CN103409370A

CN103409370A - 一种用于淋巴细胞培养的培养基及应用

Info

Publication number: CN103409370A
Application number: CN2013103496945A
Authority: CN
Inventors: 惠长野; 李智民; 张文; 高朝贤; 陈郁筠; 黄先青; 陈钰婷; 张健杰
Original assignee: SHENZHEN PREVENTION AND TREATMENT CENTER FOR OCCUPATIONAL DISEASES
Current assignee: SHENZHEN PREVENTION AND TREATMENT CENTER FOR OCCUPATIONAL DISEASES
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-12
Also published as: CN103409370B

Abstract

本发明公开了一种用于淋巴细胞培养的培养基及应用。本发明提供的用于淋巴细胞培养的培养基，包括基础培养基、混合脱氧单核苷酸和人血浆。所述混合脱氧单核苷酸中的每种核苷酸在所述培养基中的浓度为5-50mmol/L，优选为5-20mmol/L。所述人血浆在所述培养基中的体积百分含量可为5-30%，优选为10-20%或20-30%。所述培养基中还可包括抗凝剂、有丝分裂原和抗生素。本发明提供的培养基最大限度地模拟了人体内环境，无异源物质干扰，保证了细胞培养效果；额外添加的外源核苷酸满足淋巴细胞快速生长、DNA复制的需求。应用本发明提供的培养基培养淋巴细胞，可满足细胞遗传学培养淋巴细胞的需求。

Description

一种用于淋巴细胞培养的培养基及应用

技术领域

本发明涉及一种用于淋巴细胞培养的培养基及应用。

背景技术

体外淋巴细胞培养不仅是细胞遗传学的传统研究方法，还是自体细胞免疫疗法这些新兴技术实现的基础。

为了模拟淋巴细胞体内的生长环境，培养基除维持生理渗透压及pH值外，需要添加细胞生长所需的各类营养因子，如无机盐、碳水化合物、氨基酸、维生素、微量元素等。动物血清的添加一直是淋巴细胞体外培养所必需的，比较常用的是胎牛血清和新生牛血清，血清在传统淋巴细胞培养方法中起着重要作用，除有营养加富的作用外，更重要的是含有细胞生长所必须的生长因子、激素及某些痕量营养物质。培养基是淋巴细胞各种代谢产物的排放场所，血清中的组分（如血清蛋白），可作为代谢毒物清除剂使培养细胞免于过氧化损伤。使用动物血清的缺点如下：动物血清批次间质量不稳定；引入异种蛋白及抗细胞抗体抑制淋巴细胞的功能；用于细胞免疫疗法时，有传播疾病的潜在风险，异种蛋白增加过敏反应发生的机率。

鉴于动物血清的弊端，近年来出现了无血清培养基，通过额外添加细胞因子、激素、抗氧化剂等替代血清的作用，并涌现了适于各类细胞培养的商品化无血清培养基，但高昂的售价限制了其广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于淋巴细胞培养的培养基及应用。

本发明提供的用于淋巴细胞培养的培养基，包括基础培养基、混合脱氧单核苷酸和人血浆。

脱氧核苷酸是细胞基因组DNA的重要组成成分，包括嘌呤和嘧啶核苷酸两大类。淋巴细胞从头合成核酸的能力有限，而且从头合成消耗大量氨基酸及能量，在细胞快速生长的情况下，内源合成的核苷酸不足以满足自身需求。人外周血淋巴细胞正常情况下处于G₀期，体外培养时，在有丝分裂原刺激下，转化为淋巴母细胞并进行有丝分裂，蛋白质及DNA合成活跃。通过额外添加混合单核苷酸，模拟补救合成途径，可促进DNA复制，提高淋巴细胞转化效率。所述混合脱氧单核苷酸具体可为5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物。所述混合脱氧单核苷酸中的每种核苷酸在所述培养基中的浓度为5-50mmol/L，优选为5-20mmol/L。

人血浆与人血清的主要区别是血清中不含纤维蛋白原等凝血因子，人血浆蛋白质浓度比人血清蛋白质浓度高约0.2～0.5g/dL，其差异主要就是纤维蛋白原。人血浆白蛋白为胎牛血清的1.5-1.9倍，球蛋白为胎牛血清的3.3-4.1倍，高蛋白含量的人血浆赋予了培养基更强的pH缓冲及保护培养细胞的能力。人血浆是外周血淋巴细胞的天然培养基，除富含细胞生长所需的基本营养物质外，更重要的是含有促细胞生长的各种激素和生长因子、负责转运功能的结合蛋白、有保护培养细胞功能的抗蛋白酶成分等，这些都是有化学限定的无血清培养基及血清替代物所无法比拟的。人源血浆的添加，使培养环境更接近人体内环境，解决动物血清批次间质量不稳定影响培养的问题。本发明提供的培养基可广泛用于细胞遗传学研究所需的外周血淋巴细胞培养，人源血浆可以良好地支持淋巴细胞体外生长，外源核苷酸作为条件营养素的添加促进DNA合成及细胞有丝分裂。所述人血浆在所述培养基中的体积百分含量可为5-30%，优选为10-20%或20-30%，如10-15%、15-20%、20-25%或25-30%。所述人血浆具体可为人外周血血浆。所述人血浆具体可为AB型人血的血浆。

所述培养基中还可包括抗凝剂（如肝素钠）、有丝分裂原（如植物血凝素）和抗生素（如庆大霉素）。所述培养基具体可由所述基础培养基、所述混合脱氧单核苷酸、所述人血浆、所述抗凝剂、所述有丝分裂原和所述抗生素组成。所述抗凝剂在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的浓度可为50-70IU/mL（如60IU/mL），所述有丝分裂原在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的浓度可为150-170μg/mL（如160μg/mL），所述抗生素在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的浓度可为0.05-0.15mg/mL（如0.1mg/mL）。

所述培养基中还可包括秋水仙素。所述培养基具体可由所述基础培养基、所述混合脱氧单核苷酸、所述人血浆、所述抗凝剂、所述有丝分裂原、所述抗生素和所述秋水仙素组成。所述抗凝剂在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的浓度可为50-70IU/mL（如60IU/mL），所述有丝分裂原在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的浓度可为150-170μg/mL（如160μg/mL），所述抗生素在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的浓度可为0.05-0.15mg/mL（如0.1mg/mL），所述秋水仙素在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的浓度可为（6.2-8.2）×10^-8mmol/mL（如7.2×10^-8mmol/mL）。

所述基础培养基具体可为PRMI-1640培养基。PRMI-1640培养基的具体配方参见：http://zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.114.html。

本发明还保护以上任一所述的培养基在培养淋巴细胞中的应用。

以上任一所述的淋巴细胞具体可为外周血淋巴细胞。

本发明提供的培养基含有人源血浆，最大限度地模拟了人体内环境，无异源物质干扰，保证了细胞培养效果；额外添加的外源核苷酸满足淋巴细胞快速生长、DNA复制的需求。应用本发明提供的培养基培养淋巴细胞，可满足细胞遗传学培养淋巴细胞的需求，如外周血淋巴细胞微核、染色体畸变、核型、姐妹染色单体互换分析等。

附图说明

图1为实施例1的淋巴细胞转化率及实施例2的分裂指数结果，空心框代表淋巴细胞转化率（对应左侧Y轴坐标），实心框代表分裂指数（对应右侧Y轴坐标），虚线代表对照组转化率及分裂指数水平。

图2为实施例3中采用培养基-Ⅰ时，某个志愿者的淋巴细胞进行上述操作后在显微镜不同放大倍数下的观察结果。

图3为实施例4中采用培养基-甲时，某个志愿者的淋巴细胞进行上述操作后在显微镜不同放大倍数下的观察结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。植物血凝素（PHA），提取自红芸豆，是一种有丝分裂原，在体外能刺激小淋巴细胞转化成具有免疫活性的淋巴细胞，并促进其分裂，购自广州达晖生物技术有限公司，货号为S0010。

实施例1、测定淋巴细胞转化率

培养基-1的制备：在PRMI-1640培养液中加入混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、肝素钠和庆大霉素，使混合核苷酸中每种核苷酸的浓度均为20mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-2的制备：在PRMI-1640培养液中加入AB型人血的血浆、混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、肝素钠和庆大霉素，使血浆的浓度为5%（体积比），混合核苷酸中每种核苷酸的浓度为20mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-3的制备：在PRMI-1640培养液中加入AB型人血的血浆、混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、肝素钠和庆大霉素，使血浆的浓度为10%（体积比），混合核苷酸中每种核苷酸的浓度为20mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-4的制备：在PRMI-1640培养液中加入AB型人血的血浆、混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、肝素钠和庆大霉素，使血浆的浓度为15%（体积比），混合核苷酸中每种核苷酸的浓度为20mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-5的制备：在PRMI-1640培养液中加入AB型人血的血浆、混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、肝素钠和庆大霉素，使血浆的浓度为20%（体积比），混合核苷酸中每种核苷酸的浓度为20mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-6的制备：在PRMI-1640培养液中加入AB型人血的血浆、混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、肝素钠和庆大霉素，使血浆的浓度为25%（体积比），混合核苷酸中每种核苷酸的浓度为20mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-7的制备：在PRMI-1640培养液中加入AB型人血的血浆、混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、肝素钠和庆大霉素，使血浆的浓度为30%（体积比），混合核苷酸中每种核苷酸的浓度为20mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-8（现有培养基）的制备：在PRMI-1640培养液中加入胎牛血清、PHA、肝素钠和庆大霉素，使胎牛血清的浓度为20%（体积比），PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

取2×10⁶个血型为AB型的志愿者的淋巴细胞，分别接种于4mL各种培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养52h，将培养物移入15mL离心管，加入4mL低渗液（即0.075mol/L KCl水溶液）后摇匀，静置3min；加入1mL固定液(甲醇：乙酸=3：1的混合液；体积比)，摇匀，1200rpm/min离心5分钟，弃去上清液；加入8mL固定液，摇匀，静置30min，1200rpm/min离心5分钟，吸去上清液；残留细胞层用吸管打匀，滴至干净的载玻片上，自然干燥后，用吉姆萨-瑞氏染液染色15min，流水冲去染液，晾干。在油镜下计数500个淋巴细胞，计算淋巴细胞转化率。每种培养基设置3个重复处理，结果取平均值。结果见图1，含有10%血浆的培养基即可取得与现有培养基相近的淋巴细胞转化率，含有20%以上血浆的培养基中的淋巴细胞转化率均高于现有培养基。

实施例2、测定淋巴细胞的分裂指数

依次配制八种培养基，与实施例1的八种培养基的区别仅在于加入秋水仙素（使细胞处于分裂中期，便于统计分裂指数）并使其浓度为7.2×10^-8mmol/mL。

取2×10⁶个血型为AB型的志愿者的淋巴细胞，分别接种于4mL各种培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养52h，将培养物移入15mL离心管，加入4mL低渗液（即0.075mol/L KCl水溶液）后摇匀，静置3min；加入1mL固定液(甲醇：乙酸=3：1的混合液；体积比)，摇匀，1200rpm/min离心5分钟，弃去上清液；加入8mL固定液，摇匀，静置30min，1200rpm/min离心5分钟，吸去上清液；残留细胞层用吸管打匀，滴至干净的载玻片上，自然干燥后，用吉姆萨-瑞氏染液染色15min，流水冲去染液，晾干。在油镜下计数500个淋巴细胞，计算淋巴细胞的分裂指数（分裂指数=中期分裂相/淋巴细胞总数×100%）。每种培养基设置3个重复处理，结果取平均值。结果见图1，随着培养基中血浆含量的增加，淋巴细胞的分裂指数不断提高，含有10%以上血浆的培养基中的淋巴细胞分裂指数均显著高于含有现有培养基。

实施例3、外周血淋巴细胞微核分析

从30例志愿者（血型随机）的外周血中分离淋巴细胞。

培养基-Ⅰ的制备：在PRMI-1640培养液中加入AB型人血的血浆、混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、肝素钠和庆大霉素，使血浆的浓度为10%（体积比），混合核苷酸中每种核苷酸的浓度为5mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-Ⅱ的制备：在PRMI-1640培养液中加入胎牛血清、PHA、肝素钠和庆大霉素，使胎牛血清的浓度为20%（体积比），PHA的浓度为160μg/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

分别将各个血样中分离获得的淋巴细胞进行如下实验：取2×10⁶个淋巴细胞，接种于4mL培养基-Ⅰ或培养基-Ⅱ，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养68h，将培养物移入15mL离心管，加入4mL低渗液（即0.075mol/L KCl水溶液）后摇匀，静置3min；加入1mL固定液(甲醇：乙酸=3：1的混合液；体积比)，摇匀，1200rpm/min离心5分钟，弃去上清液；加入8mL固定液，摇匀，静置30min，1200rpm/min离心5分钟，吸去上清液；残留细胞层用吸管打匀，滴至干净的载玻片上，自然干燥后，用吉姆萨-瑞氏染液染色15min，流水冲去染液，晾干。在油镜下计数1000个淋巴细胞，计算淋巴细胞转化率和微核细胞率。

每种培养基设置3个重复处理，结果取平均值。

结果见表1，两组培养的淋巴细胞转化率及微核细胞率均无显著性差异（P>0.05）。采用培养基-Ⅰ时，某个志愿者的淋巴细胞进行上述操作后在显微镜不同放大倍数下的观察结果见图2。

表1淋巴细胞转化率及微核细胞率分析结果对比

	淋巴细胞例数	淋巴细胞转化率（%）	微核细胞率（‰）
				培养基-Ⅰ	30	84.50±8.11	1.52±0.62
培养基-Ⅱ	30	84.37±9.23	1.49±0.81

实施例4、外周血淋巴细胞染色体畸变分析

从30例志愿者（血型随机）的外周血中分离淋巴细胞。

培养基-甲：在PRMI-1640培养液中加入AB型人血的血浆、混合核苷酸（5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物）、PHA、秋水仙素、肝素钠和庆大霉素，使血浆的浓度为20%（体积比），混合核苷酸中每种核苷酸的浓度为20mmol/L，PHA的浓度为160μg/mL，秋水仙素的浓度为7.2×10^-8mmol/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

培养基-乙的制备：在PRMI-1640培养液中加入胎牛血清、PHA、秋水仙素、肝素钠和庆大霉素，使胎牛血清的浓度为20%（体积比），PHA的浓度为160μg/mL，秋水仙素的浓度为7.2×10^-8mmol/mL，肝素钠的浓度为60IU/mL，庆大霉素的浓度为0.1mg/mL。

分别将各个血样中分离获得的淋巴细胞进行如下实验：取2×10⁶个淋巴细胞，接种于4mL培养基-甲或培养基-乙，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养52h，将培养物移入15mL离心管，2000rpm/min离心5分钟，弃去上清液；加入8mL低渗液（即0.075mol/LKCl水溶液）后摇匀，37℃水浴中静置30min；加入1mL固定液(甲醇：乙酸=3：1的混合液；体积比)，摇匀，2000rpm/min离心5分钟，弃去上清液；加入8mL固定液，摇匀，静置30min，2000rpm/min离心5分钟，吸去上清液；加入8mL固定液，摇匀，静置8h，2000rpm/min离心5分钟，吸去上清液；残留细胞层用吸管打匀，滴至干净的载玻片上，自然干燥后，用吉姆萨-瑞氏染液染色15min，流水冲去染液，晾干。在油镜下计数200个淋巴细胞，计算分裂指数。

每种培养基设置3个重复处理，结果取平均值。

结果见表2，培养基-甲中处于中期分裂相的淋巴细胞的染色体形态更佳，且培养基-甲淋巴细胞的分裂指数大于培养基-乙中的淋巴细胞（^*P<0.01）。采用培养基-甲时，某个志愿者的淋巴细胞进行上述操作后在显微镜不同放大倍数下的观察结果见图3。

表2淋巴细胞染色体分析结果对比

组别	例数	分裂指数（%）
			培养基-甲	30	10.40±3.76^*
培养基-乙	30	4.78±1.15

Claims

1.一种用于淋巴细胞培养的培养基，包括基础培养基、混合脱氧单核苷酸和人血浆。

2.如权利要求1所述的用于淋巴细胞培养的培养基，其特征在于：所述混合脱氧单核苷酸为5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物。

3.如权利要求1或2所述的用于淋巴细胞培养的培养基，其特征在于：所述混合脱氧单核苷酸中的每种核苷酸在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的浓度为5-50mmol/L，优选为5-20mmol/L。

4.如权利要求1至3中任一所述的用于淋巴细胞培养的培养基，其特征在于：所述人血浆在所述用于淋巴细胞培养的培养基中的体积百分含量为5-30%，优选为10-20%或20-30%。

5.如权利要求1至4中任一所述的用于淋巴细胞培养的培养基，其特征在于：所述人血浆为AB型人血的血浆。

6.如权利要求1至5中任一所述的用于淋巴细胞培养的培养基，其特征在于：所述基础培养基为PRMI-1640培养基。

7.如权利要求1至6中任一所述的用于淋巴细胞培养的培养基，其特征在于：其中还包括抗凝剂、有丝分裂原和抗生素。

8.如权利要求7所述的用于淋巴细胞培养的培养基，其特征在于：所述抗凝剂为肝素钠，所述有丝分裂原为植物血凝素，所述抗生素为庆大霉素。

9.如权利要求1至8中任一所述的用于淋巴细胞培养的培养基，其特征在于：其中还包括秋水仙素。

10.权利要求1至9中任一所述的培养基在培养淋巴细胞中的应用。