CN111518871A - 一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法 - Google Patents

一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，涉及核酸检验技术领域。所述方法包括待测样本加入蛋白酶K，加入裂解液和提取磁珠混匀反应后磁性环吸附磁珠，加入清洗液，混匀，重悬磁珠，磁性吸附磁珠，移除液体，干燥后洗脱液重悬磁珠；加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，等温扩增获得扩增产物；加入亲和素修饰的扩增子靶向富集磁珠和FAM‑DNA‑NH2‑荧光探针磁珠，孵育后形成扩增子磁珠，磁性吸附磁珠，弃上清液，干燥得到混合磁珠；加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，反应后磁性吸附磁珠，蓝光下观察。把核酸提取‑扩增‑检测一管完成，过程仅更换不同条件的反应液，结合在磁珠上的提取样本、引物、探针可实现不同反应体系的自由转换，完成精准定性检测。

Description

一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法
技术领域
本发明涉及高强纤维材料技术领域，具体是一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法。
背景技术
生物样本的核酸检测用途广泛，包括疾病诊断，科学研究，病原体诊断，物种鉴定等等，目前成熟的技术主要是依靠核酸提取及PCR扩增基因靶向核酸获取，测序、电泳、荧光定量对核酸序列进行定性，此类方法在实验室专业技术人员操作及实现难度不大，但是对于非专业人员或缺少相关专业设备的机构或个人，核酸定性的检测相当困难，以往的技术是难以实现的。
除核酸检测外，抗体检测技术也是病原体检测的一大手段，目前有胶体金试剂可完成抗体检测，方法简便，不需要设备，但是此方法相对于核酸检测，有非常明显的劣势，例如病原体感染初期进行依靠蛋白或抗体的定性，由于丰度过低，很容易出现假阴性，还有其他抗体或者病原体的干扰，此类检测也容易出现假阴性。核酸检测是病原体检测的金标准有绝对的优越性，这点抗原或抗体检测是无法代替的。
因此，早日实现核酸的无场地限制检测显得非常重要，这样可以第一时间对病原体定性，减少运输造成的病原体传播风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，所述方法包括以下步骤：
反应管的待测样本加入蛋白酶K，加入裂解液和提取磁珠混匀后反应；反应后的反应管置于磁性环境下吸附磁珠，加入清洗液，取出反应管混匀，重悬磁珠，于磁性环境下吸附磁珠，移除液体；干燥后洗脱液重悬磁珠；
加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，等温扩增获得生物素修饰的靶向的扩增产物；
所述混合磁珠加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，反应后于磁性环境下吸附磁珠，扩增子磁珠上携带的靶标DNA序列与Cas12a+crRNA复合物结合，激活Cas12a非特异性切割活性，激活的Cas12a可使固定于DNA-FAM荧光探针磁珠的DNA-FAM被切断，FAM释放游离到液相，蓝光下观察；
所述混合磁珠加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，反应后于磁性环境下吸附磁珠，扩增子磁珠上携带的靶标DNA序列与Cas12a+crRNA复合物结合，激活Cas12a非特异性切割活性，激活的Cas12a可使固定于DNA-FAM荧光探针磁珠的DNA-FAM被切断，FAM释放游离到液相，蓝光下观察；
其中所述亲和素修饰的扩增子靶向富集磁珠和FAM-DNA-NH2-荧光探针磁珠重量比为1:1。
优选的，所述待测样本加入蛋白酶K具体为：
EP管中加入待测样本后加入蛋白酶K，使用溶解液补齐至预定体积。
优选的，加入裂解液和提取磁珠摇匀，室温静置5-10min。
优选的，所述加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，混匀后在37℃～40℃下静置20min。
优选的，所述产物结合磁珠和探针磁珠混合后，静置10min后置于磁性环境下吸附磁珠。
优选的，所述Cas12a为含特异性RNA切割酶Cas12a。
优选的，所述crRNA为靶向RNA序列。
优选的，所述加入Cas12a+crRNA，重悬，等待10min后置于磁性环境下吸附磁珠。
优选的，EP管中加入待测样本溶解液补齐至0.2ml。
优选的，所述磁性环境和非磁性环境的转换通过以下装置实现，所述装置包括：
装置主体，所述装置主体内补设置有反应管安装槽；
温控组件，所述温控组件位于所述装置主体内部，用于控制反应管的温度；
磁珠分离件，所述磁珠分离件设置有磁性件，通过移动磁珠分离件的位置实现反应管中磁珠的集合与释放；
荧光可视化组件，所述荧光可视化组件包括位于所述装置主体中所述反应管安装槽底部的蓝色LED光源，以及，位于所述装置主体侧部用于观察滤光的橙色滤光片。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明把核酸的提取-扩增-检测一管内完成，过程只需要更换不同条件的反应液，结合在磁珠上的提取样本、引物、探针可实现不同反应体系的自由转换，使用一次性移液吸管，即可完成精准的核酸定性检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明实施例的流程图；
图2示出了本发明实施例核酸现场提取扩增鉴定一体化装置整体结构示意图；
图3示出了本发明实施例核酸现场提取扩增鉴定一体化装置整体结构侧视图；
图4示出了本发明实施例的反应管结构示意图；
图5示出了凝胶电泳检测结果；
图6示出了Cas12a荧光磁珠荧光检测结果。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，以下实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定，我们。
本发明实施例提供，一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，所述检验方法包括以下步骤：
反应管的待测样本加入蛋白酶K，加入裂解液和提取磁珠混匀后反应；反应后的反应管置于磁性环境下吸附磁珠，加入清洗液，取出反应管混匀，重悬磁珠，于磁性环境下吸附磁珠，移除液体；干燥后洗脱液重悬磁珠；
加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，等温扩增获得生物素修饰的靶向的扩增产物；
所述扩增产物中加入亲和素修饰的扩增子靶向富集磁珠和FAM-DNA-NH2-荧光探针磁珠，孵育后形成扩增子磁珠，置于磁性环境下吸附磁珠，弃上清液，室温静置干燥磁珠得到混合磁珠，混合磁珠为靶向扩增子磁珠及荧光探针磁珠的2合1混合磁珠，该过程除了可靶向富集扩增子外，还可以清除荧光探针磁珠降解游离的荧光信号，起到降噪作用，荧光探针磁珠的荧光信号在未游离状态下荧光被磁珠淬灭状态几乎不发光；
所述混合磁珠加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，反应后于磁性环境下吸附磁珠，扩增子磁珠上携带的靶标DNA序列与Cas12a+crRNA复合物结合，激活Cas12a非特异性切割活性，激活的Cas12a可使固定于DNA-FAM荧光探针磁珠的DNA-FAM被切断，FAM释放游离到液相，蓝光下观察，具体的蓝光为波长470nm；
其中所述亲和素修饰的扩增子靶向富集磁珠和FAM-DNA-NH2-荧光探针磁珠重量比为1:1。
具体的，上述实施在实施过程中设置阳性对照，阴性对照，目的组。分别加入等温扩增反应液和生物素修饰引物及执行后续步骤；
具体的，孵育后亲和素修饰的靶向富集磁珠与含有生物素标记的特异性扩增产物结合形成扩增子磁珠。
本发明实施例核酸提取-扩增-检测可在一管内完成，通过磁珠的富集与游离更换反应体系，实现样本、引物、探针在不同反应体系的自由转换，整个过程中待测样本未离开过反应管子，且可最大程度的保留待测样本及扩增子，大大提高了核酸定性检测的精准性。
利用多种磁珠的灵活运用，除Cas12a相关的夏洛克核酸检测技术外，其他所有依靠核酸内切酶活性的DNA/RNA体外检测方法均适用。主要特性是依靠磁珠实现核酸物质的固-液转换。利用磁珠实现核酸的不同体系的转化以及信号特异性释放。
一实施例中，所述待测样本加入蛋白酶K具体为：
EP管中加入待测样本后加入蛋白酶K，加入溶解液补齐至预定体积，具体的可以为200ul。
一实施例中，加入裂解液和提取磁珠摇匀，室温静置5-10min。
一实施例中，所述加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，混匀后在37℃～40℃下静置20min。
一实施例中，所述产物结合磁珠和探针磁珠混合后，静置10min后置于磁性环境下吸附磁珠。
一实施例中，所述Cas12a为含特异性RNA切割酶Cas12a。
一实施例中，所述crRNA为靶向RNA序列。
一实施例中，所述加入Cas12a+crRNA，重悬，等待10min后置于磁性环境下吸附磁珠。
一实施例中，EP管中加入待测样本溶解液补齐至200ul。
一实施例中，所述磁性环境和非磁性环境的转换通过以下核酸现场提取扩增鉴定一体化装置实现，如图2～4所示，所述装置包括装置主体1、温控组件3、磁珠分离件4、荧光可视化组件，所述装置主体1内补设置有反应管安装槽2，所述温控组件3位于所述装置主体1内部，用于控制反应管6的温度；
所述磁珠分离件4设置有磁性件(附图中未标记)，通过移动磁珠分离件的位置实现反应管6中磁珠8的集合与释放；
所述荧光可视化组件包括位于所述装置主体1中所述反应管安装槽2底部的蓝色LED光源7，以及，位于所述装置主体1侧部用于观察滤光的橙色滤光片5。
该核酸现场提取扩增鉴定一体化装置用于检测过程的样本转移及最终定性，磁珠分离件4可以在不同的步骤实现磁珠的结合和释放，结合在磁珠8上的提取样本、引物、探针可实现不同反应体系的自由转换，使用一次性移液吸管即可轻松完成操作；
最终反应释放的特异性荧光信号可被该核酸现场提取扩增鉴定一体化装置识别，在橙色滤光片5一侧处观察荧光，对比阴性对照-阳性对照-测试样本的荧光差异即可对成本进行准确定性。一体化装置设置温控组件3，可实现生物反应的恒温孵化。结合核酸的提取，恒温孵育，可视化为一体，且设备制造成本较低，可现实运用用原场地的核酸自检
一实施例中，所述装置主体1在设置橙色滤光片5的一侧部的相对侧部以及相邻侧部设置为避光，可以采用遮光挡板、遮光膜，或者采用遮光的材料制备，具体的可以采用黑色挡板，实现避光。
一实施例中，所述温控组件3包括加热组件(附图中未标记)，所述加热组件能够对反应管加热。
一实施例中，所述加热组件维持反应管6在37-40℃。
上述实施例在实施过程，还备有电源或者电源线为加热组件提供电源，通过加热组件的加热，保温实现反应管6维持在37-40℃条件下。
一实施例中，所述磁珠分离件4，包括磁性件，以及能够带动磁性件移动的滑动件(附图中未标记)。具体的可以采用板状结构或者杆状结构，将磁性件设置在板状结构或者杆状结构上，板状结构或者杆状结构与装置主体1采用滑动抽拉的结构，如抽屉的滑动结构。
下面结合具体的实施例，进行详细的说明，以非洲猪瘟核酸检测为例：
非洲猪瘟病毒为30k左右的双链DNA病毒，为了模拟核酸微量提取环境，我们在200ul的健康猪血中加入50fM含猪瘟目的序列Puc57-ASFv-P72-DNA的质粒标准品作为模拟样本。
待检测核酸序列为：
ACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTA。
等温扩增引物：
ASFV-1-F Bio-ACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGAT(标记生物素)
ASFV-1-R1 TAGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAG
ASFV-1-R2 TAGCAGATGCCGATACCACAAGAAGAGCCGTAG(存在SNP位点)
非洲猪瘟的Cas12a靶向引导crRNA序列：
ASFV-CrRNA：AGAGAAUUUUAUAUUAGUUcggcUUUagaaccaUUg。
Cas12a荧光磁珠探针:
FAM-TTTTTTTT-NH2-COOH-磁珠。
制备方案为化学合成FAM-TTTTTTTT-NH2修饰引物，在偶链试剂的作用下连接到COOH修饰磁珠，形成固相的荧光-PloyT10-NH2-COOH-磁珠。TTTTTTTT序列为Cas12a的非特异性切割活性激活后的剪切序列。
具体流程为：
EP管中加入非洲猪瘟模拟待测样本溶解液补齐至0.2ml，再使用50ul蛋白酶K消化样本，时长5min，室温22-37℃；
上一步反应液加入裂解液500ul裂解样本全部，同时加入提取磁珠时长10min，室温22-37℃；
使用上述装置固定反应管有磁力的一端，此时磁珠会被吸附在管壁，加入清洗液，取出反应管轻弹混匀，重悬磁珠，再放入插孔吸附磁珠，移除液体，用配套的滤纸条插入管底吸尽液体，打开管盖静置等待完全干燥；
加入洗脱液重悬磁珠。
步骤2等温扩增，包括阳性对照，阴性对照，目的组
阳性对照，阴性对照，目的组(上步骤1获得)分别加入加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，混匀放置在无磁铁位置，插入反应盒子等待20min后37度；
加入试产物结合磁珠和探针磁珠，等待10min放入上述装置，有磁珠位置吸附磁珠，吸取上清，吸水纸吸干残留。
步骤3
加入Cas12a+crRNA，含特异性DNA切割酶Cas12a和靶向CrRNA序列，重悬，插入无磁铁位置反应20min，移入磁铁位置，待磁珠吸附打开蓝光灯开关，暗处观察。
样本与阴性一直则样本为阴性，样本与阳性一致则样本为阳性。
具体的，凝胶电泳检测结果，如下图5所示，其中泳道1为marker，泳道2为Puc57-ASFv-P72-DNA酶切鉴定结果，泳道3-5为阴性样本，泳道6-8为核酸阳性样本检测结果，与预期一致。
Cas12a荧光磁珠荧光检测结果，如下图6所示，1-3为核酸阴性样本，4-6为核酸阳性样本，在470nm波长激发下透过橙色滤光片可清晰观察出明显荧光差异，可准确进行核酸定性检测。
完成测试后试剂盒84消毒再丢弃。
本发明可实现全程37度反应，不需要繁琐昂贵的温控仪器，如PCR扩增仪，使用一步法裂解样本磁珠提取，避免使用离心机进行柱式提取。最终信号使用一次性设备信号可见，且与阴性对照差异明显，摆脱需要精密仪器的核酸定性检测；整个过程时长1h内，原场地进行检测，降低传播风险；成本可控，批量生产后成本相对较低，有市场运用价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
反应管的待测样本加入蛋白酶K，加入裂解液和提取磁珠混匀后反应；反应后的反应管置于磁性环境下吸附磁珠，加入清洗液，取出反应管混匀，重悬磁珠，于磁性环境下吸附磁珠，移除液体；干燥后洗脱液重悬磁珠；
加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，等温扩增获得生物素修饰的靶向的扩增产物；
所述扩增产物中加入亲和素修饰的扩增子靶向富集磁珠和FAM-DNA-NH2-荧光探针磁珠，孵育后形成扩增子磁珠，置于磁性环境下吸附磁珠，弃上清液，室温静置干燥磁珠得到混合磁珠；
所述混合磁珠加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，反应后于磁性环境下吸附磁珠，扩增子磁珠上携带的靶标DNA序列与Cas12a+crRNA复合物结合，激活Cas12a非特异性切割活性，激活的Cas12a可使固定于DNA-FAM荧光探针磁珠的DNA-FAM被切断，FAM释放游离到液相，蓝光下观察；
其中所述亲和素修饰的扩增子靶向富集磁珠和FAM-DNA-NH2-荧光探针磁珠重量比为1:1。
2.根据权利要求1所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，所述待测样本加入蛋白酶K具体为：
EP管中加入待测样本溶解液补齐至预定体积，加入蛋白酶K。
3.根据权利要求1所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于所述，加入裂解液和提取磁珠摇匀，室温静置5-10min。
4.根据权利要求1所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，所述加入等温扩增反应液和生物素修饰引物，混匀后在37℃～40℃下静置20min。
5.根据权利要求1所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，所述孵育时间为10min。
6.根据权利要求1所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，所述Cas12a为含特异性RNA切割酶Cas12a。
7.根据权利要求1所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，所述crRNA为靶向RNA序列。
8.根据权利要求1所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，所述加入Cas12a+crRNA预混液，重悬，等待10min后置于磁性环境下吸附磁珠。
9.根据权利要求2所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，EP管中加入待测样本溶解液补齐至0.2ml。
10.根据权利要求1～9任一项所述利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法，其特征在于，所述磁性环境和非磁性环境的转换通过以下装置实现，所述装置包括：
装置主体，所述装置主体内补设置有反应管安装槽；
温控组件，所述温控组件位于所述装置主体内部，用于控制反应管的温度；
磁珠分离件，所述磁珠分离件设置有磁性件，通过移动磁珠分离件的位置实现反应管中磁珠的集合与释放；
荧光可视化组件，所述荧光可视化组件包括位于所述装置主体中所述反应管安装槽底部的蓝色LED光源，以及，位于所述装置主体侧部用于观察滤光的橙色滤光片。
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