CN107326024B

CN107326024B - 一种高通量快速提取疟原虫dna的方法及其应用

Info

Publication number: CN107326024B
Application number: CN201710801013.2A
Authority: CN
Inventors: 李佩佩; 范琦; 赵振军; 叶博; 曹雅明
Original assignee: DALIAN BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE OF LIAONING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: DALIAN BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE OF LIAONING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2037-09-07
Also published as: CN107326024A

Abstract

本发明公开一种高通量快速提取疟原虫DNA的方法及其应用，具体的所述模板提取的方法为，应用碱裂解结合磁珠进行DNA的释放、富集、分离与纯化，该方法操作简单快速、成本低、通量高、污染风险低，提取的DNA品质高、可自动化，可以广泛应用于分子学检测中，能显著提高检测通量、操作便利性，并显著降低检测假阳性率，提高检测灵敏度、准确度和检测效率；通过串联核酸自动提取仪和PCR仪、优选结果可视的PCR技术，能实现在多孔板上进行集批量DNA提取与检测于一体的样品可视化、自动化诊断技术。解决了针对现行疟原虫检测技术靶标DNA制备繁琐、耗时、通量低等问题，具有广泛的应用前景。

Description

一种高通量快速提取疟原虫DNA的方法及其应用

技术领域

本发明属于寄生虫的核酸提取分离领域，具体涉及一种高通量快速提取疟原虫DNA的方法及其应用。

背景技术

疟疾是一种通过按蚊叮咬传播的寄生虫疾病，是严重危害人类健康和生命安全的一种重大传染病，被世界卫生组织(WHO)列为全球三大公共卫生问题之一。疟疾控制主要依赖三种手段：切断传播源、化学预防及案例管理。案例管理包括对疟疾流行地区的疟疾诊断及对阳性患者的治疗。WHO呼吁在疟疾流行地区对所有人进行是否感染疟原虫的检测，以达到阻断传播、控制流行，最终实现消除疟疾的目标。面对数量众多的检测样本，开发简单、快速、高通量、高灵敏度的检测方法，是提高检测效率和检测准确度的核心问题。目前，常用的疟原虫方法主要有：镜检、基于免疫学抗原的快速检测技术以及分子生物学检测技术。

传统镜检和以镜检法为基础的病原学检测是目前临床检测疟原虫最常用的方法，具有价格低廉、设备要求低、易于基层开展等优点。但镜检对镜检者的经验要求比较高，不同镜检人员的检测灵敏度差异较大，主观性强，同时对低原虫密度、不常见物种的样本误诊率高。同时，镜检费时费力、容易诱发镜检人员眼部疾病，不适合大规模样本的集中检测。

基于免疫学抗原的疟原虫快速检测技术，是一种近年来快速发展起来的定性检测全血标本中的疟原虫抗原的体外快速免疫色谱法，其优点就是便于携带。但是，该法目前只能特异性检测恶性疟和间日疟，对于其他疟原虫种类检测效果不佳，且容易受到基因缺失、种株变异等因素的影响。同时，检测样本需要全血，对于大规模普查样本收集、运输要求高而不被临床工作者看好。

分子学检测技术通过特异性扩增靶标基因达到诊断目的，灵敏度高，特异性好，广泛应用于病原微生物的检测。PCR扩增的高通量和节约人力使得该技术特别适宜进行大规模的病原微生物检测，但是分子诊断中的关键技术除了靶标基因的引物设计，PCR条件的优化以外，还涉及样本的采集与保存、运输，靶标DNA的提取，结果的快速、准确读出等。目前，靶标DNA提取过程繁琐、耗时、通量低等问题已经成为限制分子检测技术应用于临床的瓶颈。目前，已有不少科研工作者报道了一些快速简便的模板制备方法可以提高靶标DNA的提取效率而不降低检测灵敏度，但是这些方法或者存在模板纯度低易降解、或者限制后续PCR选择等弊端，例如，chelex提取的DNA，需要加热，蒸汽污染风险大，同时模板纯度低易降解。Sarponin处理、或水煮处理的血片直接做模板，避免了蒸汽污染，但是血片做模板，无法选择结果读出比较快速、简便的RT-PCR而限制了后续检测过程的便利性。也有科研工作者避开提取DNA转而提取RNA，继而以其cDNA作为PCR的扩增模板，取得了灵敏度的突破，但是RNA提取过程繁琐、费时，依旧制约了整个疟原虫分子检测进程。

综上，开发“DNA提取——PCR检测——结果读出”全过程简便、高通量、快速的检测手段是当务之急。而限制全过程高通量的控制步骤DNA提取，如何保证提取质量同时提高通量，达到高通量、快速、简便的目的是研究的重中之重。

发明内容

本发明针对现行疟原虫检测技术靶标DNA制备繁琐、耗时、通量低等问题，提供了一种高通量快速提取疟原虫DNA的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：用碱溶液对样本进行裂解处理，用磁珠进行DNA的富集、分离与纯化，具体的，所述待测样品可以是人工培养的疟原虫，病人的血液、唾液和尿液，按蚊的组织和血液等。

优选的情况下，上文所述的技术方案中，所述裂解液是一种碱性水溶液，所述碱为无机碱，例如可以为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等，所述碱性水溶液的浓度可以是0.05-1M，裂解过程通常伴有震荡、混匀操作。所述裂解过程的处理时间为1min-120h，处理温度为0-40℃。

优选的情况下，上文所述的技术方案中，所述裂解处理过程可以同时在碱液中加入十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)，浓度为10％以下。

具体的，对于上文所述的技术方案中所述的磁珠作为分离载体在生物分离中有广泛的应用，所述磁珠buffer，是一种磁珠的悬浮液，在磁分离过程中，将磁性微球直接放入含有目标物的混合溶液中，目标物与磁性微球紧密结合，然后利用外部磁场进行分离。具体应用于本发明的磁珠为含有二氧化硅和四氧化三铁成分的磁性微球，例如SiO₂@Fe₃O₄，C@SiO₂@Fe₃O₄等。

在优选的情况下，对于上文所述的技术方案，所述DNA富集的过程，是将磁珠或者磁珠的悬浮液加入到所述裂解液中，混匀，静置片刻。通常加入无水乙醇能提高富集效率，无水乙醇与裂解液的体积比通常为0.7～1:1。

上文所述的技术方案中，所述DNA的分离过程，是指通过外加磁场将磁珠与液相分离并丢弃液相。所述外加磁场通常使用磁铁。

上文所述的技术方案中，所述DNA纯化过程，通常用清洗Buffer对磁珠进行清洗，清洗后通常伴有干燥、洗脱步骤。所述清洗Buffer是70-75％的酒精；所述洗脱Buffer是ddH₂O、TE缓冲液或PCR反应液。

上文所述的高通量快速提取疟原虫DNA的方法，在疟原虫检测中应用时，当样本量十分低的情况下，可以直接使用PCR反应体系进行模板DNA的洗脱。例如，在后续采取巣式PCR诊断时，配置反应体系，每25μL的反应体系含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的外侧引物(10pM)各0.5μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs mix 2μL，去离子水19.25μL。混匀后用该反应体系对富集有目标物的磁珠进行洗脱，并将洗脱液直接用于巢式PCR第一步反应。

值得注意的是，当所述样本来源于疟原虫时，通过上述方法所获取的模板DNA是总基因组DNA，包含人和疟原虫基因组DNA、及其他寄生于人体内的微生物的基因组DNA。

进一步，本发明还提供了上述获取模板DNA的方法在疟原虫检测方面的应用。具体为：基于非疾病的诊断和治疗目的，即：并非以有生命的人体或动物体为对象，同时不以获得疾病诊断结果或健康状况为直接目的；通过DNA扩增技术对上述获取模板DNA的方法所得到的模板DNA进行扩增，进行疟原虫的检测。

具体的，上文所述的DNA扩增技术可以是常规PCR，巢式PCR(Nested-PCR)，重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)，环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)等。当所述DNA扩增技术，结果易读、可视的时候(如SYBR Green实时荧光定量PCR)，通过串联核酸自动提取仪和荧光PCR仪实现疟原虫的高通量、可视化、自动化检测。

进一步，本发明还提供了一种疟原虫检测试剂盒。

具体的，上文所述试剂盒中的试剂，可以包含上文所述的疟原虫模板DNA的获取方法中或疟原虫检测方法中所使用的试剂组合；主要包括的试剂有碱溶液和十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)；其中，所述碱溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等；碱溶液浓度可以是0.05～1M或者便于贮存的高浓度；所述SDS浓度可以是0.1～10％或者便于贮存的高浓度。

有益效果：本发明所提供的获取疟原虫模板DNA的方法，首次采用碱裂解结合磁珠富集、分离与纯化，具有明显先进于现行技术的突破：

1)现行技术提取纯品DNA普遍采用的是，使用含蛋白酶K的组织裂解液对样品进行裂解、消化，再结合柱式提取或酚氯仿抽提技术提纯DNA，此法繁琐、耗时。本发明所提供的获取疟原虫模板DNA的方法，所提DNA纯度高，同时操作简单、快速，最短5分钟即能有效裂解血片样品(裂解后，血片上不残留疟原虫DNA，实施例2)，相比蛋白酶K消化普遍需要的3小时裂解时间，有效缩短时间35倍。在快速提取模板DNA的同时也保证了模板DNA的纯度和普遍适用性，这是对现行许多技术(如chelex技术、sapornin技术等)无法兼顾简便、快速和DNA品质的一种突破；

2)本发明所提供的获取疟原虫模板DNA的方法，采用碱裂解结合磁珠进行富集、分离与纯化，操作简单，无需离心，可以实现全程最短13分即可钟获得可供PCR使用的模板DNA。该过程不受裂解液的干扰，同时无需离心操作，能在96孔板甚至384孔板上操作，大大提高了DNA提取通量，这是对现行技术普遍提取通量低的一个重要突破；

3)疟原虫检测技术，DNA提取过程是成本控制的一个重要环节。本发明所提供的获取疟原虫模板DNA的方法，采用碱液作为裂解液，无毒、廉价；采用磁珠颗粒进行DNA的富集、分离、纯化，磁珠能循环使用，经济节约。这对于降低疟原虫检测技术成本，推进检测技术用于临床医疗普查工作具有重要作用；

4)现行检测技术，在拥有检测高灵敏度的同时，也面临着各种污染和假阳性的困扰。本发明所提供的获取疟原虫模板DNA的方法，整个提取过程无需加热，无需多次换管，大大降低了因高温造成的蒸汽污染风险和因换管等繁琐操作引入的不确定污染，降低了后续PCR检测的假阳性率；同时也免去了控温设备的费用，进一步降低了成本；这也是本发明的重要突破之一；

5)本发明所提供的获取疟原虫模板DNA的方法，可以配合核酸自动提取仪实现自动化操作，更可以通过串联核酸自动提取仪和PCR仪实现“DNA提取——PCR检测——结果读出”于一体的高通量疟原虫检测技术，可以大大节约人力，解放检测人员的双手，提高效率；这也是本发明的重要突破之一。

附图说明

图1所示的是本发明实施案例1的琼脂糖凝胶电泳图；

图2所示的是本发明实施案例2的琼脂糖凝胶电泳图；

图3所示的是本发明实施案例3的实时荧光定量PCR的标准曲线图；

图4所示的是本发明实施案例3的实时荧光定量PCR的熔解曲线图；

图5所示的是本发明实施案例5的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合实施案例对本发明作进一步描述。应该指出，以下说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语与本发明所属技术领域人员通常理解的含义相同。

本发明实施案例所涉及的材料、实际和实验设备，如无特别说明，均符合病原微生物分子诊断领域的市售产品。

本发明实施例所涉及的引物均由委托生物工程公司合成，具体引物信息如下：

SEQ ID NO:1：

5’-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3’

SEQ ID NO:2：

5’-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3’

SEQ ID NO:3：

5’-TTTTTATAAGGATAACTACGGAAAAGCTGT-3’

SEQ ID NO:4：

5’-TACCCGTCATAGCCATGTTAGGCCAATACC-3’

SEQ ID NO:5:

5’-CAGATACCGTCGTAATCTTAACC-3’

SEQ ID NO:6：

5’-TACTCGCCCCAGAACCCAAAGAC-3’

SEQ ID NO:7:

5'-GTGATCTCGGTCTACGGTTCTC-3'

SEQ ID NO:8:

5'-TAGTTCACCATCTTTCGGGTCC-3'

实施例1

选取感染间日疟原虫病人滤纸血一例，人工培育恶性疟3D7株滤纸血样本一例，用打孔器分别取直径3mm的圆片血样置于2个1.5mL的EP管中，编号分别为Pv，Pos.。在Pv管中加入裂解液S(0.2M NaOH，1％SDS)200μL，震荡混匀，室温放置5分钟，加入磁珠Buffer10μL(C@SiO₂@Fe₃O₄)和无水乙醇150mL，轻轻震荡混匀，将EP管置于磁力架上分离，待磁珠与液相完全分离，倒去液相，移去磁力架，加入清洗Buffer 150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，弃液体，移去磁力架，再次加入清洗Buffer 150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，移液枪尽可能吸取液体，移去磁力架，EP管置于37℃鼓风培养箱内干燥5分钟，30μL洗脱Buffer(TE)洗脱。DNA-20℃冻存待用。从取样到获得可供检测使用的模板DNA共耗时13分钟。

Pos.管样本采用市售DNA提取试剂盒(Qiagen)，依照说明书进行提取，洗脱buffer为30μL。

巢式PCR技术进行疟原虫检测：

第一步PCR：每25μL体系含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的外侧引物(10pM)各0.5μL、模板DNA 2μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，去离子水17.25μL。PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，55℃60秒，72℃60秒进行30个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物作为DNA模板进行Nested PCR。

Nested PCR：每25μL体系含如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的内侧引物(10pM)各0.5μL、模板DNA 2μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，去离子水17.25μL。PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，62℃30秒，72℃1分钟进行35个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物用于凝胶电泳。

取Nested PCR产物10μL加入核酸染色剂，用2％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下观测结果，如图1所示。

对结果的说明如下：去离子水无特异性条带，样品Pv、Pos.在相同位置有特异性条带，为阳性。说明本发明方法提取的DNA具有较高品质，提取过程快速、耗时短。

实施例2

取人工培育恶性疟3D7株滤纸血样本，用打孔器分别取直径3mm的圆片血样置于2个1.5mL的EP管中，分别编号1#，3#。管中加入0.2M NaOH200μL，震荡混匀，1#室温放置5分钟，3#室温放置40分钟后，将其中的血片转移至新的EP管中，分别编号2#和4#。在1#和3#各加入磁珠Buffer 10μL(SiO₂@Fe₃O₄)和无水乙醇150mL，轻轻震荡混匀，将EP管置于磁力架上分离，待磁珠与液相完全分离，倒去液相，移去磁力架，加入清洗Buffer 150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，弃液体，移去磁力架，再次加入清洗Buffer 150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，移液枪尽可能吸取液体，移去磁力架，EP管置于37℃培养箱干燥10分钟，20μL洗脱Buffer洗脱。在2#和4#中分别加入PBS 1mL，震荡混匀后充分移去液体后再加入PBS各500μL再次清洗一次，充分移去液相，血片常温自然干燥。

巢式PCR技术进行疟原虫检测：

第一步PCR：每25μL体系含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的外侧引物(10pM)各0.5μL、、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，1#，3#模板DNA 2μL，2#，4#直接取风干血片做模板，去离子水补足体系。PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，55℃60秒，72℃60秒进行30个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物作为DNA模板进行Nested PCR。

Nested PCR：每25μL体系含如SEQ ID NO:3(rplu3)和SEQ ID NO:4(rplu4)所示的内侧引物(10pM)各0.5μL、第一步PCR产物2μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs2μL，去离子水17.25μL。PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，62℃30秒，72℃60秒进行35个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物用于凝胶电泳。

取Nested PCR产物10μL加入核酸染色剂，用2％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下观测结果，如图2所示。

对结果的说明如下：2#，4#无特异性条带，为阴性。样品1#，3#在有特异性条带，为阳性。说明本发明方法裂解过程高效、快速，5分钟就能实现疟原虫DNA的充分释放，血片上无疟原虫DNA残留。

实施例3

取感染间日疟原虫病人滤纸血，用打孔器取直径3mm的圆片血样置于1.5mL的EP管中，在管中加入裂解液S(0.2M NaOH，1％SDS)200μL，震荡混匀，室温放置5分钟，加入磁珠Buffer 10μL(Sigma)和无水乙醇150mL，轻轻震荡混匀，将EP管置于磁力架上分离，待磁珠与液相完全分离，倒去液相，移去磁力架，加入清洗Buffer 150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，弃液体，移去磁力架，再次加入清洗Buffer 150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，移液枪尽可能吸取液体，移去磁力架，EP管置于37℃培养箱干燥30分钟，20μL洗脱Buffer洗脱。DNA-20℃冻存待用，标记为Sample。

普通PCR进行扩增：

每25μL体系含如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的疟原虫通用引物(10pM)各0.5μL、SampleDNA 2μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，去离子水17.25μL。PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，62℃30秒，72℃1分钟进行40个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物10μL加入核酸染色剂，用2％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后回收特异性条带，对特异性条带进行克隆、提取质粒DNA。质粒DNA紫外定量，并梯度稀释得到标准质粒梯度稀释品(拷贝数为10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10)。

SYBR Green Real-time PCR技术进行检测：

所用仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪。每20μL体系含如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的疟原虫通用引物(10pM)各0.4μL、模板DNA 2μL、SYBR Premix ExTaq II 10μL，ROXReference Dye 0.4μL，去离子水6.8μL。荧光定量PCR条件为95℃30秒；以(95℃5秒，60℃34秒)进行40个循环，熔解曲线反应条件为：95℃15s，60℃60s，95℃15s，60℃15s。DNA模板依次为：标准质粒梯度稀释品(拷贝数为10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10)和去离子水。

标准质粒梯度稀释品(拷贝数为10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10)的Ct值分别是：19.4271、22.2689、25.595、29.2521、32.4828和37.1768，去离子水显示未测得，标准曲线如图3所示，熔解曲线如图4所示。得出的阳性结果判定标准为：所测Ct值小于35，并且在79.5±0.3℃出现熔解曲线峰。

实施例4

将93份普查血片样本，打孔器各取直径3mm的圆形血片置于96孔板中的93个孔中，排枪各加入100μL的裂解液S(0.2M NaOH，1％SDS)，轻轻震荡，室温放置5分钟，加入磁珠Buffer 10μL(Sigma)和无水乙醇70mL，轻轻震荡混匀，将96孔板置于96孔磁力架上分离，待磁珠与液相完全分离，倒去液相，移去磁力架，排枪各加入清洗Buffer 100μL，轻轻震荡、混匀后置于磁力架上分离，倒去液体，移去磁力架，再次加入清洗Buffer 100μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，移液枪尽可能移去液体，移去磁力架，EP管置于37℃培养箱干燥30分钟，各加入30μL洗脱Buffer洗脱。DNA-20℃冻存待用。

SYBR Green Real-time PCR技术进行检测：

所用仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪。96孔PCR反应板中分别加入上述93份样品DNA，另外三个孔分别加入阳性质粒DNA(10⁵拷贝数)、健康人血基因组DNA和Rnase freewater作为参照，每20μL体系含如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的疟原虫通用引物(10pM)各0.4μL、模板DNA 2μL、SYBR Premix ExTaq II 10μL，ROX Reference Dye 0.4μL，去离子水6.8μL。荧光定量PCR条件为95℃30秒；以(95℃5秒，60℃34秒)进行40个循环，熔解曲线反应条件为：95℃15s，60℃60s，95℃15s，60℃15s。

反应结束后，根据所测Ct值小于35，并且和阳性质粒参照在相同Tm值处出现熔解曲线峰来进行阳性判定，93例普查血样里共检出4例阳性样本。

实施例3和实施例4说明，本发明提供的DNA模板获取技术操作简单、快速、通量高，通过结合可视化的荧光定量PCR检测手段，能实现集“DNA提取——检测——结果读出”于一体的快速、高通量疟原虫可视化检测技术，这对于大规模检测疟原虫血样具有意义重大。

实施例5

选取镜检恶性疟的病人滤纸血一枚，打孔器取3mm直径的圆形血片于1.5mL的EP管中，编号Pos。在管中加入裂解液S(0.2M NaOH，1％SDS)200μL，震荡混匀，室温放置5分钟，加入磁珠悬浮液20μL(sigma)和无水乙醇150mL，轻轻震荡混匀，将EP管置于磁力架上分离，待磁珠与液相完全分离，倒去液相，移去磁力架，加入70％的乙醇150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，弃液体，移去磁力架，再次加入70％的乙醇150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，移液枪尽可能吸取液体，移去磁力架，EP管置于37℃培养箱干燥10分钟，30μL TE洗脱，转移洗脱液，DNA-20℃冻存待用。

在已经转移洗脱液的EP管中加入水1mL，移液枪吹打，是磁珠均匀分散于水中，置于磁力架上，待水相澄清，移除水相，重复该操作5次后，将含有磁珠的EP管置于37℃培养箱烘干20min待用。

选取柞蚕蛹一枚，取少量组织置于1.5mL的EP管中，编号Neg。在管中加入裂解液S(0.2M NaOH，1％SDS)200μL，震荡混匀，室温放置60分钟，将裂解液转移至上述回收磁珠EP管中，加入无水乙醇150mL，轻轻震荡混匀，将EP管置于磁力架上分离，待磁珠与液相完全分离，倒去液相，移去磁力架，加入70％的乙醇150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，弃液体，移去磁力架，再次加入70％的乙醇150μL，震荡、混匀后置于磁力架上分离，移液枪尽可能吸取液体，移去磁力架，EP管置于37℃培养箱干燥30分钟，30μL TE洗脱，转移洗脱液，DNA-20℃冻存待用。

对Pos、Neg样本进行常规PCR，每25μL体系含如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物(10pM)各0.5μL、模板DNA 1μL、ExTaq 0.25μL，10×ExBuffer 2.5μL，dNTPs 2μL，去离子水18.25μL。PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，62℃30秒,72℃1分钟进行40个循环，再在72℃下延伸5min。

另取Neg模板DNA 1μL，加入如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的柞蚕28SrRNA特异性引物(10pM)各0.5μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，去离子水18.25μL。配置的体系进行常规PCR，PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟进行40个循环，再在72℃下延伸5min。

将上述两个PCR得到的产物加入核酸染色剂，用1.5％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下观测结果，如图5所示。

对结果的说明如下，M代表DL2000Marker，样品孔从左至右，1-2为Pos、Neg的疟原虫通用引物扩增结果，3号、4号为Neg样本和水的柞蚕特异性引物扩增结果：孔道1用新鲜的磁珠提取的Pos样本出现特异性带，确定含有疟原虫基因组DNA；孔道2的Neg样本未见疟原虫特异性条带，说明提取该样本的磁珠经过清洗后，磁珠上不含可被洗脱下来的疟原虫基因组DNA，再次利用时对样本无假阳性干扰；孔道3的Neg样本出现柞蚕特异性条带，说明回收的磁珠依旧具有高质量提取DNA的能力；孔道4的水作为阴性控制，未见特异性条带。该实施例充分说明了磁珠的可回收性，也说明本方法经济、绿色。

本发明的检测方法已经通过较好的实施案例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神的范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合来实现被发明技术。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动：如类似的引物的替换和改动，如PCR循环温度的改动，如所用PCR反应体系成分的合理替换和改动，如碱浓度、处理时间的合理改变等，对本领域技术人员来说是显而易见的，它们被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims

1.一种高通量快速提取疟原虫DNA的方法，其特征在于：用碱溶液对待测样本进行裂解处理，用磁珠进行DNA的富集、分离与纯化。

2.根据权利要求1所述的高通量快速提取疟原虫DNA的方法，其特征在于：所述碱为无机碱；碱溶液的浓度是0.05～1M。

3.根据权利要求1所述的高通量快速提取疟原虫DNA的方法，其特征在于：所述碱溶液中还有浓度为10％以下的SDS。

4.根据权利要求1所述的高通量快速提取疟原虫DNA的方法，其特征在于：所述裂解处理过程的处理时间为1min～120h，处理温度为0-40℃。

5.根据权利要求1所述的高通量快速提取疟原虫DNA的方法，其特征在于：在用磁珠进行DNA的富集、分离与纯化的过程中，将磁性微球直接放入含有待测样本的混合溶液中，然后利用外部磁场进行分离，分离后采用ddH₂O、TE缓冲液或PCR反应液洗脱。

6.根据权利要求1所述的高通量快速提取疟原虫DNA的方法，其特征在于：所述磁珠为含有二氧化硅和四氧化三铁成分的磁性微球。

7.根据权利要求1所述的高通量快速提取疟原虫DNA的方法，其特征在于：所述用磁珠进行DNA富集的过程，是将磁珠或者磁珠的悬浮液加入所述裂解液中，混匀，静置片刻，其中：所述裂解液中还加有无水乙醇，无水乙醇与裂解液的体积比为0.7～1:1。

8.一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中的试剂，选自权利要求1～7中任一项所述的高通量快速提取疟原虫DNA的方法中所使用的试剂组合。

9.如权利要求1所述方法在疟原虫检测方面的应用，其特征在于，检测方法中的DNA扩增技术选自：常规PCR，巢式PCR，重组酶聚合酶扩增，环介导等温扩增或实时荧光定量PCR，且所述应用为非疾病的诊断和治疗目的。