KR20140050606A - 혈액 기생충을 진단하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents
혈액 기생충을 진단하기 위한 방법 및 장치 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20140050606A KR20140050606A KR1020137030079A KR20137030079A KR20140050606A KR 20140050606 A KR20140050606 A KR 20140050606A KR 1020137030079 A KR1020137030079 A KR 1020137030079A KR 20137030079 A KR20137030079 A KR 20137030079A KR 20140050606 A KR20140050606 A KR 20140050606A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- particles
- parasite
- particle
- measurements
- population
- Prior art date
Links
- 244000045947 parasite Species 0.000 title claims abstract description 101
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 73
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 147
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 100
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims abstract description 39
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims description 17
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004820 blood count Methods 0.000 claims description 4
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 33
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 238000001374 small-angle light scattering Methods 0.000 description 13
- 239000000306 component Substances 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 4
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 3
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 3
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000012124 rapid diagnostic test Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 2
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M Cetrimide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 1
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 description 1
- 241001505293 Plasmodium ovale Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- DDXLVDQZPFLQMZ-UHFFFAOYSA-M dodecyl(trimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C DDXLVDQZPFLQMZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229940118768 plasmodium malariae Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
- G01N21/53—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke
- G01N21/532—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke with measurement of scattering and transmission
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
- G01N21/53—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
- G01N2333/445—Plasmodium
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 혈액 샘플에서 기생충을 검출하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 상기 방법은 혈액 샘플을 용해 시약과 혼합하여 적혈구를 용해시키는 단계; 입자 분석기에서 용해된 혈액 샘플 중 입자를 측정하여 축방향 광 손실 측정치를 수득하는 단계; 및 축방향 광 손실 측정치에 따라 용해된 혈액 샘플에서 기생충 입자 군집을 구별하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 광 산란을 측정하는 것, 및 광 산란 측정치와 축방향 광 손실 측정치를 비교함으로써 기생충 입자 군집을 구별하는 것을 포함한다. 혈액 샘플에서 기생충 군집을 검출하기 위한 시스템은 축방향 광 손실 측정치를 수득하기 위한 입자 분석기; 및 축방향 광 손실 측정치를 사용하여 기생충 입자 군집을 측정하기 위한 컴퓨터를 포함한다.
Description
본 발명은 의료용 진단 분야, 더 구체적으로는 혈액 기생충에 의한 감염을 진단하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
[관련 출원]
본 출원은 2011년 5월 13일에 출원되었으며 그 전체가 참조로써 개재되는 US 가출원 61/486,059호에 대하여 우선권을 주장하는 바이다.
기생충 질환은 전 세계의 많은 사람들에게 사망 및 고통을 야기한다. 주요 기생충 질환 중 하나는 말라리아이다. 세계 보건 기구 (WHO)에 따르면, 말라리아는 매년 2억 2천 5백만명을 감염시켜 75만명을 약간 상회하는 사람들을 사망시키는 치명적인 기생충 질환이다. 사망자의 대부분은 어린이이다. 이 질환의 희생자 대부분은 사하라-이남 아프리카에 살고 있지만, 상당수의 사례가 아시아, 중동, 아메리카 및 유럽에서 발생하고 있다.
일반적으로 인간에 감염되는 하기 네 가지 유형의 말라리아 기생충이 존재한다: 플라스모듐 비박스 ( Plasmodium vivax ); 플라스모듐 말라리아에( Plasmodium malariae); 플라스모듐 오발레 ( Plasmodium ovale ); 및 플라스모듐 팔시파룸( Plasmodium falciparum ). 원숭이에서 말라리아를 야기하는 다섯 번째 유형의 플라스모듐 기생충인 플라스모듐 노울레시(Plasmodium knowlesi)가 인간에 감염되는 것으로 발견된 바 있으나, 그의 유병률은 아직 알려져 있지 않다.
조기에 진단될 경우, 이 질환은 항-말라리아 약물을 사용하여 치료가능하다. 세계 보건 기구 (WHO)는 치료 전에 속성 진단 시험 (RDT) 또는 현미경 혈액 세포 조사에 의해 환자의 감염을 반드시 확인할 것을 권장하고 있다. 현미경 조사는 느리고 노동 집약적이며, 고도로 숙련된 기술을 필요로 한다. RDT는 통상적으로 면역-크로마토그래피 항체 시험이어서, 결과적으로 온도 안정성, 요구되는 기술자의 기술 및 비용과 관련한 문제를 가지고 있다.
세포 계수기를 사용하여 말라리아 감염에 대한 백혈구 반응을 측정함으로써 말라리아 감염을 빠르게 진단하려는 시도가 어느 정도 성공을 거두었다. 그러나, 백혈구 측정치와 말라리아 감염 중증도 사이의 신뢰성 있는 관계를 확립하는 것은 어렵다. 이와 같은 문제는 측정되는 백혈구 파라미터가 림프구 및 단핵구가 기생충과 반응할 때 백혈구 부피의 변화이기 때문에 발생한다. 불행하게도, 백혈구 부피는 말라리아 기생충이 처음에 환자에게 감염되었을 때에 즉시 변화되지 않음은 물론, 일단 치료에 의해 기생충이 박멸되고난 후 즉시 정상으로 돌아오지도 않는다. 세포 부피 변화는 보통 정량화가 불가능한 방식으로 말라리아 기생충의 감염 또는 박멸에 대해 즉각적인 반응을 나타내지 않는다. 또한, 말라리아 기생충에 대한 림프구 및 단핵구의 생물학적 반응이 너무 복잡하여, 백혈구 부피의 변화 (림프구 및 단핵구의 것)와 기생충 감염 중증도 사이의 관계를 신뢰성 있게 정량화하는 것은 어렵다.
필요로 하는 것은 용이하게 사용 및 해석되는 혈액 기생충용의 속성 진단 시험이다. 본 발명은 이와 같은 필요성을 해소한다.
개시되는 주제는 일반적으로 혈액 샘플에서 기생충을 검출하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 명세서는 혈액 샘플에서의 기생충 입자 군집의 검출 방법을 개시한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 혈액 샘플을 용해 시약과 혼합하여 적혈구를 용해시키는 단계; 입자 분석기에서 혼합 혈액 샘플 중 입자를 측정하여 축방향 광 손실(axial light loss) 측정치를 수득하는 단계; 및 축방향 광 손실 측정치에 따라 혼합 혈액 샘플에서 기생충 입자 군집을 구별하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 구별 단계는 축방향 광 손실 측정치에 따라 혼합 혈액 샘플에서 기생충 입자 군집을 확인하는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, 구별된 기생충 입자 군집은 말라리아 기생충을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 1회 이상의 광 산란 측정을 수행하는 것, 및 축방향 광 손실 측정치 및 광 산란 측정치에 따라 혼합 혈액 샘플 중 기생충 입자 군집을 구별하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 또한 기생충 입자 군집 중 입자를 계수하여 기생충 농도의 계수를 측정하는 것; 및 기생충 감염에 상응하는 계수로서 기생충 농도의 계수를 기록하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 측정은 유핵 적혈구 (NRBC) 분석의 일부이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 1회 이상의 광 산란 측정은 중상각 (upper median angle) 광 산란 측정이다.
일 실시양태에서, 구별 단계는 측정된 1회 이상의 광 산란 측정치와 측정된 축방향 광 손실 측정치를 비교하는 것, 및 비교에 의해 표시되는 각 군집을 동기화(gating)함으로써 기생충 입자 군집을 검출하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 기생충 입자 군집 중 입자를 계수하여, 제1 수를 측정하는 것; 비교로부터 산출되는 다른 입자 군집 중 상기 입자를 계수하여, 제2 수를 측정하는 것; 및 기생충 감염의 지표로서 제1 수 및 제2 수를 포함하는 분율을 기록하는 것을 추가적으로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 기생충 입자 군집은 각 백혈구 군집보다 더 낮은 값의 상기 1회 이상 광 산란 측정치, 및 더 낮은 값의 상기 축방향 광 손실 측정치를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 확인 단계는 1회 이상 광 산란 측정치, 축방향 광 손실 측정치, 및 해당 입자 측정 동안 수득되는 제3의 측정치를 비교하는 것, 및 비교에 의해 표시되는 각 군집을 동기화함으로써 기생충 입자 군집을 검출하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제3 측정치는 직류 (DC) 측정치이다.
또 다른 실시양태에서, 혈액 샘플을 사용한 기생충 입자의 검출 방법은 상기 혈액 샘플을 용해 시약과 혼합하여 적혈구를 용해시키는 단계; 입자 분석기에서 혼합 혈액 샘플 중 입자를 측정하여 1회 이상의 광 산란 측정치, 축방향 광 손실 측정치, 및 부피 측정치를 수득하는 단계; 상기 1회 이상 광 산란 측정치 및 축방향 광 손실 측정치를 바탕으로 혼합 혈액 샘플에서 기생충 입자에 상응하는 제1 입자 군집을 구별하는 단계; 부피 측정치를 바탕으로 상기 기생충 입자에 의해 영향을 받은 백혈구에 상응하는 제2 입자 군집을 구별하는 단계; 및 구별된 제1 및 제2 입자 군집에 따라 기생충 감염을 기록하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 구별 단계는 1회 이상 광 산란 측정치 및 축방향 광 손실 측정치를 바탕으로 한 혼합 혈액 샘플 중 기생충 입자에 상응하는 제1 입자 군집을 포함하거나, 및/또는 기생충 입자에 의해 영향을 받은 백혈구에 상응하는 제2 입자 군집을 확인하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 입자 군집을 구별하는 단계는 추가적으로 광 산란 측정치를 바탕으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 적혈구에서의 기생충 검출 방법은 기생충이 보존되는 방식으로 혈액 샘플 중 적혈구를 용해시키는 단계; 용해된 혈액 샘플로 광선을 통과시키는 단계; 입자에 의해 야기되는 바와 같은 광선으로부터의 축방향 광 손실을 측정하는 단계; 및 측정된 축방향 광 손실 측정치로부터 감염된 세포의 군집을 측정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 광선의 방향으로부터 측정하였을 때 예정된 각도 범위 이내에서 샘플 중 입자에 의해 산란되는 광을 측정하는 단계; 및 입자에 대한 축방향 광 손실에 대비하여, 광선의 방향으로부터 측정하였을 때 예정된 각도 범위 이내에서 입자에 의해 산란되는 광을 비교하고, 상기 비교로부터 감염된 세포의 군집을 측정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서는, 감염된 세포의 군집 중 입자 수의 계수를 백혈구 수의 계수로 나눈다.
또 다른 측면에서, 개시되는 주제는 하기를 포함하는, 혈액 샘플 중 기생충 입자 군집의 검출 시스템에 관한 것이다: 축방향 광 손실 측정치를 수득하기 위한 입자 분석기; 축방향 광 손실 측정으로부터 산란된 광의 측정을 촉발하는 입자 분석기; 및 기생충 입자의 지표가 되는 군집을 측정하기 위한 컴퓨터. 일 실시양태에서, 상기 입자 분석기는 추가적으로 광 산란 측정치를 측정하고, 상기 컴퓨터는 상기 광 산란 측정치를 축방향 광 손실 측정치와 비교하며, 광 산란 측정치와 축방향 광 손실 측정치의 상기 비교는 기생충 입자 군집을 정량화한다. 일 실시양태에서, 상기 광 산란 측정은 20 내지 45도 사이에서 이루어진다.
하기에서 기술되는 도면을 참조함으로써, 본 발명의 대상 및 특징들이 더 잘 이해될 수 있다. 도면이 반드시 일정 비율로 도시된 것은 아니며; 대신 개시되는 주제의 원리를 예시하기 위하여 강조를 사용하였다. 개시내용과 연관되는 도면은 그것이 안내하는 개시내용 내의 각 기초에 초점을 맞추어져 있다.
도 1a는 선행 기술에 공지되어 있는 세포 계수기 실시양태의 개략도이고, 도 1b는 말라리아 기생충에 의해 일부가 감염되어 있는 적혈구 군의 현미경사진이고;
도 2는 본 발명 방법 실시양태의 단계를 기술하는 흐름도의 실시양태이고;
도 3a 및 도 3b는 각각 피. 비박스에 감염된 환자 및 비-감염 환자에서의 RUMALS 대 ALL의 예시적인 플롯을 나타내고;
도 4a 및 도 4b는 각각 피. 비박스에 감염된 환자 및 비-감염 환자에서의 RLALS 대 ALL의 예시적인 플롯을 나타내고;
도 5a 및 도 5b는 피. 비박스 말라리아 감염에 대하여 치료중인 환자에서의 시간 경과에 따른 기생충 부하 크기, 및 각각 CMC 및 기생충_입자_군집% 크기의 예시적인 플롯을 나타내고;
도 6a 및 도 6b는 피. 비박스 말라리아 감염에 대하여 치료중인 환자에서의 시간 경과에 따른 기생충 부하 크기, 및 각각 CMC 및 기생충_입자_군집% 크기의 예시적인 플롯을 나타내고;
도 7a 및 도 7b는 피. 비박스에 의해 감염된 환자로부터의 혈액 샘플에서의 ALL에 대비하여, 플로팅된 각각 RLALS 및 RUMALS의 플롯을 도시하고;
도 7c는 ALL에 대한 1-차원 막대그래프를 포함하여, 피. 비박스에 의해 감염된 환자로부터의 혈액 샘플에서의 RUMALS 및 ALL의 산란 플롯이고;
도 7d 및 도 7e는 피. 비박스에 의해 감염된 도 7a 및 도 7b와 동일한 환자로부터의 혈액 샘플에서의 각각 회전된 광 산란 (RLSn) 및 불투명도 (OP)에 대비하여, 플로팅된 세포 부피 (V)의 플롯을 도시하고;
도 8a, 도 8b 및 도 8c는 항-말라리아 요법을 사용하여 치료중인 피. 비박스에 의해 감염된 환자로부터의 RLALS 대 ALL 산란 플롯을 도시하고;
도 9a 및 도 9b는 피. 팔시파룸 말라리아 기생충을 가지는 환자에서의 RUMALS 및 RLALS 대 ALL 산란 플롯을 도시한다.
도 1a는 선행 기술에 공지되어 있는 세포 계수기 실시양태의 개략도이고, 도 1b는 말라리아 기생충에 의해 일부가 감염되어 있는 적혈구 군의 현미경사진이고;
도 2는 본 발명 방법 실시양태의 단계를 기술하는 흐름도의 실시양태이고;
도 3a 및 도 3b는 각각 피. 비박스에 감염된 환자 및 비-감염 환자에서의 RUMALS 대 ALL의 예시적인 플롯을 나타내고;
도 4a 및 도 4b는 각각 피. 비박스에 감염된 환자 및 비-감염 환자에서의 RLALS 대 ALL의 예시적인 플롯을 나타내고;
도 5a 및 도 5b는 피. 비박스 말라리아 감염에 대하여 치료중인 환자에서의 시간 경과에 따른 기생충 부하 크기, 및 각각 CMC 및 기생충_입자_군집% 크기의 예시적인 플롯을 나타내고;
도 6a 및 도 6b는 피. 비박스 말라리아 감염에 대하여 치료중인 환자에서의 시간 경과에 따른 기생충 부하 크기, 및 각각 CMC 및 기생충_입자_군집% 크기의 예시적인 플롯을 나타내고;
도 7a 및 도 7b는 피. 비박스에 의해 감염된 환자로부터의 혈액 샘플에서의 ALL에 대비하여, 플로팅된 각각 RLALS 및 RUMALS의 플롯을 도시하고;
도 7c는 ALL에 대한 1-차원 막대그래프를 포함하여, 피. 비박스에 의해 감염된 환자로부터의 혈액 샘플에서의 RUMALS 및 ALL의 산란 플롯이고;
도 7d 및 도 7e는 피. 비박스에 의해 감염된 도 7a 및 도 7b와 동일한 환자로부터의 혈액 샘플에서의 각각 회전된 광 산란 (RLSn) 및 불투명도 (OP)에 대비하여, 플로팅된 세포 부피 (V)의 플롯을 도시하고;
도 8a, 도 8b 및 도 8c는 항-말라리아 요법을 사용하여 치료중인 피. 비박스에 의해 감염된 환자로부터의 RLALS 대 ALL 산란 플롯을 도시하고;
도 9a 및 도 9b는 피. 팔시파룸 말라리아 기생충을 가지는 환자에서의 RUMALS 및 RLALS 대 ALL 산란 플롯을 도시한다.
하기의 상세한 설명은 개시되는 주제의 소정 실시양태들을 도시한 첨부 도면을 참조한다. 개시되는 주제의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않고도, 다른 실시양태들이 가능하며, 실시양태에 대하여 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 하기의 상세한 설명이 개시되는 주제를 제한함을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 개시되는 주제의 영역은 첨부된 청구범위에 의해 한정된다. 본 출원은 본 출원의 양수인에게 양도된 US 7,256,048호의 전체를 참조로써 개재한다.
설명을 목적으로 도 1a를 참조하여 간단하게 살펴보면, 선행 기술에 공지되어 있는 바와 같은 세포 분석기 (10)는 유동 셀 (26)의 윈도우 (22) 쪽으로 좁은 지향성 광선 (18)을 생성시키는 광원 (14)을 포함한다. 다양한 비-제한적 실시양태에서, 상기 광원은 레이저 또는 레이저 다이오드이다. 운반 유체 (30)는 유동 셀 (26)을 통하여 혈액 샘플로부터 개별 세포들을 운반함으로써, 각 개별 세포 (34)가 광선 (18)과 상호작용하는 것을 가능케 한다.
유동 셀 (26)에는, 유동 셀 (26)을 통과하는 세포 (34)에 의해 산란되는 광의 강도를 다양한 각도에서 기록하도록, 다수의 광센서가 인접하여 위치한다. 일 광센서 (38)는 광선 (18)의 경로에 직접 위치한다. 이와 같은 광센서 (38)는 축방향 광 손실 (ALL)을 측정한다. 광선 (18)의 경로로부터 측정될 때 3개의 예정된 각도 범위 이내에서 세포에 의해 산란되는 광을 수집하기 위하여, 3개 광센서 군 (42)(46)(48)이 위치한다. 이들 각도는 적혈구 및 백혈구와 같은 다양한 혈액 성분들을 가장 잘 구별하도록 선택된다. 명칭이 약간 임의적이긴 하지만, 일 실시양태에서, 이들 예정 각도 범위는 각각 10 ° 미만 (저각 광 산란 (LALS)으로 지칭) (광센서 (42)); 약 10 ° 내지 약 20 ° (중저각 광산란 (LMALS)으로 지칭) (광센서 (46)); 약 20 ° 내지 약 42 ° (중상각 광산란 (UMALS)으로 지칭) (광센서 (48)), 그리고 MALS (중각 광산란)으로 지칭되는 UMALS와 LMALS (10 °- 42 °) (각각 (46) 및 (48)) 신호에 대한 검출기의 합계 (47)이다. 이들 검출기로부터의 신호는 프로세서 (미도시)로 전송되어, 디지털화되고 분석된 후, 결과가 디스플레이된다.
광선 (18)에 직접 위치한 센서인 광센서 (38)는 세포 (34)가 광원 (14)과 광센서 (38) 사이의 광선 (18)의 경로를 통과하는 각 시점에 광선 (18)로부터의 광 손실의 양을 측정한다. 이와 같은 ALL은 유동 셀 (26)을 통과하는 세포 또는 입자 (34)의 부피 및 흡광도의 지표이다. 광 손실이 더 클수록, 세포 또는 입자 (34)가 더 크고, 그의 흡광도가 더 크다. 검출된 LALS, LMALS 및 UMALS 광은 입자 또는 세포의 구조에 관한 세부사항을 제공한다.
세포 또는 입자 크기의 또 다른 지표는 유동 셀 (26)의 전극 (52)과 전극 (56) 사이에 흐르는 전류의 양이다. 입자가 유동 셀 (10)의 윈도우 영역 (22)에 진입하게 되면, 세포 또는 입자 (34)가 전류가 흐르는 것을 차단하기 때문에, 전극 (52)과 전극 (56) 사이의 전류는 변화된다. 전류량의 감소는 세포 또는 입자 (34) 크기와 관련된다. 전류는 DC 또는 RF 전원 (미도시)에 의해 각각 공급되는 직류 (DC) 또는 라디오 주파수 (RF) 전류 중 어느 하나일 수 있다. RF 대 DC의 비는 f(RF, DC)의 함수로 주어지며, 불투명도 (opacity)로 지칭된다. 일 실시양태에서, 불투명도는 하기식으로 표현된다:
불투명도 = f(RF/DC)
(식 중, f는 데이터의 변천(shifting) 및 크기조정(scaling)을 처리하는 함수임).
또한, 일부 실시양태에서는, 전류 측정치로부터의 펄스(pulse)가 광검출기로부터의 데이터 수집을 촉발하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 말라리아 감염에는 ALL을 특징으로 하는 입자의 군집이 존재한다는 것을 발견하였다. 이와 같은 ALL은 작은 크기 및 흡광도의 지표이다. ALL에 의해 측정하였을 때 이러한 작은 크기 입자 군집의 존재는 기생충 감염을 암시하는 것이다. 따라서, 용해된 혈액의 샘플에서 단순히 ALL을 측정하는 것에 의한다면, 환자 군집을 스크리닝하는 데에 빠르게 이와 같은 기술을 사용할 수 있다. 도 1b는 말라리아 기생충에 의해 일부가 감염되어 있는 적혈구 슬라이드의 광학현미경사진이다. 말라리아 기생충은 적혈구 내의 짙은 색 입자로 보인다. 용해 과정 후, 기생충은 보존되며, 크기, 밀도, 광 산란 및 흡광도와 같은 용해물 입자의 특성을 측정하는 것에 의해 분명해지게 된다. 기생충은 이와 같은 방식으로 다른 세포 군집으로부터 구별된다.
ALL 단독의 정량적인 검출이 말라리아 감염을 스크리닝하는 데에 사용될 수도 있지만, 말라리아 감염의 정량적 측정은 ALL 및 UMALS를 측정하고, 예를 들면 서로에 대비하여, 값들을 플로팅함으로써 비교하는 것에 의해 계산될 수 있다. 방법의 일 실시양태 (도 2)에서, 환자로부터의 혈액 샘플은 먼저 용해되어 (단계 10) 적혈구가 제거된다.
일 실시양태에서, 용해 단계는 614 μL의 등장성 혈액 희석제인 쿨터(COULTER)® DxH 다일류언트(Diluent)™ (베크만 쿨터(Beckman Coulter), Inc. 사 제품, 플로리다 마이애미 소재)를 사용하여 14 μL의 항응고된 전혈 샘플 (말초 혈액)을 희석함으로써 2 % 용액을 형성시키는 것, 및 일 실시양태에서 희석된 샘플을 125 μL의 용해 시약과 5:1로 혼합하는 것을 포함한다. 용해 시약 첨가 약 9초 후, 샘플 혼합물은 시스액(sheath fluid)인 쿨터® DxH 다일류언트™를 사용하여 유동 셀로 전달된다. 용해 시약의 실시양태는 적혈구를 용해시키기 위한 활성 성분 (일 실시양태에서는, 36 g/L의 도데실트리메틸암모늄 클로리드 (50 % 용액), 3.6 g/L의 테트라데실-트리메틸암모늄 브로미드)을 함유하며, 약 4의 pH를 가지는 수용액이다.
다음에, 샘플은 혈구 분석기에 의해 분석된다 (단계 14). 일 실시양태에서, 상기 혈구 분석기는 베크만 쿨터 DxH800 혈구 분석기로서, 예를 들면 본 출원의 양수인에게 양도되어 있으며 그 전체가 참조로써 개재되는 US 8,094,299호를 참조하라. 상기 분석기는 각 혈액 세포가 유동 셀을 통과할 때 DC 및/또는 RF 전류, 그리고 ALL, LALS, LMALS 및 UMALS를 포함한 몇 가지 광 신호를 측정하도록 구성될 수 있다. 일 실시양태에서, 계수는 ALL 입자의 검출 또는 기타 촉발 수단에 의해 촉발된다 (단계 18). 다음에, 입자는 ALL에 상응하는 입자의 양을 알아내기 위하여 조사된다.
정량을 원할 경우, 일 실시양태에서, 분석기는 ALL 광센서 (38)에 의해 전기 펄스가 생성되는 경우에는 각도별 광 산란 측정치를 수득하고 (단계 18), DC 전류가 입자를 표시하는 경우에는 그렇지 않도록 구성된다. 일 실시양태에서는, UMALS 및 ALL이 측정된 (단계 26) 후, 비교된다 (일 실시양태에서는 플로팅됨) (단계 30). 이와 같은 기술을 사용하면, 새로운 입자 군집 (하기에서 설명되는 바와 같이, 기생충 입자 군집으로 지칭됨)이 구별되어 (단계 34), 분석기에 의해 측정된 다른 군집으로부터 분리된다. 다음에는, 말라리아 감염의 존재 및 중증도를 표시하기 위하여, 기생충 입자 군집의 크기가 측정된다.
일 실시양태에서는, 이와 같은 기생충 입자 군집을 분석기에 의해 측정되는 다른 군집으로부터 구별하는 것을 돕기 위하여, UMALS 측정치가 군집의 측정 전에 비-선형 함수를 사용하여 변형된다 (단계 38). 변형된 값은 회전된 UMALS (RUMALS)로 지칭되며, f(DC, UMALS)의 함수로 주어진다. 일 실시양태에서, RUMALS는 하기의 식으로 표현된다:
RUMALS = (C)ARCTAN(DC/UMALS)
(식 중, (C)는 크기조정 인자이고, (DC)는 DC 전류 값임). 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 다른 유형의 변형들이 동일한 효과를 달성하는 데에 사용될 수도 있다.
이와 같은 아크탄젠트(arctangent) 함수는 해당 물리량의 변형 함수에 비례하는 DC/UMALS 비 값의 대수 압축을 야기함으로써, DC 전류 값 및 UMALS 값에 의해 표시되는 바와 같은 부피 측정치의 상관해제를 시도한다. 이와 같은 변형의 결과는 도 3a에 나타낸 바와 같은 감염된 개체에 대해 ALL에 대비한 RUMALS의 그래프로 나타난다. 기생충 입자 군집은 플롯의 저부-좌측 구석에 나타나 있다. 이는 비-감염 개체로부터의 샘플의 ALL 플롯에 대비하여, 플로팅된 RUMALS (도 3b)의 저부-좌측 영역과 대비된다. 이와 같은 플롯의 저부-좌측 구석은 거의 비어 있다.
또 다른 실시양태에서는, UMALS 대신 LALS 측정치가 사용된다. 일 실시양태에서는, 이와 같은 기생충 입자 군집을 분석기에 의해 측정되는 다른 군집으로부터 구별하는 것을 돕기 위하여, LALS 측정치가 군집의 측정 전에 비-선형 함수를 사용하여 변형된다. 또 다른 실시양태에서는, UMALS와 관련하여 나타낸 바와 같은 ARCTAN 함수 및 LALS 측정치를 사용하여 LALS 측정치가 변형될 수 있다. 이와 같은 변형 값은 회전된 LALS (RLALS)로 지칭되며, f(DC, LALS)의 함수로 주어진다. 일 실시양태에서, RLALS는 하기의 식으로 표현된다:
RLALS = (C)ARCTAN(DC/LALS)
(식 중, (C)는 비례 상수이고, (DC)는 DC 전류임). 감염 및 비-감염 개체에서의 이와 같은 측정 및 변형의 결과를 각각 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 다른 유형의 변형들이 동일한 효과를 달성하는 데에 사용될 수도 있다.
또 다른 실시양태에서는, LAMLS와 UMALS의 합계인 MALS 측정치가 사용된다. 일 실시양태에서는, 기생충 입자 군집을 분석기에 의해 측정되는 다른 군집으로부터 구별하는 것을 돕기 위하여, MALS 측정치가 군집의 측정 전에 비-선형 함수를 사용하여 변형된다. 이와 같은 변형 값은 회전된 MALS (RMALS)로 지칭되며, f(DC, MALS)의 함수로 주어진다. 일 실시양태에서, RMALS는 하기의 식으로 표현된다:
회전된 MALS = f(log(MALS)/DC)
(식 중, f는 데이터의 변천 및 크기조정을 처리하는 함수임). 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 다른 유형의 변형들이 동일한 효과를 달성하는 데에 사용될 수도 있다.
새로운 군집은 RBC 혈구의 용해 과정 후, 기생충 및 기생된 적혈구가 유지되고, 검출되는 특성으로 인하여 고유 영역에서 다른 세포 유형 예컨대 백혈구, 유핵 적혈구, 잔재물, 혈소판, 및 기타 세포 구성요소들로부터 구별되기 때문에 기생충 입자 군집으로 지칭된다. 말라리아 감염에서 나타나는 이와 같은 기생충 입자 군집은 ALL 측정치를 특징으로 하며, UMALS, LALS 또는 DC 전류 중 1종 이상의 추가적인 측정 파라미터를 사용하여 추가적으로 구별 또는 계수될 수 있다.
기생충 입자 군집의 정량은 두 가지 추가적인 계산이 이루어지는 것을 가능케 한다. 첫 번째는 "기생충_입자 군집%"으로 지칭되는데, 백혈구 계수에 대하여 표준화된 기생충 입자 양의 상대적인 척도이다. 상기 파라미터는 하기 방정식으로 표현된다:
기생충_입자_군집% = (기생충_입자 군집 사례 계수/WBC 사례 계수) 100 %
두 번째 파라미터인 말라리아 농도 계수 (CMC) (또는 기생충 농도 계수)는 μL 당으로 나타낸 기생충 입자 군집의 절대 계수로 계산된다.
감염 샘플로부터 비-감염 샘플을 구별하는 파라미터의 능력을 평가하기 위하여, 2회의 연구로써 상기 2종의 새로운 파라미터인 CMC 및 기생충 입자 군집%의 능력을 평가하였다. AUC 값이 1에 가까울수록 더 우수한 구별자(discriminator)인 곡선하 면적 (AUC) 통계 기술을 사용하여, 139개가 정상이고 89개가 감염 샘플인 일 연구에서는 기생충_입자_군집%에 대해 0.98의 AUC 값, 및 CMC에 대해 0.98의 AUC 값을 나타내었다. 동일한 89개의 감염 샘플 및 1680개의 정상 또는 비-감염 샘플의 두 번째 연구에서는 기생충_입자_군집%에 대하여 0.94의 AUC 값, 및 CMC에 대하여 0.96의 AUC 값을 나타내었다. 따라서, 양 연구는 상기 2종의 파라미터가 말라리아 기생충 감염의 우수한 구별자라는 것을 보여주었다.
결과적으로, 양 파라미터는 치료의 효능을 추적하는 데에 사용될 수 있다. 도 5 및 도 6은 말라리아에 대하여 치료중인 환자에서의 기생충 존재량의 수동 계수 (다이아몬드)와 비교하여 시간 경과에 따른 CMC (사각형) (도 5a 및 도 6a) 및 RBC_잔재물% (사각형) (도 5b 및 도 6b)의 감소를 추적하고 있다. 볼 수 있는 바와 같이, CMC 및 RBC_잔재물%의 값은 기생충 존재량의 수동 측정을 매우 우수하게 추적한다. 치료가 4일의 치료 기간에 걸쳐 거의 100-배의 기생충 감염 감소를 유도한다는 것 역시 볼 수 있다.
실시예
일 실시양태에서는, 베크만 쿨터 DxH800™ 혈구 분석기 (베크만 쿨터 사, 캘리포니아 브레아 소재)을 사용하여, 1761개의 온혈구 계수(complete blood cell count) (CBC) 샘플을 분석하였다 (문헌 [Sensitive detection and accurate monitoring of Plasmodium vivax parasites on routine complete blood count using automatic blood analyzer (DxH800™), H.K. Lee et al, Int . Jnl . Lab . Hem. 24, 201-207] 참조). 상기 샘플들에는 52명의 피. 비박스 (P. vivax ) 말라리아 환자로부터의 123개 혈액 샘플, 1504개의 비-말라리아 샘플, 및 정상적인 건강 대상체로부터의 134개 샘플이 포함되었다. 상기 비-말라리아 샘플에는 백혈구감소증에 걸린 환자로부터의 509개 혈액 샘플이 포함되었다. 말라리아 혈액 샘플은 27명의 환자에서 진단 시점에 1회, 그리고 25명의 환자에서 2 내지 6회 채취하였다. 말라리아 감염의 진단은 현미경 조사에 의해 이루어졌다.
유핵 적혈구 (nRBC)의 산란 플롯을 스크리닝하여 말라리아 신호를 검출하였다. 피. 비박스 신호가 검출된 경우, 5개의 상이한 산란 플롯을 재검토하여, 샘플 중 말라리아 성분을 세포 잔재물로부터 구별하였다. 도 7a 및 도 7b는 말라리아에 걸린 환자로부터의 혈액 샘플에 대한 nRBC 스크리닝 플롯 (ALL에 대하여 플로팅된 각각 RLALS 및 RUMALS)을 도시하는 것으로써, 말라리아 군집 (화살표로 표시), 그리고 nRBC 및 백혈구를 도시하고 있다. 도 7c는 ALL에 대한 1-차원 막대그래프를 포함하여, 피. 비박스에 감염된 환자로부터의 혈액 샘플에 대한 RUMALS 및 ALL의 산란 플롯이다. 최소값에 대하여 최고 값을 비교함으로써, 별도의 군집들을 구별할 수 있다.
샘플에서 일단 말라리아 세포가 검출되고 나면, 5부분 구별 플롯 (5PD 플롯) (도 7d 및 도 7e)에 샘플을 적용함으로써, 다른 세포로부터 말라리아 군집 (역시 화살표로 나타내었음)을 추가적으로 구별하였다. 상기 5PD 플롯은 5종의 주요 군집인 림프구 (LY), 단핵구 (MO), 호중구 (NE), 호산구 (EO) 및 호염기구 (BA)와, 또한 비-백혈구 군집을 구별할 수 있다. 5 PD 플롯은 5PD1 및 5PD2로 지정된다. 도 7d에 나타낸 바와 같이, 5PD1에서는, 부피 (V)에 대비하여, 회전된 광 산란 (RLSn) (x-축을 따라 도시됨)의 디스플레이가 플로팅된다. 이와 같은 실시예에서 사용되는 회전된 광 산란은 회전된 중각 광 산란 (RMALS)이다. 도 7e에 나타낸 바와 같이, 5PD2에서, 디스플레이는 y-축을 따라 도시된 부피 V에 대비한 x-축을 따라 도시된 불투명도 (OP)이다. 상기 5부분 구별 산란 플롯은 세포 잔재물로부터 말라리아 입자를 구별하는 것을 돕는다.
도 8a, 도 8b 및 도 8c는 항-말라리아 요법을 사용하여 치료중인 말라리아 환자로부터의 RLALS 대 ALL 산란 플롯을 도시한다. 최초 혈액 샘플은 664개의 기생충/μl을 함유하였는데, 도 8a는 말라리아 구성요소 (화살표)를 나타낸다. 치료 2일 후, 말라리아 기생충의 농도는 도 8b의 말라리아 군집이 나타내는 바와 같이 86개의 기생충/μl로 감소되었다. 치료 12일 후에는, 기생충의 농도가 0이었으며, 도 8c에서 군집이 사라졌다. 통상적인 현미경 조사 역시 12일 후에는 말라리아 기생충을 검출하는 데에 실패하였다.
따라서, 이전의 단락에서 논의된 바와 같이, 상기 기술로부터 파생되는 한 가지 척도는 피. 비박스 신호의 크기가 기생충 존재량과 상관된다는 것이다. 따라서, 기생충의 수를 계수하고, 그로부터 단위 부피 당 기생충의 수로써 기생충 존재량의 계수를 유도하는 것이 가능하다. 결과적으로, 치료의 결과를 적극적으로 추적할 수 있으며, 항-말라리아제를 사용한 치료의 결과를 더 정확하게 예상할 수 있다.
본 연구는 이와 같은 세포측정 기술이 혈액 기생충을 저렴하고도 신속하게 시험하고 질환의 치료를 모니터링하는 데에 사용될 수 있다는 것을 보여주었다. 52개의 말라리아 샘플 전체 (100 %)가 nRBC 산란 플롯에서 특이적인 특징을 나타내었으며, 용이하게 확인되었다. 1509개 샘플 중 하나 (.07 %)가 이례적인 신호를 나타내었는데, 5PD (5부분 구별) 플롯을 수행함으로써 말라리아 감염의 결과가 아닌 것으로 용이하게 판명되었다.
따라서, 방법의 감도는 100 %이었으며, 특이성 역시 100 %이어서, 그것을 매우 강력한 기술이 되도록 하였다. 이와 같은 실시예에서의 실험 데이터 대부분이 피. 비박스 말라리아 감염에 관한 것이기는 하지만, 본 기술이 피. 팔시파룸과 같은 다른 말라리아 기생충의 존재 역시 검출하게 될 것이라는 것도 주목해야 한다 (도 9a 및 도 9b).
본 발명의 도면 및 상세한 설명이 본 발명의 더 확실한 이해를 위하여 관련되는 요소들을 예시하도록 단순화되었다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 업계 일반의 숙련자라면, 다양한 다른 요소들이 바람직한 것일 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 그러나, 그와 같은 요소들은 업계에 잘 알려져 있으며, 그것이 본 발명의 더 우수한 이해를 용이하게 하는 것은 아니기 때문에, 그와 같은 요소들에 대한 논의는 본원에서는 제공되지 않는다. 도면은 해석용 도면이 아니라 예시 목적으로 제공된 것이라는 것을 알아야 한다. 생략된 세부사항 및 변형 또는 대안적인 실시양태들은 업계 일반 숙련자의 영역에 속한다.
본 발명의 소정 측면에서는, 구성요소 또는 구조를 제공하거나, 또는 주어진 기능 또는 기능들을 수행하기 위하여, 단일 구성요소가 다수의 구성요소로 대체될 수 있으며, 다수의 구성요소가 단일 구성요소로 대체될 수 있다는 것을 알 수 있다. 그와 같은 치환이 본 발명의 소정 실시양태를 실시하는 데에 효과적이지 않은 경우가 아니라면, 그와 같은 치환은 본 발명의 영역에 속하는 것으로 간주된다.
본원에서 제공되는 실시예들은 본 발명의 가능성 및 구체적인 실행을 예시하고자 하는 것이다. 실시예들은 업계 숙련자에 대한 본 발명의 예시 목적을 우선적으로 의도한 것임을 알 수 있다. 본 발명의 기술사상에서 벗어나지 않고도, 본원에서 기술되는 해당 도표 또는 작업에 대한 변종들이 존재할 수 있다. 예를 들면, 소정의 경우에서는, 방법 단계 또는 작업이 다른 순서로 수행 또는 실행될 수 있거나, 또는 작업이 첨가, 생략 또는 변형될 수 있다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시양태가 본원에서는 그것을 제한하려는 목적이 아니라 본 발명을 예시하려는 목적으로 기술되었으므로, 업계 일반의 숙련자라면, 청구범위에 기술되어 있는 바와 같은 본 발명으로부터 벗어나지 않고도, 본 발명의 원리 및 영역 내에서 요소, 단계, 구조 및/또는 부품의 세부사항, 재료 및 배열에 관한 수많은 변종들이 구성될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
업계 일반의 숙련자에 의해서라면, 청구되어 있는 바와 같은 본 발명의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않고도 본원에서 기술되는 것의 변종, 변형 및 다른 실행이 이루어질 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 전기의 예시적인 상세한 설명에 의하는 대신, 하기하는 청구범위의 기술사상 및 영역에 의해 한정되어야 한다.
Claims (26)
- a) 혈액 샘플을 용해 시약과 혼합하여 적혈구를 용해시키는 단계;
b) 입자 분석기를 통과하는 용해된 혈액 샘플 중 입자에 의해 야기되는 광원으로부터의 광 손실을 측정하여, 축방향 광 손실 측정치를 수득하는 단계; 및
c) 컴퓨터를 사용하여, 축방향 광 손실 측정치에 따라 용해된 혈액 샘플에서 다른 군집으로부터 기생충 입자 군집을 구별하는 단계
를 포함하는, 혈액 샘플에서의 기생충 입자 군집의 검출 방법. - 제1항에 있어서, 입자 분석기를 통과하는 용해된 혈액 샘플 중 입자에 의해 야기되는 광원으로부터 산란되는 광을 측정하여, 광 산란 측정치를 수득하는 것, 및 컴퓨터를 사용하여, 광 산란 측정치 및 축방향 광 손실 측정치에 따라 용해된 혈액 샘플에서 기생충 입자 군집을 구별하는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 구별되는 기생충 입자 군집이 말라리아 기생충에 의해 감염된 세포를 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서,
a) 기생충 입자 군집의 해당 입자를 계수하여, 기생충 농도의 계수를 측정하는 것; 및
b) 기생충 농도의 계수를 기생충 감염에 상응하는 계수로 기록하는 것
을 추가적으로 포함하는 방법. - 제4항에 있어서, 항-말라리아 약물을 사용한 치료 동안 수득되는 환자 혈액의 샘플에서 기생충 농도를 주기적으로 측정함으로써 치료의 효과성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서, 1회 이상의 광 산란 측정이 중상각 광 산란 측정인 방법.
- 제2항에 있어서, 구별이
a) 컴퓨터를 사용하여, 측정된 1회 이상의 광 산란 측정치와 측정된 축방향 광 손실 측정치를 비교하는 것, 및
b) 비교에 의해 표시되는 각 군집을 동기화(gating)함으로써, 기생충 입자 군집을 검출하는 것
을 포함하는 방법. - 제7항에 있어서,
a) 컴퓨터를 사용하여, 기생충 입자 군집의 해당 입자를 계수함으로써 제1 수를 측정하는 것;
b) 컴퓨터를 사용하여, 다른 입자 군집의 해당 입자를 계수함으로써 제2 수를 측정하는 것; 및
c) 기생충 감염의 지표로서 제1 수 및 제2 수를 포함하는 분율을 기록하는 것
을 추가적으로 포함하는 방법. - 제2항에 있어서, 기생충 입자 군집이 각 백혈구 군집보다 더 낮은 값의 상기 1회 이상 광 산란 측정치, 및 더 낮은 값의 상기 축방향 광 손실 측정치를 가지는 방법.
- 제2항에 있어서, 구별이
a) 상기 1회 이상 광 산란 측정치, 축방향 광 손실 측정치, 및 해당 입자 측정 동안 수득되는 제3의 측정치를 비교하는 것, 및
b) 비교에 의해 표시되는 각 군집을 동기화함으로써, 기생충 입자 군집을 검출하는 것
을 포함하는 방법. - 제10항에 있어서, 제3 측정치가 직류 (DC) 측정치인 방법.
- 제1항에 있어서, 컴퓨터를 사용하여, 혈액 샘플에 대한 5PD 플로팅을 수행함으로써 다른 질환으로부터 기생충 감염을 구별하는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
- a) 혈액 샘플을 용해 시약과 혼합하여 적혈구를 용해시키는 단계;
b) 입자 분석기에서 용해된 혈액 샘플 중 입자를 측정하여, 입자에 의해 광원으로부터 산란된 광의 광 산란 측정치, 입자에 의해 야기되는 광원으로부터의 광 강도 감소인 축방향 광 손실 측정치, 및 각 입자의 부피 측정치를 수득하는 단계;
c) 컴퓨터를 사용하여, 1회 이상 광 산란 측정치 및 축방향 광 손실 측정치를 바탕으로, 용해된 혈액 샘플에서 기생충 입자에 상응하는 제1 입자 군집을 구별하는 단계;
d) 컴퓨터를 사용하여, 부피 측정치를 바탕으로, 해당 기생충 입자에 의해 영향을 받은 백혈구에 상응하는 제2 입자 군집을 구별하는 단계; 및
e) 확인된 제1 및 제2 입자 군집에 따라 기생충 감염을 기록하는 단계
를 포함하는, 혈액 샘플을 사용한 기생충 입자의 검출 방법. - 제13항에 있어서, 제2 입자 군집을 확인하는 것이 추가적으로 제2 입자 군집에 의해 야기되는 광 산란의 측정치를 바탕으로 하는 방법.
- a) 혈액 샘플 중 비감염 적혈구를 용해시키는 단계;
b) 용해된 혈액 샘플로 광선을 통과시키는 단계;
c) 기생충 입자 군집에 의해 야기되는 바와 같은 광선으로부터의 축방향 광 손실을 측정하는 단계;
d) 측정된 축방향 광 손실에 따라 기생충 입자 군집의 크기를 측정하는 단계
를 포함하는, 적혈구에서의 기생충 검출 방법. - 제15항에 있어서,
a) 광선의 방향으로부터 측정하였을 때 예정된 각도 범위 이내에서 샘플 중 입자에 의해 산란되는 광을 측정하는 단계;
b) 입자에 대한 축방향 광 손실에 대비하여, 광선의 방향으로부터 측정하였을 때 예정된 각도 범위 이내에서 입자에 의해 산란되는 광을 비교하는 단계; 및
c) 상기 비교로부터 감염된 세포의 군집을 측정하는 단계
를 추가적으로 포함하는 방법. - 제16항에 있어서, 항-말라리아 약물을 사용한 치료 동안 수득되는 환자 혈액의 샘플에서 기생충 농도를 주기적으로 측정함으로써 치료의 효과성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
- 제15항에 있어서, 기생충 입자 군집의 입자 수 계수를 백혈구 수의 계수로 나누는 방법.
- a) 적혈구를 용해시키기 위한 용해 용액;
b) 각 용해된 적혈구의 축방향 광 손실 측정치를 수득하기 위한 입자 분석기; 및
c) 축방향 광 손실 측정치로부터 기생충 입자의 군집을 측정하는 컴퓨터
를 포함하며, 더 낮은 축방향 광 손실 측정치의 존재가 기생충 군집 입자의 지표가 되는, 혈액 샘플 중 기생충 입자 군집의 검출 시스템. - 제19항에 있어서, 입자 분석기가 광 산란 측정치를 수득하고, 컴퓨터가 광 산란 측정치를 축방향 광 손실 측정치와 비교하여 기생충 입자의 군집을 측정하는 시스템.
- 제20항에 있어서, 광 산란 측정이 20 내지 45도 사이에서 이루어지는 시스템.
- 제19항에 있어서, 기생충 군집 계수의 측정으로부터 혈액 샘플 중 기생충 농도를 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 시스템.
- 제22항에 있어서, 혈액 샘플 공급원에서의 항-기생충 약물 치료의 효과성을 측정하기 위하여, 주기적으로 추가적인 혈액 샘플을 채취하여 기생충 농도를 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 시스템.
- 제19항에 있어서, 혈액 샘플에 대한 5PD 플로팅을 수행함으로써 또 다른 질환으로부터 기생충 감염을 구별하는 단계를 추가적으로 포함하는 시스템.
- a) 혈액 샘플을 용해 시약과 혼합하여 적혈구를 용해시키는 단계;
b) 입자 분석기에서 용해된 혈액 샘플 중 입자를 측정하여, 입자에 의해 광원으로부터 산란된 광의 광 산란 측정치를 수득하는 단계;
c) 입자 분석기에서 용해된 혈액 샘플 중 입자를 측정하여, 입자의 부피 측정치를 수득하는 단계;
d) 컴퓨터를 사용하여, 광 산란 측정치 및 부피 측정치에 따라, 용해된 혈액 샘플에서 기생충 입자에 상응하는 제1 입자 군집을 구별하는 단계;
e) 컴퓨터를 사용하여, 광 산란 측정치 및 부피 측정치에 따라, 용해된 혈액 샘플에서 백혈구 입자에 상응하는 제2 입자 군집을 구별하는 단계; 및
f) 확인된 제1 및 제2 입자 군집에 따라 기생충 감염을 기록하는 단계
를 포함하는, 혈액 샘플을 사용한 기생충 입자의 검출 방법. - a) 혈액 샘플을 용해 시약과 혼합하여 적혈구를 용해시키는 단계;
b) 입자 분석기에서 용해된 혈액 샘플 중 입자를 측정하여, 입자 불투명도의 측정치를 수득하는 단계;
c) 입자 분석기에서 용해된 혈액 샘플 중 입자를 측정하여, 입자의 부피 측정치를 수득하는 단계;
d) 컴퓨터를 사용하여, 불투명도 측정치 및 부피 측정치에 따라, 용해된 혈액 샘플에서 기생충 입자에 상응하는 제1 입자 군집을 구별하는 단계;
e) 컴퓨터를 사용하여, 불투명도 측정치 및 부피 측정치에 따라, 용해된 혈액 샘플에서 백혈구 입자에 상응하는 제2 입자 군집을 구별하는 단계; 및
f) 확인된 제1 및 제2 입자 군집에 따라 기생충 감염을 기록하는 단계
를 포함하는, 혈액 샘플을 사용한 기생충 입자의 검출 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161486059P | 2011-05-13 | 2011-05-13 | |
| US61/486,059 | 2011-05-13 | ||
| PCT/US2012/037830 WO2012158638A1 (en) | 2011-05-13 | 2012-05-14 | Method and apparatus for diagnosing blood parasites |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140050606A true KR20140050606A (ko) | 2014-04-29 |
Family
ID=46229912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020137030079A KR20140050606A (ko) | 2011-05-13 | 2012-05-14 | 혈액 기생충을 진단하기 위한 방법 및 장치 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20140050606A (ko) |
| CN (1) | CN103620386A (ko) |
| WO (1) | WO2012158638A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE537208C2 (sv) | 2012-12-03 | 2015-03-03 | Tommy Forsell | Blodanalysapparat för malariaanalys |
| JP6383216B2 (ja) * | 2014-08-08 | 2018-08-29 | シスメックス株式会社 | 血液分析方法、血液分析装置およびプログラム |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR970007077B1 (ko) * | 1987-03-13 | 1997-05-02 | 코울터 일렉트로닉스 인커퍼레이티드 | 광산란 기술을 이용한 다중-부분식별 분석 방법 |
| GB2270752B (en) * | 1992-09-16 | 1996-04-10 | Azim Fazal | Diagnostic method |
| CN100467067C (zh) * | 2002-05-09 | 2009-03-11 | 厄尔特拉斯特有限责任公司 | 增强造影或方便超声、内镜和其它医学检查的介质 |
| JP4644244B2 (ja) | 2004-02-27 | 2011-03-02 | ベックマン コールター， インコーポレイテッド | マラリア原虫その他の寄生虫の感染を検出する方法 |
| JP2005333868A (ja) * | 2004-05-26 | 2005-12-08 | Sysmex Corp | マラリア原虫測定方法及び測定装置 |
| CN101438143B (zh) * | 2005-04-29 | 2013-06-12 | 霍尼韦尔国际公司 | 血细胞计数器细胞计数和尺寸测量方法 |
| JP2007024844A (ja) * | 2005-07-21 | 2007-02-01 | Sysmex Corp | 血液分析方法及び血液分析装置 |
-
2012
- 2012-05-14 KR KR1020137030079A patent/KR20140050606A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-05-14 WO PCT/US2012/037830 patent/WO2012158638A1/en active Application Filing
- 2012-05-14 CN CN201280023830.5A patent/CN103620386A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103620386A (zh) | 2014-03-05 |
| WO2012158638A1 (en) | 2012-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5711801B2 (ja) | 赤血球中に含まれるヘモグロビンの固有色素を利用して血液試料の赤血球指数を決定するための方法及び装置 | |
| JP5184697B2 (ja) | 血小板を個々に、及び凝集塊として検出及び計数するための方法及び装置 | |
| JP4911601B2 (ja) | 有核赤血球細胞の計測方法 | |
| US9588102B2 (en) | Method and apparatus for determining white blood cell counts | |
| JP5671517B2 (ja) | 蛍光消光及び／又は蛍光退色を用いて個々の細胞又は粒状物質を分析するための方法及び装置 | |
| US10222320B2 (en) | Identifying and enumerating early granulated cells (EGCs) | |
| JP4644244B2 (ja) | マラリア原虫その他の寄生虫の感染を検出する方法 | |
| KR20150103005A (ko) | 미성숙 혈소판 계수 시스템 및 방법 | |
| KR101991989B1 (ko) | 응괴 조정을 갖는 혈소판 카운트를 위한 시스템들 및 방법들 | |
| KR20150091049A (ko) | Cpd 데이터를 이용한 결핵 선별검사 | |
| Krämer et al. | Relative frequency of malaria pigment‐carrying monocytes of nonimmune and semi‐immune patients from flow cytometric depolarized side scatter | |
| JP6189743B2 (ja) | 血中フィラリア幼虫の検出方法、血液分析装置、及びコンピュータプログラム | |
| KR20140050606A (ko) | 혈액 기생충을 진단하기 위한 방법 및 장치 | |
| Yoon et al. | Evaluation of the LH780 hematology analyzer for detection and therapeutic monitoring of malaria: cross-reactivity with nucleated RBCs | |
| Nishimura et al. | The utility of a three part differential hematology analyzer with CRP for assessing malaria | |
| WO2023125942A1 (zh) | 血液细胞分析仪、方法以及感染标志参数的用途 | |
| WO2023125988A1 (zh) | 血液细胞分析仪、方法以及感染标志参数的用途 | |
| WO2023125940A1 (zh) | 血液细胞分析仪、方法以及感染标志参数的用途 | |
| KR101902433B1 (ko) | 뇌척수액으로부터 세포를 검출하는 장치 및 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |