CN102234629A - 一种人CD3+CD8+γδT淋巴细胞的专用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的专用培养基。该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的专用培养基的溶剂为RPMI 1640培养基，溶质为人血浆、异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2，所述人血浆在所述专用培养基中的浓度是10％(体积百分浓度)，所述异戊烯焦磷酸在所述专用培养基中的浓度是100μg/L，所述人白细胞介素-2在专用培养基中的浓度是60万U/L；所述专用培养基的pH是7.2-7.4。本发明的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基选择性强，可从人外周血单个核细胞中特异性富集人CD3⁺CD8^{+ γδ}T淋巴细胞。

Description

一种人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的专用培养基

技术领域

本发明涉及一种人T淋巴细胞的专用培养基，特别涉及一种人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的专用培养基。

背景技术

淋巴细胞是具有特异免疫识别功能的细胞系，人和哺乳类动物的淋巴细胞系是由形态相似、功能各异的不均一细胞群所组成。按其个体发生、表面分子和功能的不同，可将淋巴细胞系分为T细胞和B细胞二个亚群。其中的T细胞是由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成，由于它在胸腺内分化成熟故称为T细胞。成熟T细胞由胸腺迁出，移居于周围淋巴组织中淋巴节的副皮质区和脾白髓小动脉的周围。不同功能成熟的T细胞均属小淋巴细胞，在形态学上不能区分，但可借其细胞膜表面分子不同加以鉴别。在T细胞发育不同阶段以及成熟T细胞在静止期和活化期，其细胞膜分子表达的种类和数量均不相同。由于这些分子在T细胞表面相当稳定，故可视为T细胞的表面标志，可以用以分离、鉴定不同功能的T细胞。这些分子的单克隆抗体对临床相关疾病的诊断和治疗也具有重要应用价值。其中，TCR(T cell receptor)是T细胞识别蛋白抗原的特异性受体，不同的T细胞克隆其抗原识别受体的分子结构也是不相同的。TCR有两种类型，均由两条不同的跨膜的多肽链组成，即αβTCR和γδTCR。大多数成熟T细胞(约占95％)的TCR分子是由α和β二条异二聚体肽链组成的αβTCR分子。TCRγδ细胞多见于胸腺内早期T细胞(CD4-，CD8-，TCRγδ+)，而在人周围血成熟T细胞(CD3+，TCRγδ+)中所占的比例甚少，约为1％～10％。对这种新发现的T细胞的生理功能尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的专用培养基。

本发明所提供的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的专用培养基的溶剂为RPMI 1640培养基，溶质为人血浆、异戊烯焦磷酸(IPP)和人白细胞介素-2(IL-2)，所述人血浆在所述专用培养基中的浓度是10％(体积百分浓度)，所述异戊烯焦磷酸在所述专用培养基中的浓度是100μg/L，所述人白细胞介素-2在专用培养基中的浓度是60万U/L；所述专用培养基的pH是7.2-7.4；

所述人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞表达如下三种T淋巴细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人^γδ细胞受体。

其中，RPMI 1640培养基可从商业途径获得，如可为GENMED公司产品编号为GMS12049.2A的RPMI 1640培养基。

所述人血浆具体可为人AB血浆。

本发明的另一个目的是提供一种培养人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的方法。

该方法为37℃、5％CO₂条件下，使用所述专用培养基培养人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞。

本发明的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基选择性强，可从人外周血单个核细胞中特异性富集人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞。用该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基获得的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞配合传统的手术、化疗和放疗治疗，可达到在常规疗法清除大量肿瘤细胞后，再使用生物学治疗方式清除、杀伤少量的残留或扩散的肿瘤细胞，以提高、巩固肿瘤治疗的效果，减少肿瘤复发的目的。

附图说明

图1为肺癌病史2年的男患者人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞治疗前后CT检查对比。箭头示肺癌病灶及转移灶

A为肺窗的CT检查结果

上左为2009.08.04日输注实施例1分离的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞前的结果

上右为2009.09.22日的CT检查结果

下左为2009.11.19日的CT检查结果

下右为2010.03.07日的CT检查结果

B为纵隔窗的CT检查结果

上左为2009.08.04日输注实施例1分离的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞前的结果

上右为2009.09.22日的CT检查结果

下左为2009.11.19日的CT检查结果

下右为2010.03.07日的CT检查结果

C为转移胸椎病灶逐渐硬化的CT检查结果

从左至右依次为2009.08.04日输注实施例1分离的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞前的结果、2009.09.22日的CT检查结果、2009.11.19日的CT检查结果和2010.03.07日的CT检查结果

D为转移肋骨逐渐变小硬化的CT检查结果

从左至右依次为2009.08.04日输注实施例1分离的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞前的结果、2009.09.22日的CT检查结果、2009.11.19日的CT检查结果和2010.03.07日的CT检查结果

E为转移椎体逐渐硬化的CT检查结果

从左至右依次为2009.08.04日输注实施例1分离的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞前的结果、2009.09.22日的CT检查结果、2009.11.19日的CT检查结果和2010.03.07日的CT检查结果

F为各胸椎骨质破坏区逐渐密度增高硬化的CT检查结果

从左至右依次为2009.08.04日输注实施例1分离的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞前的结果、2009.09.22日的CT检查结果、2009.11.19日的CT检查结果和2010.03.07日的CT检查结果

图2为肺癌病史6年的女患者人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞治疗前后CT检查对比

图3A为人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD3的表达情况

图3B为人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD8的表达情况

图3C为人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞通过流式细胞仪检测人^γδT细胞受体的表达情况

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

RPMI 1640为GENMED公司的产品，其产品编号为GMS12049.2A；人AB血浆购自北京红十字血液中心；注射用重组人白细胞介素-2(国药准字S10970016)。

实施例1、人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的专用培养基分离人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞

1)将血站在6-8h内采集的人三联袋血液配平后放置在大容量冷冻离心机内，以离心力1160Xg，温度4±2℃，离心8分钟。

2)停机后轻轻取出血袋置于分浆夹上，将上层血浆连同白膜层及靠近白膜层1.5-2.0cm的红细胞一起挤入转移袋内。

3)将离心机按要求预热(温度22±2℃)。

4)将多联袋中保养液加入红细胞中成为少浆血，用高频热合机将少浆血切断。剩余二联袋配平后，以3500转，温度22±2℃，离心8分钟。

5)离心后分出上层血浆至转移袋，留下约15ml血浆，剩下的血浆及白膜层即为白细胞血小板悬液。

6)制备完毕，微机录入后立即入待检库于22±2℃血小板振荡保存箱中保存。保存有效期为24h。

7)采用Ficoll-hypaque法从白细胞血小板悬液分离出单个核细胞(PBMC)。具体方法如下：用PBS将白细胞血小板悬液1倍稀释后，加到Ficoll-hypaque分离液上，稀释的白细胞血小板悬液∶分离液约为1∶1。用水平离心机以2000r/min离心20min离心后，单个核细胞位于血浆和分离液的界面层，吸取界面单个核细胞层，用PBS稀释后2000r/min离心10min洗二次。

8)将所分离的PBMC培养于37℃，5％CO₂培养箱，培养液为人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基。该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基是在RPMI 1640培养基中添加人AB血浆、异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2(IL-2)得到的培养基，人AB血浆在该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基中的浓度是10％(体积百分浓度)，异戊烯焦磷酸在该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基中的浓度是100μg/L，人白细胞介素-2在该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基中的浓度是60万U/L。该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基的pH为7.2-7.4。每2-3天在该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在(5～10)×10⁵个细胞/mL。每次传代培养的条件均为37℃，5％CO₂。传5代得到人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞。该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞用抗人CD3单克隆抗体通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD3的表达情况，用抗人CD8单克隆抗体通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD8的表达情况，用抗人TCRγδ单克隆抗体通过流式细胞仪检测人^γδT细胞受体的表达情况，结果如图3A、图3B和图3C所示，表明该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞表达人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人^γδT细胞受体。流式细胞仪检测结果表明该人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的纯度达到95％。

实施例2、人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的活性

均经过一个疗程的化疗(一周1次化疗，共6周)的53例肿瘤患者，随机分为治疗组和对照组。治疗组22例肿瘤患者，其中临床诊断为胃癌患者5例，临床诊断为结肠癌患者6例，临床诊断为肺癌患者11例。对照组31例，其中临床诊断为胃癌患者7例，临床诊断为结肠癌患者8例，临床诊断为肺癌患者16例。

将步骤1得到的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞加入由如下配比的物质组成的无菌保存液(血液保存液II)中进行保存：枸橼酸钠(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O)13.2g、枸橼酸(C₆H₈O₇·H₂O)4.8g、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)14.7g和水1000ml。该无菌保存液的pH是7.2-7.4。人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞在该无菌保存液的含量是(2-3)×10⁷个细胞/(30-50)ml。在4℃保存10-12小时，作为给患者回输的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞悬液。

治疗组的22例肿瘤患者化疗药停止后72小时给予静脉回输上述人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞悬液。每位患者一次性输入30-50ml上述人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞悬液，在30分钟内输完。即每位患者一次性输入上述人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞(2-3)×10⁷个细胞。对照组的患者在化疗后不进行治疗。各位患者在化疗前、化疗药停止后72小时人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞回输前、人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞回输后3天检测外周血象WBC、PLT。数据以平均值±标准差表示，两组间比较进行t检验。

结果表明，人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞回输后肿瘤患者的外周血WBC、PLT升高明显，*P＜0.05。说明人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞可明显缓解骨髓抑制(表1)。

表1治疗组和对照组化疗后外周血象WBC、PLT变化情况

注：对于对照组，“化疗后T细胞回输后3天”只指明时刻，对照组并未进行T细胞治疗。

治疗组的22例肿瘤患者中，其中肺癌病史2年的一位男患者在2009.08.04日输注实施例1分离的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞。在2009.08.04日输注实施例1分离的人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞前、2009.09.22日、2009.11.19日、2010.03.07日后分别进行CT检测，结果如图1所示，表明左肺癌逐渐变小(A和B)，肺癌转移胸椎逐渐硬化(C)，癌细胞转移椎体逐渐硬化(E)，癌细胞转移肋骨逐渐硬化，肿瘤逐渐变小(D)；各胸椎骨质破坏区密度逐渐增高硬化(F)。

治疗组的22例肿瘤患者中，其中肺癌病史6年的一位女患者在化疗药停止后72小时人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞回输前(治疗前)、以及人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞回输后6个月(治疗后)分别进行CT检测，结果如图2所示，表明该患者的肺癌原发病灶变小。上述两个病例均可见病灶无增大情况发生，肿瘤原发病灶被不同程度抑制。

上述实验证明人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞可改善胃癌、结肠癌、肺癌等伴癌症状，促进肺癌原发病灶及转移病灶缩小，基本上无不良反应。

Claims (3)

1.一种人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的专用培养基，所述专用培养基的溶剂为RPMI1640培养基，溶质为人血浆、异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2，所述人血浆在所述专用培养基中的浓度是10％(体积百分浓度)，所述异戊烯焦磷酸在所述专用培养基中的浓度是100μg/L，所述人白细胞介素-2在专用培养基中的浓度是60万U/L；

所述专用培养基的pH是7.2-7.4；

所述人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞表达如下三种T淋巴细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人γ^δT细胞受体。

2.一种培养人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的专用培养基培养所述人CD3⁺CD8^+γδT淋巴细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述培养在37℃且5％CO₂条件下进行。

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