CN111678873A - 快速检测疟疾的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测疟疾的方法。本发明方法可用于检测疟疾，提供诊断信息，能够快速、灵敏并且准确地检测出疟疾，尤其是疟疾的早期检测。此外，本发明的方法只需从受试者采集非常少量的血液样本即可检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及快速检测疟疾的方法。
背景技术
在世界许多地方，疟疾依然是一个严重的健康问题。不幸地是，在疟疾为地方病的地区，由于目前已有的最好的诊断工具都要求在实验室环境下使用，结果，因为未能及时而准确诊断和费用过高而常常得不到有效治疗和根除。甚至在欧洲，患病和死亡人数逐年增加，这是由于欧洲人越来越喜欢去疟疾流行地区度假，但同时又不愿采用抗疟疾预防措施所致。欧洲本体地人无免疫力，结果，因没能早期诊断，感染会(而且常常确实)造成快速死亡。此外，由于目前全球变暖而使得疟疾更易向包括南欧在内的以前无此疾病的地区蔓延，上述情况只可能会更加严重。
对疟疾的早期准确诊断是有效的疾病管理和疟疾监测所必需的。因缺乏简易、价格实惠且准确的诊断方法，使得常见的预防措施是"发烧等于疟疾，除非证明并非如此"。这导致疟疾的推定过度、非疟疾发烧的误管理以及有限资源的浪费，并且造成耐药性。
因此，寻求更为有效的检测疟疾感染存在的方法显得尤为迫切。
发明内容
本发明目的是提供了一种快速检测疟疾的方法。
本发明提供了一种快速检测疟疾的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供一裂解全血样本；
b.对所述裂解全血样本施加强度为0.5-20T的磁场，使疟原虫色素与所述裂解全血样本分离，得到分离的疟原虫色素；
c.用适当的溶剂溶解分离的疟原虫色素，从而得到含有疟原虫色素的可分析溶液；以及
d.对步骤c获得的可分析溶液进行光谱分析，得到检测所述可分析溶液中的疟原虫色素。
在另一优选例中，所述分离包括使所述裂解全血样本经过含有磁性颗粒的分离柱，较佳地为含有磁化含铁颗粒的分离柱。
在另一优选例中，所述溶剂为碱性溶剂。
在另一优选例中，所述溶剂选自下组：氢氧化钠水溶液、氢氧钾水溶液、氢氧化钙水溶液、氢氧化镁水溶液、有机季铵氢氧化物水溶液、或其组合。
在另一优选例中，所述光谱分析包括测定通过可分析溶液的透射光的吸光率。
在另一优选例中，通过所述透射光的吸光率得到所述样本中的疟原虫色素质量的指标。
在另一优选例中，所述光谱分析是在波长范围350nm-420nm或600nm-640nm 内进行测定。
在另一优选例中，所述检测包括对所述可分析溶液中的疟原虫色素进行定性和 /或定量检测。
在另一优选例中，所述方法能够检测所述裂解全血样本中的疟原虫色素的最低浓度为0.1μg/ml。
在另一优选例中，所述方法是在体外进行的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种快速检测疟疾的方法。本发明的方法能够快速、灵敏并且准确地检测出疟疾，尤其是疟疾的早期检测。此外，本发明的方法只需从受试者采集非常少量的血液样本即可检测。在此基础上完成了本发明。
除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明的方法可用于检测疟疾，提供诊断信息。本发明中，所采用的样本(样品)包括血液标本。
本发明方法可用于对样本中的疟原虫色素或β-正铁血红素的浓度进行检测。β-正铁血红素是类似于疟原虫色素的合成物质。β-正铁血红素表现出与疟原虫色素相似的性质，包括分光性质和磁性质，并且可用于模拟疟原虫色素的行为。
本发明方法可用于对样本中的疟原虫色素或β-正铁血红素的浓度进行检测或定量和/或能够进行检测或定量，所述浓度≤0.12μg/mL，优选地≤0.10μg/mL，更优选地≤0.08μg/mL并且甚至更优选地≤0.06μg/mL或≤0.05μg/mL和/或介于这些浓度中的一个和2μg/mL或2.5μg/mL的浓度之间。对0.12μg/mL的疟原虫色素浓度的检测能够实现200个寄生虫/μl的寄生物血症(如世界卫生组织所推荐的)的检测，而0.05μg/mL的疟原虫色素浓度的检测能够实现80个寄生虫/μl 的寄生物血症的检测。这些灵敏度水平(特别地，较低的水平)能够实现疟疾的早期检测，从而大大方便了患者治疗。
用于分析的样本的体积可以≤1mL，优选地≤750μL，更优选地≤500μL并且甚至更优选地≤300μL。因此，只需要从将受试者采集非常少量的血液样本。特别地，在做流体系统中，用于分析的样本的体积可以是10μL-50μL。可通过静脉穿刺或手指针刺未收集分析样本。通过血液穿刺而收集的血液体积可足够进行分析。
样本分析的时间(例如，从注入样本到接收到最终数据)可以是不超过10分钟，优选地不超过8分钟；更优选地不超过6分钟或不超过5分钟。如此将比显微术明显更快速地提供结果。
在疟疾的成熟期间，当红细胞中裂殖体的浓度较高时，细胞自然裂解，并且疟原虫色素将与感染新红细胞的裂殖体同时地释放到血液中。使用包括全血(或裂解全血)而非分离后或纯化后的红细胞的样本的一个优点在于，这样能够分析存在的全部疟原虫色素，包括(i)仍然在红血细胞内的疟原虫色素；(ii)之前已经从红血细胞释放的疟原虫色素；以及(iii)通常高水平地已经掺入巨噬细胞、单核细胞和白细胞中的疟原虫色素。
可能的裂解全血样本方法包括：可能使用玻璃珠进行的机械破裂、液体均化、冻融、杆臼。所有这些方法都可在伴随或不伴随超声处理的情况下应用。优选地，样本包括已经使用裂解溶液进行裂解(也就是说，化学裂解)并且尚未进行机械裂解的全血，这样简化了样本的制备。
在磁力分离之后，可通过收集流体来收集目标物质进行分析。收集流体优选地包含其中溶解了分离出的目标物质的成分以得到可分析的溶液。溶解的目标物质优选地是未磁化形式，即，溶解导致磁性质的丧失。收集流体可包括含有诸如氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钠、氢氧化铵、有机季铵氢氧化物、氨、有机胺等碱化剂的水溶液。优选的收集流体是氢氧化钠溶液。收集流体的浓度可大于或等于O.lM和/ 或小于或等于1M；例如可使用0.4M的NaOH溶液。这些溶液是容易得到的，只需要标准实验室使用注意事项并且其浓度可避免产生可能堵塞设备(尤其是设备中横截面小的部分，例如，任何开关阀)的盐沉淀的风险。
分离柱可容易地进行拆解并重新组装，例如，以方便可磁化颗粒的替换。可磁化颗粒可进行周期性替换，以例如在腐蚀和/或沉积物和/或污染物积聚的情况下保持装置的功效和/或精度。在替换可磁化颗粒之前进行的分析次数可以是≥10或≥ 15；其可以是≤1000。
对可分析溶液进行光谱分析以检测溶解的目标物质的过程可包括光学分析；其可包括吸收光谱。从源发出的辐射可穿过可分析溶液，以给出由传感器接收的衰减信号。选择源和传感器以涵盖能够检测目标物质的存在和(优选)数量的波长。
优选地，使用准单色光来进行光谱分析，即，具有窄带宽的光，例如，在80nm，50nm、20nm或10nm的带宽内具有其能量的至少80％的光。可使用准单色光源和/ 或传感器。在一个优选实施方式中，使用在约380nm、约405nm或约620nm的波长发射的准单色二极管。另选地，可使用单色光。疟原虫色素的吸收光谱表现出多个峰。疟原虫色素强吸收波长在330nm-410nm的范围内的辐射并且较弱地吸收波长在600nm-640nm的范围内的辐射。第一波段是灵敏度所关注的，第二波段是特异性所关注的。因此，使用对应的准单色光源能够使用稳固的、简化的但提供良好灵敏度或选择性的构造和设备。例如，发光二极管可以是低功率二极管:其可与流动的可分析流体相邻地设置，而不需要用光纤传输。通过使用裂解全血在约380nm、约405nm或约620nm处检测疟原虫色素可实现特别的优势；可使用这种组合来灵敏地检测疟原虫色素和/或避免来自样本的干扰或遮蔽指示疟原虫色素信号的不期望的寄生虫信号。光传感器可以是能够在所选择波长下进行检测的光敏传感器。因此，用于检测目标物质的光谱分析的波长可包括:≥300nm或≥320nm或≥340nm或≥ 350nm或≥360nm和/或≤440nm或≤430nm或≤420nm或≤410nm的波长；或者≥ 580nm或≥590nm或≥600nm和/或≤650nm或≤640nm或≤630nm的波长。
可使用波长集中在以上范围内的单色或准单色发射器。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
(1)制备裂解全血样本
由于β-正铁血红素表现出与疟原虫色素相似的性质，包括分光性质和磁性质，因此，为了模拟人全血样本中的疟疾(疟原虫色素晶体)的检测，将待测试样本制为β-正铁血红素在未受污染的全血样本中的悬浮液。在进行全血样本分析之前，用 Tris缓冲的(pH7)Triton X-100和皂苷溶液来裂解全血样本。首先，制备100mL的 Tris缓冲溶液。在将12.11g的三(羟基甲基)氨基甲烷溶解在60mL的水中并且添加盐酸得到pH为7的溶液之后，继续添加水，以得到100mL的Tris缓冲溶液。通过在10mg的皂苷和1mL的Triton X-100中添加必要量的Tris缓冲溶液未得到 100mL的裂解溶液。通过用裂解溶液进行1/2稀释并且反应30分钟来执行全血样本的裂解。
(2)分离阶段
将包含β-正铁血红素晶体的500μL裂解全血样本注入样品容器中，确保所注入样本是均质的。随后利用载流体(水)输送所注入的裂解全血样本到达磁力分离柱的入口。通过一个或多个永磁体向磁力分离柱施加外部磁场，分离柱处的磁场强度可以是0.5T-2T。当载流体所输送的样本经过柱中的磁化钢微球时，样本中的磁性β-正铁血红素晶体将吸附于并保持在磁化做球上，从而使β-正铁血红素晶体与裂解全血样本分离。
(3)获得可分析溶液
在待分离结束时，使洗脱液(氢氧化纳溶液)到达磁力分离柱的入口，同时收集其经过微球后的流出液，从而收集并且洗脱在分离阶段期间由微球保持的β-正铁血红素晶体，得到可分析溶液，可分析溶液包括溶解在氢氧化纳收集溶液中的β -正铁血红素晶体。
(4)分析阶段
将收集得到的可分析溶液连接到透明的流体槽，并使从窄带宽二极管发射出的光(中心405nm)穿过可分析溶液并且衰减透射光信号落在光传感器上。衰减光信号中检测到的光吸收提供了样本中溶解的β-正铁血红素或疟原虫色素晶体的存在和数量的指标。将光传感器的光信号处理换算成具体数值。
为了确定样本中的疟原虫色素(或β-正铁血红素)的数量，可以制作初步校准曲线，尤其是使用包含己知数量的β-正铁血红素的校准样本来形成初步校准曲线。例如，校准曲线指示疟原虫色素的浓度与对应于疟原虫色素的峰信号下方的表面积的变化关系，或者在简化的不太精确的替代方式中，指示疟原虫色素的浓度与吸收信号中对应于疟原虫色素的峰信号的最大强度的变化关系。
实验结果表明，根据该方法可以直接测得裂解全血样本中的β-正铁血红素晶体的浓度，并且检测结果准确灵敏。
实施例2
(1)制备裂解全血样本
在进行全血样本分析之前，用Tris缓冲的(pH7)Triton X-100和皂苷溶液来裂解全血样本，实验方法同实施例1。
(2)分离阶段
将包含β-正铁血红素晶体的300μL裂解全血样本注入样品容器中，确保所注入样本是均质的。随后利用载流体(水)输送所注入的裂解全血样本到达磁力分离柱的入口。通过一个或多个永磁体向磁力分离柱施加外部磁场，分离柱处的磁场强度可以是8T-20T。当载流体所输送的样本经过柱中的磁化钢微球时，样本中的磁性β-正铁血红素晶体将吸附于并保持在磁化做球上，从而使β-正铁血红素晶体与裂解全血样本分离。
(3)获得可分析溶液
在待分离结束时，使洗脱液(氢氧化纳溶液)到达磁力分离柱的入口，同时收集其经过微球后的流出液，从而收集并且洗脱在分离阶段期间由微球保持的β-正铁血红素晶体，得到可分析溶液，可分析溶液包括溶解在氢氧化纳收集溶液中的β -正铁血红素晶体。
(4)分析阶段
将收集得到的可分析溶液连接到透明的流体槽，并使从窄带宽二极管发射出的光(中心600nm)穿过可分析溶液并且衰减透射光信号落在光传感器上。衰减光信号中检测到的光吸收提供了样本中溶解的β-正铁血红素或疟原虫色素晶体的存在和数量的指标。将光传感器的光信号处理换算成具体数值。
实验结果表明，根据该方法可以直接测得裂解全血样本中的β-正铁血红素晶体的浓度，并且检测结果准确灵敏。
本发明方法适于小样本量的野外使用的特别紧凑的、低成本的、快速分析。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种检测疟疾的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a.提供一裂解全血样本；
b.对所述裂解全血样本施加强度为0.5-20T的磁场，使疟原虫色素与所述裂解全血样本分离，得到分离的疟原虫色素；
c.用适当的溶剂溶解分离的疟原虫色素，从而得到含有疟原虫色素的可分析溶液；以及
d.对步骤c获得的可分析溶液进行光谱分析，得到检测所述可分析溶液中的疟原虫色素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离包括使所述裂解全血样本经过含有磁性颗粒的分离柱，较佳地为含有磁化含铁颗粒的分离柱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂为碱性溶剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自下组：氢氧化钠水溶液、氢氧钾水溶液、氢氧化钙水溶液、氢氧化镁水溶液、有机季铵氢氧化物水溶液、或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光谱分析包括测定通过可分析溶液的透射光的吸光率。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过所述透射光的吸光率得到所述样本中的疟原虫色素质量的指标。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述光谱分析是在波长范围350nm-420nm或600nm-640nm内进行测定。
8.如权利要求1所述的方法，所述检测包括对所述可分析溶液中的疟原虫色素进行定性和/或定量检测。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法能够检测所述裂解全血样本中的疟原虫色素的最低浓度为0.1μg/ml。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是在体外进行的。
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| CN107003311A (zh) * | 2014-10-29 | 2017-08-01 | 蒙斯大学 | 疟疾检测 |
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