CN114276977B

CN114276977B - 一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法

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Publication number: CN114276977B
Application number: CN202111635893.3A
Authority: CN
Inventors: 房宇; 马贝贝; 马川; 李建科; 徐书法
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114276977A

Abstract

本发明披露了一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，包括：在蜜蜂胚胎单细胞的收集过程中，将取得的蜂卵用离心管中不合钙、镁离子的磷酸缓冲盐溶液暂存，并在吸除所述磷酸缓冲盐溶液及加入胰酶后，选用与离心管契合且表面光滑的研磨棒研磨所述蜂卵。在对离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理后，将离心管中未完全消化的卵壳组织进行二次消化；然后对该离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理。

Description

一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域里蜜蜂单细胞转录组技术，尤其涉及蜜蜂胚胎单细胞的制备方法。

背景技术

单细胞转录组有助于深入理解基因型和表型之间的相互关系。随着高通量测序技术的不断成熟，单细胞测序技术成为备受关注的强大工具。在多细胞生物个体发育过程中，单个卵细胞分裂产生胚胎干细胞，进而能增殖分化成为具有不同表型和功能的任何类型的细胞。细胞间差异和异质性是干细胞群体固有的基本特性。对单个小鼠卵裂细胞的转录组分析发现，在相同的卵母细胞中至少有8-19％的基因存在两个以上的转录异构体(Tang etal.2009)，这表明在胚胎发育过程中单细胞转录组表型的复杂性。如果对一群细胞进行组学分析，这些关键的信息就会被掩盖。单细胞转录组技术可以用在同种干细胞中全面剖析细胞异质性，鉴定不同表型的细胞，这将大大提高人们对胚胎发育中单细胞水平遗传信息异质性的理解，为深入阐明蜜蜂胚胎发育的分子机理开辟新途径和思路。目前，已经利用单细胞转录组技术陆续对拟南芥(Palovaara et al.2017)、果蝇(Karaiskos et al.2017)、小鼠(Peng et al.2020)和人类(Guo et al.2015)的胚期发育进行了研究，解析了其基因调控的机制，并绘制了相应的胚胎发育轨迹。

目前已有人对蜜蜂大脑的单细胞转录组研究，通过对蜜蜂大脑的单细胞转录组分析发现，感染残翅病毒(DWV-A)的蜜蜂大脑基因表达谱与采集蜂相似，导致蜜蜂采集行为的提前发生以及蜜蜂学习行为的损伤，并最终会造成染病蜜蜂错误归巢进而扩大病毒的感染范围(Traniello et al.2020)，为蜜蜂健康和群体生存的机制提供了新的见解。

在进行蜜蜂单细胞转录组实验前，需获取蜜蜂胚胎期细胞。蜜蜂的卵呈乳白色，香蕉形，长度为1.5-1.8毫米。外表面为卵壳，内部充斥卵液。为获取卵内细胞，需对蜜蜂卵进行研磨，并通过胰酶进行消化，以获得蜜蜂胚胎期细胞。用传统的细胞制备方法所得到蜜蜂胚胎细胞存活率很低，如图1所示，图中空心圈代表活细胞，不规则的黑色实心点代表死细胞，通常它仅有45.5％的胚胎细胞存活率，无法满足后续的蜜蜂单细胞转录组的实验要求。因此，需对现有的蜜蜂胚胎期细胞制备方法进行改进，以满足科研实验的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，能够有效地提高蜜蜂胚胎细胞存活率。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，包括：在所述蜜蜂胚胎单细胞的收集过程中，将取得的蜂卵用离心管中的磷酸缓冲盐溶液暂存，并在吸除所述磷酸缓冲盐溶液及加入胰酶后，选用与离心管契合且表面光滑的研磨棒研磨所述蜂卵。

优选地，使用的磷酸缓冲盐溶液是不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液。

优选地，所述方法具体包括：

将通过移虫针收集的200只蜂卵样品置于含有1ml不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液的1.5ml的离心管中；

吸除该磷酸缓冲盐溶液，加入200微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液在离心管中，用1.5ml离心管研磨棒于插入冰里的离心管中对所述蜂卵样品充分研磨，直至看不见完整卵壳；用300微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液冲洗该研磨棒，使该研磨棒上细胞充分洗脱至该离心管中，再将该离心管置于37℃水浴锅中，水浴5min。

优选地，该方法还包括：对离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程。

优选地，消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程具体包括：将离心管放置在提前预冷至4℃的离心机中，以转速800rpm旋转离心3min。

优选地，该方法还包括：将离心管中未完全消化的卵壳组织进行第二次消化的过程。

优选地，将未完全消化的卵壳组织进行第二次消化的过程，具体包括：吸除离心管中的上清，加入500微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液将蜂卵细胞吹散，再将该离心管放置于37℃水浴锅中水浴3min。

优选地，该方法还包括：对该离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程。

优选地，对离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理，具体包括：将该离心管放置于提前预冷至4℃的离心机中，以转速1000rpm旋转离心3min。

优选地，该方法还包括用含磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，具体为：吸除该离心管中的上清，加入50微升含1％牛血清白蛋白的所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液进行重悬细胞处理，即用平口枪头轻轻吹打管中消化的蜂卵细胞。

本发明制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，由于取卵时将所取之卵置于含有D-PBS液体的离心管中，使得卵接触液面会被自动吸附，避免了卵粘连到管壁，从而确保卵的完整性，防止取卵时因卵与管壁粘连使卵破碎造成细胞坏死，造成细胞存活率低。另外，在研磨时选用表面光滑的研磨头与离心管契合，即使得研磨更加充分而利于卵壳破碎，同时研磨头又不会损伤细胞。还有，本发明通过对蜜蜂卵样品进行二次消化，可将卵壳消化完全而不存在组织碎片，无需过细胞筛，因而可使得细胞数量的损失骤减。同时，在进行两次消化处理后的低温旋转离心处理，避免大量使用D-PBS来终止胰酶反应而导致后续吸除D-PBS时的细胞数量损失。

附图说明

图1为用传统的蜜蜂胚胎单细胞的制备方法获取的细胞存活率之示意；

图2为本发明的制备蜜蜂胚胎单细胞的方法之流程图；

图3为用本发明的方法制备蜜蜂胚胎单细胞后对单细胞进行计数之示例；

图4为用本发明的方法制备出蜜蜂胚胎单细胞染色后细胞存活率之示意。

具体实施方式

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该理解，以下列举的实施例仅用于说明和解释本发明的技术方案，而不能用于限制本发明。

以下实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可通过商业途径获得。

(1)D-PBS(不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液)

由于钙离子、镁离子会导致胰酶的消化能力下降，因而本发明使用不含钙、镁离子的PBS溶液。

(2)0.25％Trypsin-EDTA(品牌：gibco)，即含0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合溶液；

(3)吖啶橙(Acridine Orange，AO)

1∶2000 AO，即0.5微升AO+1000微升D-PBS；

(4)碘化丙啶(3，8-二氨基-5-[3-(二乙基甲氨基)丙基]-6-苯基啡啶二碘，PI)

1∶10 PI，即10微升PI+90微升D-PBS；

(5)BSA(牛血清白蛋白)

10％BSA添加到D-PBS中，使BSA终浓度为1％，即含1％BSA的D-PBS，冰上放置备用。

本发明提供了一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，包括：

在单细胞收集过程中，将取得的蜂卵用离心管中的磷酸缓冲盐溶液暂存，并在吸除磷酸缓冲盐溶液及加入胰酶后，选用与离心管契合且表面光滑的研磨棒研磨蜂卵。

如图2中K1所示，将通过移虫针收集的200只蜜蜂胚胎(蜂卵)置于含有1ml D-PBS的1.5ml的离心管中；蜂卵会被自动吸附到液面，避免其粘连到管壁，从而确保卵的完整性。

图2中继续对蜂卵进行如下处理，包括K2、K3：吸除D-PBS，加入200微升0.25％Trypsin-EDTA溶液，用1.5ml离心管研磨棒于插入冰里的离心管中对蜂卵样品充分研磨，直至看不见完整卵壳；用300微升0.25％Trypsin-EDTA冲洗研磨棒，使研磨棒上细胞充分洗脱至1.5ml离心管中，将离心管置于37℃水浴锅中，水浴5min。

通过这一处理，将离心管中的蜂卵细胞通过胰酶(即Trypsin)进行第一次消化。消化细胞所用的胰酶中含有EDTA(即乙二胺四乙酸)，用于螯合可能存在的钙镁离子。但由于EDTA不能被血清中和，故使用EDTA处理细胞后，一定要用不含钙镁离子的D-PBS。

上述方法步骤中D-PBS是不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液。由于钙、镁离子的存在会导致胰酶对蜂卵的消化能力下降，故本发明的方法中需采用不含钙、镁离子的PBS，用如下配方进行配制D-PBS：

氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠3.58g，磷酸二氢钾0.24g，溶于1LddH₂O中。此溶液PH为7.4。

本发明给出离心管和研磨棒的具体实施例，例如研磨时选用1.5m1离心管研磨棒，其研磨头与1.5ml离心管契合，可使研磨更加充分，利于卵壳破碎，且该研磨棒表面光滑，不易损伤细胞。当然，如果符合二者契合且研磨棒表面光滑的条件，也可选用其它容积的离心管和配对研磨棒。

在对蜂卵进行首次消化处理后，还包括步骤K4：将离心管放置在提前预冷至4℃的离心机中，以转速800rpm旋转离心3min。

本发明提供的制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，还包括图2中以下步骤K5、K6：吸除上清(即浮在管上层的组织碎片和其它无用物成分)，加入500微升0.25％Trypsin-EDTA将细胞吹散，再将离心管放置于37℃水浴锅中水浴3min。

这一处理，是将离心管中未完全消化的卵壳组织通过胰酶进行第二次消化。本发明在上述研磨过程中将卵壳磨碎进行一次消化，无法确保卵壳消化完全；进行二次消化处理后可保证卵壳消化完全，避免了用传统方法对碎卵壳进行过筛处理导致的细胞损伤，从而最大限度地保留蜂卵细胞，以满足后续的实验要求。

在对蜂卵进行第二次消化处理后，如图2中还包括步骤K7：将离心管放置于提前预冷至4℃的离心机中，以转速1000rpm旋转离心3min。

注意，本发明在对蜂卵进行第一次、第二次消化处理后，都有相应的对离心管中消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程。这是因为低温条件下不再适宜胰酶的反应条件，使得胰酶终止反应，从而不像以往需添加5倍胰酶体积的D-PBS来终止胰酶反应，这样可有效地减少后续吸除D-PBS时细胞进一步的损失，且整个操作过程不需转换离心管，最大程度地减少细胞损失。

本发明的方法还包括如图2所示的步骤K8：吸除上清，加入50微升含1％BSA的D-PBS进行重悬细胞处理，即用平口枪头轻轻吹打，使消化的蜂卵细胞分散均匀。

本发明通过这样的处理进一步保护细胞，且防止尖锐的枪头对细胞造成损伤。

本发明通过上述方法制备出蜜蜂胚胎单细胞后，采用下述步骤对单细胞计数

1)吸取5微升AO+5微升PI置于离心管中，混匀；

2)加入10微升细胞重悬液，用手轻弹管，使之混匀；

3)采用细胞计数仪(美国DeNovix品牌)进行细胞计数

示例如图3明场图片所示，图中明亮的圆点即为细胞。染色后细胞示意如图4所示，其中空心圈代表活细胞，黑色实心不规则图点代表死细胞；计数结果表明该样品细胞存活率为93.52％。

Claims

1.一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法，包括：

在所述蜜蜂胚胎单细胞的收集过程中，将取得的蜂卵用离心管中不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液暂存，并在吸除所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液及加入胰酶后，选用与离心管契合且表面光滑的研磨棒研磨所述蜂卵，具体包括：

将通过移虫针收集的200只蜂卵样品置于含有1ml所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液的1.5ml的离心管中；

将所述离心管中的蜂卵细胞进行第一次消化的过程：吸除所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液，加入200微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液在所述离心管中，用1.5ml离心管研磨棒于插入冰里的所述离心管中对所述蜂卵样品充分研磨，直至看不见完整卵壳；用300微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液冲洗该研磨棒，使该研磨棒上细胞充分洗脱至该离心管中，再将该离心管置于37℃水浴锅中，水浴5min；

还包括将未完全消化的卵壳组织进行第二次消化的过程：吸除所述离心管中的上清，加入500微升含有0.25％胰酶、0.038％乙二胺四乙酸及0.001％酚红的混合液将蜂卵细胞吹散，再将所述离心管放置于37℃水浴锅中水浴3min。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：对所述离心管中经第一次消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程：将所述离心管放置在提前预冷至4℃的离心机中，以转速800rpm旋转离心3min。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括：对所述离心管中经第二次消化的蜂卵细胞进行低温旋转离心处理的过程：将所述离心管放置于提前预冷至4℃的离心机中，以转速1000rpm旋转离心3min。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括：用磷酸缓冲盐溶液重悬蜜蜂胚胎细胞，具体为：吸除所述离心管中的上清，加入50微升含1％牛血清白蛋白的所述不含钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液进行重悬细胞处理，即用平口枪头轻轻吹打管中消化的蜂卵细胞。