JP6692743B2 - 白血球を分析するための試薬、システム、及び方法 - Google Patents
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相互参照
本出願は、２０１３年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／７７７，９６６号の利益を主張するものであり、この出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１３年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／７７７，９６６号の利益を主張するものであり、この出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
自動血液分析装置を用いる全血試料内の白血球（ＷＢＣ）の正確な計数及び分類は、必要不可欠な診断手順である。ＷＢＣ分析は、典型的に、同時に、全血の試料内の赤血球（ＲＢＣ、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ））を溶解してＷＢＣを保存することによって達成される。１つ以上のＷＢＣ試薬は、典型的に、現代の血液分析装置においてこれらの機能を実施し、ＷＢＣの分析を円滑にするために必要とされている。
ＷＢＣ計数及び差別化の質は、分析を実施するために使用される方法及び関連付けられる試薬に大いに依存している。頑強なＷＢＣ分析試薬を配合することは、血液産業において上位の課題のうちの残された１つを有する。原理上は、頑強なＷＢＣ試薬は、正確なＷＢＣ分析をもたらす。理想的には、高度に配合されたＷＢＣ試薬は、（１）典型的には約３０秒以下の時間枠内で、標準的な条件下での赤血球（ＲＢＣ）の完全な溶解、（２）大きいＲＢＣ断片のより小さい小片への分解または可溶、及び（３）ＷＢＣが正確に計数され適切に分類され得るようにＲＢＣ溶解プロセスからのＷＢＣの保護、を円滑にするべきである。
血液試料が不十分に溶解された場合、次いで、非常に小さい割合または濃度、またはより大きいＲＢＣ断片であっても、従来のＷＢＣ分析技術を用いてリンパ球（最小のＷＢＣ）からＲＢＣまたはより大きいＲＢＣ断片を分離または差別化することが困難であるため、未溶解ＲＢＣは、ＷＢＣ分析を妨げ得る。血液試料が過剰に溶解された場合、次いで、ＷＢＣの分類は、ＷＢＣの細胞膜への過度の損傷によって大いに影響され得る。したがって、これらの目的を達成できる改善したＷＢＣ分析試薬、システム、及び方法が必要とされている。
本発明の態様は、試料内の白血球（ＷＢＣ）及びＷＢＣ亜集団を識別、分類、及び／または定量するように全血の試料を分析するために使用され得るＷＢＣ分析試薬、システム、及び方法を含む。本開示のＷＢＣ分析試薬は、一般的に、少なくとも１つの膜透過性蛍光色素、ＷＢＣ保護試薬、及び界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ試薬は、ＷＢＣ試薬のモル浸透圧濃度を所望の範囲に調整するために好適な量のモル浸透圧濃度調整成分を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、自動血液分析装置を用いた白血球（ＷＢＣ）分析の実施のための方法を提供し、その方法は、（ａ）ＷＢＣ分析試薬が、試料中の複数の核含有細胞を標識する膜透過性蛍光色素と、血液分析装置を用いて分析した場合、複数のＷＢＣ亜集団を互いに分離するモル浸透圧濃度調整成分と、を含む、ＷＢＣ分析試薬を用いて全血の試料を希釈することと、（ｂ）約３０℃〜約５０℃の範囲の温度で、約２５秒未満のインキュベーション時間にわたってステップ（ａ）の希釈された血液試料をインキュベートすることと、（ｃ）ステップ（ｂ）からのインキュベートされた試料を血液分析装置内のフローセルに送達することと、（ｄ）インキュベートされた試料がフローセルを横切るときに、ステップ（ｃ）からのインキュベートされた試料を励起源で励起させることと、（ｅ）励起した試料から複数の光散乱信号及び少なくとも１つの蛍光放射信号を収集することと、（ｆ）少なくとも１つの蛍光放射信号に基づいて、蛍光閾値を満たさない希釈された血液試料内のいずれの粒子も考慮から除去しつつ、ステップ（ｅ）で収集される全ての信号に基づいてＷＢＣ差異分析を実施することと、を含む。
いくつかの実施形態では、励起源は、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、蛍光放射信号は、バンドパスフィルタまたはロングパスフィルタによって約３６０ｎｍ〜約７５０ｎｍの波長で収集される。いくつかの実施形態では、膜透過性蛍光色素は、アクリジンオレンジ、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ １２、またはＳＹＴＯ １４である。いくつかの実施形態では、試薬中の膜透過性蛍光色素の濃度は、約０．０００１％〜最大約０．０００５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬中の膜透過性蛍光色素の濃度は、約０．０１μＭ〜最大約１５μＭの範囲である。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度調整成分は、塩化アンモニウムまたは塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度調整成分の濃度は、約０．１％〜最大約０．５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、ＷＢＣ保護剤を更に含む。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ保護剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブトキシエタノール、フェノキシエタノール、またはイソプロピルアルコールである。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ保護剤の濃度は、約０．１％〜最大約１．０％の範囲である。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、界面活性剤を更に含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、サポニンである。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜最大約０．０５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、ｐＨ緩衝成分を更に含む。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝成分は、酢酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝成分の濃度は、約０．０１％〜最大約０．５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、抗菌剤を更に含む。いくつかの実施形態では、抗菌剤は、プロクリンである。いくつかの実施形態では、抗菌剤の濃度は、約０．０１％〜最大約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬のｐＨは、約２．５〜最大約１２．５ｐＨ単位の範囲である。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬のモル浸透圧濃度は、約２５〜最大約３５０ｍＯｓｍの範囲である。
いくつかの実施形態では、本開示は、全血の試料に白血球（ＷＢＣ）差異分析を行うためのシステムを提供し、そのシステムは、（ａ）血液試料内の粒子を励起させるように位置付けされた励起源と、（１）励起された血液試料から軸方向光損失を測定するように位置付けられた軸方向光損失検出器、（２）励起された血液試料から中間角度散乱を測定するように位置付けられた中間角度散乱検出器、（３）励起された血液試料から大角度偏光側方散乱を測定するように位置付けられた偏光側方散乱検出器、（４）励起された血液試料から大角度偏光解消側方散乱を測定するように位置付けられた偏光解消側方散乱検出器、及び（５）励起された血液試料から放射された蛍光を測定するように位置付けられた蛍光検出器、を含む、複数の検出器と、（Ｉ）複数の検出器から（１）軸方向光損失、（２）中間角度散乱、（３）大角度偏光側方散乱、（４）大角度偏光解消側方散乱、及び（５）蛍光の測定値を受け取り、（ＩＩ）全ての５つの測定値に基づいて、蛍光閾値を超える蛍光を放射する粒子について、血液試料のＷＢＣ差異分析を実施することと、を行うように構成されるプロセッサと、を備える、血液分析装置と、（ｂ）試料内のＷＢＣを分析するための試薬であって、膜透過性蛍光色素とモル浸透圧濃度調整成分とを含み、膜透過性蛍光色素の濃度が、血液分析装置を用いて、核を含有する試料内の１つ以上の細胞の識別を容易にするのに十分であり、モル浸透圧濃度調整成分の濃度が、血液分析装置を用いて、試料内のＷＢＣの複数の亜集団の識別を容易にするのに十分である、試薬と、を含む。
いくつかの実施形態では、膜透過性蛍光色素は、アクリジンオレンジ、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ １２、またはＳＹＴＯ １４である。いくつかの実施形態では、試薬中の膜透過性蛍光色素の濃度は、約０．０００１％〜最大約０．０００５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬中の膜透過性蛍光色素の濃度は、約０．０１μＭ〜最大約１５μＭの範囲である。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度調整成分は、塩化アンモニウムまたは塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度調整成分の濃度は、約０．１％〜最大約０．５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、ＷＢＣ保護剤を更に含む。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ保護剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブトキシエタノール、フェノキシエタノール、またはイソプロピルアルコールである。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ保護剤の濃度は、約０．１％〜最大約１．０％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、界面活性剤を更に含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、サポニンである。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜最大約０．０５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、ｐＨ緩衝成分を更に含む。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝成分は、酢酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝成分の濃度は、約０．０１％〜最大約０．５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、抗菌剤を更に含む。いくつかの実施形態では、抗菌剤は、プロクリンである。いくつかの実施形態では、抗菌剤の濃度は、約０．０１％〜最大約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬のｐＨは、約２．５〜最大約１２．５ｐＨ単位の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬のモル浸透圧濃度は、約２５〜最大約３５０ｍＯｓｍの範囲である。
いくつかの実施形態では、プロセッサは、蛍光閾値を満たさないいずれの粒子も考慮から除去するように、受け取られた測定値を事前選別するように更に構成される。いくつかの実施形態では、軸方向光損失検出器は、０°散乱で軸方向光損失を測定する。いくつかの実施形態では、中間角度散乱検出器は、約３°〜約１５°で光角度散乱を測定する。いくつかの実施形態では、複数の検出器は、１つ以上の光電子増倍管を含む。いくつかの実施形態では、励起源は、レーザである。いくつかの実施形態では、レーザは、蛍光色素に対応する波長で光を放射する。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、励起源に対応するように選択される。
いくつかの実施形態では、システムは、試薬を用いて血液試料を希釈するためのインキュベーションサブシステムを更に含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションサブシステムは、約２５秒未満である時間にわたり試薬を用いて血液試料をインキュベートするように構成される。いくつかの実施形態では、インキュベーションサブシステムは、約１７秒未満である時間にわたり試薬を用いて血液試料をインキュベートするように構成される。いくつかの実施形態では、インキュベーションサブシステムは、約９秒未満である時間にわたり試薬を用いて血液試料をインキュベートするように構成される。いくつかの実施形態では、インキュベーションサブシステムは、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度で試薬を用いて血液試料をインキュベートするように構成される。いくつかの実施形態では、インキュベーションサブシステムは、約４０℃の温度で試薬を用いて血液試料をインキュベートするように構成される。
いくつかの実施形態では、本開示は、血液分析装置を用いて全血の試料内の白血球（ＷＢＣ）を分析するための試薬を提供し、その試薬は、血液分析装置を用いて、核を含有する試料内の複数の細胞の識別を容易にするために十分な濃度中の膜透過性蛍光色素と、血液分析装置を用いて、試料内のＷＢＣの複数の亜集団の識別を容易にするために十分な濃度中のモル浸透圧濃度調整成分と、を含む。
いくつかの実施形態では、膜透過性蛍光色素は、アクリジンオレンジ、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ １２、またはＳＹＴＯ １４である。いくつかの実施形態では、試薬中の膜透過性蛍光色素の濃度は、約０．０００１％〜最大約０．０００５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬中の膜透過性蛍光色素の濃度は、約０．０１μＭ〜最大約１５μＭの範囲である。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度調整成分は、塩化アンモニウムまたは塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度調整成分の濃度は、約０．１％〜最大約０．５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、ＷＢＣ保護剤を更に含む。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ保護剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブトキシエタノール、フェノキシエタノール、またはイソプロピルアルコールである。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ保護剤の濃度は、約０．１％〜最大約１．０％の範囲である。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、界面活性剤を更に含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、サポニンである。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜最大約０．０５％の範囲である。
いくつかの実施形態では、試薬は、ｐＨ緩衝成分を更に含む。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝成分は、酢酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝成分の濃度は、約０．０１％〜最大約０．５％の範囲である。いくつかの実施形態では、試薬は、抗菌剤を更に含む。いくつかの実施形態では、抗菌剤は、プロクリンである。いくつかの実施形態では、抗菌剤の濃度は、約０．０１％〜最大約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬のｐＨは、約２．５〜最大約１２．５ｐＨ単位の範囲である。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬のモル浸透圧濃度は、約２５〜最大約３５０ｍＯｓｍの範囲である。
本明細書に組み込まれる付随の図面は、明細書の一部を形成する。この書面による記載と一緒に、本図面は、本明細書内に提示される試薬、システム、及び方法の原理を説明するために、及び当業者が本明細書内に提示される試薬、システム、及び方法を作製及び使用することを可能にするために機能する。図面において、同じ参照番号は、同一または機能的に類似の要素を示す。
本発明の態様は、試料内の白血球（ＷＢＣ）及びＷＢＣ亜集団を識別、分類、及び／または定量するように全血の試料を分析するために使用され得るＷＢＣ分析試薬、システム、及び方法を含む。本開示のＷＢＣ分析試薬は、一般的に、少なくとも１つの膜透過性蛍光色素、ＷＢＣ保護試薬、及び界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ試薬は、ＷＢＣ試薬のモル浸透圧濃度を所望の範囲に調整するために好適な量のモル浸透圧濃度調整成分を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示される試薬、システム、及び方法は、蛍光染色及び蛍光トリガ戦略を用いてＷＢＣを選別するように使用される。本手法を用いることによって、未溶解ＲＢＣ（例えば、溶解耐性のＲＢＣ、または「ｒｓｔＲＢＣ」）及びＲＢＣ断片からの干渉は、実質的にまたは完全に排除され、それによって、ＷＢＣ及びＷＢＣ亜集団の正確な計数及び差別化を確実にする。本開示はまた、例えば、蛍光トリガ手法を実行するように構成される自動血液分析装置を用いるＷＢＣの向上した分析を容易にするＷＢＣ分析試薬を提供する。本開示のＷＢＣ分析試薬は、熟成された試料を含む、脆弱リンパ球（または他の脆弱ＷＢＣ）を含有する試料のアッセイにもまた好適である。
いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に開示される方法は、血液試料を、血液分析装置によって生成される散布図上のＷＢＣ亜集団を分離するのに十分である濃度において少なくとも１つの膜透過性蛍光色素、ＷＢＣ保護試薬、界面活性剤、及びモル浸透圧濃度調整成分を含むＷＢＣ分析試薬と接触させることと、上昇温度でＷＢＣ分析試薬を用いて血液試料をインキュベートすることと、蛍光色素を使って血液試料を染色することと、ＷＢＣのための血液試料を選別するように血液分析装置上で蛍光トリガを用いることと、試料内のＷＢＣの差異分析を実施するために（１）軸方向光損失、（２）中間角度散乱、（３）大角度偏光側方散乱、（４）大角度偏光解消側方散乱、及び（５）蛍光放射の測定値の組み合わせを用いることと（例えば、試料内に存在するＷＢＣの様々なサブタイプまたは亜集団の各々の数を計数すること）、を含む。
本明細書に説明される蛍光トリガ分析手法と組み合わされて本明細書に説明される蛍光色素の使用は、ＷＢＣ試薬によって溶解されていないＲＢＣを選別して除くことによってＷＢＣの分析に例外的な感度を提供する。このことは次に、より弱いＷＢＣ分析試薬の使用を容易にし（例えば、試料内のＲＢＣを溶解するプロセスにおいてＷＢＣを溶解しないかまたは損傷させない分析試薬）、それは、例えば、モル浸透圧濃度調整成分を用いて、（血液分析装置によって生成される１つ以上の散布図上に表示されるように）互いにＷＢＣの種々の亜集団の更なる分離を容易にするように微細に調整され得る。
本明細書で使用されるとき、「蛍光情報」という用語は、血液分析装置の蛍光チャネルから収集されたデータを意味する。本明細書で使用されるとき、「蛍光チャネル」という用語は、試料から放射された蛍光の量を測定するための適切な波長バンドを設定する光電子増倍管等の検出デバイスを意味する。
ＷＢＣ分析試薬
本発明の態様は、自動血液分析装置を用いて血液試料内のＷＢＣ及びＷＢＣ亜集団の分析を向上させるように使用され得るＷＢＣ分析試薬を含む。本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、一般的に血液試料内のＲＢＣを溶解するように使用されるが、同時に分析のために血液試料内のＷＢＣを保存する。本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬はまた、一般的に血液分析装置によって生成される差異散布図上に表示されるときに互いにＷＢＣ亜集団の向上した干渉なしの分離を提供する。この向上した分離は、血液試料内に存在する種々のＷＢＣ亜集団のより正確な分析を容易にする。
本発明の態様は、自動血液分析装置を用いて血液試料内のＷＢＣ及びＷＢＣ亜集団の分析を向上させるように使用され得るＷＢＣ分析試薬を含む。本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、一般的に血液試料内のＲＢＣを溶解するように使用されるが、同時に分析のために血液試料内のＷＢＣを保存する。本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬はまた、一般的に血液分析装置によって生成される差異散布図上に表示されるときに互いにＷＢＣ亜集団の向上した干渉なしの分離を提供する。この向上した分離は、血液試料内に存在する種々のＷＢＣ亜集団のより正確な分析を容易にする。
本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、一般的に、少なくとも１つの膜透過性蛍光色素、ＷＢＣ保護試薬、界面活性剤、モル浸透圧濃度調整成分、ならびにいくつかの追加成分を含み得る。これらの成分の各々は、以下に更に詳細に説明される。
膜透過性蛍光色素
膜透過性蛍光色素は、血液細胞の２つのクラス、すなわち、ＤＮＡを含有する血液細胞及びＤＮＡを含有しない血液細胞を差別化するように使用され得る。ＷＢＣがその核において大量のＤＮＡを含有し、ＲＢＣがしないため、ＤＮＡと相互作用する膜透過性蛍光色素の含有は、ＲＢＣからのＷＢＣの差別化を容易にする。色素の目的は、色素が適切な光源によって励起されるとき、細胞膜を通過させること、十分な親和性を用いて１つ以上の核酸と結合すること、及び十分に適切なストークスシフト（Ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ）を用いて蛍光信号を放射する、ことである。可視バンドにおける色素のピーク吸収は、色素を適切に励起し最適な結果を達成するために、光源の波長を実質的に整合する（光源の波長の５０ｎｍ内、より好ましくは、光源の波長の２５ｎｍ内）。
膜透過性蛍光色素は、血液細胞の２つのクラス、すなわち、ＤＮＡを含有する血液細胞及びＤＮＡを含有しない血液細胞を差別化するように使用され得る。ＷＢＣがその核において大量のＤＮＡを含有し、ＲＢＣがしないため、ＤＮＡと相互作用する膜透過性蛍光色素の含有は、ＲＢＣからのＷＢＣの差別化を容易にする。色素の目的は、色素が適切な光源によって励起されるとき、細胞膜を通過させること、十分な親和性を用いて１つ以上の核酸と結合すること、及び十分に適切なストークスシフト（Ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ）を用いて蛍光信号を放射する、ことである。可視バンドにおける色素のピーク吸収は、色素を適切に励起し最適な結果を達成するために、光源の波長を実質的に整合する（光源の波長の５０ｎｍ内、より好ましくは、光源の波長の２５ｎｍ内）。
膜透過性蛍光色素は、好ましくは、１）核酸（例えば、ＤＮＡ）と結合することができる、２）ＷＢＣの細胞膜に浸透することができる、３）光源を受けたときに選択された波長で励起可能である、４）光源による励起時に蛍光を放射する、及び５）生物学的に安定であり液体中（例えば、水溶液）で可溶性である。好適な膜透過性蛍光色素の例としては、アクリジンオレンジ、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ １２、ＳＹＴＯ １４、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、またはそれらの任意の等価物が挙げられるが、これらに限定されない。
蛍光色素は、一般的に、血液分析装置内に構成された蛍光トリガに基づいてＷＢＣを活性化し未溶解ＲＢＣ及びＲＢＣの断片を選別して除くように使用される。いくつかの実施形態では、色素は、結合親和性、膜透過性特性、及び／または色素の蛍光放射の強度に応じて、約１ｐｇ／Ｌ〜最大約１ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、色素は、結合親和性、膜透過性特性、及び／または色素の蛍光放射の強度に応じて、約１ｐＭ〜最大約１ｍＭの濃度で存在する。種々の色素が利用可能であるが、ある単一の色素が、識別、定量化、及び／または分析されるように意図される全てのＷＢＣ亜集団の蛍光放射を染色し励起するように使用されるように、選択された色素は、一般的に、血液分析装置の励起源と対にされる。したがって、いくつかの実施形態では、単一の（すなわち、排他的な）色素は、同時に試料内に存在する異なるＷＢＣ亜集団の全てを識別、定量化、及び／または分析するように使用され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の蛍光色素が、ＷＢＣ分析試薬中に含まれ得る。
いくつかの実施形態では、蛍光色素は、約１．０μＭ、最大約１．３μＭ、最大約１．５μＭ、最大約１．８μＭ、または最大約２．０μＭ以上の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在する。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、約０．０００１％、最大約０．０００２％、最大約０．０００３％、最大約０．０００４％、または最大約０．０００５％以上の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在する。特定の実施形態では、蛍光色素は、約０．０１μＭ、最大約０．０２２μＭ、最大約０．０５μＭ、最大約０．１μＭ、最大約０．１１μＭ、最大約０．５μＭ、最大約１．０μＭ、最大約１．１３μＭ、最大約５．０μＭ、最大約１０μＭ、最大約１１．３μＭ、最大約１５μＭ以上の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在する。
ＷＢＣ保護剤
本発明のいくつかの実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、ＲＢＣ溶解中のＷＢＣへの過度の損傷を防止するＷＢＣ保護剤を含んでもよい。ＷＢＣ保護試薬の例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブトキシエタノール、フェノキシエタノール、イソプロピルアルコール、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ保護剤は、約０．１％、最大約０．２％、最大約０．３％、最大約０．４％、最大約０．５％、最大約０．６％、最大約０．７％、最大約０．８％、最大約０．９％、または最大約１％の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在する。
本発明のいくつかの実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、ＲＢＣ溶解中のＷＢＣへの過度の損傷を防止するＷＢＣ保護剤を含んでもよい。ＷＢＣ保護試薬の例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブトキシエタノール、フェノキシエタノール、イソプロピルアルコール、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＷＢＣ保護剤は、約０．１％、最大約０．２％、最大約０．３％、最大約０．４％、最大約０．５％、最大約０．６％、最大約０．７％、最大約０．８％、最大約０．９％、または最大約１％の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在する。
モル浸透圧濃度調整成分
本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、モル浸透圧濃度調整成分を含み得る。モル浸透圧濃度調整成分は、一般的に、所望の程度までＷＢＣ分析試薬のモル浸透圧濃度を変化させる試薬である。モル浸透圧濃度調整成分の例としては、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、Ｃａ２＋、及びＭｇ２＋含有塩等のカチオン含有塩、例えば、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣＯ３２−、ＨＣＯ３−、ＳＯ４２−、ＨＳＯ４−、ＰＯ４３−、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、ＣＯＯＨ−、及びＣＨ３ＣＯＯ−含有塩等のアニオン含有塩、例えば、糖（例えば、グルコース及びスクロース）及びアルコール（例えば、エタノール及びメタノール）等の有機化合物、またはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、モル浸透圧濃度調整成分を含み得る。モル浸透圧濃度調整成分は、一般的に、所望の程度までＷＢＣ分析試薬のモル浸透圧濃度を変化させる試薬である。モル浸透圧濃度調整成分の例としては、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、Ｃａ２＋、及びＭｇ２＋含有塩等のカチオン含有塩、例えば、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣＯ３２−、ＨＣＯ３−、ＳＯ４２−、ＨＳＯ４−、ＰＯ４３−、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、ＣＯＯＨ−、及びＣＨ３ＣＯＯ−含有塩等のアニオン含有塩、例えば、糖（例えば、グルコース及びスクロース）及びアルコール（例えば、エタノール及びメタノール）等の有機化合物、またはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度調整成分は、約０．１％以上、最大約０．１２５％以上、最大約０．２５％以上、最大約０．５％以上の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在する。
追加成分
上述の成分に加えて、本発明のいくつかの実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、様々な追加成分もまた含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、溶液のｐＨを調整及び／または維持し、試薬の最適なモル浸透圧濃度を達成するように使用される緩衝剤または塩を含み得る。緩衝剤または塩の例としては、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、緩衝剤または塩は、約０．０１％、最大約０．０２％、最大約０．０３％、最大約０．０４％、最大約０．０５％、最大約０．０６％、最大約０．０７％、最大約０．０８％、最大約０．０９％、最大約０．１％、最大約０．１５％、最大約０．２％、最大約０．２５％、最大約０．３％、最大約０．３５％、最大約０．４％、最大約０．４５％、最大約０．５％以上の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在し得る。
上述の成分に加えて、本発明のいくつかの実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、様々な追加成分もまた含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、溶液のｐＨを調整及び／または維持し、試薬の最適なモル浸透圧濃度を達成するように使用される緩衝剤または塩を含み得る。緩衝剤または塩の例としては、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、緩衝剤または塩は、約０．０１％、最大約０．０２％、最大約０．０３％、最大約０．０４％、最大約０．０５％、最大約０．０６％、最大約０．０７％、最大約０．０８％、最大約０．０９％、最大約０．１％、最大約０．１５％、最大約０．２％、最大約０．２５％、最大約０．３％、最大約０．３５％、最大約０．４％、最大約０．４５％、最大約０．５％以上の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、約２．５ｐＨ単位〜最大約３．０ｐＨ単位、最大約３．５ｐＨ単位、最大約４．０ｐＨ単位、最大約４．５ｐＨ単位、最大約５．０ｐＨ単位、最大約５．５ｐＨ単位、最大約６．０ｐＨ単位、最大約６．５ｐＨ単位、最大約７．０ｐＨ単位、最大約７．５ｐＨ単位、最大約８．０ｐＨ単位、最大約８．５ｐＨ単位、最大約９．０ｐＨ単位、最大約９．５ｐＨ単位、最大約１０ｐＨ単位、最大約１０．５ｐＨ単位、最大約１１ｐＨ単位、最大約１１．５ｐＨ単位、最大約１２ｐＨ単位、最大約１２．５ｐＨ単位まで変動するｐＨを有し得る。
特定の実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、ＷＢＣ分析試薬中の微生物成長を防止するために使用される抗菌剤を含んでもよい。抗菌剤の例としては、例えば、プロクリン３００等のプロクリン、またはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。抗菌剤の濃度は、一般的に、必要とされる貯蔵寿命の間ＷＢＣ分析試薬を保存するのに十分なものである。いくつかの実施形態では、抗菌剤は、約０．０１％、最大約０．０２％、最大約０．０３％、最大約０．０４％、最大約０．０５％、最大約０．０６％、最大約０．０７％、最大約０．０８％、最大約０．０９％、または最大約０．１％以上の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、ＲＢＣ断片の蓄積を最小限にし、ＲＢＣ断片が試料内のＷＢＣの分析に干渉することを防止するように使用される界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤の例としては、サポニン、またはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、約０．０１％、最大約０．０１５％、最大約０．０２％、最大約０．０２５％、最大約０．０３％、最大約０．０３５％、最大約０．０４％、最大約０．０４５％、最大約０．０５％以上の濃度でＷＢＣ分析試薬中に存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、ＲＢＣ溶解成分を含み得る。ＲＢＣ溶解成分は、一般的に、血液試料中のＲＢＣを溶解することを促し得ると同時にまた、試料中に存在する異なるクラスのＷＢＣの分離及び／または分析を容易にするようにＷＢＣ分析試薬のモル浸透圧濃度調整に対して貢献し得る。ＲＢＣ溶解成分の例としては、例えば、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、第三級アンモニウム塩、第四級アンモニウム塩、またはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。
ＷＢＣ分析試薬の調製方法
いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、膜透過性蛍光色素を溶かすために２つの段階の調製プロセスを用いて調製される。第１のステップでは、蛍光色素は、例えば、ＤＭＳＯ等の好適な有機溶媒中に溶かされて、好適な第１の濃度で蛍光色素を含有する溶液を作製する。第２のステップでは、有機溶媒中に蛍光色素を含有する溶液は、所望の最終濃度で蛍光色素を含有する水性ＷＢＣ分析試薬を作製するために水性溶媒と混合される。いくつかの実施形態では、水性溶媒は、ＷＢＣ分析試薬の追加成分を含有してもよい。
いくつかの実施形態では、ＷＢＣ分析試薬は、膜透過性蛍光色素を溶かすために２つの段階の調製プロセスを用いて調製される。第１のステップでは、蛍光色素は、例えば、ＤＭＳＯ等の好適な有機溶媒中に溶かされて、好適な第１の濃度で蛍光色素を含有する溶液を作製する。第２のステップでは、有機溶媒中に蛍光色素を含有する溶液は、所望の最終濃度で蛍光色素を含有する水性ＷＢＣ分析試薬を作製するために水性溶媒と混合される。いくつかの実施形態では、水性溶媒は、ＷＢＣ分析試薬の追加成分を含有してもよい。
血液試料中のＲＢＣを溶解する方法
本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、一般的に、全血の試料内のＲＢＣを溶解するように使用され得る。血液試料中のＲＢＣの溶解は、室温を超える温度（例えば、約４０℃等の約３０℃〜約５０℃の間）で約５秒〜最大約１分の範囲の時間にわたって行われ得る。いくつかの実施形態では、ＲＢＣの溶解は、比較的短時間で実行され得（例えば、約２５秒未満、約１７秒未満、または更に約９秒未満）、その後に血液の試料をＷＢＣ分析試薬と混合することが続き得る。血液試料の容量とＷＢＣ分析試薬の容量との希釈比（「血液試料の容量：ＷＢＣ分析試薬の容量」として表される）は、大幅に変動し得る。いくつかの実施形態では、血液試料の容量とＷＢＣ分析試薬の容量との比率は、約１：１０〜最大約１：２０、最大約１：３０、最大約１：４０、最大約１：５０、最大約１：６０、最大約１：７０、最大約１：８０、最大約１：９０、最大約１：１００以上の範囲である。
本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬は、一般的に、全血の試料内のＲＢＣを溶解するように使用され得る。血液試料中のＲＢＣの溶解は、室温を超える温度（例えば、約４０℃等の約３０℃〜約５０℃の間）で約５秒〜最大約１分の範囲の時間にわたって行われ得る。いくつかの実施形態では、ＲＢＣの溶解は、比較的短時間で実行され得（例えば、約２５秒未満、約１７秒未満、または更に約９秒未満）、その後に血液の試料をＷＢＣ分析試薬と混合することが続き得る。血液試料の容量とＷＢＣ分析試薬の容量との希釈比（「血液試料の容量：ＷＢＣ分析試薬の容量」として表される）は、大幅に変動し得る。いくつかの実施形態では、血液試料の容量とＷＢＣ分析試薬の容量との比率は、約１：１０〜最大約１：２０、最大約１：３０、最大約１：４０、最大約１：５０、最大約１：６０、最大約１：７０、最大約１：８０、最大約１：９０、最大約１：１００以上の範囲である。
蛍光トリガを含む分析の方法
血液細胞は、光源による蛍光色素の励起時に異なる規模の蛍光信号を放射する。蛍光信号の規模における違いは、細胞内の核酸、すなわちＤＮＡの量から部分的に起こる。ＤＮＡの量が多ければ多いほど、より高い蛍光信号の可能性が多くなる。蛍光の規模における違いはまた、例えば、細胞膜に浸透する蛍光色素の能力、蛍光色素分子の大きさ、蛍光色素と結合した核酸との間の結合動態、蛍光色素と核酸との間の結合親和性、及び他のそのような要因から起こる。
血液細胞は、光源による蛍光色素の励起時に異なる規模の蛍光信号を放射する。蛍光信号の規模における違いは、細胞内の核酸、すなわちＤＮＡの量から部分的に起こる。ＤＮＡの量が多ければ多いほど、より高い蛍光信号の可能性が多くなる。蛍光の規模における違いはまた、例えば、細胞膜に浸透する蛍光色素の能力、蛍光色素分子の大きさ、蛍光色素と結合した核酸との間の結合動態、蛍光色素と核酸との間の結合親和性、及び他のそのような要因から起こる。
成熟ＲＢＣ内にＤＮＡが存在しないため、成熟ＲＢＣは、最小限の蛍光信号を放射する。ＤＮＡが有核赤血球（ｎＲＢＣ）の核内に存在するという理由のみならず、ｎＲＢＣの膜が溶解手順中に破壊されるため染色がより容易に起こるという理由でも、ｎＲＢＣは、非常に強い蛍光信号を放射する。未溶解ＲＢＣまたはＲＢＣ断片は、場合によって、それらは非常に弱い自動蛍光を放射し得るが、蛍光を放射しない。
したがって、本明細書に提示されるシステム及び方法は、ＷＢＣ分析試薬と組み合わせて蛍光トリガを使用して試料内のＷＢＣを分析する。例えば、通常、ＲＢＣからの信号とＷＢＣからの信号との間に設定される蛍光トリガを使用して、更なる分析のためにＷＢＣから別個に信号を収集し得る。言い換えれば、蛍光トリガの使用は、ＲＢＣからの信号が分離されるかまたは分析から除去されることを可能にし、それは、ＲＢＣ信号から干渉を排除することによって試料内のＷＢＣ及びＷＢＣ亜集団のより正確な測定及び分析を促進する。ＦＬ１、または蛍光トリガを用いる実施例が、図１〜５に示される。図１は、ＲＢＣ（核のない粒子）の任意の断片を排除し核を含有する事象のみ（例えば、ＷＢＣ及び／またはｎＲＢＣ）を収集するために蛍光トリガの使用を示すＦＬ１対ＩＡＳの散布図である。図１では、ＷＢＣ分析試薬中の蛍光色素は、アクリジンオレンジであり、蛍光色素の濃度は、３．８μＭであった。（更に徹底的に異なる色素の濃度、すなわち、図６に示されるように１１．３μＭ〜０．０２２μＭを用いる）蛍光色素としてアクリジンオレンジを含有するＷＢＣ分析試薬の使用及び適切に設定されたＦＬ１トリガは、ＦＬ１の閾値レベルを確立することによって核含有事象の識別を容易にする。結果として、ＦＬ１トリガを超える事象（例えば、存在した場合ＷＢＣ及び／またはｎＲＢＣ）のみが、更なる分析のために捕捉される。
分析のための光学及び蛍光チャネルの使用
本発明の態様は、血液試料中のＷＢＣを分析するための光学及び蛍光チャネルの使用を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＷＢＣ差異分析は、蛍光情報によって向上された多角偏光散乱分離（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｇｌｅ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）技術（ＭＡＰＳＳ）によって行われる。少なくとも１つの光ダイオード、もしくは少なくとも１つの光電子増倍管、または少なくとも１つの光ダイオード及び少なくとも１つの光電子増倍管の両方が、フローセルを通過する各血液細胞によって散乱された光を検出するために必要である。２つ以上の光ダイオードが、約０°散乱を測定するＡＬＬ信号と、低角度（例えば、約３°〜約１５°）散乱を測定するＩＡＳ信号とを測定するために使用される。２つ以上の光電子増倍管（または電子なだれ光ダイオード）が、大角度（例えば、９０°）ＰＳＳ信号と、大角度（例えば、９０°）ＤＳＳ信号とを検出するために使用される。更なる光電子増倍管は、光源の波長の選択に応じて、適切な波長範囲（複数可）内のＦＬ１測定値に必要とされる。システム上で捕捉される各事象は、したがって、ＡＬＬ、ＩＡＳ（１つ以上のチャネル）、ＰＳＳ、ＤＳＳ、及び蛍光（１つ以上のチャネル）等の情報の複数の寸法を呈する。これらの検出チャネルからの情報は、血液細胞の更なる分析のために使用される。
本発明の態様は、血液試料中のＷＢＣを分析するための光学及び蛍光チャネルの使用を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＷＢＣ差異分析は、蛍光情報によって向上された多角偏光散乱分離（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｇｌｅ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）技術（ＭＡＰＳＳ）によって行われる。少なくとも１つの光ダイオード、もしくは少なくとも１つの光電子増倍管、または少なくとも１つの光ダイオード及び少なくとも１つの光電子増倍管の両方が、フローセルを通過する各血液細胞によって散乱された光を検出するために必要である。２つ以上の光ダイオードが、約０°散乱を測定するＡＬＬ信号と、低角度（例えば、約３°〜約１５°）散乱を測定するＩＡＳ信号とを測定するために使用される。２つ以上の光電子増倍管（または電子なだれ光ダイオード）が、大角度（例えば、９０°）ＰＳＳ信号と、大角度（例えば、９０°）ＤＳＳ信号とを検出するために使用される。更なる光電子増倍管は、光源の波長の選択に応じて、適切な波長範囲（複数可）内のＦＬ１測定値に必要とされる。システム上で捕捉される各事象は、したがって、ＡＬＬ、ＩＡＳ（１つ以上のチャネル）、ＰＳＳ、ＤＳＳ、及び蛍光（１つ以上のチャネル）等の情報の複数の寸法を呈する。これらの検出チャネルからの情報は、血液細胞の更なる分析のために使用される。
図１４は、（フローサイトメトリーを含む）血液学的分析に好適な装置の照明及び検出光学を示す概略図である。ここで図１４を参照すると、装置１０は、光源１２、光線曲げのための前方鏡１４及び後方鏡１６、第１の円柱レンズ２０及び第２の円柱レンズ２２を含む光線膨張器モジュール１８、集束レンズ２４、微細光線調整器２６、フローセル２８、前方散乱レンズ３０、ブルズアイ検出器３２、第１の光電子増倍管３４、第２の光電子増倍管３６、及び第３の光電子増倍管３８を備える。ブルズアイ検出器３２は、０°光散乱のための内部検出器３２ａ及び７°光散乱のための外部検出器３２ｂを有する。図１４に描写される装置は、本明細書に説明される方法を実行するように使用され得る装置の単なる実施例である。
以下の考察では、光源は、好ましくは、レーザである。しかしながら、例えば、ランプ（例えば、水銀、キセノン）等の他の光源が使用され得る。光源は、ＣＡ、Ｓａｎｔａ ＣｌａｒａのＣｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．から市販の垂直偏光空気冷却式Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｕｂｅレーザであり得る。いくつかの実施形態では、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有するレーザが、使用され得る。レーザについての動作条件は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」自動血液分析装置で現在使用されるレーザのそれらに実質的に類似している。
フローセルに関する更なる詳細は、レンズ、集束レンズ、微細光線調整機構、及び好適な自動血液分析装置のレーザ集束レンズが、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３１，１６５号、具体的に、第４１欄、３２行〜第４３欄、１１行に見出され得る。図１４に示される前方光路システムは、球状平凸レンズ３０及びレンズの後焦点面に位置する２素子光ダイオード検出器３２を含む。この構成では、２素子光ダイオード検出器３２内の各ポイントは、フローセル２８を通って移動する細胞からの光の特定の収集角度を地図に描く。検出器３２は、軸方向光損失（ＡＬＬ）及び中間角度前方散乱（ＩＡＳ）を検出できるブルズアイ検出器であり得る。米国特許第５，６３１，１６５号は、第４３欄、１２〜５２行で本検出器に対する種々の代替を説明する。
第１の光電子増倍管３４（ＰＭＴ１）は、偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）を測定する。選択される蛍光色素及び用いられる光源に応じて、第２の光電子増倍管３６（ＰＭＴ２）は、偏光側方散乱（ＰＳＳ）を測定し、第３の光電子増倍管３８（ＰＭＴ３）は、４４０ｎｍ〜６８０ｎｍの蛍光放射を測定する。光電子増倍管は、信号の強度を増加させるために広範囲の波長において蛍光信号を収集する。側方散乱及び蛍光放射は、二色性光線スプリッタ４０及び４２によってこれらの光電子増倍管に対して方向付けられ、それは、効率的な検出を可能にするように必要とされる波長で効率的に透過し反射する。米国特許第５，６３１，１６５号は、第４３欄、５３行〜第４４欄、４行で、光電子増倍管に関連する種々の更なる詳細を説明する。
感度は、蛍光を測定するとき、浸漬収集システムを用いることによって、光電子増倍管３４、３６、及び３８で増強される。浸漬収集システムは、屈折率整合層によって第１のレンズ３０をフローセル２８に光学的に連結させるものであり、広角にわたって光の収集を可能にする。米国特許第５，６３１，１６５号は、第４４欄、５〜３１行で本光学システムの種々の更なる詳細を説明する。
冷却器４４は、高分解能顕微鏡検査において使用される回折限界結像に関して十分な収差補正を有する光学レンズシステムである。米国特許第５，６３１，１６５号は、第４４欄、３２〜６０行で本光学システムの種々の更なる詳細を説明する。
図１４に示される他の構成要素の機能、すなわち、スリット４６、フィールドレンズ４８、及び第２のスリット５０は、米国特許第５，６３１，１６５号において、第４４欄、６３行〜第４５欄、２６行で説明される。検出される光の波長もしくは偏光、または波長及び偏光の両方を変化させるように光電子増倍管の光路内に挿入される光学フィルタ５２または５６及び偏光子５２または５６もまた、米国特許第５，６３１，１６５号において、第４４欄、６３行〜第４５欄、２６行で説明される。本明細書における使用に好適である光学フィルタは、バンドパスフィルタ及びロングパスフィルタを含む。
光電子増倍管３４、３６、及び３８は、側方散乱（その軸が入射レーザ光線に対してほぼ垂直である円錐体において散乱される光）または蛍光（入射レーザ光線のそれとは異なる波長で細胞から放射される光）のいずれかを検出する。
米国特許第５，６３１，１６５号の選択部分が上に参照されるが、米国特許第５，６３１，１６５号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
４つの従来のＭＡＰＳＳチャネル（ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＤＳＳ）から収集される情報に加えて、ＦＬ１チャネルは、互いに細胞亜集団を更に区別する。全ての光学寸法及び蛍光寸法からの組み合わされた定量的情報は、ＷＢＣを含有する血液の試料に向上したより信頼性の高い差異分析を提供する。
未溶解ＲＢＣ及びＲＢＣ断片からの干渉が実質的に排除されるため、本明細書に説明される方法は、血液分析装置に関するＷＢＣ分析を向上させ、より正確なＷＢＣ計数及びＷＢＣ亜集団のより正確な分類を提供する。蛍光の使用は、ＷＢＣの差異分析を改善するように更なる情報を提供する。本明細書に説明される方法は、ｒｓｔＲＢＣを有する試料及び脆弱ＷＢＣを有する試料を分析するとき、従来の方法よりも利点を示す。
ＷＢＣ分析試薬配合例：
ＷＢＣ分析試薬配合の種々の例を以下に提供する。以下に提示される配合は、単に例として機能するものであり、決して限定するものではない。本明細書内に記載される成分の様々な組み合わせのいずれも、本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬において利用することができる。
ＷＢＣ分析試薬配合の種々の例を以下に提供する。以下に提示される配合は、単に例として機能するものであり、決して限定するものではない。本明細書内に記載される成分の様々な組み合わせのいずれも、本発明の実施形態に従うＷＢＣ分析試薬において利用することができる。
配合例１：
配合例２：
配合例３：
配合例４：
配合例５：
配合例６：
配合例７：
配合例８：
配合例９：
配合例１０：
配合例１１：
配合例２：
配合例３：
配合例４：
配合例５：
配合例６：
配合例７：
配合例８：
配合例９：
配合例１０：
配合例１１：
実施例
図１〜５は、それぞれ、配合例１〜５において上に説明されるＷＢＣ分析試薬及びシステムを用いて分析された通常の全血検体に関するＷＢＣの差異散布図（ＦＬ１対ＩＡＳ）を示す。図１〜５に見られるように、ＷＢＣ分析試薬は、試料中のＷＢＣを十分に区別し差別化することができた。
図１〜５は、それぞれ、配合例１〜５において上に説明されるＷＢＣ分析試薬及びシステムを用いて分析された通常の全血検体に関するＷＢＣの差異散布図（ＦＬ１対ＩＡＳ）を示す。図１〜５に見られるように、ＷＢＣ分析試薬は、試料中のＷＢＣを十分に区別し差別化することができた。
図６Ａ〜６Ｄは、４つの異なるＷＢＣ分析試薬配合に関するＷＢＣの差異散布図（ＰＳＳ対ＡＬＬ及びＦＬ１対ＩＡＳ）を示す。結果は、ＷＢＣ分析試薬中の膜透過性蛍光色素の濃度が著しく変動した場合でも同様のＷＢＣ差異を獲得するということを示す。試験された４つの配合は、それぞれ、アクリジンオレンジの濃度を、１１．３μＭ（１Ｘ）、１．１３μＭ（０．１Ｘ）、０．１１μＭ（０．０１Ｘ）、及び０．０２２μＭ（０．００２Ｘ）で調製し、ＦＬ１ ＰＭＴの電圧を３７５Ｖ、４２０Ｖ、４７５Ｖ、及び５２０Ｖに設定したことを除いて、配合例１のそれらのものと同様であった。
図７Ａ〜７Ｃは、ＷＢＣ保護剤として０．２２％のホルムアルデヒドを含有するＷＢＣ分析試薬を用いて（配合例１と同じ配合）分析された通常の全血検体の種々のＷＢＣ散布図を示す。
図８Ａ〜８Ｃは、ＷＢＣ保護剤として０．２％のグルタルアルデヒドを含有するＷＢＣ分析試薬を用いて（配合例６と同じ配合）分析された通常の全血検体の種々のＷＢＣ散布図を示す。
図９Ａ〜９Ｃは、ＷＢＣ保護剤として０．５％のブトキシエタノールを含有するＷＢＣ分析試薬を用いて（配合例７と同じ配合）分析された通常の全血検体の種々のＷＢＣ散布図を示す。
図１０Ａ〜１０Ｃは、ＷＢＣ保護剤として０．５％のフェノキシエタノールを含有するＷＢＣ分析試薬を用いて（配合例８と同じ配合）分析された通常の全血検体の種々のＷＢＣ散布図を示す。
図１１Ａ〜１１Ｃは、ＷＢＣ保護剤として０．５％のイソプロピルアルコールを含有するＷＢＣ分析試薬を用いて（配合例９と同じ配合）分析された通常の全血検体の種々のＷＢＣ散布図を示す。
図１２Ａ〜１２Ｄは、モル浸透圧濃度調整成分として示された塩化アンモニウムの濃度を含有するＷＢＣ分析試薬を用いて獲得された種々のＷＢＣ散布図（ＡＬＬ対ＩＡＳ、ＰＳＳ対ＡＬＬ、及びＰＳＳ対ＩＡＳ）を示す。好中球／好酸球、リンパ球、単球、及び好塩基球が、散布図に示される。ＷＢＣ分析試薬は、塩化アンモニウムの濃度を示されるように調整したことを除いて、配合例１０において使用されたものと同じ配合を有した。ＷＢＣ分析試薬中の塩化アンモニウムの濃度における変化は、散布図上のＷＢＣ亜集団の位置のずれをもたらした。例えば、塩化アンモニウムの濃度は、ＷＢＣ試薬中で０．１２５％〜０．５％まで変化した。種々の塩化アンモニウム濃度変化からもたらされるモル浸透圧濃度変化は、ＡＬＬ対ＩＡＳ散布図における好中球、リンパ球、及び単球間の相対位置に影響した。より低い塩化アンモニウムの濃度及びより低いモル浸透圧濃度は、好中球集団を「取り除き」、散布図上に好塩基球のための空間を作製するように見てとれる。モル浸透圧濃度を、０．５％、０．３７５％、０．２５％、及び０．１２５％の塩化アンモニウムを含有するＷＢＣ試薬に関して、それぞれ、２６３、２２４、１８１、及び１４６ｍＯｓｍで測定した。好中球／好酸球集団の位置的ずれは、散布図を比較することによって見ることができる。
図１３は、ＮａＣｌの種々の濃度（配合例１１を参照）からもたらされるモル浸透圧濃度変化に因るＷＢＣ集団の相対ずれを示す。モル浸透圧濃度は、この実験では１４９〜１８１ｍＯｓｍの範囲であった。
本発明の先述の記載は、例証及び説明の目的で提示されている。それは、網羅的であること、または開示される正確な形態に本発明を限定することを意図するものではない。上記教示を踏まえて、他の修正及び変形が可能であり得る。本発明の原理及びその実用性を最善に説明し、それによって当業者が本発明を企図される特定の使用に適したままで様々な実施形態及び様々な修正において最善に利用することを可能にするため、実施形態を選択及び記載した。付随の特許請求の範囲は、等価の構造、成分、方法、及び手段を含む本発明の他の代替実施形態を含むと解釈されることが意図される。
上記の発明を実施するための形態は、１つ以上の例示的実施形態を例証する付随の図面を参照する。他の実施形態が可能である。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、記載される実施形態に修正を加えてもよい。したがって、発明を実施するための形態は、限定するためのものではない。更に、発明の概要及び要約の項は、発明者（ら）により企図される本発明の全てではなく、１つ以上の例示的実施例を明らかにし得るため、本発明及び付随の特許請求の範囲を何らかの形で限定することを意図しない。
Claims (70)
- 自動血液分析装置を用いて白血球（ＷＢＣ）分析を実施する方法であって、
（ａ）ＷＢＣ分析試薬を用いて全血の試料を希釈することであって、前記ＷＢＣ分析試薬が、
前記試料中の複数の核含有細胞を標識する、有機溶媒に溶解した膜透過性蛍光色素と、
前記血液分析装置を用いて分析した場合、複数のＷＢＣ亜集団を互いに分離するモル浸透圧濃度調整成分と、を含み、このときモル浸透圧濃度調整成分が塩化アンモニウムと塩化ナトリウムである、希釈することと、
（ｂ）約３０℃〜約５０℃の範囲の温度で、約２５秒未満のインキュベーション時間にわたってステップ（ａ）の前記希釈された血液試料をインキュベートすることと、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記インキュベートされた試料を前記血液分析装置内のフローセルに送達することと、
（ｄ）前記インキュベートされた試料が前記フローセルを横切るときに、ステップ（ｃ）からの前記インキュベートされた試料を励起源で励起させることと、
（ｅ）前記励起した試料から複数の光散乱信号及び少なくとも１つの蛍光放射信号を収集することと、
（ｆ）前記少なくとも１つの蛍光放射信号に基づいて、蛍光閾値を満たさない前記希釈された血液試料内のいずれの粒子も考慮から除去しつつ、ステップ（ｅ）で収集される全ての前記信号に基づいてＷＢＣ差異分析を実施することと、を含む、方法。 - 前記励起源が、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記蛍光放射信号が、バンドパスフィルタまたはロングパスフィルタによって約３６０ｎｍ〜約７５０ｎｍの波長で収集される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
- 前記膜透過性蛍光色素が、アクリジンオレンジ、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ １２、またはＳＹＴＯ １４である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 前記試薬中の前記膜透過性蛍光色素の濃度が、約０．０００１％〜最大約０．０００５％の範囲である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 前記試薬中の前記膜透過性蛍光色素の濃度が、約０．０１μＭ〜最大約１５μＭの範囲である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 前記塩化アンモニウムと塩化ナトリウムの濃度が、約０．１％〜最大約０．５％である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 前記試薬が、ＷＢＣ保護剤を更に含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 前記ＷＢＣ保護剤が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブトキシエタノール、フェノキシエタノール、またはイソプロピルアルコールである、請求項８に記載の方法。
- 前記ＷＢＣ保護剤の濃度が、約０．１％〜最大約１．０％の範囲である、請求項８または９に記載の方法。
- 前記ＷＢＣ分析試薬が、界面活性剤を更に含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
- 前記界面活性剤が、サポニンである、請求項１１に記載の方法。
- 前記界面活性剤の濃度が、約０．０１％〜最大約０．０５％の範囲である、請求項１１または１２に記載の方法。
- 前記試薬が、ｐＨ緩衝成分を更に含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
- 前記ｐＨ緩衝成分が、酢酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムである、請求項１４に記載の方法。
- 前記ｐＨ緩衝成分の濃度が、約０．０１％〜最大約０．５％の範囲である、請求項１４または１５に記載の方法。
- 前記試薬が、抗菌剤を更に含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
- 前記抗菌剤の濃度が、約０．０１％〜最大約０．１％の範囲である、請求項１７に記載の方法。
- 前記ＷＢＣ分析試薬のｐＨが、約２．５〜最大約１２．５ｐＨ単位の範囲である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
- 前記ＷＢＣ分析試薬の前記モル浸透圧濃度が、約２５〜最大約３５０ｍＯｓｍである、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
- 全血の試料に白血球（ＷＢＣ）差異分析を行うためのシステムであって、前記システムが、
（ａ）血液分析装置であって、
前記血液試料内の粒子を励起させるように位置付けられた励起源と、
（１）前記励起された血液試料から軸方向光損失を測定するように位置付けられた軸方向光損失検出器、（２）前記励起された血液試料から中間角度散乱を測定するように位置付けられた中間角度散乱検出器、（３）前記励起された血液試料から大角度偏光側方散乱を測定するように位置付けられた偏光側方散乱検出器、（４）前記励起された血液試料から大角度偏光解消側方散乱を測定するように位置付けられた偏光解消側方散乱検出器、及び（５）前記励起された血液試料から放射された蛍光を測定するように位置付けられた蛍光検出器、を含む、複数の検出器と、
プロセッサであって、
（Ｉ）前記複数の検出器から（１）軸方向光損失、（２）中間角度散乱、（３）大角度偏光側方散乱、（４）大角度偏光解消側方散乱、及び（５）蛍光の測定値を受け取ることと、
（ＩＩ）全ての５つの測定値に基づいて、蛍光閾値を超える蛍光を放射する粒子について、前記血液試料のＷＢＣ差異分析を実施することと、を行うように構成されるプロセッサと、を備える、血液分析装置と、
（ｂ）前記試料内のＷＢＣを分析するための試薬であって、
有機溶媒に溶解した膜透過性蛍光色素と
前記血液分析装置を用いて分析した場合に複数のＷＢＣ亜集団を互いに分離するモル浸透圧濃度調整成分であって、塩化アンモニウムと塩化ナトリウムであるモル浸透圧濃度調整成分と、を含む、試薬と、を含み、
前記膜透過性蛍光色素の濃度が、前記血液分析装置を用いて、核を含有する前記試料内の１つ以上の細胞の識別を容易にするのに十分であり、
前記モル浸透圧濃度調整成分の濃度が、前記血液分析装置を用いて、前記試料内のＷＢＣの複数の亜集団の識別を容易にするのに十分である、システム。 - 前記膜透過性蛍光色素が、アクリジンオレンジ、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ １２、またはＳＹＴＯ １４である、請求項２１に記載のシステム。
- 前記試薬中の前記膜透過性蛍光色素の濃度が、約０．０００１％〜最大約０．０００５％の範囲である、請求項２１または２２に記載のシステム。
- 前記試薬中の前記膜透過性蛍光色素の濃度が、約０．０１μＭ〜最大約１５μＭの範囲である、請求項２１〜２３のいずれかに記載のシステム。
- 前記塩化アンモニウムと塩化ナトリウムの濃度が、約０．１％〜最大約０．５％である、請求項２１〜２４のいずれかに記載のシステム。
- 前記試薬が、ＷＢＣ保護剤を更に含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載のシステム。
- 前記ＷＢＣ保護剤が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブトキシエタノール、フェノキシエタノール、またはイソプロピルアルコールである、請求項２６に記載のシステム。
- 前記ＷＢＣ保護剤の濃度が、約０．１％〜最大約１．０％の範囲である、請求項２６または２７に記載のシステム。
- 前記試薬が、界面活性剤を更に含む、請求項２１〜２８のいずれかに記載のシステム。
- 前記界面活性剤が、サポニンである、請求項２９に記載のシステム。
- 前記界面活性剤の濃度が、約０．０１％〜最大約０．０５％の範囲である、請求項２９または３０に記載のシステム。
- 前記試薬が、ｐＨ緩衝成分を更に含む、請求項２１〜３１のいずれかに記載のシステム。
- 前記ｐＨ緩衝成分が、酢酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムである、請求項３２に記載のシステム。
- 前記ｐＨ緩衝成分の濃度が、約０．０１％〜最大約０．５％の範囲である、請求項３２または３３に記載のシステム。
- 前記試薬が、抗菌剤を更に含む、請求項２１〜３４のいずれかに記載のシステム。
- 前記抗菌剤の濃度が、約０．０１％〜最大約０．１％の範囲である、請求項３５に記載のシステム。
- 前記試薬のｐＨが、約２．５〜最大約１２．５ｐＨ単位の範囲である、請求項２１〜３６のいずれかに記載のシステム。
- 前記試薬の前記モル浸透圧濃度が、約２５〜最大約３５０ｍＯｓｍである、請求項２１〜３７のいずれかに記載のシステム。
- 前記プロセッサが、前記蛍光閾値を満たさないいずれの粒子も考慮から除去するように前記受け取られた測定値を事前選別するように更に構成される、請求項２１〜３８のいずれかに記載のシステム。
- 前記軸方向光損失検出器が、０°散乱で軸方向光損失を測定する、請求項２１〜３９のいずれかに記載のシステム。
- 前記中間角度散乱検出器が、約３°〜約１５°で光角度散乱を測定する、請求項２１〜４０のいずれかに記載のシステム。
- 前記複数の検出器が、１つ以上の光電子増倍管を含む、請求項２１〜４１のいずれかに記載のシステム。
- 前記励起源が、レーザである、請求項２１〜４２のいずれかに記載のシステム。
- 前記レーザが、前記蛍光色素に対応する波長で光を放射する、請求項４３に記載のシステム。
- 前記蛍光色素が、前記励起源に対応するように選択される、請求項２１〜４４のいずれかに記載のシステム。
- 前記試薬を用いて前記血液試料を希釈するためのインキュベーションサブシステムを更に含む、請求項２１〜４５のいずれかに記載のシステム。
- 前記インキュベーションサブシステムが、約２５秒未満である時間にわたり前記試薬を用いて前記血液試料をインキュベートするように構成される、請求項４６に記載のシステム。
- 前記インキュベーションサブシステムが、約１７秒未満である時間にわたり前記試薬を用いて前記血液試料をインキュベートするように構成される、請求項４６または４７に記載のシステム。
- 前記インキュベーションサブシステムが、約９秒未満である時間にわたり前記試薬を用いて前記血液試料をインキュベートするように構成される、請求項４６〜４８のいずれかに記載のシステム。
- 前記インキュベーションサブシステムが、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度で前記試薬を用いて前記血液試料をインキュベートするように構成される、請求項４６〜４９のいずれかに記載のシステム。
- 前記インキュベーションサブシステムが、約４０℃の温度で前記試薬を用いて前記血液試料をインキュベートするように構成される、請求項４６〜５０のいずれかに記載のシステム。
- 血液分析装置を用いて全血の試料内の白血球（ＷＢＣ）を分析するための試薬であって、
前記血液分析装置を用いて核を含有する前記試料内の複数の細胞の識別を容易にするのに十分な濃度の、有機溶媒に溶解した膜透過性蛍光色素と、
前記血液分析装置を用いて前記試料内のＷＢＣの複数の亜集団の識別を容易にするために塩化アンモニウムと塩化ナトリウムを含むモル浸透圧濃度調整成分と、を含む、試薬。 - 前記膜透過性蛍光色素が、アクリジンオレンジ、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ １２、またはＳＹＴＯ １４である、請求項５２に記載の試薬。
- 前記試薬中の前記膜透過性蛍光色素の濃度が、約０．０００１％〜最大約０．０００５％の範囲である、請求項５２または５３に記載の試薬。
- 前記試薬中の前記膜透過性蛍光色素の濃度が、約０．０１μＭ〜最大約１５μＭの範囲である、請求項５２〜５４のいずれかに記載の試薬。
- 前記塩化アンモニウムと塩化ナトリウムの濃度が、約０．１％〜最大約０．５％である、請求項５２〜５５のいずれかに記載の試薬。
- 前記試薬が、ＷＢＣ保護剤を更に含む、請求項５２〜５６のいずれかに記載の試薬。
- 前記ＷＢＣ保護剤が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブトキシエタノール、フェノキシエタノール、またはイソプロピルアルコールである、請求項５７に記載の試薬。
- 前記ＷＢＣ保護剤の濃度が、約０．１％〜最大約１．０％の範囲である、請求項５７または５８に記載の試薬。
- 界面活性剤を更に含む、請求項５２〜５９のいずれかに記載の試薬。
- 前記界面活性剤が、サポニンである、請求項６０に記載の試薬。
- 前記界面活性剤の濃度が、約０．０１％〜最大約０．０５％の範囲である、請求項６０または６１に記載の試薬。
- 前記試薬が、ｐＨ緩衝成分を更に含む、請求項５２〜６２のいずれかに記載の試薬。
- 前記ｐＨ緩衝成分が、酢酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムである、請求項６３に記載の試薬。
- 前記ｐＨ緩衝成分の濃度が、約０．０１％〜最大約０．５％の範囲である、請求項６３または６４に記載の試薬。
- 前記試薬が、抗菌剤を更に含む、請求項５２〜６５のいずれかに記載の試薬。
- 前記抗菌剤の濃度が、約０．０１％〜最大約０．１％の範囲である、請求項６６に記載の試薬。
- ｐＨが、約２．５〜最大約１２．５ｐＨ単位の範囲である、請求項５２〜６７のいずれかに記載の試薬。
- 前記モル浸透圧濃度が、約２５〜最大約３５０ｍＯｓｍである、請求項５２〜６８のいずれかに記載の試薬。
- 前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１に記載の方法。
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