CN105420403A - 一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量pcr方法 - Google Patents

一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量pcr方法 Download PDF

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CN105420403A CN201610022581.8A CN201610022581A CN105420403A CN 105420403 A CN105420403 A CN 105420403A CN 201610022581 A CN201610022581 A CN 201610022581A CN 105420403 A CN105420403 A CN 105420403A
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Abstract

本发明提供了一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应；所述裂解液的组成为：0.2～0.4N氢氧化钠、0.3～0.6M氯化钾、0.01～0.05％N-月桂酰肌氨酸钠、5mM？EDTA、0.3～0.6M？Tris-HCL和1～2％曲通X-100。本发明方法不需要加热，室温裂解时间5～10分钟左右即可，只需静态洗涤一次，从而减少了实验室污染和磁珠核酸的丢失，避免了分步操作所带来的污染可能性，节省了检测时间。其敏感性以HBV？DNA定量为例，可低至5IU/ML，重复性良好。

Description

一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是一种根据生物体内DNA复制性质而设计的体外快速扩增特定DNA序列的技术。PCR反应体系主要由核酸引物、4种dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反应缓冲液体系组成。自美国Cetus公司人类遗传室KaryMullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术及其衍生技术就被快速开发出来，并在多种核酸检测中得到了广泛的运用。尤其是病毒或其他病原体的检测，当知道待检病原某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR扩增，使其达到检测量，通过适当的检测手段进行检测，即可确定病原体的存在与否。
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用DNA扩增过程中荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与普通的PCR相比。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，实现了PCR的定量分析。目前，实时荧光定量PCR技术在医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究及临床检测中得到了广泛应用。
目前应用于实时荧光定量PCR检测的核酸提取方法主要有四种，即碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱法和磁珠法。
磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附，而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱，从而得到纯净的核酸。
目前，临床实验室中使用的磁珠法核酸提取大多采用胍盐介导的方法，即在胍盐的作用下，使核酸分子吸附于磁珠，再经过洗脱得到靶核酸的方法。但其核酸提取与PCR扩增往往分别进行，并且提取过程中使用的胍盐裂解液不稳定，易受实验室条件及季节温度影响，洗脱过程中大多需要至少两步洗涤，才能够相对彻底地去除蛋白和盐分子，进而增加了整个实时荧光定量PCR检测过程的耗时。此外，由于核酸提取与PCR扩增不在同一载体中进行和洗涤次数的增加而导致的实验室污染以及核酸丢失都是影响检测结果准确性的重要原因。因此，需要找到一种磁珠法提取与PCR扩增在同一载体中进行，裂解效率稳定并且不需经过多次洗脱的核酸提取方法对提高临床检测质量具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中磁珠法提取核酸与实时荧光定量PCR扩增分别进行并且需要多次移管、核酸裂解效率不稳定、磁珠核酸洗脱导致核酸丢失、核酸污染等缺点，提供了一种在一管中进行核酸提取与扩增的实时荧光定量PCR方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应；
所述裂解液的组成为：0.2～0.4N氢氧化钠、0.3～0.6M氯化钾、0.01～0.05％N-月桂酰肌氨酸钠、5mMEDTA、0.3～0.6MTris-HCL和1～2％曲通X-100。
本发明方法利用特殊的裂解液高效裂解细胞，使细胞中的核酸有效释放到水相中，同时使磁珠将核酸完全吸附于磁珠表面，实现核酸纯化的自动化。本发明利用独特的方法，可以保证磁珠在裂解液中性能稳定，并在水相中均匀混合。且在后期行PCR扩增过程中不会影响PCR反应的进行，不干扰实验结果，保证检测结果的准确可靠。
作为优选，所述裂解液还包括3～8mMDTT。本发明加入了3～8mmol的DTT参与核酸的提取，可以有效保护核酸不被氧化，且可防止DNA自身二聚体的形成。
作为优选，所述裂解液还包括不多于0.001wt％的提取指示剂。该提取指示剂可以起到良好的指示作用，防止实验操作中的错加、漏加、多加。其中，所述提取指示剂选自溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹名、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。
更优选地，所述提取指示剂为溴酚蓝。溴酚蓝可以起到良好的指示剂作用，在本发明方法的裂解液中，在室温条件下呈蓝色，与待检测样品混合后颜色减退，从而提示操作者样品的加入情况，避免因操作问题带来的样本漏加、错加、多加的问题。
本发明方法中的裂解液可以充分裂解样本中的细胞，使核酸完全释放，并配合磁珠进行核酸吸附，使核酸提取效果达到最优化；同时以加快裂解速度，去蛋白更为彻底，并且不受季节温度、盐离子浓度等影响，不需要苛刻的实验条件。
作为优选，本发明所述方法包括以下步骤：
步骤1)将混合有磁珠的裂解液加入到PCR扩增管中；
步骤2)将待检测样品加入到所述混合有磁珠的裂解液中，混匀，室温静置5～10分钟；
步骤3)将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
步骤4)，将PCR扩增管从磁力架上取下，将洗涤液加入步骤3)得到的PCR扩增管中，再将其放回磁力架上，待磁珠吸附至一侧后，立即将洗涤液吸走；步骤5)将配制好的PCR反应液加入到步骤4)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行实时荧光定量PCR反应。
在上述步骤中：
首先，将混合有磁珠的裂解液加入到PCR扩增管中。
其中，所述磁珠可以为市售磁珠法核酸提取中所使用的任意常规磁珠。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述磁珠按照以下方法制备：
步骤A)纳米微球的制备：
在氩气保护下，在含有13～17g硫酸亚铁七水合物和8～12g三氯化铁六水合物的水溶液中，每间隔10分钟滴加1ml0.4M～0.6M氢氧化钠溶液；当反应溶液变为胶状乳浊液时，每间隔20分钟滴加1ml0.2M～0.3M氢氧化钠溶液，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，待出现磁性后，继续在氩气保护下反应4～10小时；随后在所得溶液中加入氯化钠，使氯化钠终浓度为0.5M～1M；室温静置18～36小时后使用去离子水漂洗至溶液pH为7；再使用0.2M～0.3M的氢氧化钠溶液配成磁珠体积百分比为20％～40％的磁珠悬液，即得；
步骤B)通过表面修饰制备纳米磁珠：
将步骤A)所得磁珠悬液在50℃～60℃条件下通入氩气并均匀搅拌；加入60g九水硅酸钠搅拌至完全溶解，每3min滴加0.5ml冰乙酸，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，搅拌2h；当pH值为6～8时，使用3倍于所述磁珠悬液体积的0.3M氯化钠溶液漂洗5次，再使用0.3M氯化钠溶液配制成磁珠体积百分比为20％～40％的磁珠悬液；在得到的磁珠悬液中加入30gPEG-1750，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，搅拌24h；使用3倍于所述磁珠悬液体积的0.3M的氯化钠溶液漂洗5次；再使用0.3M氯化钠溶液和叠氮钠配制成磁珠体积百分比为40％-60％的磁珠悬液，即得所述纳米磁珠。
通过以上方法制备的磁珠具有如下优势：适用性广，能纯化多种不同样品；可通过改变反应条件能控制磁珠大小和表面修饰基团的数量；可在水相中呈表面颗粒均匀，分散性好。区别其它有机溶剂得到的磁珠，以上方法制备的磁珠核酸吸附量大，制备方法简单，成本低，无需复杂大型设备，适合实验室或工业化生产。
其中，所述混合有磁珠的裂解液中磁珠和裂解液可以按照任意比例混合。作为优选，所述混合有磁珠的裂解液中磁珠和裂解液的体积混合比例为1～1.5：100。
为了实现大批量自动化实时荧光定量PCR检测，可将混合有磁珠的裂解液按照上述比例分装至多个PCR扩增管中，在4℃冷藏或-20℃冷冻条件下保存，使用时根据需要取出放置至室温即可。
其中，本发明方法使用的所述PCR扩增管可以为市售任意规格的PCR扩增管，如Eppendorf0.2mlPCR扩增管。
其次，将待检测样品加入到所述混合有磁珠的裂解液中，混匀，室温静置5～10分钟。
其中，所述待检测样品可以为任意含有核酸的物质。作为优选，所述待检测样品为细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液或胸腹水。更优选地，所述待检测样品为血清或血浆。所述核酸包括但不限于DNA或RNA。
其中，作为优选，在所述将待检测样品加入到所述混合有磁珠的裂解液中之前对PCR扩增管进行离心，这样可以将盖上残存的液体或磁珠离心下来，保证结果检测的准确性。更优选地，在本发明的一个实施方式中，以2000rpm的转速进行离心。
作为优选，所述待检测样品与所述混合有磁珠的裂解液的体积比为1：1。这样更容易将待检测样品与混合有磁珠的裂解液充分混合。
其中，所述混匀的方法可以为移液器吹打、超声震动等常规混匀方法。作为优选，所述混匀的方法为吹打。更优选地，所述吹打的次数为3～5次。
本发明方法对于待检测样品的加入量并没有特别地限制。但为了使检测效果达到最优，所述为待检测样品的加入量50μl～150μl，优选为100μl。更优选地，所述待检测样品为血清或血浆。
第三，将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出。
其中，所述磁力架可以为市售吸附磁珠用常规磁力架。所述从磁珠对侧将混合液吸出可以使用任意市售的吸取工具。作为优选，使用八连排枪负压泵在磁珠的对侧将管内混合液吸走。所述混合液包含上述步骤中的裂解液裂解液、待检测样品溶液等磁珠吸附核酸后的残留液体。
第四，将PCR扩增管从磁力架上取下，将洗涤液加入步骤3)得到的PCR扩增管中，再将其放回磁力架上，待磁珠吸附至一侧后，立即将洗涤液吸走。
其中，所述洗涤液可以为任意市售核酸提取所用洗涤液。作为优选，所述洗涤液为0.3～0.6M氯化钾溶液，所述洗涤液的pH值为4～5。
作为优选，在本发明中，用乙酸将所述洗涤液的pH值调整为4～5。
在本发明中，使用0.3～0.6M氯化钾作为洗涤液的主要成分，其不含有乙醇。乙醇是PCR的中度抑制物，少量残存会影响PCR扩增的实验结果。此外，磁珠在含有乙醇的溶液中不稳定，易蹦跳而导致污染。核酸在偏酸性的氯化钾中溶解率低，避免核酸的丢失，使用本发明洗涤液仅需洗涤一次，且少量残余液不会影响PCR扩增的实验结果，保证实验结果的准确有效。
为了便于观察操作过程中残液是否吸净，防止多加、漏加、错加等操作失误，所述洗涤液还包括不多于0.001wt％的洗涤指示剂，所述洗涤指示剂选自溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹名、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。
作为优选，所述洗涤指示剂与所述提取指示剂不同。
更优选地，所述洗涤指示剂为石绿。
由于本发明方法使用特殊的裂解液和洗涤液，因此洗涤过程只需要一步即可完成，并且无需放置时间，既减少了操作过程中发生污染的可能性，又节约了检测时间。
作为优选，所述混合有磁珠的裂解液、待检测样品和洗涤液的体积比为1：1：2。
第五，将配制好的PCR反应液加入到步骤4)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行实时荧光定量PCR反应。
其中，所述配制好的PCR反应液可以为针对待检测样品中的靶核酸所设计的任意常规PCR反应液，例如，可包含PCR扩增缓冲液，选自dATP、dCTP、dGTP和dUTP4种dNTP的混合物，DNA聚合酶，镁离子，针对所述目标核酸设计的上下游引物和探针。
所述PCR扩增的程序可根据待检测样品中的靶核酸设计，例如，所提取核酸类型为DNA，PCR扩增程序优选为37℃，2min；95℃，5分钟；然后进行45～50循环的95℃，10秒钟和61℃，45秒钟；在61℃检测荧光信号。所提取核酸类型为RNA，PCR扩增程序优选为42℃，20min；95℃，5分钟；然后进行45-50循环的95℃，10秒钟和60℃，45秒钟。在60℃检测荧光信号。
所述PCR扩增程序主要依赖于DNA聚合酶和引物的退火温度，扩增程序包括但不限于上述扩增程序。
作为优选，所述离心为以2000～3000rpm水平离心30～60s。
本发明方法适用的检测项目包括但不限于乙肝病毒、丙肝病毒、CMV、EBV、HIV等各种病毒定量检测。
本发明的有益效果为：
本发明的方法，经待检测样品与裂解液混匀，不需要加热，室温保持时间5～10分钟左右即可，采用带有指示剂的洗涤液，可指示残液去除的彻底程度而又不影响检测结果，只需静态洗涤一次，从而减少了实验室污染和磁珠核酸的丢失，所得磁珠核酸全部参与PCR扩增反应，避免了分步操作所带来的污染可能性，节省了检测时间。其敏感性以HBVDNA定量为例，可低至5IU/ML，重复性良好。
附图说明
图1为本发明实施例1的方法检测HBVDNA的结果图；
图2为本发明实施例2的方法检测HBVDNA的结果图；
图3为利用本发明方法检测HBVDNA的敏感性结果图；
图4为利用本发明方法检测HBVDNA的重复性结果图；
图5为利用本发明方法检测HBVDNA与利用罗氏COBAS商品试剂盒检测HBVDNA的相关性比较图。
具体实施方式
本发明公开了一种在一管中进行核酸提取与扩增的实时荧光定量PCR方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本发明中使用的术语“磁珠”，是指磁性微球(简称磁珠)，现已广泛用于细胞分离、酶的固定、核酸纯化等多个领域。
本发明中使用的术语“裂解液”，即“lysisbuffer”，是指为了使样品中的核酸游离在裂解体系中所需加入的一种配制液体。
本发明中使用的术语“洗涤液”，即“washbuffer”，是指可以去除核酸以外杂质所需加入的试剂。
本发明中使用的术语“指示剂”，是化学试剂中的一类，其在一定介质条件下，其颜色能发生变化。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实验材料与仪器
以下实施例中所用的PCR扩增仪器为上海宏石医疗科技有限公司生产的实时荧光定量PCR仪。
样本采用临床化验室HBVDNA定量检测后的血清。
为了详细说明本发明方法的具体实施方式，分别按照以下浓度配制1L裂解液的工作液以便后续操作使用：方案1)0.2N氢氧化钠、0.3M氯化钾、0.01％N-月桂酰肌氨酸钠、5mMEDTA、0.3MTris-HCL、1％曲通X-100、3mMDTT和0.001wt％的溴酚蓝。方案2)0.4N氢氧化钠、0.6M氯化钾、0.05％N-月桂酰肌氨酸钠、5mMEDTA、0.6MTris-HCL、2wt％曲通X-100、8mMDTT和0.001wt％的溴酚蓝。
为了详细说明本发明方法的具体实施方式，分别按照磁珠和裂解液的体积比为1：100和1.5：100的比例将磁珠加入上述已配制好的裂解液中，即混合有磁珠的裂解液方案1)1L裂解液中加入10ml自然沉淀24小时的磁珠，混匀。混合有磁珠的裂解液方案2)1L裂解液中加入15ml自然沉淀24小时的磁珠，混匀。
为了详细说明本发明方法的具体实施方式，分别按照以下组成成分配制1L的洗涤液工作液以便后续操作使用：洗涤液方案1)0.3M氯化钾、0.001wt％的石绿、用乙酸将pH值调至4。洗涤液方案2)0.6M氯化钾、0.001wt％的石绿、用乙酸将pH值调至5。
实施例1：HBVDNA的实时荧光定量PCR检测
分别采用根据上述混合有磁珠的裂解液方案1)和洗涤液方案1)配制的试剂对临床诊断明确且经过检测HBVDNA定量值为2×101IU/ml乙肝患者血清进行如下步骤的操作：
(1)PCR裂解液的分装：将配制好的混有磁珠的裂解液按照每管100μl分装到专用PCR管中。
(2)加样：取100μl的血清加入到上述分装有混合有磁珠的裂解液的PCR管中，用吸头轻轻吹打混匀5次，室温静置10分钟。
(3)吸弃液体：将上述PCR管放置到八联排磁力架上，静置2分钟，用移液器在磁珠对侧将液体吸掉，注意勿吸掉磁珠。
(4)洗涤：从八联排磁力架上取下PCR管，并将已配制好的洗涤液每管加入200μl，重新放置到八联排磁力架上，无需等候时间直接用移液器或负压泵吸弃洗涤液，注意吸净残液。
(5)将2.0μl(1U/μl)单位的TaqDNA聚合酶与38.0μlPCR反应液(所述反应液为包括浓度40nmol/μl上下游引物和30nmol/μl探针；20nmol/μl的Tris碱；20mmol/μl氯化镁；50mmol/μl氯化钾、200umol/μl的dNTP和0.001wt％的石绿指示剂的荧光PCR扩增试剂混合液)混匀，加入到步骤(4)得到的PCR扩增管中，封盖，轻轻将磁珠弹下来，保证磁珠与PCR反应液彻底混匀。
其中正向引物序列为HBVF5’-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3’，反向引物序列为HBVR5’-GCACAGCTTGGAGGCTTGT-3’，探针序列为HBVP5’-FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB-3’。
(6)离心：水平离心机3000RPM离心45秒。
(7)将上述得到的PCR管放置于PCR仪内进行扩增。
扩增程序：37℃，2min；95℃，5分钟；进行45-50循环的95℃，10秒钟和61℃，45秒钟，在61℃检测荧光信号。
实验结果如图1所示，结果表明，按照本实例的试剂配比方案,可以有效准确检测出HBVDNA定量值为2×101IU/ml的乙肝患者血清标本。
实施例2：HBVDNA的实时荧光定量PCR检测
分别采用根据上述混合有磁珠的裂解液方案2)和洗涤液方案2)配制的试剂对临床诊断明确且经过检测HBVDNA定量值为2×101IU/ml乙肝患者血清进行如下步骤的操作：
(1)PCR裂解液的分装：将配制好的混有磁珠的裂解液按照每管100μl分装到专用PCR管中。
(2)加样：取100μl的血清加入到上述分装有混合有磁珠的裂解液的PCR管中，用吸头轻轻吹打混匀5次，室温静置5分钟。
(3)吸弃液体：将上述PCR管放置到八联排磁力架上，静置2分钟，用移液器在磁珠对侧将液体吸掉，注意勿吸掉磁珠。
(4)洗涤：从八联排磁力架上取下PCR管，并将已配制好的洗涤液每管加入200μl，重新放置到八联排磁力架上，无需等候时间直接用移液器或负压泵吸弃洗涤液，注意吸净残液。
(5)将2.0μl(1U/μl)单位的TaqDNA聚合酶与38.0μlPCR反应液(所述反应液为包括浓度40nmol/μl上下游引物和30nmol/μl探针；20nmol/μl的Tris碱；20mmol/μl氯化镁；50mmol/μl氯化钾、200umol/μl的dNTP和0.001wt％的石绿指示剂的荧光PCR扩增试剂混合液)混匀，加入到步骤(4)得到的PCR扩增管中，封盖，轻轻将磁珠弹下来，保证磁珠与PCR反应液彻底混匀。
其中正向引物序列为HBVF5’-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3’，反向引物序列为HBVR5’-GCACAGCTTGGAGGCTTGT-3’，探针序列为HBVP5’-TCACCTCTGCCTAATC-3’。
(6)离心：水平离心机3000RPM离心45秒。
(7)将上述得到的PCR管放置于PCR仪内进行扩增。
扩增程序：37℃，2min；95℃，5分钟；进行45-50循环的95℃，10秒钟和61℃，45秒钟，在61℃检测荧光信号。
实验结果如图2所示，结果表明，按照本实例的试剂配比方案,可以有效准确检测出HBVDNA定量值为2×101IU/ml的乙肝患者血清标本。
实施例3：本发明实时荧光定量PCR方法的敏感性测试
用HBVDNA为阴性的血清样本作为稀释液，将临床诊断明确且经过检测HBVDNA定量值为2×109IU/ml的乙肝患者血清依次进行稀释，分别获得HBVDNA浓度为5IU/ml、10IU/ml、20IU/ml、2×102IU/ml、2×103IU/ml、2×104IU/ml、2×105IU/ml、2×106IU/ml、2×107IU/ml、2×108IU/ml、2×109IU/ml的样品。利用与实施例1相同的方法对以上稀释样品进行实时荧光定量PCR检测。
实验结果如图3所示，其中，从右至左的曲线依此代表浓度为5IU/ml、10IU/ml、20IU/ml、2×102IU/ml、2×103IU/ml、2×104IU/ml、2×105IU/ml、2×106IU/ml、2×107IU/ml、2×108IU/ml、2×109IU/ml的样品。结果表明，本发明可检测出浓度范围在5IU/ml～2×109IU/ml的HBVDNA样品，同时表明本发明方法的灵敏度可低至5IU/ml。
实施例4：本发明实时荧光定量PCR检测的重复性测试及变异系数分析
用HBVDNA为阴性的血清样本作为稀释液，将临床诊断明确且经过检测HBVDNA定量值为2×109IU/ml的乙肝患者血清分别制备成HBVDNA浓度为20IU/ml、2.0U/m3IU/ml、2.0mlm5IU/ml和2.0mlm8IU/ml的样品，将其用于重复性测试。利用与实施例1相同的方法对上述样品分别进行6复孔检测。同时用罗氏COBASAmpliPrepTM及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒对样品进行检测，比对两种方法的重复性及变异系数。结果如图4和表1所示。图4为应用本发明对浓度为20IU/ml、2.0U/m3IU/ml、2.0mlm5IU/ml和2.0mlm8IU/ml的样品进行重复性检测，如图4所示，其实验结果重复性良好，各浓度曲线基本在同一Ct值处。表1为分别将本发明对各浓度标本重复检测的Ct值与罗氏COBASAmpliPrepTM重复检测的Ct值进行比对，结果表明，二者之间各个浓度的变异系数CV(％)无统计学差异。从而得出结论：本发明方法的检测重复性及变异系数与罗氏COBASAmpliPrepTM及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒的检测结果吻合。
表1HBVDNA实时荧光定量PCR检测的重复性测试及变异系数分析结果
以上所述COBASAmpliPrepTMmpliPrep是全自动样本处理系统，该系统使聚合酶链式反应(PCR)中样本准备步骤实现全自动，该系统利用探针或硅包被玻璃珠捕获分离用于PCR的DNA或RNA。COBASAmpliPrepTMmpliPre特点：为全自动样本处理，内含3个条型码样本架，每个可容纳24个样本，使用该仪器可用于监测靶物质，获取内对照。
COBASAmpliPrepTM操作步骤：
(1)打开COBASAmpliPrepTM和COBASTaqMan开关，等待仪器初始化程序完成，为等待(stand-by)状态。
(2)登陆电脑及相应(Amplilink)软件。
(3)装载试剂、耗材、准备样本，加载样本处理单元，关联K-carrier和K-carrier架。启动COBASAmpliPrepTM仪器。
实施例5：本发明方法检测HBVDNA结果与罗氏COBASAmpliPrepTM检测的相关性比较
分别利用实施例1的方法与实验方法与罗氏COBASAmpliPrepTM及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒，随机对临床检测的100例标本进行重复检测，对20IU/ml～1.28×108IU/ml以上的标本结果进行相关性分析。结果如图5所示，经计算得出，二者相关系数为0.984。
实施例6：本发明方法的低限值敏感性检测
利用与实施例1相同的方法，对WHO标准品标定的HBVDNA定量值分别为100IU/ml、30IU/ml和5IU/ml的血清进行20复孔的低限值重复性检测，同时用罗氏COBASAmpliPrepTM仪器及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒对样品进行检测。将二者结果进行比对，结果如表2所示，其中NT，NotTarget表示无检测信号；<20为低于检测低限值。
实验结果表明：当检测样本定量值为5IU/ml时，应用罗氏COBASAmpliPrepTM仪器及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒无法对其进行准确定量。根据罗氏COBASAmpliPrepTM仪器及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒的使用说明可知，当检测样本定量值<20IU/ml，就无法准确对样品进行准确定量。不仅如此，当检测样品定量值为30IU/ml时，罗氏COBASAmpliPrepTM仪器及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒亦会出现对个别样品定量结果不准确的现象。而使用本发明方法其灵敏度可低至5IU/ml，即可以对浓度为5～20IU/ml的样品进行准确定量。如表2所示，应用本发明方法可以对浓度5IU/ml、30IU/ml、100IU/ml的样品都作出精确的定量。
表2低限值敏感性检测结果
其中NT表示无检测信号；<20为低于检测低限值。
实施例7：本发明方法与罗氏COBASAmpliPrepTM的便捷性比较
用HBVDNA为阴性的血清样本作为稀释液，将临床诊断明确且经过检测HBVDNA定量值为2×109IU/ml的乙肝患者血清制备成HBVDNA浓度为1×107IU/ml的样本，分别制备24份、48份和96份。然后利用与实施例1相同的方法和罗氏COBASAmpliPrepTM及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒进行检测，然后对比两种检测方法所用时间、操作步骤等。实验结果如表3所示。结果表明，应用本发明对48例以内的标本进行检测仅需一个小时的时间，而相比之下使用罗氏COBASAmpliPrepTM进行检测的时间是使用本发明的4倍之多。而应用本发明进行96例标本检测，最多耗时需要90分钟，而应用罗氏COBASAmpliPrepTM需要超过12个小时。由此充分说明，本发明方法相较罗氏COBASAmpliPrepTM更为快速、便捷。此外，本发明检测成本低，单个样品检测成本为50RMB，仅为罗氏COBASAmpliPrepTM检测成本的1/6。综上所述，本发明不仅耗时短且价格低廉，更适宜临床诊断的需求。
表3方法和罗氏COBASAmpliPrepTM及其配套的HBVDNA检测商品试剂盒检测耗时及成本比较
*根据两种方法成本的市场价格计算
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应；
所述裂解液的组成为：0.2～0.4N氢氧化钠、0.3～0.6M氯化钾、0.01～0.05％N-月桂酰肌氨酸钠、5mMEDTA、0.3～0.6MTris-HCL和1～2％曲通X-100。
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述裂解液还包括3～8mMDTT。
3.根据权利要求1或2所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述裂解液还包括不多于0.001wt％的提取指示剂，所述提取指示剂选自溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹名、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种，优选为溴酚蓝。
4.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1)将混合有磁珠的裂解液加入到PCR扩增管中；
步骤2)将待检测样品加入到所述混合有磁珠的裂解液中，混匀，室温静置5～10分钟；
步骤3)将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后将混合液吸出；
步骤4)将PCR扩增管从磁力架上取下，将洗涤液加入步骤3)得到的PCR扩增管中，再将其放回磁力架上，待磁珠吸附至一侧后，立即将洗涤液吸走；
步骤5)将配制好的PCR反应液加入到步骤4)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行实时荧光定量PCR反应。
5.根据权利要求1、2或4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述混合有磁珠的裂解液中磁珠和裂解液的体积混合比例为1～1.5：100。
6.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述混合有磁珠的裂解液、待检测样品和洗涤液的体积比为1：1：2。
7.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤2)所述待检测样品的加入量为50μl～150μl，优选为100μl。
8.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤2)所述待检测样品为细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液或胸腹水，优选为血清或血浆。
9.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤4)所述洗涤液为0.3～0.6M氯化钾溶液，所述洗涤液的pH值为4～5。
10.根据权利要求10所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述洗涤液还包括不多于0.001wt％的洗涤指示剂，所述洗涤指示剂选自溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹名、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种，优选为石绿。
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