WO2005063982A1 - 標的物質の検出方法 - Google Patents

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WO2005063982A1
WO2005063982A1 PCT/JP2004/019601 JP2004019601W WO2005063982A1 WO 2005063982 A1 WO2005063982 A1 WO 2005063982A1 JP 2004019601 W JP2004019601 W JP 2004019601W WO 2005063982 A1 WO2005063982 A1 WO 2005063982A1
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WO
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probe
particles
particle
target substance
magnet
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PCT/JP2004/019601
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hideji Tajima
Original Assignee
Universal Bio Research Co., Ltd.
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Publication date
Application filed by Universal Bio Research Co., Ltd. filed Critical Universal Bio Research Co., Ltd.
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Priority to US11/477,836 priority patent/US20080268545A1/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention provides a method for separating a conjugate of a first probe, a second probe, and a target substance from a reaction mixture obtained by reacting a first probe, a second probe, and a target substance
  • the present invention relates to a method of reacting a probe, a second probe, and a target substance, and a method of detecting a target substance using the first probe and the second probe.
  • a method for detecting a target nucleic acid for example, a first oligonucleotide that hybridizes to a first segment of a target nucleic acid, a detection probe that also has a labeling force added to the first oligonucleotide
  • a method using a hybridizing second oligonucleotide and a capture probe added to the second oligonucleotide and having a capturing ability see Patent Document 1.
  • the above-mentioned hybridization form is separated by using the capture group of the capture probe. Then, the hybridized body is detected based on the label of the detection probe.
  • the label strength can be enhanced and the detection accuracy of the target nucleic acid can be improved. Therefore, the target nucleic acid can be detected even if the amount of the target nucleic acid is small (that is, the target nucleic acid is not amplified by PCR or the like).
  • a magnetic particle is used as a capturing group to be added to the second oligonucleotide, the formation and separation of the above-mentioned hybridization body can be easily and rapidly performed by controlling the magnetic force. be able to.
  • a method for separating magnetic particles by magnetic force control for example, a method using a dispenser (see Patent Documents 2 and 3) is known.
  • a magnet is arranged on a pipette tip of a dispenser that sucks and discharges a liquid from the inside of a container, and the magnet is actuated so that magnetic particles in the liquid sucked into the pipette tip are removed from the inner wall surface of the pipette tip. Magnetic particles while keeping the The inner wall force of the pet tip is also released, and the pet tip is discharged to the outside of the pipette tip together with the liquid.
  • Patent Document 1 JP-A-6-311899
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3115501
  • Patent Document 3 JP-A-8-320274
  • a first probe having a labeled particle and a first oligonucleotide immobilized on the labeled particle, and a second probe having a magnetic particle and a second oligonucleotide immobilized on the magnetic particle may be used.
  • the hybridization form of the first probe, the second probe, and the target nucleic acid is a huge molecule containing labeled particles and magnetic particles. Therefore, when the above-mentioned hybridization body is formed and separated using a dispenser, the impact of the suction and discharge of the dispenser causes breakage and decomposition of the above-mentioned hybridization body. There is a risk.
  • the present invention provides a first probe having a first particle (eg, a labeled particle) and a first binding substance (eg, a first oligonucleotide) immobilized on the first particle, and a second particle (eg, a first oligonucleotide).
  • a first mixture is obtained from a reaction mixture obtained by reacting a second probe having a second binding substance (for example, a second oligonucleotide) immobilized on a magnetic particle) and a second particle with a target substance (for example, a target nucleic acid).
  • the conjugate of the probe, the second probe and the target substance is not destroyed, decomposed, etc.! / ⁇ It is an object of the present invention to provide a method for separating the conjugate under mild conditions.
  • the present invention also provides a first probe having a first particle (eg, a labeled particle) and a first binding substance (eg, a first oligonucleotide) immobilized on the first particle; (E.g., magnetic particles) and a second probe having a second binding substance (e.g., a second oligonucleotide) immobilized on the second particles, and a target substance (e.g., a target nucleic acid) by combining the first probe, the second probe, and the target
  • a first probe having a first particle (eg, a labeled particle) and a first binding substance (eg, a first oligonucleotide) immobilized on the first particle
  • a second binding substance e.g., a second oligonucleotide
  • a target substance e.g., a target nucleic acid
  • the present invention provides a first probe having a first particle (eg, a labeled particle) and a first binding substance (eg, a first oligonucleotide) immobilized on the first particle; (E.g., magnetic particles) and a second binding substance (e.g., a second oligonucleotide) immobilized on the second particles, resulting in destruction, decomposition, etc. of the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance.
  • the present invention provides, as a first invention, a first probe having a first particle and a first binding substance immobilized on the first particle; A second probe having a different second particle and a second binding substance fixed to the second particle, a first portion to which the first binding substance can bind, and the second binding substance
  • the reaction mixture obtained by reacting the first probe, the second probe, and the target substance includes an unreacted first probe (bound to the target substance! /, Na !, first probe),
  • the second probe in the reaction bound to the target substance, the second probe), the unreacted target substance (target substance not bound to either the first probe or the second probe), and the first probe
  • a conjugate of the target substance, a conjugate of the second probe and the target substance, a conjugate of the first probe and the second probe and the target substance, and the like can be included. However, not all of them are included in the reaction mixture.For example, depending on the reaction procedure, reaction conditions, etc., the conjugate between the first probe and the target substance or the conjugate between the second probe and the target substance If not included, etc.
  • the mass and volume of the first particles are much larger than the mass and volume of the first binding substance.
  • the mass and volume of the second particles are much larger than the mass and volume of the second binding substance. Since the mass and volume of the first and second particles are much larger than the mass and volume of the target substance, the specific gravity of the first probe is the specific gravity of the first particle, and the specific gravity of the second probe is the specific gravity of the second particle.
  • the specific gravity of the conjugate of the first probe and the target substance is the specific gravity of the first particle
  • the specific gravity of the conjugate of the second probe and the target substance is the specific gravity of the second particle
  • the first probe and the second probe are The specific gravity of the conjugate with the target substance can be approximated to the specific gravity of the particle composite of the first particle and the second particle.
  • the specific gravity of the second particles is greater than the specific gravity of the first particles! /
  • the specific gravity of the reaction mixture is lower than that of the second particles, which is higher than that of the first particles, and
  • the mixture is allowed to stand, and the unreacted second probe, the conjugate of the second probe and the target substance, and the first probe and the second probe are mixed.
  • the conjugate of the probe and the target substance precipitates, and the unreacted first probe and the conjugate of the first probe and the target substance float.
  • the reaction mixture is mixed with the first particles having a specific gravity larger than the first particles and having a specific gravity smaller than the first particles.
  • the mixture is allowed to stand, and then the unreacted second probe, the conjugate of the second probe and the target substance, and the first probe and the second probe.
  • the conjugate of the target and the target substance floats, and the unreacted first probe and the conjugate of the first probe and the target substance precipitate.
  • the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance is treated as a sediment or a float under mild conditions under which the conjugate does not break or decompose. Can be separated.
  • the sediment or the floating substance may include the unreacted second probe and the conjugate of the second probe and the target substance together with the conjugate of the first probe, the second probe and the target substance. However, it may not include the unreacted first probe and the conjugate of the first probe and the target substance.
  • the first probe is labeled (for example, the first particle is a labeled particle), and the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance is detected based on the label. It is important when
  • the reaction mixture may include a reaction solvent.
  • the specific gravity of the liquid varies depending on the mixing of the reaction solvent. There is no problem if the above conditions regarding specific gravity are satisfied even after the change, but if the above conditions are not satisfied after the change, the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance should be separated as a sediment or float. Can not. Therefore, it is preferable to reduce the amount of the reaction solvent contained in the reaction mixture as much as possible and to prevent the fluctuation of the specific gravity of the liquid as much as possible.
  • the first particles and the Z or second particles are magnetic particles
  • the reaction mixture includes the first probe, the second probe, and the target substance. It is preferable that the reaction solution is obtained by reacting in a reaction solvent contained in a vessel and then removing the reaction solvent in a state where a magnet is arranged near the outer wall surface of the container.
  • the change in the specific gravity of the liquid can be prevented by reducing the amount of the reaction solvent contained in the reaction mixture.
  • the magnet acts on the magnetic particles, so that the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance can be held in the container. Therefore, a decrease in the amount of the conjugate contained in the reaction mixture can be prevented.
  • the first particles are non-magnetic particles and the second particles are magnetic particles.
  • the magnet acts on the magnetic particles to retain the unreacted second probe, the conjugate of the second probe and the target substance, and the conjugate of the first probe, the second probe and the target substance in the container.
  • the unreacted first probe and the conjugate of the first probe and the target substance can be removed together with the reaction solvent, the unreacted first probe and first probe contained in the reaction mixture can be removed. The amount of the conjugate between the probe and the target substance can be reduced.
  • the present invention provides, as a second invention, a first probe having a first particle and a first binding substance immobilized on the first particle; A second probe having a second binding substance immobilized on the two particles, a first portion to which the first binding substance can bind, and a target substance having a second portion to which the second binding substance can bind.
  • first particles and Z or the second particles are magnetic particles
  • a first step of containing the first probe, the second probe, the target substance, and a reaction solvent in a container A second step of applying a magnet to the magnetic particles in the container through a predetermined region of the outer wall surface of the container, a third step of releasing the operation of the magnet, and the second step of changing the position of the predetermined region. Repeat Step 2 and Step 3 To provide the method comprising the fourth step.
  • the molecules containing the magnetic particles move in the reaction solvent toward the predetermined area after the change. Moving. Therefore, when the second step and the third step are repeated while changing the position of the predetermined region, the molecules including the magnetic particles move in the reaction solvent while changing the moving direction. As a result, the probability of encountering a molecule containing a magnetic particle with another molecule is improved, and The reaction between the molecule including the particle and another molecule can be promoted.
  • the first probe, the second probe, and the target substance are connected to each other by adjusting the magnetic amount (magnetic charge) of the magnet and the movement speed of the molecule including the magnetic particles.
  • the reaction can be carried out under mild conditions without destruction, decomposition, or the like of the conjugate of the probe and the target substance.
  • the predetermined area and the magnet are brought close to each other to cause the magnet to act, and in the third step, the predetermined area and the magnet are connected to each other. It is preferable that the action of the magnet is released by separating the magnets, and in the fourth step, the approach and the separation between the magnet and the predetermined area are repeated while changing the position of the predetermined area.
  • the first probe, the second probe, and the target substance can be connected to each other by adjusting the magnetic amount (magnetic charge) of the magnet, the distance between the container and the magnet, the approach speed, the separation speed, and the like. No destruction, decomposition, etc., occur in the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance, and the reaction can be performed under mild conditions.
  • the position of the predetermined region is changed in a circumferential direction or a longitudinal direction of the container.
  • the molecules including the magnetic particles move in the reaction solvent in various directions, the probability of encountering the molecules including the magnetic particles with other molecules is further improved, and the molecules including the magnetic particles are further improved. And the reaction with other molecules can be further promoted.
  • the present invention provides, as a third invention, a first probe having a first particle and a first binding substance fixed to the first particle, a second particle and the second probe, Using a second probe having a second binding substance immobilized on two particles, a first part capable of binding the first binding substance and a second part capable of binding the second binding substance
  • the present invention provides, as a fourth invention, a first probe having a first particle and a first binding substance immobilized on the first particle; Using a second probe having a second binding substance immobilized on two particles, a first part capable of binding the first binding substance and a second part capable of binding the second binding substance
  • a method for detecting a target substance wherein a labeled particle is selected as the first particle, a specific gravity is smaller than the first particle as the second particle, and the first step is to select a particle.
  • a particle composite comprising the first particles and the second particles After mixing with a liquid having a large specific gravity, a third step of allowing the sediment and floating material to stand is formed, and the first and second probes contained in the floating material and the target substance are mixed with each other. Providing the method comprising a fourth step of detecting a conjugate based on the label of the first particle.
  • the conjugate can be separated as a sediment or a float.
  • the sediment or float may include a conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance, as well as an unreacted conjugate of the second probe and the second probe and the target substance.
  • the first probe of the reaction and the conjugate of the first probe and the target substance cannot be included. Therefore, the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance contained in the sediment or the floating substance can be detected based on the label of the first particle.
  • the first particles and Z or magnetic particles are selected as the second particles, and in the second step, the first probe and the second particle are selected.
  • the reaction solvent is removed with a magnet placed near the outer wall surface of the container, and Preferably, the reaction mixture is obtained.
  • the change in the specific gravity of the liquid can be prevented by reducing the amount of the reaction solvent contained in the reaction mixture.
  • the magnet acts on the magnetic particles, so that the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance can be held in the container. Therefore, a decrease in the amount of the conjugate contained in the reaction mixture can be prevented.
  • nonmagnetic particles are selected as the first particles
  • magnetic particles are selected as the second particles.
  • the reaction mixture when the reaction mixture is mixed with the above liquid to form a sediment and a floating substance, the unreacted first probe and the conjugate of the first probe and the target substance become the first probe, the second probe, and the target substance.
  • the possibility of contaminating sediments or floats containing conjugates with the target substance can be reduced, and the detection accuracy of the conjugate of the first and second probes and the target substance contained in the sediment or floats can be improved. It can be done.
  • the first particles and Z or magnetic particles are selected as the second particles, and in the second step, the second particles are selected by the method of the second invention. It is preferable to react one probe, the second probe, and the target substance.
  • the first probe, the second probe, and the target substance are not broken, decomposed, or the like in the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance.
  • the reaction can be performed under mild conditions.
  • the magnet in the second step, after reacting the first probe, the second probe, and the target substance, the magnet is disposed near the outer wall surface of the container. It is preferable to remove the reaction solvent in this state to obtain the reaction mixture. This makes the reaction The amount of the reaction solvent contained in the mixture can be reduced, and the fluctuation of the specific gravity of the liquid can be prevented. In addition, when the reaction solvent is removed, the magnet acts on the magnetic particles, so that the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance can be held in the container. A decrease in the amount of the conjugate can be prevented.
  • nonmagnetic particles are selected as the first particles and magnetic particles are selected as the second particles.
  • the unreacted second probe, the conjugate of the second probe and the target substance, and the conjugate of the first probe, the second probe and the target substance can be held in the container, while the unreacted second probe Since one probe and the conjugate of the first probe and the target substance can be removed together with the reaction solvent, the amount of the unreacted first probe and the conjugate of the first probe and the target substance contained in the reaction mixture can be reduced. Can be reduced.
  • the reaction mixture when the reaction mixture is mixed with the above liquid to form a sediment and a floating substance, the unreacted first probe and the conjugate of the first probe and the target substance become the first probe, the second probe, and the target substance.
  • the possibility of contaminating sediments or floats containing conjugates with the target substance can be reduced, and the detection accuracy of the conjugate of the first and second probes and the target substance contained in the sediment or floats can be improved. It can be done.
  • magnetic particles are selected as the second particles, and in the second step, the sample containing the target substance and the second probe are mixed.
  • the conjugate of the second probe and the target substance is recovered by magnetic force control, and the conjugate of the second probe and the target substance is reacted with the first probe.
  • a first probe having a first particle (eg, a labeled particle) and a first binding substance (eg, a first oligonucleotide) immobilized on the first particle, and a second particle (eg, (E.g., magnetic particles) and a second probe having a second binding substance (e.g., a second oligonucleotide) immobilized on the second particles and a target substance (e.g., a target nucleic acid).
  • a method for separating a conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance from the reaction mixture is not destroyed or decomposed under mild conditions./ ⁇
  • a first probe having a first particle (eg, a labeled particle) and a first binding substance (eg, a first oligonucleotide) immobilized on the first particle;
  • a second probe having a probe (e.g., a magnetic particle) and a second binding substance (e.g., a second oligonucleotide) immobilized on the second particle; and a target substance (e.g., a target nucleic acid).
  • a method is provided in which the conjugate of the second probe and the target substance is not destroyed or decomposed, and the reaction is performed under mild conditions.
  • a first probe having a first particle (eg, a labeled particle) and a first binding substance (eg, a first oligonucleotide) immobilized on the first particle;
  • a probe e.g., a magnetic particle
  • a second binding substance e.g., a second oligonucleotide
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a dispenser used in an embodiment of the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic sectional view showing each step (step ad) of the embodiment.
  • FIG. 3 is a schematic sectional view showing each step (step eh) of the embodiment.
  • FIG. 4 is a schematic sectional view showing each step (step i-k) of the embodiment.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing each step (step 11-n) of the embodiment.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view showing each step (step o-q) of the embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic sectional view showing each step (step r-u) of the embodiment.
  • FIG. 8 (a) is a schematic view showing an embodiment of a method for causing a magnet to act on magnetic particles in a container through a predetermined region while changing the position of a predetermined region on the outer wall surface of the container in the circumferential direction of the container. It is a schematic plan view, and (b) is a schematic plan view showing another embodiment of the method.
  • FIG. 9 is a schematic plan view showing another embodiment of a method of causing a magnet to act on magnetic particles in the container through the predetermined region while changing the position of the predetermined region on the outer wall surface of the container in the circumferential direction of the container.
  • FIG. 10 (a) is a schematic view showing one embodiment of a method of causing a magnet to act on magnetic particles in a container through a predetermined region while changing the position of a predetermined region on the outer wall surface of the container in the longitudinal direction of the container. It is a side view, (b) is a perspective view showing other embodiments of the same method.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing a binding state between a probe and a target nucleic acid.
  • Target nucleic acid target substance
  • the constituent material of the particles is not particularly limited as long as it is insoluble in various liquids (for example, a reaction solvent, a washing solution, etc.) used in the method of the present invention.
  • Specific examples thereof include styrene. , Chlorostyrene, chloromethinolestyrene, ⁇ -methylstyrene, divininolebenzene, sodium styrenesulfonate, (meth) acrylic acid, methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, ⁇ —Butyl, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, polyoxyethylene (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, ethylene glycol di- (meth) acrylate, tribromophenyl (meth) acrylate, Tribromopropyl atalylate, (meth) acrylonitrile, (meth) acrolein, (meth) acryl
  • Cross-linked products of polysaccharides such as carboxymethyl cellulose, cross-linked products of proteins such as methylamine albumin, gelatin, collagen, casein; inorganic materials such as glass and ceramics; metals such as iron and silicon; composite materials of these And the like.
  • the substance exhibiting magnetism (magnetic material) contained in the magnetic particles is not particularly limited. Specific examples thereof include metals such as Fe, Ni, Co, Gd, Tb, and Dy; Alloys such as Fe—Co, Fe—Al, Fe—Si—Al, Fe—Ni—Mo, Al—Ni—Co, Sm—Co, Nd—Fe—B; intermetallic compounds; Fe O, Fe O — NiO—ZnO, Fe O—CuO—ZnO, Fe O— MnO—ZnO, etc.
  • metals such as Fe, Ni, Co, Gd, Tb, and Dy
  • Alloys such as Fe—Co, Fe—Al, Fe—Si—Al, Fe—Ni—Mo, Al—Ni—Co, Sm—Co, Nd—Fe—B
  • intermetallic compounds Fe O, Fe O — NiO—ZnO, Fe O—CuO—ZnO, Fe O— MnO—ZnO, etc.
  • the magnetic particles for example, ferromagnetic particles, high magnetic susceptibility, paramagnetic particles, and the like can be used. It is preferable that the residual magnetism is small in order to improve the dispersibility in the liquid after the action of the magnet, and it is preferable that the saturation magnetism is large in order to improve the reactivity with the magnet. .
  • the magnetic particles may be anisotropic, but are preferably isotropic.
  • the shape of the particles is not particularly limited, and a specific example thereof is a sphere.
  • the particle size of the particles is not particularly limited as long as the particles can settle or float under the influence of gravity and buoyancy in a standing liquid.
  • a specific range is, for example, about 0. m—about 100 m.
  • the labeling of the labeled particles is not particularly limited, and specific examples thereof include Marine Blue, Cascade Blue, Cascade Yellow, Fluorescein, Rhodamine, Phycoerythnn, CyChrome, PerCP, Texas Red, Allophycocyanin, PharRed and the like. , Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7 and other Cy dyes, Alexa-488, Alexa-532, Alexa-546, Alexa-633, Alexa-680 etc. Alexa dyes, BODIPY FL, BODIPY TR- etc. Labeling with fluorescent compounds such as BODIPY dyes; chemistry of luminol, lucigenin, ataridium ester, etc.
  • Chemiluminescent labeling with a luminescent compound can be detected according to standard methods.
  • the target substance is not particularly limited, and specific examples thereof include biological substances such as nucleic acids, proteins, antigens, antibodies, enzymes, and sugar chains.
  • the nucleic acid includes DNA, RNA, and analogs or derivatives thereof (for example, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, and the like).
  • the binding substance is not particularly limited as long as it can bind to the target substance, and specific examples thereof include biological substances such as nucleic acids, proteins, antigens, antibodies, enzymes, and sugar chains. Specific examples of the combination of the target substance and the binding substance include a nucleic acid Z complementary nucleic acid, a receptor protein Z ligand, an enzyme Z substrate, an antibody Z antigen, and the like.
  • the first probe and the second probe may simultaneously bind to the target substance. it can.
  • the binding substance preferably binds specifically to the target substance.
  • “Specifically binds” means that it does not bind to any part other than the predetermined portion of the target substance.
  • “specifically binds” means that they hybridize under stringent conditions, and the stringent conditions include, for example, 2 ° C., 2 ° C. XS SC and 0.1% SDS conditions, preferably 65. C, 0.1 X SSC and 0.1% SDS.
  • the number of binding substances immobilized on one particle is not particularly limited, and may be one or more, but usually is plural.
  • Immobilization of the binding substance to the particles can be performed by various binding modes.
  • Specific examples of the binding mode include specific interaction between streptavidin or avidin and biotin, hydrophobic interaction, magnetic interaction, polar interaction, and covalent bond (e.g., amide bond, disulfide bond, thioether bond, etc.). And crosslinking with a crosslinking agent.
  • the particle surface can be immobilized by these binding modes. Appropriate chemical modification can be applied to the surface or the binding substance.
  • maltose binding protein Z maltose In addition to the specific interaction between streptavidin or avidin and biotin, maltose binding protein Z maltose, polyhistidine peptide Z metal ions such as nickel and cobalt, glutathione s transferase Z glutathione, canolemodulin Z force lumodulin binding Immobilize binding substances to particles using specific interactions such as peptide, ATP binding protein ZATP, nucleic acid Z complementary nucleic acid, receptor protein Z ligand, enzyme Z substrate, antibody Z antigen, IgGZ protein A, etc. You can do it too.
  • binding of a binding substance into which biotin has been introduced can be bound to particles coated with avidin or streptavidin.
  • a binding substance into which biotin has been introduced for example, a biotinylated nucleic acid obtained by performing PCR using a primer having a 5′-end biotinylated
  • binding of a binding substance into which biotin has been introduced can be bound to particles coated with avidin or streptavidin.
  • a binding substance into which biotin has been introduced for example, a biotinylated nucleic acid obtained by performing PCR using a primer having a 5′-end biotinylated
  • a covalent bond can be formed using a functional group present on the particle surface or the binding substance.
  • the functional group capable of forming a covalent bond include a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, and the like.
  • the carboxyl group is activated with a carposimide such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarboimide hydrochloride (EDC).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarboimide hydrochloride
  • the amino group When an amino group is present on the surface of the particles, the amino group is converted to a carboxyl group using a cyclic acid anhydride such as succinic anhydride, and then reacted with the amino group present in the binding substance.
  • a cyclic acid anhydride such as succinic anhydride
  • crosslinking by a crosslinking agent various crosslinking agents capable of reacting with the functional group of the substance to be crosslinked can be used.
  • the crosslinking agent include polyfunctional reagents such as bifunctional reagents and trifunctional reagents.
  • Specific examples of such multifunctional reagents include N-succinimidyl (4-diodeacetyl) aminobenzoate (
  • N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate) (SIAB), dimalimide (dimaleimide), dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB), N-succinimidyl-S-acetyl- Thioacetate (N-succinimidy U-S-acetyH: hioacetate) (SATA), N- Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SATA), N- Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SATA), N- Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SATA), N- Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SATA), N- Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SATA), N- Succinimid
  • SMCC 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)
  • HYNIC 6-hydrazinonicotimide
  • the reaction solvent used when reacting the first probe, the second probe, and the target substance is not particularly limited as long as the reaction is not hindered, and examples thereof include a buffer solution.
  • the composition of the reaction solvent can be appropriately adjusted depending on the types of the target substance and the binding substance, and the like.
  • the order in which the first probe, the second probe, the target substance, and the reaction solvent are contained in the container is not particularly limited, and may be any order. They may be housed separately in the order, or two or more kinds in any combination may be housed simultaneously.
  • the first probe and the target substance may be in a bonded state, or may be in a bonded state. The same applies to the case where the second probe and the target substance are simultaneously contained.
  • Reaction conditions eg, reaction temperature, reaction time, and the like
  • Reaction conditions for reacting the first probe, the second probe, and the target substance are appropriately adjusted according to the types of the target substance and the binding substance. It comes out.
  • the specific gravity of the liquid is larger than that of the second particle and the specific gravity is larger than the particle composite of the first and second particles! /
  • Specific examples that are not particularly limited as long as they can be stably present include water-soluble non-ion 'polymer aqueous solutions (eg, Fikonore (Amersham Pharmacia Biotech) solution), sucrose aqueous solution, polyethylene glycol aqueous solution And glycerol aqueous solution. Among them, particularly preferred is a ficoll aqueous solution.
  • Ficoll is a copolymer of sucrose and epichlorohydrin (molecular weight of about 400,000), and aqueous solutions of various specific gravities can be prepared by changing the concentration of ficoll.
  • Liquid is one kind of liquid It may be strong or a mixture of two or more liquids. The specific gravity of the liquid can be appropriately adjusted depending on the type and concentration of the liquid.
  • the specific gravity of the particles can be appropriately adjusted depending on the type and content of the constituent materials.
  • the specific gravity of the first particles is, for example, less than 3 (for example, the specific range is 1.03-3), and the specific gravity of the second particles can be, for example, 3 or more.
  • the specific gravity of the particles can be calculated based on the mass and the volume. Further, the specific gravity of the particle composite including the first particles and the second particles can be calculated based on the total mass and the total volume of the first particles and the second particles. That is, it can be calculated as the ratio of the total mass of the first and second particles to the standard substance (usually water at 4 ° C) that is the same volume as the total volume of the first and second particles. it can.
  • the reaction mixture has a specific gravity smaller than the first particles, a specific gravity smaller than the second particles, and a specific gravity smaller than the particle composite of the first particles and the second particles! /
  • the specific gravity is larger than the second particle, which has a lower specific gravity than one particle, and higher than the particle composite of the first particle and the second particle./ ⁇
  • the reaction mixture is mixed with the liquid.
  • the liquid may be added to the liquid, or the liquid may be added to the reaction mixture.
  • the type of magnet is not particularly limited, and either a permanent magnet or a temporary magnet may be used.
  • permanent magnets include alnico magnets, ferrite magnets, rare earth metal magnets, and the like.
  • Examples of the temporary magnet include an electromagnet.
  • predetermined area on the outer wall surface of the container means one predetermined area or a plurality of different predetermined areas. Therefore, in order to “act the magnet on the magnetic particles in the container through a predetermined region on the outer wall surface of the container”, there are cases where the magnet operates through one predetermined region and the case where the magnet operates through a plurality of different predetermined regions. included. When a magnet is operated through a plurality of different predetermined regions, different magnets may be used for each region, or the same magnet may be used.
  • the position, area, shape, and the like of the predetermined region are not particularly limited! The predetermined area before the change and the predetermined area after the change may be continuous or may be discontinuous.
  • the predetermined area before the change and the predetermined area after the change may be an area that shares a part or an area that does not have a part to be shared.
  • Predetermined area location The manner of change is not particularly limited, and examples thereof include a change in a circumferential direction of the container, a longitudinal direction of the container, and a direction in which these are combined.
  • the method of causing the magnet to act on the magnetic particles in the container through a predetermined region on the outer wall surface of the container is not particularly limited.
  • the magnet can be made to act by bringing the predetermined region and the magnet close to each other.
  • the magnet used may be a permanent magnet or a temporary magnet.
  • the magnet may be in an excited state before approaching, or may be in an excited state after approaching.
  • the distance between the predetermined region and the magnet when in the proximity state can be appropriately adjusted according to the amount of magnetism (magnetic charge) of the magnet.
  • the magnet may be moved with the container fixed, or the container may be moved with the magnet fixed, and the magnet and the container may be moved together (for example, in the same direction or (In the opposite direction).
  • the method of canceling the action of the magnet is not particularly limited.
  • the action of the magnet can be canceled by separating the magnet from the predetermined region.
  • the action of the magnet can be canceled by bringing it into a non-excited state in a state where it is close to the magnet.
  • the distance between the predetermined region and the magnet in the separated state can be appropriately adjusted according to the amount of magnetism (magnetism) of the magnet.
  • the magnet When separating the magnet from the predetermined area, the magnet may be moved with the container fixed, the container may be moved with the magnet fixed, or both the magnet and the container (for example, in the same direction or (In the opposite direction).
  • the same magnet may be used before and after the change of the position of the predetermined area, a different magnet may be used, or a different part of the same magnet may be used.
  • the number of repetitions of the action and release of the magnet through the predetermined area on the outer wall surface of the container is not particularly limited, but the number of times a sufficient amount of the conjugate of the first probe, the second probe, and the target substance is formed It is preferable that.
  • the position of the magnet is not particularly limited, but is preferably near the outer wall surface at the bottom or bottom of the container.
  • the distance between the magnet and the outer wall surface of the container is not particularly limited as long as the magnet can act on the magnetic particles in the container. The distance can be appropriately adjusted according to the magnetic amount (magnetic charge) of the magnet.
  • a bottomless cylindrical container for example, a pipette tip or the like
  • the liquid can be held in the bottomless cylindrical container while being sucked.
  • the container is transparent or translucent.
  • light for example, fluorescence, chemiluminescence, etc.
  • the transparent or translucent material include plastic and glass.
  • the detection may be performed without collecting the sediment or the floating substance. It is preferable to detect after collecting the floating material. Sediment or float may be collected with the liquid. The sediment can be recovered as the remainder of the liquid, for example, after removing the liquid supernatant. The float can be collected, for example, as a liquid supernatant.
  • the sample containing the target substance is not particularly limited, and specific examples thereof include blood, serum, plasma, manure, cerebrospinal fluid, semen, saliva, cell lysate, tissue lysate, and cell culture. Biological materials such as nutrients and tissue cultures are included.
  • the method of recovering the conjugate of the second probe is particularly limited as long as the behavior of the magnetic particles can be controlled.
  • a magnet is arranged on a pipet tip of a dispenser that sucks and discharges a liquid from the inside of a container, and the magnet is actuated so that the combined body in the liquid sucked into the pipette tip is placed on the inner wall surface of the pipette tip. While holding, by removing the action of the magnet, the combined body is released from the inner wall surface of the pipette tip and discharged together with the liquid to the outside of the pipette chip, whereby the combined body can be recovered.
  • FIG. 1 is a schematic view of a dispenser used in the present embodiment
  • FIGS. 2-7 are schematic cross-sectional views showing each step of the present embodiment.
  • the dispenser used in the present embodiment includes a pipette tip 10, a nozzle 20 removably attached to an upper end opening of the pipette tip 10, and a pipetting machine through the nozzle 20.
  • a magnet 30, a magnet moving device (not shown) for moving the magnet 30 toward and away from the pipette tip 10, and a control device (not shown) for controlling the operation of each device. Have.
  • the pipette tip 10 has a distal end 11 inserted into the container 2, a large-diameter reservoir 12 for storing liquid, and a small-diameter liquid passage 13 communicating the distal end 11 and the reservoir 12. With.
  • the liquid passage 13 has a separation region 130 where the action of the magnet 30 close to the pipette tip 10 is exerted.
  • the liquid suction / discharge device is, for example, a syringe or the like, and the magnet 30 is, for example, a permanent magnet, an electromagnet, or the like.
  • the liquid sample L 1 in the container 2 a is sucked into the pipette tip 10.
  • the liquid sample L1 is a biological material such as blood, serum, plasma, manure, cerebrospinal fluid, semen, saliva, cell lysate, tissue lysate, cell culture, tissue culture, and the like.
  • the liquid sample L1 contains various contaminants (eg, nucleic acids other than the target nucleic acid, proteins, lipids, etc.) (not shown) together with the target nucleic acid T.
  • the pipette tip 10 is moved to discharge the liquid sample L1 in the pipette tip 10 into the container 2b.
  • a suspension L2 of the probe P1 is stored in the container 2b, and the liquid sample L1 in the pipette tip 10 is discharged into the container 2b to form a mixture L3 of the liquid sample L1 and the suspension L2.
  • the probe P1 is composed of the magnetic particles MB and the oligonucleotide N1 immobilized on the magnetic particles MB.
  • the oligonucleotide N1 has a base sequence complementary to the region R1 of the target nucleic acid T, and can specifically hybridize to the region R1 of the target nucleic acid T.
  • step c the suction of the mixed solution L3 into the pipette tip 10 and the discharge from the pipette tip 10 are repeated.
  • the probe P1 reacts with the target nucleic acid to form a hybrid C1 between the probe P1 and the target nucleic acid T.
  • the mixed solution L3 in the container 2b is pipetted into a pipette tip 10 Suction into.
  • the magnet 30 moves in a direction approaching the pipette tip 10. Therefore, when the mixed solution L3 passes through the liquid passage 13 of the pipette tip 10, molecules including the magnetic particles MB (the unreacted probe P1 and the hybridization body C1) are deposited on the inner wall surface of the liquid passage 13 by the action of the magnet 30.
  • An aggregate G1 containing the unreacted probe P1 and the hybridization body C1 is formed on the inner wall surface of the liquid passage 13 which is collected and acted on by the magnet 30.
  • step e the mixed solution L3 excluding the aggregate G1 is discharged from the pipette tip 10 into the container 2b. At this time, even if the mixed liquid L3 is discharged, the aggregates G1 are held in a state of being attached to the inner wall surface of the liquid passage 13 of the pipet tip 10.
  • step f the pipette tip 10 is moved, and the suction of the washing liquid L4 in the container 2c into the pipe tip 10 and the discharge from the pipe tip 10 are repeated. You. At this time, as shown in FIG. 3 (step f), the magnet 30 moves in a direction away from the pipette tip 10 to release the holding state of the aggregate G1. Therefore, the unreacted probe P1 and the hybridization product C1 contained in the aggregate G1 are dispersed and washed in the washing solution L4.
  • step g the washing liquid L4 in the container 2c is sucked into the pipette tip 10.
  • step g the magnet 30 moves in the direction approaching the pipette tip 10 again. Therefore, when the cleaning liquid L4 passes through the liquid passage 13 of the pipette tip 10, molecules including the magnetic particles MB (the unreacted probe P1 and the hybridization body C1) are deposited on the inner wall surface of the liquid passage 13 by the action of the magnet 30. An aggregate G1 containing the unreacted probe P1 and the hybridization C1 is formed on the inner wall surface of the liquid passage 13 that is collected and acted on by the magnet 30.
  • step h the cleaning liquid L4 excluding the aggregate G1 is discharged from the pipette tip 10 into the container 2c. At this time, even if the cleaning liquid L4 is discharged, the aggregates G1 are held in a state of being attached to the inner wall surface of the liquid passage 13 of the pipe tip 10.
  • the pipette tip 10 is moved, and the suction of the liquid L5 in the container 2d into the pipette tip 10 and the discharge from the pipette tip 10 are repeated.
  • the magnet 30 separates from the pipette tip 10. To release the state of holding the aggregate G1. Therefore, the unreacted probe P1 and the hybridization C1 contained in the aggregate G1 are dispersed in the liquid L5.
  • the liquid L5 is, for example, a buffer.
  • a liquid L5 containing the unreacted probe P1 and the hybridization body C1 and containing almost no other contaminants is prepared in the container 2d as shown in FIG.
  • the detection accuracy of the target nucleic acid T can be improved by containing almost no impurities in the liquid 5.
  • the liquid 5 may include the unreacted target nucleic acid T.
  • the probe P2 is mixed with the liquid L5 in the container 2d.
  • the probe P2 is composed of the labeled non-magnetic particles LB and the oligonucleotide N2 immobilized on the labeled non-magnetic particles LB.
  • the oligonucleotide N2 has a base sequence complementary to the region R2 of the target nucleic acid, and can specifically hybridize to the region R2.
  • the labeled non-magnetic particles LB particles having a lower specific gravity than the magnetic particles MB are selected.
  • Two magnets 3a and 3b are arranged around the container 2d so as to be separated from the outer wall surface of the container 2d! (See FIG. 5 (Step 1)). Since the magnets 3a and 3b are arranged away from the outer wall surface of the container 2d, the action of the magnets 3a and 3b does not reach the magnetic particles MB in the container 2d.
  • the magnet 3a separated from the region F1 on the outer wall surface of the container 2d is brought close to the region F1.
  • the magnet 3b is kept separated from the region F2 on the outer wall surface of the container 2d.
  • the magnet 3a acts on the magnetic particles MB, and the hybridization body C1 moves in the liquid L5 in the direction of the region F1.
  • a part of the hybridization body C1 encounters and reacts with the probe 2 during the movement, and a hybridization body C2 of the probe P1, the probe 2 and the target nucleic acid T is formed.
  • the remaining portion of the hybridization body C1 finally moves to the inner wall surface of the container 2d without encountering the probe 2, and adheres to the inner wall surface of the container 2d.
  • step m after the magnet 3a is separated from the area F1, or The magnet 3b in a state of being separated from the region F2 is made to approach the region F2 while being turned.
  • the magnet 3a When the magnet 3a is moved away from the area F1, the hydridization body C1 floats again in the liquid L5.
  • the magnet 3b acts on the magnetic particles MB, and the hybridization body C1 floating in the liquid L5 moves in the liquid L5 toward the region F2. .
  • a part of the hybridization body C1 encounters and reacts with the probe 2 during the movement and forms a hybridization body C2.
  • the remainder of the hybridization body C1 finally moves to the inner wall surface of the container 2d without encountering the probe 2, and adheres to the inner wall surface of the container 2d.
  • step n after the magnet 3b is separated from the region F2 or while the magnet 3b is separated, the magnet 3a separated from the region F1 is brought close to the region F1. . Similar to step m, a part of the hybridization body C1 encounters and reacts with the probe 2 during the movement, and forms a hybridization body C2. The remainder of the hybridization body C1 finally moves to the inner wall surface of the container 2d without encountering the probe 2, and adheres to the inner wall surface of the container 2d.
  • step m and step n are repeated a predetermined number of times.
  • the number of repetitions of Step m and Step n is not particularly limited, but is preferably the number of times that a sufficient amount of the hybridization body C2 is formed.
  • the detection accuracy of the target nucleic acid T can be improved by forming a sufficient amount of the hybridization body C2.
  • step 11 o the magnetic quantities (magnetic charge) of the magnets 3a and 3b, the distance between the container 2d and the magnets 3a or 3b, the approach speed, the separation speed, and the like are adjusted, and the hybridization body C2 is Hybridization body C2 is formed under mild conditions that do not cause destruction or decomposition.
  • the magnet 3c is arranged near the outer wall surface at the bottom of the container 2d.
  • the hybridization body C2 moves toward the bottom of the container 2d together with the unreacted probe P1 and the hybridization body C1, and finally Is held attached to the inner wall surface of the bottom.
  • the unreacted probe P2 does not include the magnetic particles MB in its molecule, it is not affected by the magnet 3c and remains in the liquid L5.
  • step q the supernatant of the liquid L5 in the container 2d is removed while the magnet 3c is arranged near the outer wall surface at the bottom of the container 2d.
  • the unreacted probe P2 contained in the supernatant of the liquid L5 is removed, and the amount of the unreacted probe P2 contained in the remainder of the liquid L5 is reduced.
  • the hybridization C2 is held in a state of being attached to the inner wall surface at the bottom of the container 2d, so that the decrease in the amount of the hybridization C2 is prevented. .
  • the specific gravity is smaller than the magnetic particles MB having a higher specific gravity than the labeled non-magnetic particles LB, and the labeled non-magnetic particles LB are contained.
  • the liquid L6 having a lower specific gravity than the particle composite which also has the magnetic force and the magnetic force MB is injected.
  • the amount of the liquid L5 in the container 2d is larger than the specific gravity of the liquid 7 obtained by mixing the liquid L5 and the liquid L6 with the specific gravity of the liquid 7 which is larger than the specific gravity of the non-magnetic particles LB. Is adjusted so that the particle density is smaller and the specific gravity is smaller than that of the particle composite including the magnetic particles MB and the labeled magnetic particles LB.
  • step s the liquid L7 in which the unreacted probe Pl, the unreacted probe P2, the hybridization body C1, and the hybridization body C2 are dispersed. Is obtained.
  • step t the liquid L7 is allowed to stand.
  • the mass and volume of the magnetic particles MB are much larger than the mass and volume of the oligonucleotide N1.
  • the mass and volume of the labeled non-magnetic particles LB are much larger than the mass and volume of the oligonucleotide N2.
  • the specific gravity of the probe P1 is the specific gravity of the magnetic particles MB
  • the specific gravity of the probe P2 is the non-magnetic
  • the specific gravity of particle LB, the specific gravity of hybridization C1 is close to the specific gravity of magnetic particle LB, and the specific gravity of hybridization C2 is close to the specific gravity of particle composite consisting of magnetic particles MB and labeled nonmagnetic particles LB. can do. Therefore, when the liquid L7 is allowed to stand, the unreacted probe P1, the hybridization body C1, and the hybridization body C2 settle, while the unreacted probe P2 floats.
  • the sediment does not include the unreacted probe P1 and the unreacted probe P2 together with the hybridization body C2. This is important when detecting the nodules and the hybridization C2 based on the label of the labeled non-magnetic particles LB.
  • step s the supernatant of the liquid L7 is removed.
  • the floating substance containing the unreacted probe P2 is removed, and the sediment containing the unreacted probe P1, the hybridization body C1, and the hybridization body C2 is left on the remainder of the liquid L7. Remains.
  • the label When the label is a fluorescent label, it is irradiated with excitation light to cause the labeled non-magnetic particles LB to emit light, and the amount of the emitted light is measured using a CCD camera, a fluorescent scanner, a spectrofluorometer, a photomultiplier tube : PMT) or other optical measuring device.
  • a luminescence trigger liquid such as hydrogen peroxide solution is supplied to cause the labeled non-magnetic particles LB to emit light, and the amount of the emitted light is measured by an optical measuring device such as a PMT.
  • the label is an enzyme label, the reaction solution is supplied after dispensing the substrate solution, and the absorbance is measured by irradiating measurement light of a predetermined wavelength.
  • two or more types of target nucleic acids can be detected in parallel.
  • probe P1 and probe P2 are used to detect target nucleic acid T
  • probe P1' and probe P2 are used to detect target nucleic acid T '.
  • Probe P1 ' is also a magnetic particle MB' and oligonucleotide N1 immobilized on magnetic particle MB '. As shown in FIG.
  • the oligonucleotide N1 has a base sequence complementary to the region R1 ′ of the target nucleic acid T ′, and can specifically hybridize to the region R1 ′ of the target nucleic acid T ′.
  • the probe P2 ' also has the force of the oligonucleotide N2' fixed to the labeled magnetic non-magnetic particles LB 'and the labeled magnetic non-magnetic particles LB'.
  • the oligonucleotide N2 ′ has a nucleotide sequence complementary to the region R2 ′ of the target nucleic acid T ′. And specifically hybridize to the region R2 'of the target nucleic acid T'.
  • a fluorescent label by differentiating the type and amount ratio of the fluorescent conjugate, the label of the labeled non-magnetic particles LB and the label of the labeled non-magnetic particles LB 'are detected separately. You can do it.
  • the labeled non-magnetic particles LB particles having a specific gravity larger than that of the magnetic particles MB are selected, and as the liquid L6, the specific gravity is smaller than that of the labeled non-magnetic particles LB.
  • a liquid having a higher specific gravity than the magnetic particles MB and a higher specific gravity than the particle composite including the magnetic particles MB and the labeled non-magnetic particles LB can be selected.
  • the unreacted probe P1, the hybridization body C1, and the hybridization body C2 float, while the unreacted probe P2 sediments, so that the floating body C2 including the hybridization body C2 floats.
  • the substance is recovered, and the hybridization C2 contained in the floating substance is detected based on the label of the labeled magnetic non-magnetic particles LB.
  • the magnet 3a or 3b approaches and separates from the container 2d with the container 2d fixed.
  • the container 2d may be moved in a direction approaching and separating from the magnet 3a or 3b while the magnet 3a or 3b is fixed. Further, the container 2d and the magnet 3a or 3b may be moved together (for example, in the same direction or in the opposite direction).
  • the position of the predetermined area on the outer wall surface of the container 2d is changed from the area F1 to the area F2 and from the area F2 to the area F1, but the change of the position of the predetermined area is not limited to this. Not something.
  • molecules including the magnetic particles MB can be moved in various directions, so that the probability of encounter between the probe P1, the probe P2 and the target nucleic acid T is improved, The reaction between the probe P1, the probe P2 and the target nucleic acid T can be promoted.
  • the position of the predetermined region on the outer wall surface of the container 2d can be changed, for example, in the circumferential direction of the container 2d, the longitudinal direction of the container, or a combination thereof.
  • a plurality of magnets 3a-3h are arranged near the outer wall surface of the cylindrical member 4 and move along the inner wall surface of the cylindrical member 4 while rotating the container 2d.
  • each magnet can act on the magnetic particles MB in the container 2d through the predetermined region while changing the position of the predetermined region on the outer wall surface of the container 2d in the circumferential direction of the container 2d.
  • a plurality of convex portions 21 are provided on the outer wall surface of the container 2d, and a plurality of concave portions 41 are provided on the inner wall surface of the cylindrical member 4, and the convex portions 21 and the concave portions are provided.
  • the container 2d By sequentially fitting the 41, the container 2d can be moved along the inner wall surface of the cylindrical member 4 while rotating.
  • FIGS. 8A and 8B eight magnets are arranged near the outer wall surface of the cylindrical member 4, but the number and arrangement positions of the magnets can be changed as appropriate.
  • the cylindrical member 6 is arranged in the through hole of the ring-shaped magnet 5 in which the N pole and the S pole are appropriately arranged, and the cylindrical member 6 is rotated while rotating the container 2d.
  • the ring-shaped magnet 5 acts on the magnetic particles in the container 2d through each predetermined region while changing the position of the predetermined region on the outer wall surface of the container 2d in the circumferential direction of the container 2d. It can be done. At this time, as in FIG.
  • a plurality of protrusions are provided on the outer wall surface of the container 2d, and a plurality of recesses are provided on the outer wall surface of the columnar member 6, and the protrusions and the recesses are sequentially fitted. Accordingly, the container 2d can be moved along the outer wall surface of the columnar member 6 while rotating.
  • the magnet 3a or 3b disposed near the outer wall surface of the container 2d is moved in the longitudinal direction of the container 2d (vertical direction in FIG. 10). This allows the magnet 3a or 3b to act on the magnetic particles in the container 2d through each predetermined region while changing the position of the predetermined region on the outer wall surface of the container 2d in the longitudinal direction of the container 2d.
  • the shape of the magnet 3a or 3b can be formed along the outer wall surface of the container 2d as shown in FIG. 10 (b).
  • the force before bringing the magnet 3a or 3b close to the container 2d may be in the excited state, or the magnet 3a or 3b may be in the excited state after being brought close. Good.
  • the action of the magnet may be canceled by bringing the magnet close to the container 2d so as to be in a non-excited state.
  • a bottomed cylindrical container is used as the container 2d, but a bottomless cylindrical container such as the pipette tip 10 may be used.
  • the liquid can be held in the bottomless cylindrical container while being sucked.

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Abstract

　第一粒子（例えば標識化粒子）及び第一粒子に固定された第一結合性物質（例えば第一オリゴヌクレオチド）を有する第一プローブと、第二粒子（例えば磁性粒子）及び第二粒子に固定された第二結合性物質（例えば第二オリゴヌクレオチド）を有する第二プローブと、標的物質（例えば標的核酸）とを反応させて得られる反応混合物から、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下、当該結合体を分離するために、反応混合物を、第一粒子よりも比重が大きく、第二粒子よりも比重が小さく、かつ第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さい液体、又は第一粒子よりも比重が小さく、第二粒子よりも比重が大きく、かつ第一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する。

Description

明 細 書
標的物質の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させて得られる反応混 合物から第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を分離する方法、第一 プローブと第二プローブと標的物質とを反応させる方法、及び第一プローブと第二プ ローブとを用いて標的物質を検出する方法に関する。
背景技術
[0002] 標的核酸の検出方法として、例えば、標的核酸の第一セグメントにハイブリダィズす る第一オリゴヌクレオチド及び第一オリゴヌクレオチドに付加された標識力もなる検出 用プローブと、標的核酸の第二セグメントにハイブリダィズする第二オリゴヌクレオチ ド及び第二オリゴヌクレオチドに付加された捕捉基力もなる捕捉用プローブとを利用 する方法が知られている (特許文献 1参照)。この方法では、検出用プローブと捕捉 用プローブと標的核酸とのハイブリダィゼーシヨン体を形成させた後、捕捉用プロ一 ブの捕捉基を利用して上記ハイブリダィゼーシヨン体を分離し、上記ハイブリダィゼ ーシヨン体を検出用プローブの標識に基づき検出する。
[0003] 上記方法にぉ 、て、第一オリゴヌクレオチドに付加する標識として標識化粒子を利 用すれば、標識強度が増強され、標的核酸の検出精度を向上させることができる。し たがって、標的核酸の量が少なくても（すなわち標的核酸を PCR等により増幅しなく ても)標的核酸を検出することができる。
[0004] また、上記方法にぉ 、て、第二オリゴヌクレオチドに付加する捕捉基として磁性粒 子を利用すれば、磁力制御により上記ハイブリダィゼーシヨン体の形成及び分離を 容易かつ迅速に行うことができる。磁力制御による磁性粒子の分離方法としては、例 えば、分注機を利用した方法 (特許文献 2及び 3参照）が知られている。この方法で は、容器内から液体を吸引及び吐出する分注機のピペットチップに磁石を配置し、 磁石を作用させて、ピペットチップ内に吸引された液体中の磁性粒子をピペットチッ プの内壁面に保持する一方、磁石の作用を受けなくすることによって、磁性粒子をピ ペットチップの内壁面力も離脱させて液体とともにピペットチップ外へ吐出する。 特許文献 1：特開平 6—311899号公報
特許文献 2：特許第 3115501号公報
特許文献 3：特開平 8— 320274号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 上記方法において、標識化粒子及び標識化粒子に固定された第一オリゴヌクレオ チドを有する第一プローブと、磁性粒子及び磁性粒子に固定された第二オリゴヌタレ ォチドを有する第二プローブとを利用する場合、第一プローブと第二プローブと標的 核酸とのハイブリダィゼーシヨン体は、標識化粒子及び磁性粒子を含む巨大な分子 となる。したがって、分注機を利用して上記ハイブリダィゼーシヨン体の形成及び分離 を行なうと、分注機の吸引及び吐出時の衝撃により、上記ハイブリダィゼーシヨン体の 破壊、分解等が生じるおそれがある。
[0006] そこで、本発明は、第一粒子 (例えば標識化粒子)及び第一粒子に固定された第 一結合性物質 (例えば第一オリゴヌクレオチド)を有する第一プローブと、第二粒子（ 例えば磁性粒子)及び第二粒子に固定された第二結合性物質 (例えば第二オリゴヌ クレオチド)を有する第二プローブと、標的物質 (例えば標的核酸)とを反応させて得 られる反応混合物から、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、 分解等が生じな!/ヽ穏やかな条件下、当該結合体を分離する方法を提供することを目 的とする。
[0007] また、本発明は、第一粒子 (例えば標識化粒子)及び第一粒子に固定された第一 結合性物質 (例えば第一オリゴヌクレオチド)を有する第一プローブと、第二粒子 (例 えば磁性粒子)及び第二粒子に固定された第二結合性物質 (例えば第二オリゴヌク レオチド)を有する第二プローブと、標的物質 (例えば標的核酸)とを、第一プローブ と第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じな 、穏やかな条件下で 反応させる方法を提供することを目的とする。
[0008] さらに、本発明は、第一粒子 (例えば標識化粒子)及び第一粒子に固定された第一 結合性物質 (例えば第一オリゴヌクレオチド)を有する第一プローブと、第二粒子 (例 えば磁性粒子)及び第二粒子に固定された第二結合性物質 (例えば第二オリゴヌク レオチド)とを用いて、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、 分解等が生じない穏ゃ力な条件下、標的物質 (例えば標的核酸)を検出する方法を 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題を解決するために、本発明は、第一発明として、第一粒子及び前記第一 粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、前記第一粒子と比重が 異なる第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プロ ーブと、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結 合し得る第二部分を有する標的物質とを反応させて得られる反応混合物から、前記 第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との結合体を分離する方法であつ て、前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が大きぐ前記第二粒子よりも比重 が小さぐかつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小 さい液体、又は前記第一粒子よりも比重が小さぐ前記第二粒子よりも比重が大きぐ かつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体と 混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する工程を含む前記方法を 提供する。
[0010] 第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させて得られる反応混合物には、 未反応の第一プローブ (標的物質と結合して!/、な!、第一プローブ)、未反応の第二 プローブ (標的物質と結合して 、な 、第二プローブ)、未反応の標的物質 (第一プロ ーブ及び第二プローブのいずれとも結合していない標的物質）、第一プローブと標 的物質との結合体、第二プローブと標的物質との結合体、第一プローブと第二プロ ーブと標的物質との結合体等が含まれ得る。但し、必ずしもこれらの全てが反応混合 物に含まれるわけではなぐ例えば、反応手順、反応条件等によっては、第一プロ一 ブと標的物質との結合体、第二プローブと標的物質との結合体等が含まれな 、場合 もめる。
[0011] 第一粒子の質量及び体積は第一結合性物質の質量及び体積よりも遥かに大きぐ 第二粒子の質量及び体積は第二結合性物質の質量及び体積よりも遥かに大きぐ 第一粒子及び第二粒子の質量及び体積は標的物質の質量及び体積よりも遥かに大 きいので、第一プローブの比重は第一粒子の比重に、第二プローブの比重は第二 粒子の比重に、第一プローブと標的物質との結合体の比重は第一粒子の比重に、 第二プローブと標的物質との結合体の比重は第二粒子の比重に、第一プローブと第 二プローブと標的物質との結合体の比重は第一粒子及び第二粒子力 なる粒子複 合体の比重に近似することができる。
[0012] したがって、第一粒子の比重よりも第二粒子の比重の方が大き!/、場合、反応混合 物を、第一粒子よりも比重が大きぐ第二粒子よりも比重が小さぐかつ第一粒子及び 第二粒子力 なる粒子複合体よりも比重が小さい液体と混合した後、静置すると、未 反応の第二プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二 プローブと標的物質との結合体は沈降し、未反応の第一プローブ及び第一プローブ と標的物質との結合体は浮上する。
[0013] 一方、第一粒子の比重よりも第二粒子の比重の方が小さい場合、反応混合物を、 第一粒子よりも比重が小さぐ第二粒子よりも比重が大きぐかつ第一粒子及び第二 粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体と混合した後、静置すると、未反応 の第二プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二プロ ーブと標的物質との結合体は浮上し、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標 的物質との結合体は沈降する。
[0014] このとき、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体には重力及び浮力以 外の力は加わらないので、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破 壊、分解等は生じない。したがって、第一発明によれば、第一プローブと第二プロ一 ブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏ゃ力な条件下、当該結合体を 沈降物又は浮上物として分離することができる。
[0015] 沈降物又は浮上物には、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体ととも に、未反応の第二プローブ及び第二プローブと標的物質との結合体が含まれ得るが 、未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との結合体は含まれ得な 、。 このことは、第一プローブが標識化されており（例えば、第一粒子が標識化粒子であ り）、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を当該標識に基づき検出す る場合に重要となる。
[0016] 第一発明にお!/、て、第一プローブと第二プローブと標的物質との反応は反応溶媒 中で行なわれるので、反応混合物には反応溶媒が含まれ得る。反応溶媒を含む反 応混合物を上記液体と混合する場合、上記液体の比重は反応溶媒の混入によって 変動する。変動後も比重に関する上記条件を満たせば問題はないが、変動後に上 記条件を満たさなければ、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を沈 降物又は浮上物として分離することができない。したがって、反応混合物に含まれる 反応溶媒の量を出来る限り減少させ、上記液体の比重の変動を出来る限り防止する ことが好ましい。
[0017] そこで、第一発明にお 、て、前記第一粒子及び Z又は第二粒子が磁性粒子であり 、前記反応混合物が、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを容 器内に収容された反応溶媒中で反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配 置した状態で前記反応溶媒を除去して得られたものであることが好ましい。
[0018] 本態様によれば、反応混合物に含まれる反応溶媒の量を減少させることにより、上 記液体の比重の変動を防止することができる。また、本態様によれば、反応溶媒を除 去する際、磁性粒子に磁石が作用することにより、第一プローブと第二プローブと標 的物質との結合体を容器内に保持することができるので、反応混合物に含まれる当 該結合体の量の減少を防止することができる。
[0019] 本態様において、前記第一粒子が非磁性粒子であり、前記第二粒子が磁性粒子 であることが好ましい。この場合、磁性粒子に磁石が作用することにより、未反応の第 二プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二プローブ と標的物質との結合体を容器内に保持することができる一方、未反応の第一プロ一 ブ及び第一プローブと標的物質との結合体を反応溶媒とともに除去することができる ので、反応混合物に含まれる未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質と の結合体の量を減少させることができる。したがって、反応混合物を上記液体と混合 して沈降物又は浮上物を形成させる際、未反応の第一プローブ及び第一プローブと 標的物質との結合体が、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を含む 沈降物又は浮上物に混入する可能性を低減させることができる。 [0020] 上記課題を解決するために、本発明は、第二発明として、第一粒子及び前記第一 粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、第二粒子及び前記第 二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブと、前記第一結合性物 質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部分を有する 標的物質とを反応させる方法であって、前記第一粒子及び Z又は前記第二粒子が 磁性粒子であり、前記第一プローブ、前記第二プローブ、前記標的物質及び反応溶 媒を容器に収容する第一工程、前記容器の外壁面の所定領域を通じて前記容器内 の前記磁性粒子に磁石を作用させる第二工程、前記磁石の作用を解除する第三ェ 程、及び前記所定領域の位置を変化させながら前記第二工程及び前記第三工程を 繰り返す第四工程を含む前記方法を提供する。
[0021] 容器の外壁面の所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させると、磁性 粒子を含む分子 (第一粒子が磁性粒子である場合、未反応の第一プローブ及び Z 又は第一プローブと標的物質との結合体を意味し、第二粒子が磁性粒子である場合
、未反応の第二プローブ及び Z又は第二プローブと標的物質との結合体を意味する
)は、反応溶媒中を所定領域の方向へ移動する。移動中に、磁性粒子を含む分子の 一部は他の分子と遭遇して反応する（未反応の第一プローブは標的物質と反応し、 第一プローブと標的物質との結合体は未反応の第二プローブと反応し、未反応の第 二プローブは標的物質と反応し、第二プローブと標的物質との結合体は未反応の第 一プローブと反応する）。磁性粒子を含む分子の残部は他の分子と反応することなく 、最終的に容器の内壁面まで移動し、容器の内壁面に付着する。
[0022] 磁性粒子を含む分子が容器の内壁面に付着する前又は付着した後に磁石の作用 を解除すると、磁性粒子を含む分子は再び反応溶媒中に浮遊し、磁石の作用を受け 得る状態となる。
[0023] 所定領域の位置を変化させ、変化後の所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁 石を作用させると、磁性粒子を含む分子は、反応溶媒中を変化後の所定領域の方 向へ移動する。したがって、所定領域の位置を変化させながら第二工程及び第三ェ 程を繰り返すと、磁性粒子を含む分子は、移動方向を変化させながら反応溶媒中を 移動する。これにより、磁性粒子を含む分子と他の分子との遭遇確率が向上し、磁性 粒子を含む分子と他の分子との反応を促進させることができる。このとき、磁石の磁 気量 (磁荷)等を調節し、磁性粒子を含む分子の移動速度を調節することにより、第 一プローブと第二プローブと標的物質とを、第一プローブと第二プローブと標的物質 の結合体に破壊、分解等が生じな 、穏ゃ力な条件下で反応させることができる。
[0024] 第二発明では、前記第二工程にお!ヽて、前記所定領域と前記磁石とを近接させる ことにより前記磁石を作用させ、前記第三工程において、前記所定領域と前記磁石 とを離反させることにより前記磁石の作用を解除し、前記第四工程において、前記所 定領域の位置を変化させながら前記所定領域と磁石との近接及び離反を繰り返すこ とが好ましい。
[0025] 本態様によれば、磁石の磁気量 (磁荷)、容器と磁石との距離、近接速度、離反速 度等を調節することにより、第一プローブと第二プローブと標的物質とを、第一プロ一 ブと第二プローブと標的物質の結合体に破壊、分解等が生じな!/、穏やかな条件下で 反応させることができる。
[0026] 第二発明において、前記所定領域の位置を前記容器の周方向又は長手方向に変 化させることが好ましい。
本態様によれば、磁性粒子を含む分子が反応溶媒中を様々な方向に移動するの で、磁性粒子を含む分子と他の分子との遭遇確率がより一層向上し、磁性粒子を含 む分子と他の分子との反応をより一層促進させることができる。
[0027] 上記課題を解決するために、本発明は、第三発明として、第一粒子及び前記第一 粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、第二粒子及び前記第 二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブとを用いて、前記第一 結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部 分を有する標的物質を検出する方法であって、前記第一粒子として標識化粒子を選 択し、前記第二粒子として前記第一粒子よりも比重が大き!、粒子を選択する第一ェ 程、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させ、反応混合 物を得る第二工程、前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が大きぐ前記第 二粒子よりも比重が小さぐかつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合 体よりも比重が小さい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置 する第三工程、及び前記沈降物に含まれる前記第一プローブと前記第二プローブと 前記標的物質との結合体を、前記第一粒子の標識に基づき検出する第四工程を含 む前記方法を提供する。
[0028] 上記課題を解決するために、本発明は、第四発明として、第一粒子及び前記第一 粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブと、第二粒子及び前記第 二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プローブとを用いて、前記第一 結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合し得る第二部 分を有する標的物質を検出する方法であって、前記第一粒子として標識化粒子を選 択し、前記第二粒子として前記第一粒子よりも比重が小さ!、粒子を選択する第一ェ 程、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させ、反応混合 物を得る第二工程、前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が小さぐ前記第 二粒子よりも比重が大きぐかつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合 体よりも比重が大きい液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置 する第三工程、及び前記浮上物に含まれる前記第一プローブと前記第二プローブと 前記標的物質との結合体を、前記第一粒子の標識に基づき検出する第四工程を含 む前記方法を提供する。
[0029] 第三発明及び第四発明によれば、第一発明と同様に、第一プローブと第二プロ一 ブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じない穏ゃ力な条件下、当該結合体を 沈降物又は浮上物として分離することができる。沈降物又は浮上物には、第一プロ ーブと第二プローブと標的物質との結合体とともに、未反応の第二プローブ及び第 二プローブと標的物質との結合体が含まれ得るが、未反応の第一プローブ及び第一 プローブと標的物質との結合体は含まれ得ない。したがって、沈降物又は浮上物に 含まれる第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を、第一粒子の標識に 基づき検出することができる。
[0030] 第三発明及び第四発明では、前記第一工程において、前記第一粒子及び Z又は 前記第二粒子として磁性粒子を選択し、前記第二工程において、前記第一プローブ と前記第二プローブと前記標的物質とを容器内に収容された反応溶媒中で反応させ た後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で前記反応溶媒を除去し、前 記反応混合物を得ることが好ま 、。
[0031] 本態様によれば、反応混合物に含まれる反応溶媒の量を減少させることにより、上 記液体の比重の変動を防止することができる。また、本態様によれば、反応溶媒を除 去する際、磁性粒子に磁石が作用することにより、第一プローブと第二プローブと標 的物質との結合体を容器内に保持することができるので、反応混合物に含まれる当 該結合体の量の減少を防止することができる。
[0032] 本態様では、前記第一工程にぉ 、て、前記第一粒子として非磁性粒子を選択し、 前記第二粒子として磁性粒子を選択することが好ましい。これにより、未反応の第二 プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二プローブと 標的物質との結合体を容器内に保持することができる一方、未反応の第一プローブ 及び第一プローブと標的物質との結合体を反応溶媒とともに除去することができるの で、反応混合物に含まれる未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との 結合体の量を減少させることができる。したがって、反応混合物を上記液体と混合し て沈降物及び浮上物を形成させる際、未反応の第一プローブ及び第一プローブと 標的物質との結合体が、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を含む 沈降物又は浮上物に混入する可能性を低減することができ、沈降物又は浮上物に 含まれる第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体の検出精度を向上させ ることがでさる。
[0033] 第三発明及び第四発明では、前記第一工程において、前記第一粒子及び Z又は 前記第二粒子として磁性粒子を選択し、前記第二工程において、第二発明の方法 により前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させることが好 ましい。
[0034] 本態様によれば、第二発明と同様に、第一プローブと第二プローブと標的物質とを 、第一プローブと第二プローブと標的物質の結合体に破壊、分解等が生じない穏ゃ 力な条件下で反応させることができる。
[0035] 本態様では、前記第二工程にお!、て、前記第一プローブと前記第二プローブと前 記標的物質とを反応させた後、前記容器の外壁面近傍に前記磁石を配置した状態 で前記反応溶媒を除去し、前記反応混合物を得ることが好ましい。これにより、反応 混合物に含まれる反応溶媒の量を減少させ、上記液体の比重の変動を防止すること ができる。また、反応溶媒を除去する際、磁性粒子に磁石が作用することにより、第 一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を容器内に保持することができるの で、反応混合物に含まれる当該結合体の量の減少を防止することができる。
[0036] 本態様では、前記第一工程にお!、て、前記第一粒子として非磁性粒子を選択し、 前記第二粒子として磁性粒子を選択することが好ましい。これにより、未反応の第二 プローブ、第二プローブと標的物質との結合体及び第一プローブと第二プローブと 標的物質との結合体を容器内に保持することができる一方、未反応の第一プローブ 及び第一プローブと標的物質との結合体を反応溶媒とともに除去することができるの で、反応混合物に含まれる未反応の第一プローブ及び第一プローブと標的物質との 結合体の量を減少させることができる。したがって、反応混合物を上記液体と混合し て沈降物及び浮上物を形成させる際、未反応の第一プローブ及び第一プローブと 標的物質との結合体が、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体を含む 沈降物又は浮上物に混入する可能性を低減することができ、沈降物又は浮上物に 含まれる第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体の検出精度を向上させ ることがでさる。
[0037] 第三発明及び第四発明では、前記第一工程において、前記第二粒子として磁性 粒子を選択し、前記第二工程において、前記標的物質を含有する試料と前記第二 プローブとを混合し、磁力制御により前記第二プローブと前記標的物質との結合体を 回収し、前記第二プローブと前記標的物質との結合体を前記第一プローブと反応さ せることが好ましい。
[0038] 本態様によれば、試料に含まれる夾雑物が反応混合物に混入することを防止する ことができるので、標的物質の検出精度を向上させることができる。
発明の効果
[0039] 本発明によれば、第一粒子 (例えば標識化粒子)及び第一粒子に固定された第一 結合性物質 (例えば第一オリゴヌクレオチド)を有する第一プローブと、第二粒子 (例 えば磁性粒子)及び第二粒子に固定された第二結合性物質 (例えば第二オリゴヌク レオチド)を有する第二プローブと、標的物質 (例えば標的核酸)とを反応させて得ら れる反応混合物から、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、 分解等が生じな!/ヽ穏やかな条件下、当該結合体を分離する方法が提供される。
[0040] また、本発明によれば、第一粒子 (例えば標識化粒子)及び第一粒子に固定された 第一結合性物質 (例えば第一オリゴヌクレオチド)を有する第一プローブと、第二粒 子 (例えば磁性粒子)及び第二粒子に固定された第二結合性物質 (例えば第二オリ ゴヌクレオチド)を有する第二プローブと、標的物質 (例えば標的核酸)とを、第一プロ ーブと第二プローブと標的物質との結合体に破壊、分解等が生じな!/、穏やかな条件 下で反応させる方法が提供される。
[0041] さらに、本発明によれば、第一粒子 (例えば標識化粒子)及び第一粒子に固定され た第一結合性物質 (例えば第一オリゴヌクレオチド)を有する第一プローブと、第二粒 子 (例えば磁性粒子)及び第二粒子に固定された第二結合性物質 (例えば第二オリ ゴヌクレオチド)とを用いて、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体に破 壊、分解等が生じない穏ゃ力な条件下、標的物質 (例えば標的核酸)を検出する方 法が提供される。
図面の簡単な説明
[0042] [図 1]本発明の方法の一実施形態で使用される分注機の概略断面図である。
[図 2]同本実施形態の各ステップ (ステップ a— d)を示す概略断面図である。
[図 3]同実施形態の各ステップ (ステップ e— h)を表す概略断面図である。
[図 4]同実施形態の各ステップ (ステップ i一 k)を表す概略断面図である。
[図 5]同実施形態の各ステップ (ステップ 1一 n)を表す概略断面図である。
[図 6]同実施形態の各ステップ (ステップ o— q)を表す概略断面図である。
[図 7]同実施形態の各ステップ (ステップ r一 u)を表す概略断面図である。
[図 8] (a)は、容器の外壁面の所定領域の位置を容器の周方向に変化させながら、所 定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる方法の一実施形態を示す概 略平面図であり、（b)は、同方法の他の実施形態を示す概略平面図である。
[図 9]容器の外壁面の所定領域の位置を容器の周方向に変化させながら、所定領域 を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる方法の他の実施形態を示す概略平 面図である。 [図 10] (a)は、容器の外壁面の所定領域の位置を容器の長手方向に変化させながら 、所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる方法の一実施形態を示 す概略側面図であり、（b)は、同方法の他の実施形態を示す斜視図である。
[図 11]プローブと標的核酸との結合状態を示す模式図である。
符号の説明
[0043] T…標的核酸 (標的物質）
P1 · · ·プローブ（第二プローブ）
ΜΒ· ··磁性粒子 (第二粒子）
N1 · · 'オリゴヌクレオチド (第二結合性物質）
P2- · ·プローブ（第一プローブ）
LB- · '標識ィ匕非磁性粒子 (第一粒子）
N2- · 'オリゴヌクレオチド (第一結合性物質）
C 1 · · 'ハイブリダィゼーシヨン体 (第二プローブと標的物質との結合体）
C2' ··ハイブリダィゼーシヨン体 (第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体
)
L1 · · ·液体試料 (標的物質を含有する試料）
2a, 2b, 2c, 2d…容器
3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3h…磁石
F 1 , F2 · · '容器の外壁面の領域 (容器の外壁面の所定領域）
発明を実施するための最良の形態
[0044] 粒子の構成材料は、本発明の方法で使用される各種液体 (例えば、反応溶媒、洗 浄液等）に不溶性である限り特に限定されるものではなぐその具体例としては、スチ レン、クロルスチレン、クロロメチノレスチレン、 α—メチルスチレン、ジビニノレベンゼン、 スチレンスルホン酸ナトリウム、 （メタ)アクリル酸、 （メタ)アクリル酸メチル、 （メタ)アタリ ル酸ェチル、 （メタ）アクリル酸 η—ブチル、 （メタ）アクリル酸 2—ヒドロキシェチル、 （ メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、 （メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール ジ— (メタ）アクリル酸エステル、 （メタ）アクリル酸トリブロモフエ-ル、トリブロモプロピル アタリレート、 （メタ）アクリロニトリル、 （メタ）ァクロレイン、 （メタ）アクリルアミド、メチレン ビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビュル、ビュルピリジン、 N—ビ -ルピロリドン、塩ィ匕ビュル、臭化ビュル等の芳香族ビ-ルイ匕合物、 a , j8—不飽和 カルボン酸のエステル類又はアミド類、 a , j8—不飽和-トリル化合物、ハロゲン化ビ -ル化合物、共役ジェン化合物、低級脂肪酸ビニルエステル等の 1種以上を重合し て得られるポリマー；ァガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセル口 ース等の多糖類の架橋体;メチルイ匕アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の 蛋白質の架橋体;ガラス、セラミックス等の無機材料;鉄、シリコン等の金属;これらの 複合材料等が挙げられる。
[0045] 磁性粒子に含まれる磁性を示す物質 (磁性体）は特に限定されるものではなぐそ の具体例としては、 Fe、 Ni、 Co、 Gd、 Tb、 Dy等の金属； Fe— Ni、 Fe— Co、 Fe— Al、 Fe— Si— Al、 Fe—Ni—Mo、 Al— Ni— Co、 Sm—Co、 Nd— Fe—B等の合金'金属間化 合物； Fe O、 Fe O— NiO— ZnO、 Fe O—CuO— ZnO、 Fe O— MnO— ZnO等の
2 3 2 3 2 3 2 3 フェライトイ匕合物が挙げられる。
[0046] 磁性粒子としては、例えば、強磁性粒子、磁化率の大き!/、常磁性粒子等を使用す ることができる。磁石を作用させた後の液体への分散性を向上させるためには残留 磁ィ匕が小さいことが好ましぐ磁石との反応性を向上させるためには飽和磁ィ匕が大き いことが好ましい。また、磁性粒子は異方性であってもよいが等方性であることが好ま しい。
[0047] 粒子の形状は特に限定されるものではなぐその具体例としては球状が挙げられる 。また、粒子の粒径は、静置された液体中において粒子が重力及び浮力の影響によ り沈降又は浮上し得る限り特に限定されるものではなぐその具体的な範囲は例えば 直径約 0. ： m—約 100 mである。
[0048] 標識化粒子の標識は特に限定されるものではなぐその具体例としては、 Marine Blue, Cascade Blue, Cascade Yellow, Fluorescein, Rhodamine, Phycoerythnn, CyChrome, PerCP, Texas Red, Allophycocyanin, PharRed等の他、 Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7等の Cy系色素、 Alexa- 488, Alexa- 532, Alexa- 546, Alexa- 633, Alexa-680等の Alexa系色素、 BODIPY FL, BODIPY TR-等の BODIPY系色素等の蛍 光性ィヒ合物による蛍光標識;ルミノール、ルシゲニン、アタリジゥムエステル等の化学 発光性ィ匕合物による化学発光標識;アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペル ォキシダーゼ等の酵素による酵素標識;ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光 性ィ匕合物による生物発光標識等が挙げられる。これらの標識は常法に従って検出す ることがでさる。
[0049] 標的物質は特に限定されるものではなぐその具体例としては、核酸、タンパク質、 抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質が挙げられる。なお、核酸には、 DNA、 RNA 及びこれらの類似体又は誘導体 (例えば、ペプチド核酸 (PNA)、ホスホロチォエート DNA等）が含まれる。
[0050] 結合性物質は、標的物質と結合し得る限り特に限定されるものではなぐその具体 例としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質が挙げられる。 標的物質と結合性物質との組み合わせの具体例としては、核酸 Z相補的核酸、受容 体タンパク質 Zリガンド、酵素 Z基質、抗体 Z抗原等が挙げられる。
[0051] 第一結合性物質及び第二結合性物質は、標的物質の異なる部分 (第一部分及び 第二部分）に結合するので、第一プローブ及び第二プローブは標的物質に同時に 結合することができる。
[0052] 結合性物質は、標的物質に特異的に結合することが好ましい。「特異的に結合する 」とは、標的物質の所定部分以外には結合しないことを意味する。標的物質及び結 合性物質が核酸である場合、「特異的に結合する」とは、ストリンジェントな条件下で ハイブリダィズすることを意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、 2°C、 2 X S SC及び 0. 1%SDSの条件、好ましくは 65。C、0. 1 X SSC及び 0. 1%SDSの条件 が挙げられる。
[0053] 1個の粒子に固定される結合性物質の数は特に限定されるものではなぐ 1個であ つてもょ 、し複数個であってもよ 、が、通常は複数個である。
[0054] 粒子への結合性物質の固定は、種々の結合様式によって行なうことができる。結合 様式の具体例としては、ストレプトアビジン又はアビジンとピオチンとの特異的相互作 用、疎水性相互作用、磁性相互作用、極性相互作用、共有結合 (例えば、アミド結合 、ジスルフイド結合、チォエーテル結合等)の形成、架橋剤による架橋等が挙げられ る。これらの結合様式による固定が可能となるように、公知の技術を用いて、粒子表 面又は結合性物質に適当な化学修飾を施すことができる。
[0055] ストレプトアビジン又はアビジンとピオチンとの特異的相互作用以外にも、マルトー ス結合タンパク質 Zマルトース、ポリヒスチジンペプチド Zニッケルやコバルト等の金 属イオン、グルタチオン s トランスフェラーゼ Zグルタチオン、カノレモジュリン Z力 ルモジュリン結合ペプチド、 ATP結合タンパク質 ZATP、核酸 Z相補的核酸、受容 体タンパク質 Zリガンド、酵素 Z基質、抗体 Z抗原、 IgGZプロテイン A等の特異的 相互作用を利用して、粒子への結合性物質の固定を行うこともできる。 ば、ピオチンを導入した結合性物質 (例えば、 5'末端をピオチン化したプライマーを 用いて PCRを行なうことにより得られたピオチンィ匕核酸）を、アビジン又はストレプトァ ビジンでコーティングされた粒子に結合させることができる。
[0057] 共有結合の形成を利用する場合には、粒子表面又は結合性物質に存在する官能 基を利用して共有結合を形成させることができる。共有結合を形成し得る官能基の具 体例として、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。例えば、粒子の表面 にカルボキシル基が存在する場合には、 1-ェチル -3-(3-ジメチルァミノプロピル) -3- ェチルカルポジイミド塩酸塩 (EDC)等のカルポジイミド類でカルボキシル基を活性ィ匕 させた後、結合性物質に存在するァミノ基と反応させることにより、粒子と結合性物質 とをアミド結合させることができる。また、粒子の表面にァミノ基が存在する場合には、 無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、 結合性物質に存在するァミノ基と反応させることにより、粒子と結合性物質とをアミド 結合させることができる。
[0058] 架橋剤による架橋を利用する場合には、架橋対象物質が有する官能基と反応し得 る種々の架橋剤を使用できる。架橋剤の具体例としては、二官能性試薬、三官能性 試薬等の多官能性試薬が挙げられる。このような多官能性試薬の具体例としては、 N-スクシンィミジル (4-ィオードァセチル)ァミノべンゾエート（
N-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate) (SIAB)、ンマレづ ト (dimaleimide)、ン チォ-ビス -ニトロ安息香酸（dithio- bis- nitrobenzoic acid) (DTNB)、 N -スクシンイミジ ル- S-ァセチル-チォアセテート（N- succinimidy卜 S- acetyH:hioacetate) (SATA)、 N- スクシンィミジル- 3-(2-ピリジルジチォ)プロピオネート（
N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate) (SPDP)、スクシンィミジル 4— (N—マレ イミドメチノレ)シクロへキサン- 1-力ノレボキシレート（succinimidyl
4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane- 1 -carboxylate) (SMCC)、 6—ヒドラジノニコチミド ( 6-hydrazinonicotimide) (HYNIC)等が挙げられる。
[0059] 第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させる際に使用される反応溶媒 は、当該反応を妨害しない限り特に限定されるものではなぐ例えば、緩衝液が挙げ られる。反応溶媒の組成は、標的物質及び結合性物質の種類等に応じて適宜調節 することができる。
[0060] 第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させる際、第一プローブ、第二プ ローブ、標的物質及び反応溶媒の容器への収容順序は特に限定されるものではなく 、任意の順序で別々に収容してもよいし、任意に組み合わせた 2種類以上を同時に 収容してもよい。第一プローブと標的物質とを同時に収容する際、第一プローブと標 的物質とは結合した状態であっても結合して 、な 、状態であってもよ 、。第二プロ一 ブと標的物質とを同時に収容する場合も同様である。
[0061] 第一プローブと第二プローブと標的物質とを反応させる際の反応条件 (例えば、反 応温度、反応時間等)は、標的物質及び結合性物質の種類等に応じて適宜調節す ることがでさる。
[0062] 第一粒子よりも比重が大きぐ第二粒子よりも比重が小さぐかつ第一粒子及び第 二粒子力 なる粒子複合体よりも比重が小さい液体、又は第一粒子よりも比重が小さ ぐ第二粒子よりも比重が大きぐかつ第一粒子及び第二粒子力 なる粒子複合体よ りも比重が大き!/、液体は、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体が安 定して存在し得る限り特に限定されるものではなぐその具体例としては、水溶性非ィ オン'性ポリマー水溶液（例えばフイコーノレ（Amersham Pharmacia Biotech社製）溶液） 、ショ糖水溶液、ポリエチレングリコール水溶液、グリセロール水溶液等が挙げられる 。この中でも特に好ましいものとして、フイコール水溶液が挙げられる。フイコールはシ ョ糖とェピクロルヒドリンの共重合体 (分子量約 40万)であり、フイコールの濃度を変化 させることにより、種々の比重の水溶液を調製することができる。液体は 1種類の液体 力もなつてもよいし、 2種類以上の液体の混合液であってもよい。液体の比重は、液 体の種類、濃度等によって適宜調節することができる。
[0063] 粒子の比重は構成材料の種類、含有量等によって適宜調節することができる。第 一粒子として標識ィ匕非磁性粒子を選択し、第二粒子として第一粒子よりも比重が大 き 、磁性粒子を選択する場合、第一粒子の比重は例えば 3未満 (具体的範囲は例え ば 1. 03— 3)とすることができ、第二粒子の比重は例えば 3以上とすることができる。
[0064] 粒子の比重は質量及び体積に基づいて算出することができる。また、第一粒子及 び第二粒子からなる粒子複合体の比重は、第一粒子及び第二粒子の合計質量及び 合計体積に基づいて算出することができる。すなわち、第一粒子及び第二粒子の合 計質量と、第一粒子及び第二粒子の合計体積と同体積の標準物質 (通常、 4°Cにお ける水）との比として算出することができる。
[0065] 反応混合物を、第一粒子よりも比重が大きぐ第二粒子よりも比重が小さぐかつ第 一粒子及び第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さ!/、液体、又は第一粒子よ りも比重が小さぐ第二粒子よりも比重が大きぐかつ第一粒子及び第二粒子力 な る粒子複合体よりも比重が大き!/ヽ液体と混合する際、反応混合物を当該液体へ添加 してもょ 、し、当該液体を反応混合物へ添加してもよ 、。
[0066] 磁石の種類は特に限定されるものではなぐ永久磁石及び一時磁石のいずれを使 用してもよい。永久磁石としては、アルニコ磁石、フェライト磁石、希土類金属磁石等 が挙げられる。一時磁石としては、電磁石等が挙げられる。
[0067] 「容器の外壁面の所定領域」 t 、う用語は、 1つの所定領域又は異なる複数の所定 領域を意味する。したがって、「容器の外壁面の所定領域を通じて容器内の磁性粒 子に磁石を作用させる」には、 1つの所定領域を通じて磁石を作用させる場合及び異 なる複数の所定領域を通じて磁石を作用させる場合が含まれる。異なる複数の所定 領域を通じて磁石を作用させる場合、各領域に対して異なる磁石を使用してもよいし 、同一の磁石を使用してもよい。所定領域の位置、面積、形状等は特に限定されるも のではな!/、。変化前の所定領域と変化後の所定領域とは連続して 、てもよ ヽし不連 続であってもよい。変化前の所定領域と変化後の所定領域とは、一部を共有する領 域であってもよいし、共有する部分を持たない領域であってもよい。所定領域の位置 の変化態様は特に限定されるものではなぐ例えば、容器の周方向、容器の長手方 向、これらを組み合わせた方向への変化が挙げられる。
[0068] 容器の外壁面の所定領域を通じて容器内の磁性粒子に磁石を作用させる方法は 特に限定されるものではなぐ例えば、所定領域と磁石とを近接させることにより磁石 を作用させることができる。この際、使用する磁石は永久磁石であってもよいし一時 磁石であってもよい。一時磁石を使用する場合には、近接前から励磁状態としてもよ いし、近接後に励磁状態としてもよい。近接状態にあるときの所定領域と磁石との距 離は、磁石の磁気量 (磁荷)等に応じて適宜調節することができる。所定領域と磁石 とを近接させる際、容器を固定した状態で磁石を移動させてもよいし、磁石を固定し た状態で容器を移動させてもよし、磁石及び容器をともに（例えば同一方向又は逆 方向に)移動させてもよい。
[0069] 磁石の作用を解除させる方法は特に限定されるものではなぐ例えば、所定領域と 磁石とを離反させることにより磁石の作用を解除することができる。一時磁石を使用 する場合には、近接させた状態で非励磁状態とすることにより磁石の作用を解除する ことができる。離反状態にあるときの所定領域と磁石との距離は、磁石の磁気量 (磁 荷)等に応じて適宜調節することができる。所定領域と磁石とを離反させる際、容器を 固定した状態で磁石を移動させてもょ ヽし、磁石を固定した状態で容器を移動させ てもよし、磁石及び容器をともに (例えば同一方向又は逆方向に)移動させてもよい。
[0070] 磁石は、所定領域の位置の変化前後で同一のものを使用してもよいし、異なるもの を使用してもょ 、し、同一の磁石の異なる部分を使用してもょ 、。
容器の外壁面の所定領域を通じた磁石の作用及びその解除を繰り返す回数は特 に限定されるものではないが、第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体が 十分量形成される回数であることが好まし 、。
[0071] 容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で反応溶媒を除去する際、磁石の配置 位置は特に限定されるものではないが、容器の下部又は底部の外壁面近傍であるこ とが好ましい。磁石と容器の外壁面との距離は、磁石が容器内の磁性粒子に作用し 得る限り特に限定されるものではなぐ磁石の磁気量 (磁荷)等に応じて適宜調節す ることがでさる。 [0072] 容器としては、有底筒状容器等の一般的に使用される容器の他、無底筒状容器（ 例えばピペットチップ等）を使用することができる。無底筒状容器内には、液体を吸引 した状態で保持することができる。
容器は透明又は半透明であることが好ましい。これにより、容器内から発せられる光 (例えば、蛍光、化学発光等)を容器外で検出することができる。透明又は半透明の 材料としては、プラスチック、ガラス等が挙げられる。
[0073] 沈降物又は浮上物に含まれる第一プローブと第二プローブと標的物質との結合体 を検出する際、沈降物又は浮上物を回収することなく検出してもよいが、沈降物又は 浮上物を回収した後に検出することが好ましい。沈降物又は浮上物は液体とともに回 収してもよい。沈降物は、例えば、液体の上清を除去した後、液体の残部として回収 することができる。浮上物は、例えば、液体の上清として回収することができる。
[0074] 標的物質を含有する試料は特に限定されるものではなぐその具体例としては、血 液、血清、血漿、糞尿、脳脊髄液、精液、唾液、細胞溶解液、組織溶解液、細胞培 養物、組織培養物等の生物材料が挙げられる。
[0075] 磁力制御により第二プローブ (第二プローブが有する第二粒子は磁性粒子である） と標的物質との結合体を回収する方法は、磁性粒子の挙動を制御し得る限り特に限 定されるものではない。例えば、容器内から液体を吸引及び吐出する分注機のピぺ ットチップに磁石を配置し、磁石を作用させて、ピペットチップ内に吸引された液体中 の当該結合体をピペットチップの内壁面に保持する一方、磁石の作用を受けなくす ることによって、当該結合体をピペットチップの内壁面力 離脱させて液体とともにピ ペットチップ外へ吐出することにより、当該結合体を回収することができる。
[0076] 以下、本発明に係る標的物質の検出方法の一実施形態を図面に基づいて説明す る。
図 1は、本実施形態で使用される分注機の概略図であり、図 2— 7は本実施形態の 各ステップを表す概略断面図である。
[0077] 本実施形態で使用される分注機は、図 1に示すように、ピペットチップ 10と、ピペット チップ 10の上端開口部に着脱自在に装着されたノズル 20と、ノズル 20を通じてピぺ ットチップ 10内を減圧又は加圧してピペットチップ 10への液体の吸引又はピペットチ ップ 10からの液体の吐出を行う液体吸引 ·吐出装置（図示せず）と、ピペットチップ 10 を所望の方向（例えば、上下方向、左右方向）に移動させるピペットチップ移動装置（ 図示せず）と、磁石 30と、磁石 30をピペットチップ 10に対して近接及び離反する方 向に移動させる磁石移動装置（図示せず)と、各装置の動作を制御する制御装置（図 示せず）とを備えている。
[0078] ピペットチップ 10は、容器 2内に挿入される先端部 11と、液体を貯溜する太径の貯 溜部 12と、先端部 11及び貯溜部 12を連通させる細径の液通路 13とを有して 、る。 液通路 13は、ピペットチップ 10に近接した磁石 30の作用が及ぼされる分離領域部 1 30を有している。液体吸引'吐出装置は、例えばシリンジ等であり、磁石 30は、例え ば永久磁石、電磁石等である。
[0079] 本実施形態では、まず、図 2 (ステップ a)に示すように、容器 2a内の液体試料 L1を ピペットチップ 10内へ吸引する。液体試料 L1は、例えば、血液、血清、血漿、糞尿、 脳脊髄液、精液、唾液、細胞溶解液、組織溶解液、細胞培養物、組織培養物等の生 物材料である。液体試料 L1には、標的核酸 Tとともに様々な夾雑物（例えば、標的核 酸以外の核酸、タンパク質、脂質等）（図示せず)が含まれている。
[0080] 次!、で、図 2 (ステップ b)に示すように、ピペットチップ 10を移動させて、ピペットチッ プ 10内の液体試料 L 1を容器 2b内に吐出する。容器 2b内にはプローブ P 1の懸濁液 L2が収容されており、ピペットチップ 10内の液体試料 L1を容器 2b内に吐出すること により、液体試料 L1と懸濁液 L2との混合液 L3が調製される。図 2及び図 11に示す ように、プローブ P1は磁性粒子 MB及び磁性粒子 MBに固定されたオリゴヌクレオチ ド N1からなる。図 11に示すように、オリゴヌクレオチド N1は、標的核酸 Tの領域 R1と 相補的な塩基配列力もなり、標的核酸 Tの領域 R1に特異的にハイブリダィズすること ができる。
[0081] 次いで、図 2 (ステップ c)に示すように、混合液 L3のピペットチップ 10内への吸引 及びピペットチップ 10からの吐出を繰り返す。これにより、プローブ P1と標的核酸丁と が反応して、プローブ P1と標的核酸 Tとのノ、イブリダィゼーシヨン体 C1が形成される
[0082] 次 、で、図 2 (ステップ d)に示すように、容器 2b内の混合液 L3をピペットチップ 10 内へ吸引する。このとき、図 2 (ステップ d)に示すように、磁石 30はピペットチップ 10 に近接する方向に移動する。したがって、混合液 L3がピペットチップ 10の液通路 13 を通過するとき、磁性粒子 MBを含む分子 (未反応のプローブ P1及びハイブリダィゼ ーシヨン体 C1)は、磁石 30の作用により液通路 13の内壁面に捕集され、磁石 30の 作用が及ぶ液通路 13の内壁面には、未反応のプローブ P1及びハイブリダィゼーシ ヨン体 C1を含む凝集物 G1が形成される。
[0083] 次いで、図 3 (ステップ e)に示すように、凝集物 G1を除く混合液 L3をピペットチップ 10内から容器 2b内へ吐出する。このとき、混合液 L3を吐出しても、凝集物 G1はピぺ ットチップ 10の液通路 13の内壁面に付着した状態で保持される。
[0084] 次いで、図 3 (ステップ f)に示すように、ピペットチップ 10を移動させて、容器 2c内の 洗浄液 L4のピぺットチップ 10内への吸引及びピぺットチップ 10からの吐出を繰り返 す。このとき、図 3 (ステップ f)に示すように、磁石 30は、ピペットチップ 10から離反す る方向に移動し、凝集物 G1の保持状態を解除する。したがって、凝集物 G1に含ま れる未反応のプローブ P1及びハイブリダィゼーシヨン体 C1は洗浄液 L4に分散して 洗浄される。
[0085] 次!、で、図 3 (ステップ g)に示すように、容器 2c内の洗浄液 L4をピペットチップ 10 内へ吸引する。このとき、図 3 (ステップ g)に示すように、磁石 30は、再びピペットチッ プ 10に近接する方向に移動する。したがって、洗浄液 L4がピペットチップ 10の液通 路 13を通過するとき、磁性粒子 MBを含む分子 (未反応のプローブ P1及びハイプリ ダイゼーシヨン体 C1)は、磁石 30の作用により液通路 13の内壁面に捕集され、磁石 30の作用が及ぶ液通路 13の内壁面には、未反応のプローブ P1及びノヽイブリダィゼ ーシヨン体 C 1を含む凝集物 G 1が形成される。
[0086] 次 、で、図 3 (ステップ h)に示すように、凝集物 G1を除く洗浄液 L4をピペットチップ 10内から容器 2c内に吐出する。このとき、洗浄液 L4を吐出しても、凝集物 G1はピぺ ットチップ 10の液通路 13の内壁面に付着した状態で保持される。
[0087] 次 、で、図 4 (ステップ i)に示すように、ピペットチップ 10を移動させて、容器 2d内の 液体 L5のピペットチップ 10内への吸引及びピペットチップ 10からの吐出を繰り返す 。このとき、図 4 (ステップ i)に示すように、磁石 30は、ピペットチップ 10から離反する 方向に移動し、凝集物 G1の保持状態を解除する。したがって、凝集物 G1に含まれ る未反応のプローブ P1及びノヽイブリダィゼーシヨン体 C1は液体 L5に分散する。液 体 L5は、例えば、緩衝液である。
[0088] こうして、図 4 (ステップ に示すように、未反応のプローブ P1及びハイブリダィゼー シヨン体 C1を含み、それ以外の夾雑物をほとんど含まない液体 L5が容器 2d内に調 製される。液体 L5に夾雑物がほとんど含まれないことにより、標的核酸 Tの検出精度 を向上させることができる。なお、図示していないが、液体 5には、未反応の標的核酸 Tが含まれ得る。
[0089] 次!、で、図 4 (ステップ k)に示すように、容器 2d内の液体 L5にプローブ P2を混合 する。図 4及び図 11に示すように、プローブ P2は標識ィ匕非磁性粒子 LB及び標識ィ匕 非磁性粒子 LBに固定されたオリゴヌクレオチド N2からなる。図 11に示すように、オリ ゴヌクレオチド N2は、標的核酸の領域 R2に相補的な塩基配列からなり、領域 R2に 特異的にハイブリダィズすることができる。標識ィ匕非磁性粒子 LBとしては、磁性粒子 MBよりも比重が小さ 、粒子が選択される。
[0090] なお、容器 2dの周囲には、 2個の磁石 3a及び 3bが容器 2dの外壁面から離反した 状態で配置されて!、る（図 5 (ステップ 1)参照)。磁石 3a及び 3bは容器 2dの外壁面か ら離反した状態で配置されて ヽるので、磁石 3a及び 3bの作用は容器 2d内の磁性粒 子 MBに及んでいない。
[0091] 次 、で、図 5 (ステップ 1)に示すように、容器 2dの外壁面の領域 F1から離反した状 態にある磁石 3aを領域 F1に近接させる。このとき、図 5 (ステップ 1)に示すように、磁 石 3bは、容器 2dの外壁面の領域 F2から離反したままの状態にある。磁石 3aを領域 F1に近接させると、磁性粒子 MBに磁石 3aが作用し、ハイブリダィゼーシヨン体 C1 は、液体 L5中を領域 F1の方向に向力つて移動する。ハイブリダィゼーシヨン体 C1の うちの一部は、移動中にプローブ 2と遭遇して反応し、プローブ P1とプローブ 2と標的 核酸 Tとのハイブリダィゼーシヨン体 C2が形成される。ハイブリダィゼーシヨン体 C1の 残部は、プローブ 2と遭遇することなぐ最終的には容器 2dの内壁面まで移動し、容 器 2dの内壁面に付着する。
[0092] 次いで、図 5 (ステップ m)に示すように、磁石 3aを領域 F1から離反させた後又は離 反させながら、領域 F2から離反した状態にある磁石 3bを領域 F2に近接させる。磁石 3aを領域 F1から離反させると、ノ、イブリダィゼーシヨン体 C1は再び液体 L5中に浮遊 する。磁石 3bを領域 F2に近接させると、磁性粒子 MBに磁石 3bが作用し、液体 L5 中に浮遊しているハイブリダィゼーシヨン体 C1は、液体 L5中を領域 F2の方向に向 かって移動する。ハイブリダィゼーシヨン体 C1のうちの一部は、移動中にプローブ 2と 遭遇して反応し、ハイブリダィゼーシヨン体 C2が形成される。ハイブリダィゼーシヨン 体 C1の残部は、プローブ 2と遭遇することなぐ最終的には容器 2dの内壁面まで移 動し、容器 2dの内壁面に付着する。
[0093] 次 、で、図 5 (ステップ n)に示すように、磁石 3bを領域 F2から離反させた後又は離 反させながら、領域 F1から離反した状態にある磁石 3aを領域 F1に近接させる。ステ ップ mと同様に、ハイブリダィゼーシヨン体 C1のうちの一部は、移動中にプローブ 2と 遭遇して反応し、ハイブリダィゼーシヨン体 C2が形成される。ハイブリダィゼーシヨン 体 C1の残部は、プローブ 2と遭遇することなぐ最終的には容器 2dの内壁面まで移 動し、容器 2dの内壁面に付着する。
[0094] 次!、で、図 6 (ステップ o)に示すように、ステップ m及びステップ nを所定回数繰り返 す。ステップ m及びステップ nを繰り返す回数は特に限定されるものではないが、ハイ ブリダィゼーシヨン体 C2が十分量形成される回数であることが好ま 、。ハイブリダィ ゼーシヨン体 C2が十分量形成されることにより、標的核酸 Tの検出精度を向上させる ことができる。
[0095] ステップ 1一 oにおいて、磁石 3a及び 3bの磁気量 (磁荷）、容器 2dと磁石 3a又は 3b との距離、近接速度、離反速度等が調節され、ハイブリダィゼーシヨン体 C2に破壊、 分解等が生じない穏やかな条件下でハイブリダィゼーシヨン体 C2が形成される。
[0096] 次 、で、図 6 (ステップ p)に示すように、容器 2dの底部の外壁面近傍に磁石 3cを配 置する。磁性粒子 MBに磁石 3cが作用することにより、ハイブリダィゼーシヨン体 C2 は、未反応のプローブ P1及びノヽイブリダィゼーシヨン体 C1とともに、容器 2dの底部 の方向へ移動し、最終的には底部の内壁面に付着した状態で保持される。一方、未 反応のプローブ P2は、その分子中に磁性粒子 MBを含まないので、磁石 3cの作用 を受けず、液体 L5に浮遊したままの状態にある。 [0097] 次 、で、図 6 (ステップ q)に示すように、容器 2dの底部の外壁面近傍に磁石 3cを配 置した状態で、容器 2d内の液体 L5の上清を除去する。これにより、液体 L5の上清に 含まれる未反応のプローブ P2は除去され、液体 L5の残部に含まれる未反応のプロ ーブ P2は少量となる。液体 L5の上清を除去する際、ハイブリダィゼーシヨン体 C2は 容器 2dの底部の内壁面に付着した状態で保持されるので、ハイブリダィゼーシヨン C 2の量の減少は防止される。
[0098] 次いで、図 7 (ステップ r)に示すように、容器 2d内に、標識ィ匕非磁性粒子 LBよりも 比重が大きぐ磁性粒子 MBよりも比重が小さぐかつ標識化非磁性粒子 LB及び磁 性粒子 MB力もなる粒子複合体よりも比重が小さい液体 L6を注入する。このとき、容 器 2d内の液体 L5の量は、液体 L5と液体 L6と混合して得られる液体 7の比重力 標 識ィ匕非磁性粒子 LBよりも比重が大きぐ磁性粒子 MBよりも比重が小さぐかつ磁性 粒子 MB及び標識ィ匕非磁性粒子 LBからなる粒子複合体よりも比重が小さくなるよう に調節しておく。
[0099] こうして、図 7 (ステップ s)〖こ示すように、未反応のプローブ Pl、未反応のプローブ P 2、ハイブリダィゼーシヨン体 C1及びハイブリダィゼーシヨン体 C2が分散した液体 L7 が得られる。
[0100] 次いで、図 7 (ステップ t)に示すように、液体 L7を静置する。
磁性粒子 MBの質量及び体積はオリゴヌクレオチド N1の質量及び体積よりも遥か に大きぐ標識ィ匕非磁性粒子 LBの質量及び体積はオリゴヌクレオチド N2の質量及 び体積よりも遥かに大きぐ磁性粒子 MB及び標識ィ匕非磁性粒子 LBの質量及び体 積は標的核酸 Tの質量及び体積よりも遥かに大きいので、プローブ P1の比重は磁性 粒子 MBの比重に、プローブ P2の比重は標識ィ匕非磁性粒子 LBの比重に、ハイブリ ダイゼーシヨン体 C1の比重は磁性粒子 LBの比重に、ハイブリダィゼーシヨン体 C2の 比重は磁性粒子 MB及び標識ィ匕非磁性粒子 LBからなる粒子複合体の比重に近似 することができる。したがって、液体 L7を静置すると、未反応のプローブ Pl、ハイブリ ダイゼーシヨン体 C1及びハイブリダィゼーシヨン体 C2は沈降する一方、未反応のプ ローブ P2は浮上する。このとき、ハイブリダィゼーシヨン体 C2には重力及び浮力以外 の力は加わらないので、ハイブリダィゼーシヨン体 C2に破壊、分解等は生じない。こ のようにして、ノ、イブリダィゼーシヨン C2に破壊、分解等が生じない穏やかな条件下 、 ノ、イブリダィゼーシヨン C2は沈降物として分離される。
[0101] 沈降物には、ハイブリダィゼーシヨン体 C2とともに、未反応のプローブ P1及びハイ ブリダィゼーシヨン体 C1は含まれる力 未反応のプローブ P2は含まれない。このこと は、標識ィ匕非磁性粒子 LBの標識に基づいて、ノ、イブリダィゼーシヨン C2を検出する 際に重要となる。
[0102] 次いで、図 7 (ステップ s)に示すように、液体 L7の上清を除去する。これにより、未 反応のプローブ P2を含む浮上物は除去され、液体 L7の残部には、未反応のプロ一 ブ Pl、ハイブリダィゼーシヨン体 C1及びハイブリダィゼーシヨン体 C2を含む沈降物 が残る。
[0103] 次いで、標識ィ匕非磁性粒子 LBの標識に基づいて、沈降物に含まれるノ、イブリダイ ゼーシヨン体 C2を検出する。
[0104] 標識が蛍光標識である場合、励起光を照射して標識ィヒ非磁性粒子 LBを発光させ 、その発光量を CCDカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計、光電子増倍管（ photomultiplier tube : PMT)等の光学測定装置で測定する。また、標識が化学発光 標識である場合、過酸ィ匕水素水等の発光トリガー液を供給して標識ィ匕非磁性粒子 L Bを発光させ、その発光量を PMT等の光学測定装置で測定する。また、標識が酵素 標識である場合、基質液を分注した後、反応停止液を供給し、所定波長の測定光を 照射してその吸光度を測定する。
[0105] 本実施形態において、 2種類以上の標的核酸を並列して検出することもできる。例 えば、 2種類の標的核酸 T及び T'を並列して検出する場合、標的核酸 Tの検出には プローブ P1及びプローブ P2を使用し、標的核酸 T'の検出にはプローブ P1 '及びプ ローブ P2'を使用する。プローブ P1 'は磁性粒子 MB'及び磁性粒子 MB'に固定さ れたオリゴヌクレオチド N1，力もなる。オリゴヌクレオチド N1，は、図 11に示すように、 標的核酸 T'の領域 R1 'と相補的な塩基配列からなり、標的核酸 T'の領域 R1 'に特 異的にハイブリダィズすることができる。また、プローブ P2'は標識ィ匕非磁性粒子 LB' と標識ィ匕非磁性粒子 LB'に固定されたオリゴヌクレオチド N2'力もなる。オリゴヌタレ ォチド N2'は、図 11に示すように、標的核酸 T'の領域 R2'と相補的な塩基配列力 なり、標的核酸 T'の領域 R2'に特異的にハイブリダィズすることができる。標識化非 磁性粒子 LBの標識と標識ィ匕非磁性粒子 LB'の標識とは区別して検出可能な標識 である。蛍光標識の場合、蛍光性ィ匕合物の種類や量比を異なるものとすることにより 、標識ィ匕非磁性粒子 LBの標識と標識ィ匕非磁性粒子 LB'の標識とを区別して検出す ることがでさる。
[0106] 本実施形態にぉ 、て、標識ィ匕非磁性粒子 LBとして、磁性粒子 MBよりも比重が大 きい粒子を選択し、液体 L6として、標識ィ匕非磁性粒子 LBよりも比重が小さぐ磁性 粒子 MBよりも比重が大きく、かつ磁性粒子 MB及び標識ィ匕非磁性粒子 LBからなる 粒子複合体よりも比重が大きい液体を選択することができる。この場合、液体 L7を静 置すると、未反応のプローブ Pl、ハイブリダィゼーシヨン体 C1及びハイブリダィゼー シヨン体 C2は浮上する一方、未反応のプローブ P2は沈降するので、ハイブリダィゼ ーシヨン体 C2を含む浮上物を回収し、標識ィ匕非磁性粒子 LBの標識に基づいて、浮 上物に含まれるハイブリダィゼーシヨン体 C2を検出する。
[0107] 本実施形態では、容器 2dの外壁面の所定領域と磁石 3a又は 3bとを近接及び離反 させる際、容器 2dを固定した状態で磁石 3a又は 3bを容器 2dに対して近接及び離反 する方向に移動させた力 磁石 3a又は 3bを固定した状態で容器 2dを磁石 3a又は 3 bに対して近接及び離反する方向に移動させてもよい。また、容器 2d及び磁石 3a又 は 3bをともに（例えば同一方向又は逆方向へ)移動させてもよい。
[0108] 本実施形態では、容器 2dの外壁面の所定領域の位置を、領域 F1から領域 F2へ 及び領域 F2から領域 F1へ変化させたが、所定領域の位置の変化はこれに限定され るものではない。所定領域の位置を様々な位置に変化させれば、磁性粒子 MBを含 む分子を様々な方向へ移動させることができので、プローブ P1とプローブ P2と標的 核酸 Tとの遭遇確率が向上し、プローブ P1とプローブ P2と標的核酸 Tと反応を促進 させることがでさる。
[0109] 容器 2dの外壁面の所定領域の位置は、例えば、容器 2dの周方向、容器の長手方 向又はこれらを組み合わせた方向に変化させることができる。
例えば、図 8 (a)に示すように、円筒状部材 4の外壁面近傍に複数個の磁石 3a— 3 hを配置し、容器 2dを回転させながら円筒状部材 4の内壁面に沿って移動させること により、容器 2dの外壁面の所定領域の位置を容器 2dの周方向に変化させながら、 所定領域を通じて容器 2d内の磁性粒子 MBに各磁石を作用させることができる。こ の際、図 8 (b)に示すように、容器 2dの外壁面に複数の凸部 21を設けるとともに、円 筒状部材 4の内壁面に複数の凹部 41を設け、凸部 21と凹部 41を順次嵌合させるこ とにより、容器 2dを回転させながら円筒状部材 4の内壁面に沿って移動させることが できる。なお、図 8 (a)及び (b)では、円筒状部材 4の外壁面近傍に 8個の磁石を配 置したが、磁石の個数及び配置位置は適宜変更可能である。
[0110] また、図 9に示すように、 N極及び S極を適宜配列させたリング状磁石 5の貫通孔内 に円柱状部材 6を配置し、容器 2dを回転させながら円柱状部材 6の外壁面に沿って 移動させることにより、容器 2dの外壁面の所定領域の位置を容器 2dの周方向に変 ィ匕させながら、各所定領域を通じて容器 2d内の磁性粒子にリング状磁石 5を作用さ せることができる。この際、図 8 (b)と同様に、容器 2dの外壁面に複数の凸部を設ける とともに、円柱状部材 6の外壁面に複数の凹部を設け、凸部と凹部を順次嵌合させる ことにより、容器 2dを回転させながら円柱状部材 6の外壁面に沿って移動させること ができる。
[0111] また、図 10 (a)及び (b)に示すように、容器 2dの外壁面近傍に配置した磁石 3a又 は 3bをそれぞれ容器 2dの長手方向（図 10では上下方向）に移動させることにより、 容器 2dの外壁面の所定領域の位置を容器 2dの長手方向に変化させながら、各所 定領域を通じて容器 2d内の磁性粒子に磁石 3a又は 3bを作用させることができる。磁 石 3a又は 3bの形状は、図 10 (b)に示すように、容器 2dの外壁面に沿った形状とす ることがでさる。
[0112] 本実施形態において、磁石 3a又は 3bが電磁石等の一時磁石である場合、磁石 3a 又は 3bを容器 2dに近接させる前力も励磁状態としてもょ 、し、近接させた後に励磁 状態としてもよい。また、磁石の作用を解除する際、容器 2dに近接させた状態で非励 磁状態とすることにより磁石の作用を解除してもよい。
本実施形態では、容器 2dとして有底筒状容器を使用したが、ピペットチップ 10のよ うな無底筒状容器を使用してもよい。無底筒状容器内には、液体を吸引した状態で 保持することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブ と、前記第一粒子と比重が異なる第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結 合性物質を有する第二プローブと、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及 び前記第二結合性物質が結合し得る第二部分を有する標的物質とを反応させて得 られる反応混合物から、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との 結合体を分離する方法であって、
前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が大きぐ前記第二粒子よりも比重が 小さぐかつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さ い液体、又は前記第一粒子よりも比重が小さぐ前記第二粒子よりも比重が大きぐか つ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大きい液体と 混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する工程を含む前記方法。
[2] 前記第一粒子及び Z又は第二粒子が磁性粒子であり、
前記反応混合物が、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを容 器内に収容された反応溶媒中で反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配 置した状態で前記反応溶媒を除去して得られたものである請求項 1記載の方法。
[3] 前記第一粒子が非磁性粒子であり、前記第二粒子が磁性粒子である請求項 2記載 の方法。
[4] 第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブ と、第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プロ一 ブと、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物質が結合 し得る第二部分を有する標的物質とを反応させる方法であって、
前記第一粒子及び Z又は前記第二粒子が磁性粒子であり、
前記第一プローブ、前記第二プローブ、前記標的物質及び反応溶媒を容器に収 容する第一工程、
前記容器の外壁面の所定領域を通じて前記容器内の前記磁性粒子に磁石を作用 させる第二工程、
前記磁石の作用を解除する第三工程、及び 前記所定領域の位置を変化させながら前記第二工程及び前記第三工程を繰り返 す第四工程を含む前記方法。
[5] 前記第二工程において、前記所定領域と前記磁石とを近接させることにより前記磁 石を作用させ、
前記第三工程において、前記所定領域と前記磁石とを離反させることにより前記磁 石の作用を解除し、
前記第四工程において、前記所定領域の位置を変化させながら前記所定領域と 磁石との近接及び離反を繰り返す請求項 4記載の方法。
[6] 前記所定領域の位置を前記容器の周方向又は長手方向に変化させる請求項 4又 は 5記載の方法。
[7] 第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブ と、第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プロ一 ブとを用いて、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物 質が結合し得る第二部分を有する標的物質を検出する方法であって、
前記第一粒子として標識化粒子を選択し、前記第二粒子として前記第一粒子よりも 比重が大き!、粒子を選択する第一工程、
前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させ、反応混合物 を得る第二工程、
前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が大きぐ前記第二粒子よりも比重が 小さぐかつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が小さ い液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する第三工程、及び 前記沈降物に含まれる前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との 結合体を、前記第一粒子の標識に基づき検出する第四工程を含む前記方法。
[8] 第一粒子及び前記第一粒子に固定された第一結合性物質を有する第一プローブ と、第二粒子及び前記第二粒子に固定された第二結合性物質を有する第二プロ一 ブとを用いて、前記第一結合性物質が結合し得る第一部分及び前記第二結合性物 質が結合し得る第二部分を有する標的物質を検出する方法であって、
前記第一粒子として標識化粒子を選択し、前記第二粒子として前記第一粒子よりも 比重が小さ！/、粒子を選択する第一工程、
前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させ、反応混合物 を得る第二工程、
前記反応混合物を、前記第一粒子よりも比重が小さぐ前記第二粒子よりも比重が 大きぐかつ前記第一粒子及び前記第二粒子からなる粒子複合体よりも比重が大き い液体と混合した後、沈降物及び浮上物が形成されるまで静置する第三工程、及び 前記浮上物に含まれる前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質との 結合体を、前記第一粒子の標識に基づき検出する第四工程を含む前記方法。
[9] 前記第一工程にお!、て、前記第一粒子及び Z又は前記第二粒子として磁性粒子 を選択し、
前記第二工程にお!、て、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質と を容器内に収容された反応溶媒中で反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石 を配置した状態で前記反応溶媒を除去し、前記反応混合物を得る請求項 7又は 8記 載の方法。
[10] 前記第一工程にお!ヽて、前記第一粒子として非磁性粒子を選択し、前記第二粒子 として磁性粒子を選択する請求項 9記載の方法。
[11] 前記第一工程において、前記第一粒子及び Z又は前記第二粒子として磁性粒子 を選択し、
前記第二工程にぉ 、て、請求項 4一 6の 、ずれかに記載の方法により前記第一プ ローブと前記第二プローブと前記標的物質とを反応させる請求項 7又は 8記載の方 法。
[12] 前記第二工程にお!、て、前記第一プローブと前記第二プローブと前記標的物質と を反応させた後、前記容器の外壁面近傍に磁石を配置した状態で前記反応溶媒を 除去し、前記反応混合物を得る請求項 11記載の方法。
[13] 前記第一工程にお!ヽて、前記第一粒子として非磁性粒子を選択し、前記第二粒子 として磁性粒子を選択する請求項 12記載の方法。
[14] 前記第一工程にお!、て、前記第二粒子として磁性粒子を選択し、
前記第二工程にお!、て、前記標的物質を含有する試料と前記第二プローブとを混 合し、磁力制御により前記第二プローブと前記標的物質との結合体を回収し、前記 第二プローブと前記標的物質との結合体を前記第一プローブと反応させる請求項 7 一 13のいずれかに記載の方法。
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