CN114563244B - 一种淋巴细胞染色体核型制片方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淋巴细胞染色体核型制片方法，通过在新鲜采集的血样中添加抗凝剂，接种培养后制备单细胞悬液，利用低渗液进行低渗处理，再通过核型固定液固定制片，所述的抗凝剂肝素钠和纤溶酶组成，所述的低渗液为丙三醇和KCl混合溶液，所述的核型固定液卡诺氏固定液的中添加二甲基亚砜形成。该方法通过抗凝剂和低渗液的作用提升淋巴细胞的分散程度及舒展性，固定液的快速固定作用提升染色效果，最终实现了显带条纹清晰，易于辨认的特点。

Description

一种淋巴细胞染色体核型制片方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及细胞核型分析，特别是一种淋巴细胞染色体核型制片方法。

背景技术

染色体是细胞核中的遗传物质，血液中的淋巴细胞在一定条件下培养后，经收获、制片、胰酶消化后染色显带，可在显微镜下观察到染色体，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为决定男女性别的性染色体，染色体上载有遗传信息的基因，染色体数目增加或减少，或染色体有缺失、易位等结构异常称染色体病，可出现相应的临床症状。染色体核型分析技术是以分裂中期染色体为研究对象，根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，并借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号，根据染色体结构和数目的变异情况来进行诊断。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。

目前的染色体核型分析技术主要包括细胞培养、收获、制片、显带和分析几个步骤，在此过程需要使用抗凝剂、抑制剂、低渗液、固定液和染料等试剂，由于外周血淋巴细胞样本之间存在差异，且使用的试剂种类繁多，各试剂之间或多或少都会存在相互影响，经常会出现有染色体在胞浆中无法逸出，核型偏小，染色体偏短、或染色体分散过度，无法准确计数核型，条带模糊不清，染色体的条带辨认困难等情况，导致核型分析失败，极大地影响了显带效率和分析质量。因此，染色体核型分析的准确性和成功率一直是本领域研究人员不断探索的方向。

发明内容

为了克服现有核型分析的试剂体系不稳定导致的条带模糊不清等缺陷，提高分析结果的准确性，在本发明中提供了一种淋巴细胞染色体核型制片方法，通过抗凝剂和低渗液的作用提升淋巴细胞的分散程度及舒展性，固定液的快速固定作用提升染色效果，最终实现了显带条纹清晰，易于辨认的特点。

为了实现上述技术效果，本发明具体采用以下技术方案：

一种淋巴细胞染色体核型制片方法，通过在新鲜采集的血样中添加抗凝剂，接种培养后制备单细胞悬液，利用低渗液进行低渗处理，再通过核型固定液固定制片，所述的抗凝剂肝素钠和纤溶酶组成，所述的低渗液为丙三醇和KCl混合溶液，所述的核型固定液为在卡诺氏固定液中添加二甲基亚砜形成。

进一步的，所述肝素钠的添加量为10～20IU/mL，所述纤溶酶的添加量为0.1～0.5IU/mL。

所述肝素钠用于干扰血液样本的凝血过程，在体内外都有抗凝血作用。通过与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、X、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用，阻止血小板凝集和破坏、妨碍凝血激活酶的形成、阻止凝血酶原变为凝血酶，抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而发挥抗凝作用。

所述纤溶酶具有纤维蛋白溶解活性，能够消化纤维蛋白、纤维蛋白原和V因子、VIII因子及XII因子，纤维蛋白溶解能够缓慢清除凝血块，降低血小板聚集及血液粘稠度，且降解得到的降解产物(FDP)具有抗凝作用。

所述纤溶酶与所述肝素钠配合使用从抗凝和降解两方面共同作用，不仅具有阻凝作用，还具有将凝结的血栓溶解的作用，提高了血样中淋巴细胞的分散性。

进一步的，所述丙三醇体积浓度为3％～8％，所述KCl浓度为0.05～0.1mol/Lmol/L。

所述KCl溶液可凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，结合丙三醇易于穿透细胞的能力，可与氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。一方面加快了低渗透过程，另一方面保证了细胞成分的构型，提高了黏附于染色体的核仁物质的分散性，使得在一个平面上观察所有得染色体形态，得到的染色体轮廓清楚，用于显带染色时能充分显示带型特点。

进一步的，所述二甲基亚砜占核型固定液的体积浓度为1％～10％。

所述二甲基亚砜可以增强卡诺氏固定液的渗透能力，使得核型固定液可以迅速进入组织中，从而对细胞的蛋白质成分进行改性，维持染色体的形态，以提高对显带判断的准确性。而且二甲基亚砜具有防冻保护能力，在卡诺氏固定液中冰醋酸在温度稍变低时即可形成冰晶，容易造成染色体发脆后丢失，通过与二甲基亚砜混合，可以防止冰醋酸结冰从而保护染色体的完整形态，避免结冰过程中造成染色体的断裂。

进一步的，所述外周血淋巴细胞染色体核型制片方法包括：

在采集的外周静脉血样中加入抗凝剂，接种至培养基上培养；

培养终止前加入秋水仙素，使血样中淋巴细胞停止于有丝分裂中期；

收集细胞培养液，离心去上清；

收集细胞沉淀加入预热的低渗液滴管吹打均匀，低渗处理完成后离心取细胞沉淀；

在细胞沉淀中加入核型固定液，滴管吹匀固定，离心去上清；重复固定多次；

根据细胞沉淀的多少加入核型固定液，吹打细胞制成微白色悬液；

用滴管吸取细胞悬液，于载玻片垂直上方滴片，烘干。

进一步的，所述秋水仙素处理时间为2～4h。细胞在分裂间期染色质凝集，为了方便检测核型，需要使细胞处于分裂间期。秋水仙素可以使细胞停滞于有丝分裂中期，但并不是阻滞时间越长越好，时间太长或者太短都会影响染色体中期的数目和形态，时间过长会解离过度不利于染色，而且会造成染色体断裂。

进一步的，所述低渗液处理温度为37℃，处理时间5～10min。低渗处理过程中时间太短处理不充分，细胞膨胀不充分，影响最后染色体的平铺，低渗处理时间过长，会使细胞提前破裂，致使染色体在散落于溶液中，降低检测准确度。

进一步的，所述固定液在使用前在室温条件下进行预处理。在该温度环境下可以加快分子运动，影响膜的流动性，降低膜的稳定性，从而影响膜的通透性增强细胞的通透性，增强固定液的固定效果。

本发明的有益效果为：

1)本发明通过在抗凝剂中使用纤溶酶，可以对凝结的血块进行溶解，而且溶解后的降解产物具有抗凝作用，配合肝素钠的抗凝作用，从抗凝和溶解两个方面阻止血样凝结，对保持淋巴细胞的分散性具有优良的作用，避免了血样从采集至检测之间的时间过长造成血样分散性下降导致的检测结果不准确。

2)通过混合低渗液的使用，一方面通过丙三醇的渗透能力缩短了细胞低渗处理的时间。另一方面通过丙三醇的保护作用稳定了细胞成分的构型。提高了细胞核仁物质的分散性，使得显色条带清楚，易于辨认，提高检测准确度。

3)利用二甲基亚砜提高了固定液的渗透能力，增强了固定液对细胞蛋白成分的固型作用，缩短固定处理时间，同时具有保护染色体的作用，避免了冰醋酸结冰对染色体的破坏。

综上，本发明通过抗凝处理、低渗处理和固定处理三个方面，提高了细胞染色体的分散性和舒展性，以及固型效果，共同提高了细胞核型分析的准确度和成功率。

附图说明

图1是实施例5不同低渗液处理染色体的部分镜显图；

图2是实施例6不同固定液处理染色体的部分镜显图；

图3是实施例7临床验证染色体的分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

作为本发明的一个具体实施例，提供了一种淋巴细胞染色体核型制片方法，具体包括以下步骤：

1)常规取静脉血后，加入肝素钠和纤溶酶混合溶液。

其中，肝素钠添加量为10～20IU/mL，纤溶酶添加量为0.1～0.5IU/mL。具体的，肝素钠添加量为可以为10IU/mL、11IU/mL、12IU/mL、13IU/mL、14IU/mL、15IU/mL、16IU/mL、17IU/mL、18IU/mL、19IU/mL、20IU/mL。纤溶酶添加量可以为0.1IU/mL、0.2IU/mL、0.3IU/mL、0.4IU/mL、0.5IU/mL。

优选的，肝素钠添加量为15IU/mL，纤溶酶添加量为0.3IU/mL。

2)将血样接种至细胞培养液，终止培养前2～3h，在细胞培养液中加入20μg/mL秋水仙素至终浓度为0.1～0.2μg/mL，细胞正常培养条件下处理2～4h。

具体的，处理时间可以为2h、2.5h、3h、3.5h、4h，优选为3h。

细胞培养液的配制：含20％血清的1640培养液，pH7.2。

秋水仙素溶液的配制：将秋水仙素母液用生理盐水配制成20μg/mL浓度，灭菌，分装，置于-20℃避光保存。。

作为细胞培养的另一实施例，由于本申请抗凝剂中存在纤溶酶，可以溶解凝血，因此可以适当延长细胞培养的过程，用通入二氧化碳代替秋水仙素，产生于秋水仙素同样的技术效果。

具体的，细胞培养在37℃、5％CO₂条件下培养68-72h。

作为细胞培养的第三实施例，可以同时采用秋水仙素和5％CO₂件下培养的方案，可以减少秋水仙素的用量，减轻对细胞中染色体的毒性损害。

3)将细胞培养液转移至离心管中，1500r/min室温离心10min，弃上清。

4)将KCl溶液和丙三醇混合低渗液预热至37℃，加入细胞沉淀，用滴管吹打成单细胞悬液，37℃低渗处理5～10min，离心弃上清。

其中，KCl浓度为0.05～0.1mol/L，丙三醇体积浓度为3％～8％，具体的，KCl溶液浓度可以为0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L、0.08mol/L、0.09mol/L、0.1mol/L，优选为0.075mol/L。丙三醇体积浓度可以为3％、4％、5％、6％、7％、8％，优选为5％。处理时间可以为5min、6min、7min、8min、9min、10min，优选为7min。

5)现场按照甲醇与冰乙酸体积比为3:1配制卡诺氏固定液，并在其中加入体积浓度1％～10％的二甲基亚砜形成核型固定液，现配现用。

具体的，二甲基亚砜的体积浓度可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，优选为5％。

6)加入核型固定液吹打，进行半固定，离心取细胞沉淀；

7)继续将核型固定液加入细胞沉淀中，用滴管从上到下吹吸均匀，弃上清。

8)重复步骤7)2～3次，滴加与沉淀细胞等体积的核型固定液，重悬至悬液呈微白色。

9)用滴管吸取细胞悬液，于载玻片垂直高空处滴片，置于75℃恒温干燥箱中烤片2.5h。

10)利用吉姆萨染液对载玻片染色：胰酶消化14s，Nacl溶液清洗2次，显带1min，自来水冲洗，晾干。

11)显微镜下观察。

每条染色体含有2条染色单体，通过着丝粒彼此连接。自着丝粒向两端伸展的染色体结构称染色体臂，染色体臂分为长臂和短臂。根据着丝粒位置的不同，可把人类染色体分为三类：中央着丝粒染色体，长臂与短臂几乎相等；亚中央着丝粒染色体，长臂与短臂能明显区分；近端着丝粒染色体，短臂极短，着丝粒几乎在染色体的顶端。在显微镜下观察染色体的形态结构、次缢痕的位置以及有无结构上的畸变，比如断裂、缺失、重复、易位、倒位、环状、等臂染色体等。

下面结合具体的实施案例对上述技术方案及效果进行说明。

实施例1

本实施例提供了一种淋巴细胞染色体核型制片方法，包括以下内容：

1)常规采血针采集血样3～5mL，加入肝素钠和纤溶酶，其中肝素钠添加量为15IU/mL，纤溶酶添加量为0.3IU/mL。

2)细胞培养液的配制：含20％血清的1640培养液，pH7.2。

秋水仙素溶液的配制：将秋水仙素母液用生理盐水配制成20μg/mL浓度，灭菌，分装，置于-20℃避光保存。。

将血样接种至细胞培养液，终止培养前1.5h，在细胞培养液中加入20μg/mL秋水仙素至终浓度为0.1μg/mL，细胞正常培养条件下处理3h。

3)将细胞培养液转移至离心管中，1500r/min室温离心10min，弃上清。

4)将KCl溶液和丙三醇混合低渗液5mL预热至37℃，加入细胞沉淀，用滴管吹打成单细胞悬液，低渗处理8min，离心弃上清。混合低渗液中KCl摩尔浓度为0.075mol/L，丙三醇体积浓度为5％。

5)现场按照甲醇与冰乙酸体积比为3:1配制卡诺氏固定液，并在其中加入体积浓度5％的二甲基亚砜形成核型固定液，现配现用。

6)加入0.5-1mL的核型固定液吹打，进行半固定。

7)将核型固定液加入细胞沉淀中，用滴管从上到下吹吸均匀，弃上清。

8)重复步骤7)2～3次，滴加与沉淀细胞等体积的核型固定液，重悬至悬液呈微白色。

9)用滴管吸取细胞悬液，于载玻片垂直高空处滴片，置于75℃恒温干燥箱中烤片2.5h。

实施例2

本实施例提供了一种淋巴细胞染色体核型制片方法，基本方法同实施例1，不同之处在于：

步骤1)中血样中肝素钠添加量为10IU/mL，纤溶酶添加量为0.1IU/mL；

步骤2)中终止培养前2h，在细胞培养液中添加秋水仙素至终浓度为0.1μg/mL，培养2h；

步骤4)中混合低渗液中KCl浓度为0.05mol/L，丙三醇体积浓度为3％，低渗处理5min；

步骤5)中核型固定液中二甲基亚砜的体积浓度为1％。

实施例3

本实施例提供了一种淋巴细胞染色体核型制片方法，基本方法同实施例1，不同之处在于：

步骤1)中血样中肝素钠添加量为20IU/mL，纤溶酶添加量为0.5IU/mL；

步骤2)中终止培养前3h，在细胞培养液中添加秋水仙素至终浓度为0.2μg/mL，培养4h；

步骤4)中混合低渗液中KCl浓度为0.1mol/L，丙三醇体积浓度为8％，低渗处理10min；

步骤5)中核型固定液中二甲基亚砜的体积浓度为9％。

实施例4血样抗凝实验

实验仪器：

赛科希德自动血流变测试仪SA-5600。

实验方法：

购买新西兰白兔，在同一环境下进行适应性饲养两周以上，饲喂全价营养颗粒饲料，饮自来水。采血前空腹一天，随机自耳中央动脉采集血样，并分为实验组和对照组，实验组中添加肝素钠和纤溶酶混合抗凝剂，对照组中添加肝素钠、乙二胺四乙酸、草酸钠、枸橼酸钠中一种或多种，并设立空白组，平均将各组分为三份。

实验组1：肝素钠15IU/mL+纤溶酶3IU/mL；

实验组2：肝素钠10IU/mL+纤溶酶0.1IU/mL；

实验组3：肝素钠20IU/mL+纤溶酶0.5IU/mL；

对照组1：肝素钠15IU/mL；

对照组2：乙二胺四乙酸0.8mg/mL；

对照组3：草酸钠2mg/mL；

对照组4：枸橼酸钠4mg/mL；

对照组5：肝素钠15IU/mL+枸橼酸钠4mg/mL；

对照组6：肝素钠15IU/mL+草酸钠2mg/mL；

对照组7：肝素钠15IU/mL+乙二胺四乙酸0.8mg/mL；

空白组：无添加。

利用血流变测试仪分别测定各组血样室温放置不同时间的全血比粘度(高切)，结果如表1。

表1抗凝剂对兔血全血粘度的影响

由表1可知，本发明肝素钠和纤溶酶混合抗凝剂相比现有肝素钠、乙二胺四乙酸、草酸钠和枸橼酸钠单独或混合使用表现出了良好的血液抗凝效果，在1～15天内血样的全血比粘度稳定，且与新鲜兔血的全血比粘度没有明显区别。说明本发明纤溶酶与肝素钠混合抗凝剂具有从抗凝和降解两方面阻凝的作用，可以长时间保持血液的粘度处于新鲜血液的水平。

实施例5低渗处理实验

血液样本来源于河南科技大学第一附属医院，以实施例1方法得到消化的单细胞悬液，加入不同低渗液处理后，经本发明核型固定液固定制片，利用吉姆萨染液对载玻片染色1min，显微镜下观察染色体形态。

低渗液处理分为实验组和对照组，其中，

实验组1：KCl 0.075mol/L+丙三醇5％(V/V)；

实验组2：KCl 0.05mol/L+丙三醇3％(V/V)；

实验组3：KCl 0.1mol/L+丙三醇8％(V/V)；

对照组：KCl 0.075mol/L；

空白组：去离子水。

结果如图1染色体显微镜下观察的部分显带所示，实验组经氯化钾和丙三醇的混合低渗液处理后，在显微镜下染色体显带清晰，无交叉重叠染色体，对照组和空白组处理的人染色体条带均出现了重叠、弯曲，由于对照组经过了氯化钾溶液处理，染色体条带相对空白组重叠弯曲较少。说明本发明混合低渗液相比氯化钾处理更容易使粘附于染色体的核仁物质散开，有助于染色体的舒展延伸，主要原因在于本申请低渗液的渗透能力强于氯化钾溶液，且丙三醇相比水对染色体具有一定的塑形能力。

实施例6染色体固定实验

血样来源于河南科技大学第一附属医院，以实施例1方法得到经低渗处理的细胞沉淀，经核型固定液进行制片，利用吉姆萨染液对载玻片染色1min，显微镜下观察染色体形态。

对照组与实验组不同之处在于固定液采用卡诺氏固定液，其中，

实验组1：卡诺氏固定液+二甲基亚砜5％(V/V)；

实验组2：卡诺氏固定液+二甲基亚砜1％(V/V)；

实验组3：卡诺氏固定液+二甲基亚砜9％(V/V)；

对照组：卡诺氏固定液。

结果如图2染色体显微镜下观察的部分显带所示，经本发明卡诺氏固定液和二甲基亚砜组成的核型固定液处理的染色体，在显微镜下得到的条带清晰，可以明显的观测到条纹状染色体，易于确定着丝粒，从而对染色体进行准确的分辨。对照组卡诺氏固定液虽然也能得到清除的染色体条带，但是染色体的黑白条纹模糊，对于染色体的分辨造成了障碍，难以进行配对分离，影响分析的准确性。主要原因在本申请核型固定液中含有二甲基亚砜，二甲基亚砜具有增强细胞通透性的能力，从而加强了卡诺氏固定液的渗透能力，缩短了固定处理的时间，避免了染色体相关蛋白及核算流失，使得染色效果显著。

实施例7临床试验

以河南科技大学第一附属医院患者血样评分三份，采用实施例1～3方法制片，将得到的载玻片倒扣(染色体面向下)于染色盒内，于载玻片和盒内壁之间加入吉姆萨染液，水浴加热37℃，染色1min。

结果如图3所示，实施例1～3方法均分析得到血样21号染色体重复，属于21号染色体三体综合症，与患者身体发育异常和智力发育异常症状相吻合，说明本发明方法稳定准确。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，包括：

在新鲜采集的血样中添加抗凝剂，所述抗凝剂由肝素钠和纤溶酶组成；

将含有抗凝剂的所述血样接种培养；

利用低渗液处理所述血样接种培养的培养液，所述低渗液为丙三醇和KCl混合溶液；

将经所述低渗液处理的细胞沉淀用核型固定液固定制片，所述核型固定液为在卡诺氏固定液中添加二甲基亚砜形成。

2.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述肝素钠的添加量为10～20IU/mL，所述纤溶酶的添加量为0.1～0.5IU/mL。

3.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述丙三醇体积浓度为3％～8％，所述KCl浓度为0.05～0.1mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述二甲基亚砜占核型固定液的体积浓度为1％～10％。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，包括：

在采集的外周静脉血样中加入抗凝剂，接种至培养基中培养；

培养终止前加入秋水仙素，使血样中淋巴细胞停止于有丝分裂中期；

收集细胞培养液，离心去上清；

收集细胞沉淀加入预热的低渗液滴管吹打均匀，低渗处理后离心取细胞沉淀；

在细胞沉淀中加入核型固定液，滴管吹匀固定，离心去上清；重复固定多次；

根据细胞沉淀的多少加入核型固定液，吹打细胞制成微白色悬液；

用滴管吸取细胞悬液，于载玻片垂直上方滴片，烘干。

6.根据权利要求5所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述秋水仙素处理时间为2～4h。

7.根据权利要求5所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述低渗液处理温度为37℃，处理时间5～10min。

8.根据权利要求5所述的一种淋巴细胞染色体核型制片方法，其特征在于，所述固定液在使用前在室温条件下进行预处理。