于当晚将事主装入铁笼后抛入湖里致其溺死。
Claims (8)
1.一种法医学硅藻检验方法，其特征在于至少包括以下步骤：
(1)微波消解：
将待检验样品加至微波消解罐内，加入浓硝酸和过氧化氢溶液后进行微波消解，消解后加入超纯水稀释消解液；将消解液转移后，消解罐用NaOH溶液浸泡，再用超纯水清洗；
(2)真空抽滤：
采用真空抽滤装置，将稀释后的消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤以去除滤膜水分；
(3)扫描电镜自动拍照并存储图像：
在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金属膜，使其具有导电性，然后在扫描电镜放大下，将滤膜含样品区域化分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，对每个视场进行自动拍照并存储其图像；
(4)硅藻定性定量分析：
对所拍摄视场图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。
2.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于微波消解步骤前设有防止污染影响的空白试验步骤，以确认所有试剂、工具、器皿以及消解罐不含硅藻。
3.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述微波消解步骤具体为：
所述待检验样品为1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样；
取待检验样品置微波消解仪的消解罐内，加入1-10ml浓硝酸和1-5ml的30％过氧化氢，然后将消解罐置于微波消解仪内进行微波消解；微波消解仪消解条件为：5-10min内将微波功率由0升至600-1000W，保持该功率10-20min后停止微波辐射，通风冷却，直至消解罐外部温度降至30-50℃，然后加入30-60mL超纯水以稀释组织消解液的酸度；将稀释后的消解液转移至试管中；用1-5NNaOH溶液浸泡消解罐，并用超纯水洗净。
4.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述真空抽滤步骤的真空度为100-800mmHg，所采用滤膜直径10-50cm，孔径为0.1-1.0μm。
5.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述真空抽滤步骤中采用单联或多联真空抽滤装置进行真空抽滤，所述单联真空抽滤装置每次只对一个样品进行抽滤；所述多联真空抽滤装置，每次可同时对多个样品进行抽滤处理。
6.根据权利要求5所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于所述真空抽滤装置包括滤杯、滤膜、抽滤接口、滤液收集瓶、抽真空管、真空泵；所述滤杯下设滤膜，滤膜下设抽滤接口和滤液收集瓶，真空泵通过抽真空管与抽滤接口连接，真空泵抽真空后滤液通过滤膜进入滤液收集瓶；
所述多联真空抽滤装置的抽真空管道包括总管和与总管相连的若干个支管，总管与真空泵连接，各个支管与每个抽滤接口连接，实现同时真空抽滤功能。
7.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于在扫描电镜放大倍数下，将滤膜含样品区域分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，通过计算机程序驱动扫描电镜样品台自动移动，逐个拍摄所划分视场的图像，并对图像进行存储，具体参数设置为：加速电压10-20KV，放大倍数300-10000X，图像分辨率为1024×800-2048×1600；样品扫描区域为5×5mm2-20×20mm2的矩形区域。
8.根据权利要求1所述的法医学硅藻检验方法，其特征在于硅藻定性定量分析步骤采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。
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