CN112014189A - 一种用于微核和染色体试验的制片方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于微核和染色体试验的制片方法，包括如下步骤：细胞培养后吸弃上清液低渗处理1‑30min，添加固定液预固定1‑5min；离心后添加所述固定液6‑12ml固定20‑40min，然后再‑离心、滴片。本发明的制片方法只固定一次，减少了离心和人为操作次数。新方法在固定步骤完离心后，上清液直接倾倒掉也节约了时间。总之，新方法节省时间、节省人力物力，降低了试验成本，试验也更简单易行，试验质量也更容易控制，试验结果也更加可靠。

Description

一种用于微核和染色体试验的制片方法

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，具体而言，涉及一种用于微核和染色体试验的制片方法。

背景技术

微核试验和染色体试验在环境卫生、职业卫生和遗传毒性损伤研究等公共卫生领域和生物检测及临床医学诊断中均有着广泛的应用，如染色体损伤检测、癌症风险评估和射线暴露生物剂量评估等等。微核是染色体断片或分裂滞后的整条染色体，有微核意味着染色体断裂或畸变。无论微核试验还是染色体试验，在制片过程中都要经过多次离心、多次固定，试验操作过程较繁琐复杂、费时费力、质量也不易控制。尤其在样本多、试验操作人员少的情况下，工作量大更显得紧张，试验结果也难以保证。工作效率、工作进度降低，常延误出报告时间。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于微核和染色体试验的制片方法，该制片方法在整个方法实施过程中只需固定一次，减少了离心和人为操作次数。并且采用了该新方法后，固定步骤完成离心后，上清液直接倾倒掉也节约了时间。总之，本发明的制片方法节省了时间、节省了人力物力，降低了试验成本，试验也更简单易行，试验质量也更容易控制，试验结果也更加可靠。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种用于微核和染色体试验的制片方法，包括如下步骤：

细胞培养后吸弃上清液低渗处理1-30min，添加固定液预固定1-5min；

离心后添加所述固定液6-12ml固定20-40min，然后再离心、滴片。

本发明的制片方法是经过长期的实践摸索得到的，传统的制片方法是将细胞培养结束后先将培养物混匀、离心，离心完成后吸弃上清液，然后在沉淀中加入低渗氯化钾溶液。本发明的方法则在细胞培养结束后直接吸弃上清液，并在沉淀中直接加入低渗氯化钾溶液。因为培养物在培养箱中一般都属于静置培养，既然细胞在静置培养过程中已经在重力作用下自然沉降，取出培养物后就没有必要再多此一举重新离心了。因为重新混匀、离心既浪费时间还会损伤细胞、降低细胞回收率，也不利于试验质量控制。也就是说通过采用本发明的操作方法减少了一次吹打、离心过程，等于避免了一次对细胞的损伤过程，在减少工作量的同时也使试验得到优化、质量得到保证，结果也更为可靠。

因此本发明的制片方法相当于对微核试验和染色体试验的试验方法特别是对制片过程进行了优化、简化，相较于现有技术的操作方法节约了操作时间，也降低了人力成本。

此外，传统方法中，固定次数多虽然可以减少杂质，但也容易丢失细胞。样本量大、血样达到几百个时，由于操作先后时间差别太大很难保证试验的均一性和质量，离心次数多反而不利于试验，还增加试验人员的劳动量。本发明的方法中，固定次数减少可能会影响固定效果和细胞碎片等杂质的清除。但是通过实践发现，固定效果主要与固定时间有关，本发明的方法虽然减少固定次数但不减少固定所需要的时间，因此并不会影响到最终的固定效果。

本发明在进行预固定时，是为了先对细胞发生一定程度的固定，适当增加固定液用量可以减少细胞碎片，将预固定离心后的上清液吸取干净并适当增加固定液的用量，也可以减少细胞碎片；这都可以弥补因固定次数减少而带来的杂质问题。

本发明固定液的添加量为6-12ml，这也是根据血液接种量为0.4-0.6ml相对折算的，固定液用量一般是6-8ml，一般增加2ml即可，或视沉淀多少增加1.5-4ml，增加后总体积12ml左右。

当然，如果接种血液量超过0.6ml，那么固定液量也应适当增加，但由于离心管最大容量就是15ml，因此也不适合种血太多。目前，大多数试验中种血量大都在这个范围，只是偶尔达到0.8ml。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述固定液为醇类和醋酸的混合物，所述醇类与所述冰醋酸的体积比为(2-4)：1，优选地体积比为3:1；优选地，所述醇类为甲醇、乙醇中的任意一种或两种，优选地为甲醇与乙醇的混合物，所述乙醇与甲醇的体积比在3:1以下。之所以最好采用部分乙醇来代替甲醇，是因为可以显著降低甲醇中毒的风险，尤其在样本量大、通风不良的情况下可以避免甲醇中毒。固定液的作用在于固定细胞，使得细胞不会发生变形。

优选地，作为进一步可实施的方案，低渗处理为采用浓度为0.05-0.1mol/L的KCl水溶液再混匀吹打，KCl水溶液预先预热至30-40℃之间。KCl水溶液能够很好的实现低渗操作。通过低渗处理后细胞涨大，使得细胞中的微核更容易被观察到。

另外，该方法可以采用不同浓度的氯化钾溶液进行低渗，甚至可以取得更好的效果。微核试验根据是否加松胞素分为双核法微核试验(又叫胞质分裂阻滞法微核试验)和单核法微核试验(常规培养法微核试验)，前者在细胞培养时加松胞素，后者不加。该方法适用于双核法微核试验、单核法微核试验和染色体试验。

优选地，作为进一步可实施的方案，低渗处理采用浓度为0.075mol/L的KCl水溶液。

优选地，作为进一步可实施的方案，KCl水溶液预先预热至37℃，预热的作用是为了加强低渗的效果。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述混匀吹打的次数为20-30次。

优选地，作为进一步可实施的方案，离心的速率为1000-1500rpm/min。离心的目的是为了使得细胞发生沉淀。

优选地，作为进一步可实施的方案，离心的时间为8-12min。

优选地，作为进一步可实施的方案，离心后添加所述固定液固定25-35min，优选地为30min。

优选地，作为进一步可实施的方案，滴片的过程中每一片上滴3-5滴，自然晾干。最好为湿冷的载玻片，而且动作要轻一些。

总之，本发明的制片方法固定1次即可滴片，传统方法至少固定2次，有时甚至固定多达5次以上。固定次数多，优点是细胞固定效果好、滴片后杂质少，但缺点也很明显。因为每次固定都需要吹打混匀和离心，每多固定一次都要多吹打一次、多离心一次。每次离心都不可能回收全部细胞，即每多离心一次都会多丢失一部分细胞。另外，吹打、离心都会损伤细胞，特别是离心时，剪切力更容易破坏细胞；而试验中细胞都经过低渗处理，所以更容易破碎。固定次数越多，细胞损伤越重、丢失越多。可见，传统方法操作难度大、费时费力、细胞回收率低、试验不易控制、试验结果也难以保证。科研一次做几个或十几个，或许并不觉得累和麻烦。但在实际工作中，样本量常常高达几百人份，染色体和微核加起来高达四五百个血样甚至更高，工作量极大。尤其染色体试验，在低渗时每个标本或血样要吹打二三十次，四五百个试管要吹打一万余次，几乎超出了人的承受能力。处理完一批样品往往需要几个小时，结果同一批样品有的低渗时间长、有的低渗时间短；低渗时间长的细胞可能已破裂、而低渗时间短的样本细胞胞浆膨胀又不够，严重影响试验质量。而长时间的吹打也容易疲劳，导致每次吹打的力度和手法不同，也会影响试验质量。而增加人员，由于不同的人操作手法力度、熟练程度都不相同，试验质量更难保证。体检人数多少每日变化很大，有时几个、有时几百甚至几千人。体检机构从成本效益考虑往往也不配备太多试验人员，被检单位从自身经济成本考量往往集中所有体检人员一起到体检机构体检。试验人员少与体检人员多及不均衡的矛盾一时难以解决，因此体检机构也没有更多的试验人员。

本发明通过对方法进行改进后只固定一次，减少了离心和人为操作次数。即使只减少一次离心，四五百个血样也会减少四五百次吹打，而染色体可减少一万次吹打动作。这样在固定完离心后，上清液直接倾倒掉，这明显减轻了劳动量、节约了时间。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的制片方法通过实践可知，微核试验只要低渗时间得当、固定时间足够一般能保证试验结果和质量。过多的人为操作和离心反而更容易损伤细胞、影响试验质量和结果，同时还会浪费人力物力、增加试验人员的劳动量。

(2)本发明的制片方法简单易行，并且适用面广，可适用于双核法微核试验、单核法微核试验和染色体试验，试验质量更容易控制，试验结果也更加可靠，同时还降低了试验成本，节省了时间、节省了人力物力。也更容易实现工业自动化和流水线作业，为将来机器化的操作模式带来便利。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1为本发明实施例1的镜检图；

图2为本发明实施例2的镜检图；

图3为本发明实施例3的镜检图；

图4为本发明实施例4的镜检图；

图5为本发明实施例5的镜检图；

图6为本发明实施例6的镜检图；

图7为本发明比较例1的镜检图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

微核实验方法具体操作步骤如下：

1)低渗处理：取出培养瓶，直接吸弃上清液；然后在培养瓶中直接加入3-6ml已预温至37℃的0.075mol/L的KCl溶液，用吸管轻轻吹打、混匀，转移至15ml锥形刻度离心管中，低渗处理2-4min。随后加入1-2ml新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)，用吸管轻轻吹打、混匀；预固定2-3min；然后以1000-1500rpm/min离心10min；

2)固定：离心结束后，吸弃上清液，尽量吸弃干净；然后在沉淀中加入8-12ml固定液，用吸管轻轻吹打、混匀，固定30min；然后以1000-1500rpm/min离心10min。离心结束后直接倾倒，弃掉上清液；然后将离心管直立片刻，使管壁残留液体回流入沉淀中，用吸管轻轻吹打，将沉淀与少量残留液体混匀；吸取混悬液滴至湿冷的载玻片上，根据沉淀多少每片3～5滴，空气中晾干。

3)染色：用10％Giemsa染液染色8-12min，流水冲洗，空气中晾干。细胞核及来自细胞核的物质被染成紫红色，细胞浆及来细胞浆的物质被染成蓝灰色。

4)镜检：先用低倍镜观察全片，发现双核细胞后转至高倍镜下仔细观察，在油镜下采集图像。观察片子上双核细胞数量、胞浆膨胀大小、染色是否清晰，以双核细胞较多、双核细胞胞浆完整且膨大清亮、染色清晰者为好。微核标准为圆形或椭圆形、边界清晰、大小为主核的1/16-1/3、染色和折光性与主核相同的核物质颗粒，镜检结果具体见附图1。

实施例2

具体操作步骤与实施例1一致，只是步骤1)中的KCl水溶液0.05mol/L，镜检结果具体见附图2。

实施例3

具体操作步骤与实施例1一致，只是步骤1)中的KCl水溶液0.1mol/L，镜检结果具体见附图3。

实施例4

具体操作步骤与实施例1一致，只是在细胞培养时不加松胞素，步骤4)镜下观察的是单核细胞，具体镜检图见附图4。

实施例5

具体操作步骤与实施例1一致，但未加松胞素(采用单核微核试验法)，其中步骤1)、步骤2)中的固定液，甲醇被乙醇部分取代，取代体积为75％，具体镜检图见附图5。

实施例6

染色试验方法具体操作步骤如下：

1)低渗处理：取出培养瓶，直接吸弃上清液；然后在培养瓶中直接加入6-8ml已预温至37℃的0.075mol/L的KCl溶液，用吸管吹打20-30次；然后转移至15ml锥形刻度离心管中，可于37℃水浴箱中低渗处理20-30min。随后加入1-2ml新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)，用吸管轻轻吹打、混匀，预固定1-5min；然后以1000-1500rpm/min离心10min；

2)固定：离心结束后，吸弃上清液，尽量吸弃干净；在沉淀中加入8-12ml固定液，用吸管轻轻吹打、混匀，固定30-40min；然后以1000-1500rpm/min离心8-12min。离心结束后直接倾倒，弃掉上清液；然后将离心管直立片刻，使管壁残留液体回流入沉淀中，用吸管轻轻吹打，将沉淀与少量残留液体混匀；吸取混悬液滴至湿冷的载玻片上，根据沉淀量多少，每片3-5滴，空气中晾干；

3)染色：用10％Giemsa染液染色3-5min，流水冲洗，空气中晾干。

4)镜检：先用低倍镜观察全片，发现分裂象后转至油镜下仔细观察，并采集图像。具体镜检结果参见图6。

实施例7

具体操作步骤与实施例1一致，只是步骤1)中的甲醇:冰醋酸＝2:1。

实施例8

具体操作步骤与实施例1一致，只是步骤1)中的甲醇:冰醋酸＝4:1。

实施例9

具体操作步骤与实施例1一致，只是步骤2)中的固定时间为20min。

实施例10

具体操作步骤与实施例1一致，只是步骤1)中的KCl水溶液不预温。

比较例1

微核实验方法具体操作步骤如下：

1)收获细胞：取出培养瓶，用吸管轻轻吹打混匀，将培养物吸出转移至15ml锥形刻度离心管中，以1000-1500rpm/min离心10-15min；

2)低渗处理：离心结束后，取出离心管，吸弃上清液；在沉淀中加入6-8ml已预温至37℃的0.075mol/L的KCl溶液，用吸管轻轻吹打、混匀，低渗处理2-5min。随后加入1ml新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)，用吸管轻轻吹打、混匀；预固定2-3min；然后以1000-1500rpm/min离心10-15min。

3)固定：离心结束后，吸弃上清液，在沉淀中加入6-8ml固定液，用吸管轻轻吹打、混匀，固定15-20min；然后以1000-1500rpm/min离心10-15min。

4)再固定：离心结束后，吸弃上清液，在沉淀中加入6-8ml固定液，用吸管轻轻吹打、混匀，固定15-20min；然后以1000-1500rpm/min离心10-15min。该步视情况再重复2-3次。离心结束后，吸弃上清液，留3-5滴，滴至湿冷的载玻片上，空气中晾干。

5)染色：用10％Giemsa染液染色8-12min，流水冲洗，空气中晾干。细胞核及来自细胞核的物质被染成紫红色，细胞浆及来细胞浆的物质被染成蓝灰色。

6)镜检：先用低倍镜观察全片，发现双核细胞后转至高倍镜下仔细观察，在油镜下采集图像。观察片子上双核细胞数量、胞浆膨胀大小、染色是否清晰，以双核细胞较多、双核细胞胞浆完整且膨大清亮、染色清晰者为好。微核标准为圆形或椭圆形、边界清晰、大小为主核的1/16-1/3、染色和折光性与主核相同的核物质颗粒，具体镜检结果见图7所示。

实验例1

镜检实验过程如下：

先用低倍镜观察全片，微核试验发现双核细胞后转至高倍镜下仔细观察，在油镜下采集图像；染色体试验发现分裂象后直接转至油镜下仔细观察并采集图像。微核试验每一例图样均分别包括低倍(×20)、高倍(×40)和油镜下(×100)三幅图像。染色体试验每一例图样均为油镜图像(×100)。

参见图1-7的镜检图片，可以看出将本发明实施例与比较例1最后镜检的结果进行对比，发现通过采用本发明的制片方法所得到的细胞边缘清晰，杂质少，也能够说明通过采用本发明的制片方法并没有降低制片效果，相应的提高了制片的效果。

实验例2

微核观察，选择胞浆完整、染色良好的双核细胞，观察1000个双核细胞，计算微核细胞率(‰)。细胞着色率(％)和胞浆完整率(％)的观察：由于滴片或涂片的头部和尾部细胞分布不均且常堆积重叠影响观察。为了排除滴片头部和尾部对试验结果的影响，沿长轴将滴片平均分成5等分，舍弃头部和尾部各1/5。将中间3/5均分为3等份，每份沿垂直方向再分为3等份，即9个区域或9等份。每个区域再分为4个象限，分别在每个象限的中心和四个角各取一个视野(高倍)，分别计数视野内染色良好的双核细胞和胞浆完整的双核细胞。最后，各个视野相加再求平均，计算出每人的细胞着色率和胞浆完整率，最后求出各组的平均细胞着色率和胞浆完整率。双核细胞的多少可以通过平均每单位面积或平均每个高倍视野的双核细胞数求出。用细胞成团指数判断细胞分散程度，指数越高分散越差。细胞成团指一团或一簇细胞大于等于3个细胞，且三个细胞重叠胞浆不能分辨，如果仅仅靠在一起能够分辨各自的细胞浆则不视为细胞团。细胞分散好指细胞团数量少、细胞团细胞数少。在上述每个视野中，用细胞团的个数乘以细胞团的分值再相加，求出每个视野的细胞成团指数。细胞团的分值根据细胞团细胞数求出，每个细胞团的细胞数≥3个计为1分、≥5个计为2分、≥7个计为3分、≥9个计为4分、≥12个计为5分、≥15个计为6分。各个视野细胞成团指数相加再求平均，求出每人的细胞成团指数，最后求出各组的平均细胞成团指数。染色体须找分散良好的中期分裂相，观察100个细胞，计算淋巴细胞染色体畸变细胞率(％)。

用SPSS 17.0软件分析，计算胞浆完整率(％)、细胞着色率(％)、微核细胞率(‰)用两样本资料卡方检验进行统计，平均每高倍视野双核细胞数比较用t检验，细胞成团指数用两样本资料Wilcoxon秩和检验进行统计，具体参见下表1所示。

表1细胞观察结果

与比较例1比较:*P<0.05，**P<0.01

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种用于微核和染色体试验的制片方法，其特征在于，包括如下步骤：

细胞培养后吸弃上清液低渗处理1-30min，添加固定液预固定1-5min；

离心后添加所述固定液6-12ml固定20-40min，然后再离心、滴片。

2.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，所述固定液为醇类和醋酸的混合物，所述醇类与所述冰醋酸的体积比为(2-4)：1，优选地体积比为3:1；

优选地，所述醇类为甲醇、乙醇中的任意一种或两种，优选地为甲醇与乙醇的混合物，所述乙醇与甲醇的体积比在3:1以下。

3.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，低渗处理采用浓度为0.05-0.1mol/L的KCl水溶液再混匀吹打，KCl水溶液预先预热至30-40℃之间。

4.根据权利要求3所述的制片方法，其特征在于，低渗处理采用浓度为0.075mol/L的KCl水溶液。

5.根据权利要求3所述的制片方法，其特征在于，KCl水溶液预先预热至37℃。

6.根据权利要求3所述的制片方法，其特征在于，所述混匀吹打的次数为20-30次。

7.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，离心的速率为1000-1500rpm/min。

8.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，离心的时间为8-12min。

9.根据权利要求1-8任一项所述的制片方法，其特征在于，离心后添加所述固定液固定25-35min，优选地为30min。

10.根据权利要求1-8任一项所述的制片方法，其特征在于，滴片的过程中，每一片上滴3-5滴，自然晾干。

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