CN110257331A - 一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法 - Google Patents

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曹红翠
冯旭东
俞炯
潘巧玲
刘景琪
李兰娟
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明涉及动物细胞提取方法，旨在提供一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法。提供一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法，包括：对小鼠肝脏静脉灌流、冲洗后，剪碎进行解离和消化；过滤后多次离心处理，对所得沉淀进行裂解以完全去除红细胞；终止裂红后再次离心处理；弃上清，得到纯净肝脏全免疫细胞。本发明能够在保证细胞纯度的基础上尽可能多地去除肝脏实质细胞，分离出高得率的小鼠肝脏全免疫细胞。与现有技术中研磨法分离的结果相比，本发明分离的小鼠肝脏全免疫细胞得率在大于5×106/只，高于研磨法得率的1～2.5×106/只，且细胞活率大于95％，大于传统研磨法细胞活率约85％。

Description

一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法
发明领域
本发明涉及动物细胞提取方法，特别涉及一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法。
背景技术
肝脏是一个重要的代谢器官，由多种细胞组成，其中肝实质细胞约占细胞总数的65％，肝脏内皮细胞、星状细胞、枯否细胞、肝脏相关淋巴细胞等非实质细胞占35％。同时肝脏也是重要的免疫活性器官，也被称为淋巴组织样器官，机体单核-巨噬细胞90％在肝脏，肝脏内的枯否细胞是机体单核-巨噬细胞的主要成分，占肝脏内细胞总数的25％；肝脏内B细胞、T细胞亚群也有着独特的淋巴细胞亚群分布模式。肝脏内固有免疫细胞和反应性免疫细胞在肝脏中发挥着重要的免疫调节作用。因此高效分离得到肝脏全免疫细胞尤为必要。
传统的分离方法将肝脏组织研磨，根据细胞密度采用离心，去除肝实质细胞，这样分离得到的免疫细胞得率较低，而且只能分离特定密度的细胞亚群，不能有效分离肝脏内所有免疫细胞。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中不足，提供一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜小鼠尸体，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部；分离出小鼠肝脏，保留胆囊和至少1厘米长度的主血管；
(2)以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)经肝门静脉持续灌流、冲洗肝脏，清除内部血液使肝脏从血红色变为白色；
(3)剥离胆囊和主血管，将肝脏置于含有磷酸盐缓冲液的培养皿内浸洗；
(4)将肝脏剪碎后置于含有4.7毫升改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco’smodified eagle medium,DMEM)和0.3毫升酶混合液的解离管内；
(5)将解离管放入德国MACS公司GentleMACSTM Dissociator解离机器中，以m_liver_03模式运行两次；
(6)取出解离管，置于37℃恒温、220转/分钟转速的摇床上消化30分钟；
(7)消化结束后，将解离管再次置于解离机器中，以m_liver_04模式运行两次；
(8)将解离管内混悬液以100微米滤器过滤到50毫升离心管内，用5毫升磷酸盐缓冲液重悬解离管内残留物后，再次将液体部分过滤至离心管内；
(9)在室温条件下，以相对离心力300g离心处理10分钟；
(10)弃掉上清液后，向沉淀内加3毫升36％Percoll细胞分离液；在室温条件下，以相对离心力600g离心处理15分钟；
(11)弃掉包含肝细胞碎片的上清液，并向沉淀内加入2毫升红细胞裂解液(ACKlysis buffer)裂解3分钟以完全去除红细胞；然后加入5ml磷酸盐缓冲液终止裂红，在4℃条件下以相对离心力400g离心处理5分钟；弃上清，得到纯净的小鼠肝脏全免疫细胞。
本发明中，所述磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.01摩尔/升，酸碱度(pH值)7.4。
本发明中，所述酶混合液的配置方法为：向100毫升磷酸盐缓冲液里加入12毫克胶原酶Ⅳ、30毫克链酶蛋白酶和5毫克脱氧核糖核酸酶Ⅰ粉末，混匀。
本发明中，在将剪碎后的肝脏置于解离管内之前，先将含改良杜氏伊格尔培养基和酶混合液的解离管置于37℃水浴中预热5分钟。
本发明中，所述Percoll细胞分离液的配置方法为：先将1毫升10倍磷酸盐缓冲液与9毫升percoll原溶液混合均匀，再加入15毫升1倍的磷酸盐缓冲液得到25毫升36％Percoll分离液。
本发明中，所述的10倍磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.1摩尔/升，酸碱度(pH值)7.4。
本发明中，所述步骤(9)、(10)中启动离心机前，应先将离心机升速降速均调整到最低档。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明能够在保证细胞纯度的基础上尽可能多地去除肝脏实质细胞，分离出高得率的小鼠肝脏全免疫细胞。
2、经流式细胞术测定细胞是否结合碘化丙啶和CD45-异硫氰酸荧光素方法验证，碘化丙啶阳性为死细胞，CD45阳性为免疫细胞。与现有技术中研磨法分离的结果相比，本发明分离的小鼠肝脏全免疫细胞得率在大于5×106/只，高于研磨法得率的1～2.5×106/只，且细胞活率大于95％，大于传统研磨法细胞活率约85％。
附图说明
图1分离到的肝脏免疫细胞形态显微镜观察图(20倍物镜观察)；
图2分离到的肝脏免疫细胞瑞氏姬姆萨染色图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售商品试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明所用小鼠肝脏的来源说明：本发明所用的小鼠肝脏均取自实验室废弃的自然死亡或意外死亡的小鼠，摘取肝脏时间应距死亡时间1小时内。选择其中的6-8周龄、体重18-25克的C57BL/6幼鼠尸体，用100毫升70％乙醇清洗后，在生物安全柜内取出肝脏供后续试验。本发明的实施过程中，不存在杀死存活小鼠的操作，也不存在对小鼠活体采取剖开、切除等创伤性或者介入性处置。
仪器与试剂：
解离管(MACS，German)，解离机器(MACS，German),恒温摇床(Thermo，America),离心管(corning，America)，离心机(eppendorf，German)，10厘米培养皿(Greiner，German)，100微米滤网(corning，America)，水浴锅(Thermo，America)，倒置显微镜(Nikon，Japan)，数字切片扫描装置(HAMAMATSU，Japan)，载玻片(世泰，中国)
DMEM(gibco，America)，PBS(吉诺，中国)，10倍PBS(gibco，America)，胶原酶Ⅳ(invitrogen，America)，链酶蛋白酶(roche，America)，脱氧核糖核酸酶Ⅰ(sigma，America)，percoll细胞分离液(GE Healthcare，Sweden)，红细胞裂解液(gibco，America)，瑞氏姬姆萨染色液(贝索，中国)
实施例1
高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法包括以下步骤：
(1)取新鲜小鼠尸体，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部；分离出小鼠肝脏，保留胆囊和至少1厘米长度的主血管；
(2)以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)经肝门静脉持续灌流、冲洗肝脏，清除肝脏内的血液使得小鼠肝脏从血红色变为白色；
(3)剥离胆囊和主血管，将肝脏置于含有PBS的10厘米培养皿内浸洗；
(4)将肝脏剪碎后置于含有4.7毫升改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco’smodified eagle medium,DMEM)和0.3毫升酶混合液的解离管内；
(5)将解离管放入GentleMACSTM Dissociator解离机器中，以m_liver_03模式运行两次；
(6)之后再将解离管置于37℃，以220转/分钟的转速旋转的恒温摇床上消化30分钟；
(7)消化结束后，再将解离管置于解离机器中，以m_liver_04模式运行两次；
(8)解离管内混悬液经100微米滤器过滤到50毫升离心管内，然后用5毫升PBS重悬解离管内残留物，然后再过滤至50毫升的离心管内，最后将50毫升离心管内液体转移到15毫升的离心管内；
(9)室温下，300相对离心力(g)离心10分钟，注意将离心机升速降速均调整到最低档再进行离心；
(10)弃掉上清液后，往沉淀内加3毫升36％Percoll细胞分离液，600相对离心力(g)室温离心15分钟，注意将离心机升速降速均调整到最低档再进行离心；
(11)弃掉包含肝细胞碎片的上清液，并往沉淀内加入2毫升红细胞裂解液(ACKlysis buffer)裂解3分钟以完全去除红细胞，之后加入5ml PBS终止裂红并在400相对离心力(g)4℃条件下离心5分钟，弃上清后可得到纯净的小鼠肝脏全免疫细胞。
上述步骤中：
磷酸盐缓冲液为商业试剂，其成分为氯化钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠和氯化钾，浓度为0.01摩尔/升(磷酸二氢钾0.24克/升，磷酸氢二钠1.42克/升，氯化钠8.0克/升，氯化钾0.2克/升)，酸碱度(pH值)7.4。酶混合液的配置方法为：100毫升磷酸盐缓冲液里加入12毫克胶原酶Ⅳ、30毫克链酶蛋白酶和5毫克脱氧核糖核酸酶Ⅰ粉末。含有4.7毫升改良杜氏伊格尔培养基和0.3毫升酶混合液的解离管需要置于37℃水浴预热5分钟。所述滤器是：100微米过滤网。36％Percoll细胞分离液的配置方法为：先将1毫升10倍PBS与9毫升percoll原溶液混合均匀后，在加入15毫升1倍的PBS得到25毫升的36％Percoll分离液。10倍PBS的成分为氯化钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠和氯化钾，浓度为0.1摩尔/升，酸碱度(pH值)7.4。
细胞形态观察方法：
用1毫升PBS重悬实施例1所得小鼠肝脏全免疫细胞，并滴一滴在载玻片中心，倒置显微镜下观察细胞。
免疫细胞瑞氏染色鉴定
(1)用1毫升PBS重悬免疫细胞，并滴一滴在载玻片整片的四分之一处，用玻片以均匀的速度将液滴向载玻片的另一端推动，干燥后形成细胞涂片。
(2)滴加0.5毫升瑞氏姬姆萨A液在涂片上，并让染液覆盖整个标本染色1分钟。
(3)再将瑞氏姬姆萨B液加于A液上面(滴加量为A液的2-3倍)，以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色5分钟。
(4)水洗(冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉渣沉淀在标本上)，干燥后用数字切片扫描装置扫片，免疫细胞的细胞核会被染成紫红色，胞浆染成粉红色。
实验结果
分离的免疫细胞形态观察
在倒置显微镜下对免疫细胞进行观察发现，刚分离出来的细胞呈现圆形，饱满且透亮度好(20倍物镜)，且含有的杂质较少。
分离的免疫细胞瑞氏染色鉴定
根据扫描仪扫出来的图像，可以观察到分离的免疫细胞的细胞核均染上了紫红色，胞浆染成了粉红色，且细胞大多为单个核的淋巴细胞，未见红细胞。

Claims (7)

1.一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取新鲜小鼠尸体，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部；分离出小鼠肝脏，保留胆囊和至少1厘米长度的主血管；
(2)以磷酸盐缓冲液经肝门静脉持续灌流、冲洗肝脏，清除内部血液使肝脏从血红色变为白色；
(3)剥离胆囊和主血管，将肝脏置于含有磷酸盐缓冲液的培养皿内浸洗；
(4)将肝脏剪碎后置于含有4.7毫升改良杜氏伊格尔培养基和0.3毫升酶混合液的解离管内；
(5)将解离管放入德国MACS公司GentleMACSTMDissociator解离机器中，以m_liver_03模式运行两次；
(6)取出解离管，置于37℃恒温、220转/分钟转速的摇床上消化30分钟；
(7)消化结束后，将解离管再次置于解离机器中，以m_liver_04模式运行两次；
(8)将解离管内混悬液以100微米滤器过滤到50毫升离心管内，用5毫升磷酸盐缓冲液重悬解离管内残留物后，再次将液体部分过滤至离心管内；
(9)在室温条件下，以相对离心力300g离心处理10分钟；
(10)弃掉上清液后，向沉淀内加3毫升36％Percoll细胞分离液；在室温条件下，以相对离心力600g离心处理15分钟；
(11)弃掉包含肝细胞碎片的上清液，并向沉淀内加入2毫升红细胞裂解液裂解3分钟以完全去除红细胞；然后加入5ml磷酸盐缓冲液终止裂红，在4℃条件下以相对离心力400g离心处理5分钟；弃上清，得到纯净的小鼠肝脏全免疫细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.01摩尔/升，酸碱度7.4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶混合液的配置方法为：向100毫升磷酸盐缓冲液里加入12毫克胶原酶Ⅳ、30毫克链酶蛋白酶和5毫克脱氧核糖核酸酶Ⅰ粉末，混匀。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在将剪碎后的肝脏置于解离管内之前，先将含改良杜氏伊格尔培养基和酶混合液的解离管置于37℃水浴中预热5分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Percoll细胞分离液的配置方法为：先将1毫升10倍磷酸盐缓冲液与9毫升percoll原溶液混合均匀，再加入15毫升1倍的磷酸盐缓冲液得到25毫升36％的Percoll分离液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的10倍磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.1摩尔/升，酸碱度7.4。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(9)、(10)中启动离心机前，应先将离心机升速降速均调整到最低档。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112342182A (zh) * 2020-10-29 2021-02-09 浙江大学 一种高效分离小鼠肝脏胆管细胞的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020045262A1 (en) * 2000-09-25 2002-04-18 Jetsumon Prachumsri Human liver cell line

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020045262A1 (en) * 2000-09-25 2002-04-18 Jetsumon Prachumsri Human liver cell line

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU JINGQI 等: "Immune cell atlas and dynamics in mouse liver injury and immunomodulatory of MSC therapy by high-dimensional analysis", 《EBIOMEDICINE》 *
李仪奎: "《中药药理实验方法学》", 30 October 2016, 上海科学技术出版社 *
道客巴巴: "gentleMACS实验操作步骤中文", 《道客巴巴》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112342182A (zh) * 2020-10-29 2021-02-09 浙江大学 一种高效分离小鼠肝脏胆管细胞的方法
CN112342182B (zh) * 2020-10-29 2022-12-20 浙江大学 一种高效分离小鼠肝脏胆管细胞的方法

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