JP2003164279A - 核酸ハイブリダイゼーションにおけるb/f分離方法 - Google Patents

核酸ハイブリダイゼーションにおけるb/f分離方法

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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 プローブとしてプローブ固定化磁性粒子
を用いた核酸ハイブリダイゼーション反応終了後のB/
F分離方法であって、反応容器の底部のみに当該磁性粒
子が不動化するように磁力制御することを特徴とするB
/F分離方法。 【効果】 本発明のB/F分離方法によれば、磁性粒子
が反応容器に吸着することがなく、上清の吸引除去及び
洗浄液注入による再懸濁を迅速かつ効率的に行うことが
でき、ハイブリダイゼーションの自動化された装置によ
るハイブリダイゼーションが迅速かつ容易に実施可能と
なる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、ハイブリダイゼー
ション反応終了後の効率的なB/F分離方法に関する。
【0002】
【従来の技術】核酸ハイブリダイゼーション法は、特定
の遺伝子を特異的に検出する手段として広く利用されて
いる。そのうち、プローブとして核酸プローブ固定化粒
子を用い、反応容器中で液体サンプル中の標的核酸と核
酸プローブ固定化粒子とをハイブリダイゼーションさ
せ、次いで固/液分離(B/F分離)した後、当該粒子
上にハイブリダイズした標的核酸量を測定するハイブリ
ダイゼーション法は、簡便かつ迅速なハイブリダイゼー
ション法であることから、特に注目されている。
【0003】B/F分離の簡便性等の点から、最近、核
酸プローブ固定化用の粒子として磁性粒子が注目されて
いる。当該磁性粒子を用いた場合のB/F分離手段とし
ては、(1)反応容器の外側側面に磁力体を配し、磁性
粒子を反応容器の内側面に吸着保持することにより、行
う方法(特許第3115501号)、(2)反応容器の
外側側面に回転する磁力体を配し、磁性粒子を反応容器
の内側面に吸脱着させることにより、行う方法(特開平
11−156231号)、(3)溶液と隔てられたスリ
ーブ中の磁気デバイスを用い、磁気デバイスを回転およ
び/または昇降させることにより、スリーブの外壁に磁
性粒子を吸着させて磁気回収、再懸濁する方法(特開平
8−29425号)等が知られている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記
(1)〜(3)の方法でB/F分離を行った場合、反応
容器やスリーブは通常プラスチックで作製されており、
磁性粒子の種類によってはそれ自体がプラスチックに吸
着しやすい特性をもっているため、磁力をオフにしても
反応容器の内壁やスリーブに吸着したままになってしま
い、その後測定する磁性粒子がうまく回収されず粒子数
が減ることから、測定の感度(精度)が落ちてしまうこ
とが判明した。また、測定の際には別の測定容器に移し
替える手間が必要であった。従って、本発明の目的は、
もれなく磁性粒子を集めることができ、高感度で迅速な
B/F分離手段を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者は、核酸ハイブ
リダイゼーション反応終了後のB/F分離について検討
したところ、磁力制御することによりプローブ固定化磁
性粒子を反応容器の底部のみに不動化するようにすれ
ば、上清の吸引により容易に液体部が除去でき、さらに
不動化状態で、又は磁力制御により磁性粒子を可動化後
に洗浄液を注入して洗浄した後、磁性粒子をもれなく集
めることができること、さらに洗浄液注入後磁力のON
−OFFを繰り返すと磁性粒子が動くので洗浄が効率的
かつ容易にできることから、高い感度の測定ができ、さ
らにB/F分離後の測定にそのまま(反応容器を他の容
器に移し替えることなく)移行できることを見出し本発
明を完成するに至った。
【0006】すなわち、本発明は、プローブとして核酸
プローブ固定化磁性粒子を用いた核酸ハイブリダイゼー
ション反応終了後のB/F分離方法であって、当該磁性
粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御
することを特徴とするB/F分離方法を提供するもので
ある。
【0007】
【発明の実施の形態】本発明のB/F分離方法において
は、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみ
に不動化されるように磁力制御すればよい。具体的には
反応容器の下部に磁力発生源を配置し、反応容器下部の
磁力をON、OFFすることにより、磁力制御すればよ
い。より具体的には、(1)反応容器下部に配置した永
久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のON−OF
Fをする手段(図1)、(2)反応容器下面で永久磁石
を水平方向に例えば半ピッチあるいは、完全に取り除く
ようにずらすことにより、磁力のON−OFFをする手
段、(3)永久磁石を備えた強磁性体を回転制御する手
段、例えば反応容器下部に配置した永久磁石を埋め込ん
だ鉄などの磁性体丸棒を回転させ、磁束の向きを変える
ことにより磁力をON−OFFする手段(図2)、ま
た、反応容器下部に配置した、磁石の一部の端面が突出
するように磁石を保持した磁性体棒を回転させ、磁力を
ON−OFFする手段(図3)、(4)永久磁石のシー
ルド材を水平方向にずらし、磁石のON−OFFをする
手段、(5)丸型電磁石により磁力のON−OFFをす
る手段、(6)馬蹄型電磁石により磁力がON−OFF
をする手段、(7)コアなしの電磁石を使って磁力のO
N−OFFをする手段等が挙げられる。これらの磁力の
ON−OFF手段のうち、(1)、(2)及び(3)の
手段が簡便であることから好ましい。例えば、図3の手
段を採用すると、磁束が磁石保持棒内部に引き寄せられ
ることなく端面延長方向に伸びる為、磁石が有する磁力
を効果的に反応容器へ向けることが可能となる。磁石を
挿入する穴は貫通せず、磁力が漏洩しない十分な厚みを
有する。これにより保持側端面の磁束は磁石保持棒内部
を通り、保持棒の外側には磁力を及ぼさない為、磁力遮
断時には反応容器への磁力を完全に遮断することが可能
となる。
【0008】本発明のB/F分離工程は、ハイブリダイ
ゼーション反応終了後、次の工程(1)及び(2)を所
定回数繰り返すことにより行われる(手段a)。 (1)当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化する
ように磁力制御して上清を吸引除去する工程、(2)当
該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該
磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工
程。
【0009】また、本発明のB/F分離工程は、ハイブ
リダイゼーション反応終了後、次の工程(1)、(2)
及び(3)を行ってもよい(手段b)。 (1)当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化する
ように磁力制御して上清を吸引除去する工程、(2)当
該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該
磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工
程、(3)磁力のON−OFFを繰り返して洗浄液中の
当該磁性粒子を動かす工程。
【0010】ここで、上記工程(1)において、反応容
器下部の磁力をONにすることにより磁性粒子を反応容
器底部にのみ不動化した状態は、図1、図2及び図3の
右側に示されている。通常、ハイブリダイゼーション用
反応容器、例えば24ウェル〜96ウェルマイクロプレ
ートは、底面が小さくなっているので、磁性粒子を底部
のみに不動化すれば、磁性粒子として磁性細菌がつくる
磁性ビーズのようなプラスチックに吸着しやすい粒子を
用いた場合でも吸着がほとんどない。
【0011】工程(2)において、反応容器下部の磁力
をOFFしても磁性粒子は容器底に集まった状態を保持
するが、洗浄液を注入することによりある程度拡散す
る。その後再度磁力をONにして磁性粒子を底に不動化
した状態で洗浄液を吸引・廃棄してもよいが、はじめか
ら磁力をON状態で洗浄することも可能である。それに
より、更に洗浄が迅速かつ効率的に行われる。
【0012】手段aにおいて、工程(1)及び工程
(2)は、1回以上、例えば1〜3回繰り返せばよい。
【0013】手段bの工程(3)は、反応容器への洗浄
液の注入を1回だけとしたにもかかわらず、十分な洗浄
を可能とし、磁性粒子に対する非特異的吸着物質を除去
する手段である。手段bによれば、工程(1)及び工程
(2)を2回繰り返す必要がないため、洗浄液注入後の
上清吸引除去工程が省略できる。従って、上清吸引操作
による磁性粒子を誤って吸引してしまうという危険性が
低減できる。
【0014】反応容器下部の磁力のON−OFFを繰り
返すことにより洗浄液中の磁性粒子が動く原理は次の如
くである。すなわち、自発磁化をもつ磁性粒子は、下か
ら与える磁場がゼロのときには、それぞれのビーズのN
極−S極が接触するように横たわっている。下から大き
なN極の磁場を与えると、磁性粒子間の磁力相互作用を
上回り、その場でちょうど90度回転するようにして磁
性粒子はS極側が下を向く。磁性粒子間の磁力相互作用
は、お互いに反発しあう極同士が向き合うことになる。
この状態から少しずつ強制磁場を小さくしていくと、磁
性粒子間の磁力相互作用が上回る時点で、磁性粒子は”
穂立ち”と呼ばれる倒立現象を起す。このように、強制
的に磁場を制御して強→弱→切断というサイクルを繰り
返すと、磁性粒子が洗浄液中で動き回ることになり、磁
性粒子表面の非特異吸着物質を解放することが可能とな
る。
【0015】工程(2)又は工程(3)終了後磁力をO
FFにすれば、反応容器中にはB/F分離の終了した被
測定用固相が残存する。また、B/F分離を行った反応
容器を図示しない測定部にそのまま移行することによ
り、底に集められた磁気粒子の発光量あるいは蛍光量を
測定することが可能となる。
【0016】本発明に使用される磁性粒子としては、水
溶液中で不溶性であり且つ磁性を示すものであるならば
特に限定されるものではない。例えば、FeO、γ-FeO、C
o-γ-FeO、(NiCuZn)O・FeO、(CuZn)O・FeO、(MnZn)O・F
eO、(NiZn)O・FeO、SrO・6FeO、BaO・6FeO、SiO2で被覆
したFeO(粒径約200A)〔Enzyme Microb.Tecnol.,vol
2,p.2-10(1980)参照〕、各種の高分子材料(ナイロン、
ポリアクリルアミド、ポリスチレン等)とフェライトと
の複合微粒子及び磁性細菌が菌体内に合成する磁性細菌
粒子等が挙げられる。当該磁性細菌粒子は、磁区が粒子
内で一定方向にあるシングルドメイン領域にあるため、
磁石を反応容器の下部に配置することで反応容器底部の
狭い領域に集めることができるため、特に好ましい。
【0017】尚、磁性細菌は、1970年代、アメリカ
で発見され、菌体内に50〜100nmの程度の粒径のマ
グネタイト(Fe34)単結晶の微粒子が10〜20個
ほど連なったマグネトソームと呼ばれるチェイン状の粒
子を保持している。磁性細菌はこのマグネトソームを保
持することで地磁気を感知し、磁力線の方向を認識する
ことができる。磁性細菌は微好気性の細菌であり、地磁
気を感知することで好気的な水面から微好気的な沈殿物
表層へ磁力線に沿って泳ぐことができる。斯かる磁性細
菌は、ANALYTICAL CHEMISTRY,VOL. 63,No. 3,FEBRUARY
1,1991 P268-P272に示されるように、単菌分離され、大
量培養が可能となっている。この磁性細菌中の磁性粒子
は、六角柱で粒径、形状が非常に均一であり、純度も高
く、粒子を含む菌体の磁化を微粒子当りに換算すると約
50emu/gである。また、保磁力は230 Oe で、単磁
区構造をとっていることが確かめられている。また、こ
の磁性粒子は、粒子表面が有機薄膜で覆われていること
から金属の溶出がほとんど起こらず安定に存在し、水溶
液中での分散性にも優れているといった特性を有してい
る。
【0018】磁性細菌からの磁性細菌粒子の抽出方法に
は、フレンチプレスを用いた物理的圧力破砕、アルカリ
煮沸、酵素処理、超音波破砕処理等が知られており、磁
性細菌粒子を大量に得る場合には、フレンチプレスによ
る破砕が適している。抽出後、磁石等により磁性細菌粒
子を分離すればよい。
【0019】核酸プローブ固定化磁性粒子としては、上
記磁性粒子に標的遺伝子のプローブとなるDNA、RN
A、PNAが固定化されているものであれば制限されな
い。また、DNAの配列に対して特異的に結合能を有す
る物質であれば、これら以外でも使用することができ
る。標的遺伝子のプローブとなり得るDNAは、それ自
体公知のものを用いることができる。プローブの磁性粒
子への固定化は、通常の架橋剤を利用した共有結合によ
る固定化が好ましい。
【0020】本発明のB/F分離手段は、自動化された
ハイブリダイゼーション装置を用いたハイブリダイゼー
ションに用いるのが好ましい。当該ハイブリダイゼーシ
ョン装置としては、図4に示すように、少なくとも
(a)反応容器保持具及び加温・冷却装置を備えてなる
ディネーチャー部5、(b)反応容器保持具及び加温・
冷却装置を備えてなるアニーリング部6、(c)反応容
器保持具及び磁力制御装置を備えてなり、核酸プローブ
固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するよう
に磁力制御できるB/F分離部7、(d)チップラック
15を備えてなるチップラック収納部8、(e)洗浄液
収容容器を備えてなる洗浄液部10、(f)廃液収容容
器を備えてなる廃液部9及び(g)複数本のチップノズ
ル14を装備し、該チップノズルにチップを装着・脱着
させる機構と、装着されたチップが処理液を吸引・注入
する機構と、反応容器の把持及び離脱を自由に行わせる
ことが可能なロボットハンド機構13とを有し、X−Z
軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてなる
ヘッド部12、より構成される自動核酸ハイブリダイゼ
ーション装置が挙げられる。
【0021】このハイブリダイゼーション装置を用いれ
ば、下記工程(1)〜(10)を自動で行い、次いで反
応容器中の標識核酸量を測定することにより、サンプル
中の核酸が検出できる。 (1)核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプ
ル核酸が注入・混合された反応容器をディネーチャー部
5に設置し、加温・冷却装置により反応容器中の温度を
核酸のディネーチャー温度に設定し、当該温度を所定時
間保持してサンプル核酸を一本鎖化する。このとき、反
応容器中の磁性粒子は、磁力制御により可動化されてい
る。 (2)アームユニットを稼働してディネーチャー部5の
反応容器をアニーリング部6に移送する。 (3)アニーリング部6の加温・冷却装置により反応容
器中の温度を核酸のアニーリング温度に設定し、当該温
度を所定時間保持してアニーリングを行なう。 (4)アームユニットをアニーリング部6に移動し、反
応容器をB/F分離部7に移送する。 (5)磁力制御装置を稼働して磁性粒子に結合したサン
プル核酸を反応容器底部に不動化させる。 (6)アームユニットをチップラック収納部8に移動
し、チップノズル14にチップ16を装着する。 (7)アームユニットをB/F分離部7に移動し、反応
容器中の上清をチップノズル14にて吸引する。 (8)アームユニットを廃液部9に移動し、チップノズ
ル内の吸引上清を廃液部9の廃棄収容容器に排出する。 (9)アームユニットを洗浄液部10に移動し、洗浄液
収容容器から洗浄液を吸引し、B/F分離部7の反応容
器中に洗浄液を注入する。 (10)(7)〜(9)の洗浄操作を所定回数繰り返
し、最後に反応容器に洗浄液を注入する。
【0022】さらに、ハイブリダイゼーションにおける
すべての反応、すなわち、ディネイチャー、アニーリン
グ及びB/F分離のすべてが、一の反応容器中において
行なわれるようにしたハイブリダイゼーション装置がよ
り好ましい。このような装置としては、反応容器保持
具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えた反応部を
有するハイブリダイゼーション装置が挙げられる。より
具体的には、少なくとも(A)反応容器保持具、加温・
冷却装置及び磁力制御装置を備えてなる反応部17、
(B)チップラック及び廃液収容容器を備えてなるチッ
プラック・廃液部18、(C)洗浄液収容容器及び加温
・冷却装置を備えてなる洗浄液部19、及び(D)複数
本のチップノズルを装備し、該チップノズルにチップを
装着・脱着させる機構と、装着されたチップが処理液を
吸引・注入する機構とを有し、X−Z軸方向へ自在に移
動可能なアームユニットを備えてなるヘッド部12、よ
り構成される自動核酸ハイブリダイゼーション装置(図
5)である。ここで、(A)の反応部における磁力制御
装置は、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部
にのみ不動化するように磁力制御可能である。
【0023】このハイブリダイゼーション装置を用い
て、下記工程(1)〜(8)を自動で行い、次いで反応
容器中の標識核酸量を測定すれば、サンプル中の核酸が
検出できる。 (1)核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプ
ル核酸が注入・混合された反応容器を反応部に設置し、
加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のディネ
ーチャー温度に設定し、当該温度を所定時間保持してサ
ンプル核酸を一本鎖化する。このとき、反応容器中の磁
性粒子は、磁力制御により可動化されている。 (2)反応容器中の温度を核酸のアニーリング温度に変
更し、当該温度を所定時間保持してアニーリングを行な
う。 (3)磁力制御装置を稼働して磁性粒子に結合したサン
プル核酸を容器の底部に不動化させる。 (4)アームユニットを稼働してチップラック・廃液部
に移動し、チップノズルにチップを装着する。 (5)アームユニットを反応部に移動し、反応容器中の
上清をチップノズルにて吸引する。 (6)アームユニットをチップラック・廃液部に移動
し、チップノズル内の吸引上清を廃棄収容容器に排出す
る。 (7)アームユニットを洗浄液部に移動し、洗浄液収容
容器から予め加温・冷却装置によりアニーリング温度に
温度調節された洗浄液を吸引し、反応部の反応容器中に
洗浄液を注入する。 (8)(5)〜(7)の洗浄動作を所定回数繰り返し、
最後に反応容器に洗浄液を注入する。
【0024】以下、図面に基づいて、本発明B/F分離
方法に用いるハイブリダイゼーション装置の具体例を説
明する。図5は、自動核酸ハイブリダイゼーション装置
の内部構成を示す概念図である。図5中の反応部17は
サンプル核酸を一本鎖(ディネーチャー)化し、次いで
一本鎖化されたサンプル核酸と特定の核酸プローブとの
ハイブリダイゼーション(アニーリング)を行い、次い
でB/F分離を行う反応部であって、反応容器を収納保
持するための保持具20と、ディネーチャー及びアニー
リングの各温度を調節する加温・冷却装置及び磁力制御
装置25で構成される(図6)。
【0025】図6に示すように、加温・冷却装置は、反
応容器保持具20を加温するヒータ21と、これを冷却
するチラー22と、温度を制御するセンサー23と、温
度を制御する温度制御装置24とを備えるものである。
温度制御装置24は、ディネーチャーでは反応容器内部
でディネーチャー反応を進行させる温度(一般的には9
5℃前後であるが、サンプル核酸の長さが短い場合はこ
れよりも低くてもよい。)にコントロールされるように
固定され、アニーリングでは、アニーリング温度(通常
40〜70℃)にコントロールされるように固定され
る。また、温度制御装置のタイマー機能により反応時間
もコントロールされる。
【0026】磁力制御装置25は、前記の如く、核酸プ
ローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化さ
れるように磁力制御できる装置であればよい。図6で
は、反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずら
すことにより磁力のON−OFFをする手段(図1)に
よる磁力制御装置が示されている。磁力制御装置として
は、永久磁石を備えた強磁性体を回転制御する磁力制御
装置、例えば図2又は図3のように、反応容器下部に配
置した永久磁石を埋め込んだ磁性体棒を回転させること
で磁力をON−OFFする手段による磁力制御装置を用
いることが好ましい。
【0027】ディネーチャー及びアニーリング反応時
は、図1、図2及び図3の左側のように反応容器下部の
磁力をOFFにしておく。アニーリング反応終了後、前
記の手段a、又は手段bにより洗浄、B/F分離を行
う。
【0028】図5における18は、チップラック・廃液
部であって、洗浄液や試薬を分注するためのディスポチ
ップを保持するチップラックと、B/F分離/洗浄時に
反応部から吸い上げた廃液を排出し、留めておくための
廃液収容容器をその下部に備えるものである。このよう
に、チップラックと廃液収容容器をヘッド部の移動平面
に対して垂直に配置することで省スペース化が図れる。
チップラックには、ディスポーザブルチップ(以下、デ
ィスポチップ)のテーパ部を支えるよう穴が空けてあ
り、測定を開始する前はそこにディスポチップがささっ
ている。
【0029】図5における19は、洗浄液部であって、
洗浄液収容容器と加温・冷却装置を備えるものである。
洗浄液は、洗浄時に反応容器内の核酸が、温度変化によ
って非特異吸着や解離をしないよう、加温・冷却装置に
よりアニーリング温度と同じ温度にコントロールされ
る。洗浄液部は必要に応じて複数設けることができる。
例えばハイブリダイズされた核酸を検出するために免疫
反応を行う場合は2つの洗浄液部が必要となる。
【0030】図5の12は、ヘッド部であり、X−Z軸
方向へ移動自在のアームユニットを有し、当該アームユ
ニットは、チップノズルと、ヘッド部を移動させる機構
と、該ヘッド部を移動させることにより該チップノズル
にチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップ
から処理液(廃液や洗浄液)を吸引・注入する機構、よ
り構成されている。
【0031】このハイブリダーゼーション装置には、必
要に応じて更に試薬収容容器を備えてなる試薬部(E)
を設けることができる。例えば、ハイブリダイズされた
核酸を検出するための標識が必要な場合は、当該標識試
薬(例えばアルカリフォスファターゼ標識アンチ−DI
G Fab'フラグメント(anti−DIG−AP)
等)や酵素発色基質(例えば、アルカリフォスファター
ゼ発光基質等)を収納するための試薬部を設ける必要が
ある。一方、予めサンプル核酸を標識したものを用いた
場合には、本試薬部を設ける必要はない。
【0032】ここで用いられる核酸ハイブリダイゼーシ
ョン法は、サンプル中の核酸と核酸プローブ固定化磁性
粒子のハイブリダイゼーションを利用するものであれ
ば、ハイブリダイゼーション法が1ステップ法であって
も2ステップ法(サンドイッチ法)であってもよい。ま
た、用いる核酸プローブも一本鎖DNA、RNA又はP
NAのいずれであってもよい。
【0033】
【実施例】上記のハイブリダイゼーション装置(図5参
照)を用いた核酸の検出法の具体例を以下に示す。 1.準備工程 (1)磁性細菌粒子の作製 磁性細菌粒子の生産のため、単菌分離された磁性細菌
Magnetopsirillum sp.AMB-1 (Matsunaga et al. 1991)
をMSGM培地(Blakemore et al. 1979)(100L)を用
いて室温で約7日間、嫌気条件下で培養した。培養3日
後にキナ酸鉄溶液を培養液1Lに対し4mL添加した。
培養した菌体は10000g、4℃で連続遠心機を用い
て回収した。10mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS,
pH7.4)を用いて懸濁した。この菌体を、1500
kg/cm2の条件下でフレンチプレス(大岳製作所、
5501M)を用いて破砕し、ネオジウム−ボロン(N
d−B)磁石を用いて破砕菌体から磁性細菌粒子を磁気
回収した。得られた磁性細菌粒子は、超音波洗浄器(Ka
ijo Denki Co. Ltd., CA4481)を用いて、PBS中で3
回以上洗浄された後、PBSに懸濁され4℃で保存し
た。
【0034】(2)検出用プローブの合成 シアノバクテリアの16SrDNAの領域において属特
異的領域を検索し、15〜20塩基内において各属間で
2〜3以上の塩基の差異が見られる領域を見出し、その
領域からMicrocystis属特異的検出用プローブDNAを
デザインした。デザインしたプローブDNAについて、
5'末端にビオチン標識された合成オリゴDNAを作製
した。
【0035】(3)DNA固定化磁性細菌粒子の作製 磁性細菌粒子への修飾は、磁性細菌膜上に存在すると考
えられるアミノ基を利用した。まず、磁性細菌AMB−
1株より抽出・精製された磁性細菌粒子(BMPs)1
mgを2.5%グルタルアルデヒドを含むPBS1mL
中に懸濁し、室温で30分間反応させることにより、磁
性細菌粒子膜上のアミノ基に対してアルデヒド基の導入
を行った。反応後、磁気回収し、PBSで3回洗浄し
た。洗浄後、修飾BMPs 1mgに対して、ストレプ
トアビジン(New England Bio Labs.)100μgをPB
S 1mL中に懸濁し、室温で2時間反応させることに
よりBMPsとストレプトアビジンを架橋した。架橋
後、PBSで3回磁気回収、及び洗浄を行った後、DN
Aの非特異吸着を押さえるためにNaBH4で未反応の
アルデヒド基を還元し、ストレプトアビジン固定化BM
Ps(SA−BMPs)とした。作製したSA−BMP
s 300μgに対して5′末端にビオチン標識したオ
リゴDNA 300pmolをPBS 300μl中で
アビジン・ビオチン反応を行わせ、オリゴDNA固定化
磁性細菌粒子(DNA−BMPs)を作製した。
【0036】(4)サンプルDNAの調製 シアノバクテリアからのゲノムDNAの抽出は、MagExt
ractor-genome-の抽出法を改良した方法により抽出を行
った。抽出された全ゲノムDNAに対して、原核微生物
を16SrDNA増幅用プライマーRSF−1、RSR
−2(E.coli 1523-1542ntのアンチセンス)(Kawaguchi
et al.1992)を用い、PCRによって遺伝子増幅を行っ
た。尚、遺伝子増幅の際に、蛍光、発光若しくは電気化
学的シグナルによって検出可能な蛍光色素、アルカリフ
ォスファターゼ、フェロセン等のマーカーで標識したd
UTPを用いてPCRを行うことで標識されたサンプル
核酸を調製することができる。例えば、FITC標識さ
れた16SrDNAを合成する場合には、蛍光物質であ
るFITC標識されたdUTPを用いてPCRを行えば
よい。
【0037】(5)装置への試薬等の設置 100μgのプローブDNA固定化磁性粒子と、10
0μlのサンプルDNAをクイクロプレート等の反応容
器で混合し、十分に攪拌した後、本装置の反応部に設置
する。 チップノズルを保持したチップラックを滅菌後、チッ
プラック・廃液部に設置する。 洗浄液を収容する洗浄液収容容器を、洗浄部に設置す
る。
【0038】2.ディネーチャー工程 装置の始動スイッチを投入し、反応部1の加温・冷却装
置の温度制御機能を稼働させ、反応容器を95℃に温め
る。このまま5分間保持することにより、反応容器中の
サンプル核酸の一本鎖化を行う。
【0039】3.アニーリング工程 温度を60℃に冷却し、このまま10分間保持すること
により、容器中の核酸プローブ固定化磁性細菌粒子とサ
ンプル核酸のアニーリングを行う。
【0040】4.B/F分離 アニーリング終了後、容器真下に設置された磁気制御装
置を稼働して磁気吸引力を発生させ、磁性粒子を容器底
面に集める。磁気制御装置を動作させてから約3分間そ
のまま待機する。この時、反応容器は60℃に維持され
る。
【0041】5.洗浄工程 チップラック・廃液部上に移動させたアームユニットを
下方へ移動させ、チップノズルとディスポチップを嵌合
させることで、チップラック・廃液部に保持されたチッ
プノズルを装着する。アームユニットを反応部へ移動さ
せ、そのまま降下させて、適当な位置で停止後、チップ
ノズルにて反応容器中の上清を吸引し、廃液部に移動し
て排出させる。その後、アームユニットを洗浄液部へ移
動させ、洗浄液収容容器より60℃に維持された洗浄液
を吸引し、再びアームユニットを反応部へ移動させ、反
応容器中にこれを注入する。約3分間の待機後、再びチ
ップノズルで反応容器中の上清を吸引し、チップラック
・廃液部に排出する。この洗浄動作を3回繰り返し、最
後に洗浄液を注入し動作を終了する。
【0042】動作終了後も反応部の磁気吸引力は維持さ
せ、温度は0〜15℃、好ましくは4℃で維持するよう
に制御する。これにより、反応溶液中の磁性体が容器底
部に凝集した状態を保ち、溶液の性質が変質することを
防ぐことができる。尚、洗浄液部の温度制御は切断す
る。また、反応容器には、装置外からの光を遮断するた
めのカバーを装着することにより、核酸中に取り込んだ
蛍光物質の劣化を防ぐことができる。
【0043】6.検出 反応容器を装置から取出し、容器を移し替えることな
く、蛍光プレートリーダ(FLUOstarTM)によって反
応容器内に生じる光の変化を測定する。この結果、Micr
ocystis aeruginosa NIES-98のPCR産物試料から最も
強い発光が観察され、Microcystis属を特異的に検出で
きることが明らかとなった。
【0044】
【発明の効果】本発明のB/F分離方法によれば、磁性
粒子が反応容器に吸着したままになることがなく、磁性
粒子をもれなく集めることによって高い感度の測定がで
き、さらにB/F分離後の測定にそのまま(反応容器を
他の容器に移し替えることなく)移行でき、ハイブリダ
イゼーションの自動化された装置によるハイブリダイゼ
ーションが迅速かつ容易に実施可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向に
ずらすことにより磁力のON−OFFをする磁力制御の
例を示す図である。
【図2】磁性粒子下部に配置した永久磁石を埋め込んだ
磁性体丸棒を回転させ、磁束の向きを変えることにより
磁力のON−OFFをする磁力制御の例を示す図であ
る。
【図3】磁性粒子下部に配置した、磁石の一部の端面が
突出するように磁石を保持した磁性体棒を回転させ、磁
力をON−OFFする磁力制御の例を示す図である。
【図4】ハイブリダイゼーション装置の例の内部構成を
示す図である。
【図5】ハイブリダイゼーション装置の例の内部構成を
示す図である。
【図6】図5のハイブリダイゼーション装置の反応部の
内部構成を示す図である。
【符号の説明】
1:反応容器 2:溶液 3:磁性粒子 4:磁石 5:ディネーチャー部 6:アニーリング部 7:B/F分離部 8:チップラック収納部 9:廃液部 10:洗浄液部 11:試薬部 12:ヘッド部 13:ロボットハンド機構 14:ノズル 15:チップラック 16:チップ 17:反応部 18:チップラック・廃液部 19:洗浄液部 20:反応容器保持具 21:ヒーター 22:チラー 23:温度センサー 24:温度制御装置 25:磁力制御装置
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宇田川 雄司 東京都調布市国領町8−2−1 ジューキ 株式会社内 (72)発明者 根本 越男 東京都調布市国領町8−2−1 ジューキ 株式会社内 (72)発明者 丸山 浩平 東京都調布市国領町8−2−1 ジューキ 株式会社内 Fターム(参考) 2G045 AA40 BA01 DA13 FB02 4B024 AA11 CA01 CA09 GA19 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ42 QR32 QR38 QR55 QR66 QR82 QS25 QS34 QS39 QX01

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 プローブとして核酸プローブ固定化磁性
    粒子を用いた核酸ハイブリダイゼーション反応終了後の
    B/F分離方法であって、当該磁性粒子が反応容器の底
    部のみに不動化するように磁力制御することを特徴とす
    るB/F分離方法。
  2. 【請求項2】 B/F分離工程が、ハイブリダイゼーシ
    ョン反応終了後、次の工程(1)及び(2)を所定回数
    繰り返すものである請求項1記載のB/F分離方法。 (1)当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化する
    ように磁力制御して上清を吸引除去する工程、 (2)当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御
    して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入
    する工程。
  3. 【請求項3】 B/F分離工程が、ハイブリダイゼーシ
    ョン反応終了後、次の工程(1)、(2)及び(3)を
    行うものである請求項1記載のB/F分離方法。 (1)当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化する
    ように磁力制御して上清を吸引除去する工程、 (2)当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御
    して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入
    する工程、 (3)磁力のON−OFFを繰り返して洗浄液中の当該
    磁性粒子を動かす工程。
  4. 【請求項4】 磁力制御及び磁力のON−OFFが、永
    久磁石を備えた強磁性体を回転制御するものである請求
    項1〜3のいずれか1項記載のB/F分離方法。
  5. 【請求項5】 ハイブリダイゼーション反応が、反応容
    器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えてな
    る反応部で行なわれるものである請求項1〜4のいずれ
    か1項記載のB/F分離方法。
  6. 【請求項6】 ハイブリダイゼーション反応が、少なく
    とも(A)反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制
    御装置を備えてなる反応部、(B)チップラック及び廃
    液収容容器を備えてなるチップラック・廃液部、(C)
    洗浄液収容容器及び加温・冷却装置を備えてなる洗浄液
    部、及び(D)複数本のチップノズルを装備し、該チッ
    プノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着され
    たチップが処理液を吸引・注入する機構とを有し、X−
    Z軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてな
    るヘッド部、より構成される自動核酸ハイブリダイゼー
    ション装置を用いて行なわれるものである請求項1〜5
    のいずれか1項記載のB/F分離方法。
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