JPH11225759A - 核酸の固定化方法及びこれを利用した核酸検出法 - Google Patents
核酸の固定化方法及びこれを利用した核酸検出法Info
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- JPH11225759A JPH11225759A JP3446798A JP3446798A JPH11225759A JP H11225759 A JPH11225759 A JP H11225759A JP 3446798 A JP3446798 A JP 3446798A JP 3446798 A JP3446798 A JP 3446798A JP H11225759 A JPH11225759 A JP H11225759A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 磁性粒子表面に多くの官能基を導入すること
により、単位磁性粒子量当たりの固定化核酸量を高める
と共に、導入した官能基の親水性により磁性粒子の水溶
液中での分散状態にも優れる核酸の固定化方法、及びこ
れを利用した高感度で操作性の良い核酸検出法の提供。 【解決手段】 表面に官能基Ａを有する磁性粒子に、官
能基Ａと反応する官能基Ｂを３個以上有する多官能基性
ポリマーを、官能基ＡとＢとの反応によって結合させて
多官能基性磁性粒子を調製し、次いでこれの遊離官能基
Ｂに核酸を反応させる核酸の固定化方法及びこれを利用
した核酸検出法。
により、単位磁性粒子量当たりの固定化核酸量を高める
と共に、導入した官能基の親水性により磁性粒子の水溶
液中での分散状態にも優れる核酸の固定化方法、及びこ
れを利用した高感度で操作性の良い核酸検出法の提供。 【解決手段】 表面に官能基Ａを有する磁性粒子に、官
能基Ａと反応する官能基Ｂを３個以上有する多官能基性
ポリマーを、官能基ＡとＢとの反応によって結合させて
多官能基性磁性粒子を調製し、次いでこれの遊離官能基
Ｂに核酸を反応させる核酸の固定化方法及びこれを利用
した核酸検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】核酸の分離精製や検出に利用
される磁性粒子の表面の官能基量を増加させることによ
り多量の核酸を固定化する方法及びこれを利用した核酸
検出法に関する。
される磁性粒子の表面の官能基量を増加させることによ
り多量の核酸を固定化する方法及びこれを利用した核酸
検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸、蛋白質などの生体内物質を特異的
に検出又は精製するには、目的とする生体内物質を特異
的に標識又は分離する手段が必要であるが、そのひとつ
として固相に目的生体内物質と特異的に結合する性質の
物質を固定化し、溶液中の目的物質を特異的に捕獲する
方法が広く用いられている〔千葉仁志，ニッポン臨床53
巻９号（9, 1995）〕。特に、核酸の検出又は精製の場
合は相補的な核酸が特異的に結合（ハイブリダイゼーシ
ョン）する性質を利用することによって目的とする核酸
を特異的に捕獲することができ、この相補的な核酸を固
定化するための固相として、液相中で細かく分散させる
ことにより液相-固相間の高い反応性が得られ、磁石に
吸着させることにより簡便に液相と分離できる磁性粒子
が用いられるようになっている。
に検出又は精製するには、目的とする生体内物質を特異
的に標識又は分離する手段が必要であるが、そのひとつ
として固相に目的生体内物質と特異的に結合する性質の
物質を固定化し、溶液中の目的物質を特異的に捕獲する
方法が広く用いられている〔千葉仁志，ニッポン臨床53
巻９号（9, 1995）〕。特に、核酸の検出又は精製の場
合は相補的な核酸が特異的に結合（ハイブリダイゼーシ
ョン）する性質を利用することによって目的とする核酸
を特異的に捕獲することができ、この相補的な核酸を固
定化するための固相として、液相中で細かく分散させる
ことにより液相-固相間の高い反応性が得られ、磁石に
吸着させることにより簡便に液相と分離できる磁性粒子
が用いられるようになっている。
【０００３】それには、まず目的とする核酸をハイブリ
ダイゼーションによって捕獲するための相補的な核酸を
磁性粒子へ固定化する必要がある。核酸を固定化する方
法としては、粒子の表面へ物理吸着させる方法と、粒子
表面のアミノ基、カルボキシル基などの官能基へ共有結
合させる方法が知られている（Vera Land, Ruth Schmi
d, David Rickwood, Erik Hornes(1988). Nucleic Acid
s Res. 16(22), 10861）。また、ビオチンアビジン系を
用いた固定化法も利用されている（Shao-OchieHuang, H
arold Swerclow, and Karin D. Caldwell(1994). Analy
tical Biochemistry 222, 441-119）。
ダイゼーションによって捕獲するための相補的な核酸を
磁性粒子へ固定化する必要がある。核酸を固定化する方
法としては、粒子の表面へ物理吸着させる方法と、粒子
表面のアミノ基、カルボキシル基などの官能基へ共有結
合させる方法が知られている（Vera Land, Ruth Schmi
d, David Rickwood, Erik Hornes(1988). Nucleic Acid
s Res. 16(22), 10861）。また、ビオチンアビジン系を
用いた固定化法も利用されている（Shao-OchieHuang, H
arold Swerclow, and Karin D. Caldwell(1994). Analy
tical Biochemistry 222, 441-119）。
【０００４】物理吸着法は簡便な手法であるが、結合力
が弱く、ある種の界面活性剤などを用いた強い条件で洗
浄すると核酸が剥離する可能性がある。また、共有結合
法は、固定化すべき核酸に官能基を導入する必要があり
物理吸着法に比べて操作は煩雑であるが、粒子と核酸と
を強く結合させることが可能である（Vera Land, Ruth
Schmid, David Rickwood, Erik Hornes(1988). Nucleic
Acids Res. 16(22),10861）。共有結合法における粒子
表面の官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、水
酸基などが知られている（Vera Land, Ruth Schmid, Da
vid Rickwood, Erik Hornes(1988). Nucleic Acids Re
s. 16(22), 10861）。粒子表面のカルボキシル基は、1-
(3-ジエチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド
塩酸塩（EDC）などの活性化試験薬で活性化し、核酸に
あらかじめ導入したアミノアルキル基と結合させること
ができる。粒子表面のアミノ基は、２価反応性の架橋試
薬を用いてカルボキシル基に変換し、核酸にあらかじめ
導入したアミノアルキル基と結合させる（Running, J.
A., Urdea, N. S.,(1990) Bio Techniques 8,(3), 27
6）か、又は末端に付加したリン酸と結合させることが
できる（Vera Land,Ruth Schmid, David Rickwood, Eri
k Hornes(1988). Nucleic Acids Res. 16(22), 1086
1）。また、粒子表面の水酸基は、トシル基で活性化し
て核酸に付加したアミノアルキル基と結合させることが
できる（Yu-An Chang, Adrian Gee, AlanSmith, Willia
m Lake(1992) Bioconjugate Chem. 3, 200-202）。
が弱く、ある種の界面活性剤などを用いた強い条件で洗
浄すると核酸が剥離する可能性がある。また、共有結合
法は、固定化すべき核酸に官能基を導入する必要があり
物理吸着法に比べて操作は煩雑であるが、粒子と核酸と
を強く結合させることが可能である（Vera Land, Ruth
Schmid, David Rickwood, Erik Hornes(1988). Nucleic
Acids Res. 16(22),10861）。共有結合法における粒子
表面の官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、水
酸基などが知られている（Vera Land, Ruth Schmid, Da
vid Rickwood, Erik Hornes(1988). Nucleic Acids Re
s. 16(22), 10861）。粒子表面のカルボキシル基は、1-
(3-ジエチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド
塩酸塩（EDC）などの活性化試験薬で活性化し、核酸に
あらかじめ導入したアミノアルキル基と結合させること
ができる。粒子表面のアミノ基は、２価反応性の架橋試
薬を用いてカルボキシル基に変換し、核酸にあらかじめ
導入したアミノアルキル基と結合させる（Running, J.
A., Urdea, N. S.,(1990) Bio Techniques 8,(3), 27
6）か、又は末端に付加したリン酸と結合させることが
できる（Vera Land,Ruth Schmid, David Rickwood, Eri
k Hornes(1988). Nucleic Acids Res. 16(22), 1086
1）。また、粒子表面の水酸基は、トシル基で活性化し
て核酸に付加したアミノアルキル基と結合させることが
できる（Yu-An Chang, Adrian Gee, AlanSmith, Willia
m Lake(1992) Bioconjugate Chem. 3, 200-202）。
【０００５】これらのうち、粒子表面にカルボキシル基
を有する磁性粒子を利用する方法は、反応性も高く、効
率よく核酸を導入することが可能であるが、核酸に導入
したアミノアルキル基との反応の選択性に問題があり、
実際にハイブリダイゼーションに有効な状態で結合して
いる核酸は少ない（Vera Land, Ruth Schmid, DavidRic
kwood, Erik Hornes(1988). Nucleic Acids Res. 16(2
2), 10861）。一方、粒子表面にアミノ基を有する磁性
粒子を利用して２価反応性架橋試薬を用いる方法は、副
反応が少なく核酸に付加したアミノアルキル基と特異的
に反応するため核酸を有効に結合させることが可能であ
る。しかし、一般的にアミノ基の付加した磁性粒子を利
用した場合、カルボキシル基の付加したものに比べて導
入できる核酸の量が少ないという問題がある。特に、磁
性粒子法と化学発光検出法（Debbie J. Berry, Penelop
e M. S. Clark, and Christopher P. Price(1998) Cli
n.Chem. 34(10), 2087-2090）を組合せて用いる場合
は、磁性粒子による溶液の濁りが発光検出を阻害するた
め、使用粒子量をできうる限り少なくする必要があり、
十分量の固定化核酸を利用するためには単位粒子量当た
りの核酸の固定量を上げる必要がある。
を有する磁性粒子を利用する方法は、反応性も高く、効
率よく核酸を導入することが可能であるが、核酸に導入
したアミノアルキル基との反応の選択性に問題があり、
実際にハイブリダイゼーションに有効な状態で結合して
いる核酸は少ない（Vera Land, Ruth Schmid, DavidRic
kwood, Erik Hornes(1988). Nucleic Acids Res. 16(2
2), 10861）。一方、粒子表面にアミノ基を有する磁性
粒子を利用して２価反応性架橋試薬を用いる方法は、副
反応が少なく核酸に付加したアミノアルキル基と特異的
に反応するため核酸を有効に結合させることが可能であ
る。しかし、一般的にアミノ基の付加した磁性粒子を利
用した場合、カルボキシル基の付加したものに比べて導
入できる核酸の量が少ないという問題がある。特に、磁
性粒子法と化学発光検出法（Debbie J. Berry, Penelop
e M. S. Clark, and Christopher P. Price(1998) Cli
n.Chem. 34(10), 2087-2090）を組合せて用いる場合
は、磁性粒子による溶液の濁りが発光検出を阻害するた
め、使用粒子量をできうる限り少なくする必要があり、
十分量の固定化核酸を利用するためには単位粒子量当た
りの核酸の固定量を上げる必要がある。
【０００６】一方、磁性粒子としては、ポリスチレンな
どの疎水性の素材をベースとして用いたものが知られて
いるが（Vera Land, Ruth Schmid, David Rickwood, Er
ik Hornes(1988). Nucleic Acids Res. 16(22), 1086
1）、それらのものは水溶液中で疎水的に凝集を起こし
やすく、また容器の壁に吸着し、水溶液中への分散及び
磁石への集合が阻害される。また、蛋白質、核酸などを
非特異的に吸着しやすいために、生体内物質の検出に使
用する場合はバックグラウンドの上昇の原因となること
が考えられる。
どの疎水性の素材をベースとして用いたものが知られて
いるが（Vera Land, Ruth Schmid, David Rickwood, Er
ik Hornes(1988). Nucleic Acids Res. 16(22), 1086
1）、それらのものは水溶液中で疎水的に凝集を起こし
やすく、また容器の壁に吸着し、水溶液中への分散及び
磁石への集合が阻害される。また、蛋白質、核酸などを
非特異的に吸着しやすいために、生体内物質の検出に使
用する場合はバックグラウンドの上昇の原因となること
が考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、磁
性粒子表面に多くの官能基を導入することによって、単
位磁性粒子量当たりの固定化核酸量を高めると共に、導
入した官能基の親水性により磁性粒子の水溶液中での分
散状態にも優れる核酸の固定化方法、及びこれを利用し
た高感度で操作性の良い核酸検出法を提供することを目
的とする。
性粒子表面に多くの官能基を導入することによって、単
位磁性粒子量当たりの固定化核酸量を高めると共に、導
入した官能基の親水性により磁性粒子の水溶液中での分
散状態にも優れる核酸の固定化方法、及びこれを利用し
た高感度で操作性の良い核酸検出法を提供することを目
的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】かかる実情において本発
明者らは、多官能基を持つポリマー、特にポリアミノ酸
中に核酸を結合させるために有用なアミノ基又はカルボ
キシル基が多量に存在し、かつ親水性も高いことに注目
し、これらのポリマーを磁性粒子表面に結合又は被覆す
ることによって核酸固定化量を増やすことができると共
に、ポリマー分子の親水性によって磁性粒子の水溶液中
での分散状態が改善されることを見出した。また、特に
表面にカルボキシル基を有する磁性粒子にポリ塩基性ア
ミノ酸を結合させれば、導入核酸量が少ないというアミ
ノ基を有する磁性粒子の欠点及び直接核酸を固定化する
と副反応を起こす可能性が高いというカルボキシル基を
有する磁性粒子の欠点の双方を補い、核酸を効果的かつ
効率的に導入することが可能となることを見出し、本発
明を完成した。
明者らは、多官能基を持つポリマー、特にポリアミノ酸
中に核酸を結合させるために有用なアミノ基又はカルボ
キシル基が多量に存在し、かつ親水性も高いことに注目
し、これらのポリマーを磁性粒子表面に結合又は被覆す
ることによって核酸固定化量を増やすことができると共
に、ポリマー分子の親水性によって磁性粒子の水溶液中
での分散状態が改善されることを見出した。また、特に
表面にカルボキシル基を有する磁性粒子にポリ塩基性ア
ミノ酸を結合させれば、導入核酸量が少ないというアミ
ノ基を有する磁性粒子の欠点及び直接核酸を固定化する
と副反応を起こす可能性が高いというカルボキシル基を
有する磁性粒子の欠点の双方を補い、核酸を効果的かつ
効率的に導入することが可能となることを見出し、本発
明を完成した。
【０００９】すなわち本発明は、表面に官能基Ａを有す
る磁性粒子に、官能基Ａと反応する官能基Ｂを３個以上
有する多官能基性ポリマーを、官能基ＡとＢとの反応に
よって結合させて多官能基性磁性粒子を調製し、次いで
これの遊離官能基Ｂに核酸を反応させることを特徴とす
る核酸の固定化方法を提供するものである。
る磁性粒子に、官能基Ａと反応する官能基Ｂを３個以上
有する多官能基性ポリマーを、官能基ＡとＢとの反応に
よって結合させて多官能基性磁性粒子を調製し、次いで
これの遊離官能基Ｂに核酸を反応させることを特徴とす
る核酸の固定化方法を提供するものである。
【００１０】また本発明は、上記のようにして調製した
遊離官能基Ｂを有する多官能基性磁性粒子に、官能基Ｂ
と反応する官能基Ａを３個以上有する多官能基性ポリマ
ーを、官能基ＡとＢとの反応によって結合させて多官能
基性磁性粒子を調製し、次いでこれの遊離官能基Ａに核
酸を反応させることを特徴とする核酸の固定化方法を提
供するものである。
遊離官能基Ｂを有する多官能基性磁性粒子に、官能基Ｂ
と反応する官能基Ａを３個以上有する多官能基性ポリマ
ーを、官能基ＡとＢとの反応によって結合させて多官能
基性磁性粒子を調製し、次いでこれの遊離官能基Ａに核
酸を反応させることを特徴とする核酸の固定化方法を提
供するものである。
【００１１】更に本発明は、上記固定化方法を利用した
核酸検出法を提供するものである。
核酸検出法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
まず、磁性粒子に多官能基を有するポリマーを結合させ
る方法について説明する。
まず、磁性粒子に多官能基を有するポリマーを結合させ
る方法について説明する。
【００１３】本発明に使用される磁性粒子としては、ロ
ーヌプーラン社のエスタポール、セラダイン社のCM-M
P、パーセプティブ社のバイオマグ、日本ペイント社の
フェリスフェアなど、磁性粒子表面にアミノ基又はカル
ボキシル基を有するものが好ましい。また、ダイナテッ
ク社のダイナビーズなど、磁性粒子表面の官能基が水酸
基のものも、3-アミノプロピルトリエトキシシラン等の
試薬を利用してアミノアルキル基を導入して用いること
ができる。
ーヌプーラン社のエスタポール、セラダイン社のCM-M
P、パーセプティブ社のバイオマグ、日本ペイント社の
フェリスフェアなど、磁性粒子表面にアミノ基又はカル
ボキシル基を有するものが好ましい。また、ダイナテッ
ク社のダイナビーズなど、磁性粒子表面の官能基が水酸
基のものも、3-アミノプロピルトリエトキシシラン等の
試薬を利用してアミノアルキル基を導入して用いること
ができる。
【００１４】表面にカルボキシル基を有する磁性粒子と
反応させる場合に用いられる、カルボキシル基と反応す
る官能基を３個以上有する多官能基性ポリマーとして
は、ポリ塩基性アミノ酸、例えばポリD-リジン、ポリL-
リジン、ポリDL-リジン；ポリD-オルニチン、ポリL-オ
ルニチン、ポリDL-オルニチン；ポリエチレンイミン、
ポリ（トリメチレンイミン）等のポリアルキルイミン；
又はそれらの塩酸塩、硫酸塩、臭化水素塩、コハク酸塩
などが挙げられ、なかでもポリリジン及びポリオルニチ
ン、更にポリD-リジン及びポリD-オルニチン、特にポリ
D-リジンが好ましい。またこれらのポリマーをN-サクシ
ンイミジル-S-アセチルチオアセテート等の試薬と反応
させることにより、アミノ基をチオール基に変換させた
ものを用いることも可能である。一方、表面にアミノ基
を有する磁性粒子と反応させる場合に用いられる、アミ
ノ基と反応する官能基を３個以上有する多官能基性ポリ
マーとしては、ポリ酸性アミノ酸、例えばポリD-グルタ
ミン酸、ポリL-グルタミン酸、ポリDL-グルタミン酸；
ポリD-アスパラギン酸、ポリL-アスパラギン酸、ポリDL
-アスパラギン酸；又はそれらのナトリウム塩、カリウ
ム塩等が挙げられ、なかでもポリD-グルタミン酸及びポ
リD-アスパラギン酸が好ましい。更に、ポリ（リジン-
アラニン）、ポリ（グルタミン酸-アラニン）等のリジ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸を含むアミノ酸のポ
リマー又はその塩でもよい。
反応させる場合に用いられる、カルボキシル基と反応す
る官能基を３個以上有する多官能基性ポリマーとして
は、ポリ塩基性アミノ酸、例えばポリD-リジン、ポリL-
リジン、ポリDL-リジン；ポリD-オルニチン、ポリL-オ
ルニチン、ポリDL-オルニチン；ポリエチレンイミン、
ポリ（トリメチレンイミン）等のポリアルキルイミン；
又はそれらの塩酸塩、硫酸塩、臭化水素塩、コハク酸塩
などが挙げられ、なかでもポリリジン及びポリオルニチ
ン、更にポリD-リジン及びポリD-オルニチン、特にポリ
D-リジンが好ましい。またこれらのポリマーをN-サクシ
ンイミジル-S-アセチルチオアセテート等の試薬と反応
させることにより、アミノ基をチオール基に変換させた
ものを用いることも可能である。一方、表面にアミノ基
を有する磁性粒子と反応させる場合に用いられる、アミ
ノ基と反応する官能基を３個以上有する多官能基性ポリ
マーとしては、ポリ酸性アミノ酸、例えばポリD-グルタ
ミン酸、ポリL-グルタミン酸、ポリDL-グルタミン酸；
ポリD-アスパラギン酸、ポリL-アスパラギン酸、ポリDL
-アスパラギン酸；又はそれらのナトリウム塩、カリウ
ム塩等が挙げられ、なかでもポリD-グルタミン酸及びポ
リD-アスパラギン酸が好ましい。更に、ポリ（リジン-
アラニン）、ポリ（グルタミン酸-アラニン）等のリジ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸を含むアミノ酸のポ
リマー又はその塩でもよい。
【００１５】表面にカルボキシル基を有する磁性粒子に
多官能基性ポリマーを反応させるには、まず磁性粒子の
カルボキシル基を活性化する必要がある。磁性粒子のカ
ルボキシル基の活性化は、磁性粒子を分散させた弱酸性
又は中性付近の水溶液又は緩衝液中に活性化剤を加え、
室温で30分程度振盪した後、磁石で磁性粒子を分離し、
水又は緩衝液で洗浄して過剰の試薬を取り除くことによ
り行われる。活性化剤としては、1,3-ジシクロヘキシル
カルボジイミド及び1-(3-ジエチルアミノプロピル)-3-
エチルカルボジイミド塩酸塩が好ましいものとして挙げ
られる。活性化磁性粒子と多官能基性ポリマーとの反応
は、活性化磁性粒子に、そのカルボキシル基に対して大
過剰の多官能基性ポリマー（ポリ塩基性アミノ酸）を緩
衝液に溶解したものを加え、適当な条件で振盪すること
により行われる。反応後、磁石で磁性粒子を分離して溶
液を取り除き、未反応のポリマーを塩化ナトリウム水溶
液及び緩衝液で洗浄して、アミノ基を多数有するポリ塩
基性アミノ酸結合磁性粒子を得ることができる。
多官能基性ポリマーを反応させるには、まず磁性粒子の
カルボキシル基を活性化する必要がある。磁性粒子のカ
ルボキシル基の活性化は、磁性粒子を分散させた弱酸性
又は中性付近の水溶液又は緩衝液中に活性化剤を加え、
室温で30分程度振盪した後、磁石で磁性粒子を分離し、
水又は緩衝液で洗浄して過剰の試薬を取り除くことによ
り行われる。活性化剤としては、1,3-ジシクロヘキシル
カルボジイミド及び1-(3-ジエチルアミノプロピル)-3-
エチルカルボジイミド塩酸塩が好ましいものとして挙げ
られる。活性化磁性粒子と多官能基性ポリマーとの反応
は、活性化磁性粒子に、そのカルボキシル基に対して大
過剰の多官能基性ポリマー（ポリ塩基性アミノ酸）を緩
衝液に溶解したものを加え、適当な条件で振盪すること
により行われる。反応後、磁石で磁性粒子を分離して溶
液を取り除き、未反応のポリマーを塩化ナトリウム水溶
液及び緩衝液で洗浄して、アミノ基を多数有するポリ塩
基性アミノ酸結合磁性粒子を得ることができる。
【００１６】更に、上記の表面にカルボキシル基を有す
る磁性粒子として、表面にアミノ基を有する磁性粒子の
懸濁溶液に、環状酸無水物、好ましくは無水コハク酸を
反応させることによりカルボキシル基を導入した磁性粒
子を用い、このものに対して上記と同様にポリ塩基性ア
ミノ酸を結合させることも可能である。また以上のよう
にして得られたアミノ基を多数有するポリ塩基性アミノ
酸結合磁性粒子の懸濁溶液に、環状酸無水物、好ましく
は無水コハク酸を反応させることにより、カルボキシル
基を導入することもできる。このものに対して上記と同
様にポリ塩基性アミノ酸を結合させることによって更に
官能基数の増幅を図ることが可能である。
る磁性粒子として、表面にアミノ基を有する磁性粒子の
懸濁溶液に、環状酸無水物、好ましくは無水コハク酸を
反応させることによりカルボキシル基を導入した磁性粒
子を用い、このものに対して上記と同様にポリ塩基性ア
ミノ酸を結合させることも可能である。また以上のよう
にして得られたアミノ基を多数有するポリ塩基性アミノ
酸結合磁性粒子の懸濁溶液に、環状酸無水物、好ましく
は無水コハク酸を反応させることにより、カルボキシル
基を導入することもできる。このものに対して上記と同
様にポリ塩基性アミノ酸を結合させることによって更に
官能基数の増幅を図ることが可能である。
【００１７】また、表面にアミノ基を有する磁性粒子に
多官能基性ポリマーを反応させるには、まず多官能基性
ポリマー（ポリ酸性アミノ酸）のカルボキシル基を活性
化する必要がある。ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基
の活性化は、ポリ酸性アミノ酸をDMF、DMSO、アセトニ
トリル等の無水の有機溶媒に懸濁し、前記と同様の活性
化剤を加えて室温で30分程度振盪することにより行われ
る。これを表面にアミノ基を有する磁性粒子の懸濁溶液
に加えて反応させることにより、カルボキシル基を多数
有するポリ酸性アミノ酸結合磁性粒子を得ることができ
る。
多官能基性ポリマーを反応させるには、まず多官能基性
ポリマー（ポリ酸性アミノ酸）のカルボキシル基を活性
化する必要がある。ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基
の活性化は、ポリ酸性アミノ酸をDMF、DMSO、アセトニ
トリル等の無水の有機溶媒に懸濁し、前記と同様の活性
化剤を加えて室温で30分程度振盪することにより行われ
る。これを表面にアミノ基を有する磁性粒子の懸濁溶液
に加えて反応させることにより、カルボキシル基を多数
有するポリ酸性アミノ酸結合磁性粒子を得ることができ
る。
【００１８】また、上記のようにして得られたカルボキ
シル基を多数有するポリ酸性アミノ酸結合磁性粒子に、
更にポリ塩基性アミノ酸を結合することによって、官能
基の数をより増幅することも可能である。この場合の磁
性粒子の活性化及びポリ塩基性アミノ酸との反応は前記
と同様にして行うことができる。
シル基を多数有するポリ酸性アミノ酸結合磁性粒子に、
更にポリ塩基性アミノ酸を結合することによって、官能
基の数をより増幅することも可能である。この場合の磁
性粒子の活性化及びポリ塩基性アミノ酸との反応は前記
と同様にして行うことができる。
【００１９】また、ポリ塩基性アミノ酸を結合させた磁
性粒子に、更にポリ酸性アミノ酸を活性化し、結合する
ことによって、官能基の数を増幅することも可能であ
る。
性粒子に、更にポリ酸性アミノ酸を活性化し、結合する
ことによって、官能基の数を増幅することも可能であ
る。
【００２０】なお、最終的に磁性粒子表面の官能基をカ
ルボキシル基とし、これを核酸の検出や精製に使用する
場合、この磁性粒子は、それに結合している多数のカル
ボキシル基を活性化することによって、アミノアルキル
基を有する核酸、又はその他の生理活性物質を結合させ
ることを目的としているが、このとき粒子表面にアミノ
基が残存していると、これが活性化されたカルボキシル
基と反応して、目的物との反応を阻害する。そこで、こ
の磁性粒子の懸濁溶液に無水酢酸、無水コハク酸、スル
ホサクシンイミジルアセテート等のキャッピング剤を加
え、残存アミノ基を塞ぐことにより、不活性化すること
が好ましく、これにより、活性化したカルボキシル基に
目的とする核酸等の生理活性物質を効率よく結合させる
ことができる。
ルボキシル基とし、これを核酸の検出や精製に使用する
場合、この磁性粒子は、それに結合している多数のカル
ボキシル基を活性化することによって、アミノアルキル
基を有する核酸、又はその他の生理活性物質を結合させ
ることを目的としているが、このとき粒子表面にアミノ
基が残存していると、これが活性化されたカルボキシル
基と反応して、目的物との反応を阻害する。そこで、こ
の磁性粒子の懸濁溶液に無水酢酸、無水コハク酸、スル
ホサクシンイミジルアセテート等のキャッピング剤を加
え、残存アミノ基を塞ぐことにより、不活性化すること
が好ましく、これにより、活性化したカルボキシル基に
目的とする核酸等の生理活性物質を効率よく結合させる
ことができる。
【００２１】以上の操作を組合せて繰り返し行えば、磁
性粒子表面に、親水性の多官能基を持つポリマーの層を
積み重ねることができる。
性粒子表面に、親水性の多官能基を持つポリマーの層を
積み重ねることができる。
【００２２】以上説明した方法により得られる多官能基
性磁性粒子のうち、本発明の核酸検出法に使用する上で
最も好ましいものは、最終的に磁性粒子表面の官能基を
アミノ基としたものであり、このような磁性粒子を用い
ることにより、導入核酸量が少ないというアミノ基を有
する磁性粒子の欠点及び直接核酸を固定化すると副反応
を起こす可能性が高いというカルボキシル基を有する磁
性粒子の欠点の双方を補い、核酸を効果的かつ効率的に
導入することが可能である。
性磁性粒子のうち、本発明の核酸検出法に使用する上で
最も好ましいものは、最終的に磁性粒子表面の官能基を
アミノ基としたものであり、このような磁性粒子を用い
ることにより、導入核酸量が少ないというアミノ基を有
する磁性粒子の欠点及び直接核酸を固定化すると副反応
を起こす可能性が高いというカルボキシル基を有する磁
性粒子の欠点の双方を補い、核酸を効果的かつ効率的に
導入することが可能である。
【００２３】本発明の核酸検出法に用いられる磁性粒子
は、上記のようにして得られた多官能基性磁性粒子に、
核酸を結合させることによって得ることができる。核酸
には、結合に利用するための官能基をあらかじめ導入し
ておいてもよい（Vera Land,Ruth Schmid, David Rickw
ood, Erik Hornes(1988). Nucleic Acids Res. 16(22),
10861）。導入する官能基は、アミノアルキル基、カル
ボキシル基、リン酸基など、磁性粒子に導入した官能基
と直接反応するもの、又は２価反応性の架橋試薬を利用
して間接的に結合させることができるものでもよく、合
成的に、又は酵素反応を利用して導入することができ
る。多官能基性磁性粒子と核酸との結合法としては、ペ
プチド合成法に用いられるカルボジイミド法、活性エス
テル法、混酸無水物法等を用いることができる。また間
接法の例を挙げれば、合成アミノアルキル化DNAプロー
ブに２価反応性の活性エステルであるジサクシンイミジ
ルスベレートを反応させて活性化DNAプローブとし、こ
れを多数のアミノ基を有するポリマーを結合させた磁性
粒子と反応させることにより核酸固定化磁性粒子を得る
ことができる。更に、その他の結合法としてグルタルア
ルデヒド法、2,4,6-トリクロロ-s-トリアジン法等を用
いることもできる。
は、上記のようにして得られた多官能基性磁性粒子に、
核酸を結合させることによって得ることができる。核酸
には、結合に利用するための官能基をあらかじめ導入し
ておいてもよい（Vera Land,Ruth Schmid, David Rickw
ood, Erik Hornes(1988). Nucleic Acids Res. 16(22),
10861）。導入する官能基は、アミノアルキル基、カル
ボキシル基、リン酸基など、磁性粒子に導入した官能基
と直接反応するもの、又は２価反応性の架橋試薬を利用
して間接的に結合させることができるものでもよく、合
成的に、又は酵素反応を利用して導入することができ
る。多官能基性磁性粒子と核酸との結合法としては、ペ
プチド合成法に用いられるカルボジイミド法、活性エス
テル法、混酸無水物法等を用いることができる。また間
接法の例を挙げれば、合成アミノアルキル化DNAプロー
ブに２価反応性の活性エステルであるジサクシンイミジ
ルスベレートを反応させて活性化DNAプローブとし、こ
れを多数のアミノ基を有するポリマーを結合させた磁性
粒子と反応させることにより核酸固定化磁性粒子を得る
ことができる。更に、その他の結合法としてグルタルア
ルデヒド法、2,4,6-トリクロロ-s-トリアジン法等を用
いることもできる。
【００２４】本発明の核酸検出法においては、標識とし
て、放射性物質、蛍光もしくは発光物質、又は酵素を用
いることができる。すなわち、ハイブリダイゼーション
法を用い、又は組合せて、磁性粒子に固定化した核酸プ
ローブに目的とする核酸を固定化し、更に標識のついた
核酸をハイブリダイゼーションさせ、磁石で磁性粒子を
分離することによって、磁性粒子上の標識を特異的に検
出することができる。
て、放射性物質、蛍光もしくは発光物質、又は酵素を用
いることができる。すなわち、ハイブリダイゼーション
法を用い、又は組合せて、磁性粒子に固定化した核酸プ
ローブに目的とする核酸を固定化し、更に標識のついた
核酸をハイブリダイゼーションさせ、磁石で磁性粒子を
分離することによって、磁性粒子上の標識を特異的に検
出することができる。
【００２５】本発明の核酸検出法に用いるハイブリダイ
ゼーション法は、溶液温度を30℃から99℃、好ましくは
45℃から70℃まで上昇させた後冷却し、好ましくは25℃
付近まで下げることによって、行うことができる。
ゼーション法は、溶液温度を30℃から99℃、好ましくは
45℃から70℃まで上昇させた後冷却し、好ましくは25℃
付近まで下げることによって、行うことができる。
【００２６】また、標識に使う酵素としては、アルカリ
フォスファターゼ、パーオキシダーゼ、β-ガラクトシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。
フォスファターゼ、パーオキシダーゼ、β-ガラクトシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。
【００２７】また、基質としては、それぞれの酵素に適
合した基質を採用することができる。例えば、アルカリ
フォスファターゼにはp-ニトロフェニルフォスフェー
ト、3-(2′-ピロ-トリサイクロ[3.3.1.1]デカン)-4-メ
トキシ-4-(3″-フォスフォリルオキシ)フェニル-1,2-ジ
オキセタン二ナトリウム塩など、パーオキシダーゼには
2,2′-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホ
ン酸（ABTS）、ルミノール-過酸化水素など、β-ガラク
トシダーゼにはp-ニトロフェニル-β-o-ガラクトース、
3-(2′-スピロアダマンタン)-4-(3-β-D-ガラクトピラ
ノシル)フェニル-1,2-ジオキセタンなどを用いることが
できる。
合した基質を採用することができる。例えば、アルカリ
フォスファターゼにはp-ニトロフェニルフォスフェー
ト、3-(2′-ピロ-トリサイクロ[3.3.1.1]デカン)-4-メ
トキシ-4-(3″-フォスフォリルオキシ)フェニル-1,2-ジ
オキセタン二ナトリウム塩など、パーオキシダーゼには
2,2′-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホ
ン酸（ABTS）、ルミノール-過酸化水素など、β-ガラク
トシダーゼにはp-ニトロフェニル-β-o-ガラクトース、
3-(2′-スピロアダマンタン)-4-(3-β-D-ガラクトピラ
ノシル)フェニル-1,2-ジオキセタンなどを用いることが
できる。
【００２８】検出は、酵素反応が阻害されない温度で行
い、生じる発色又は発光量を測定する。
い、生じる発色又は発光量を測定する。
【００２９】
【発明の効果】本発明の核酸の固定化法及びこれを利用
した核酸検出法は、以下のような効果を有する。
した核酸検出法は、以下のような効果を有する。
【００３０】(1) 本発明によれば、従来の方法に比べ
て磁性粒子に格段に多量の核酸を効果的に固定化するこ
とが可能である。従って、目的とする核酸を効率的に捕
獲することが可能であり、核酸検出の測定感度が向上す
る。
て磁性粒子に格段に多量の核酸を効果的に固定化するこ
とが可能である。従って、目的とする核酸を効率的に捕
獲することが可能であり、核酸検出の測定感度が向上す
る。
【００３１】(2) 本発明によれば、単位磁性粒子量当
たりの有効な核酸の固定化量を格段に増やすことができ
るため、同一の測定当たりに使用する磁性粒子の量を減
らすことができる。従って、磁性粒子による溶液の濁度
を減らすことができるため、特に検出システムとして化
学発光を採用している場合、検出光量が増加し、感度が
向上する。
たりの有効な核酸の固定化量を格段に増やすことができ
るため、同一の測定当たりに使用する磁性粒子の量を減
らすことができる。従って、磁性粒子による溶液の濁度
を減らすことができるため、特に検出システムとして化
学発光を採用している場合、検出光量が増加し、感度が
向上する。
【００３２】(3) 本発明によれば、疎水性材質で被覆
された磁性粒子が水溶性のポリマーで被覆されるため、
水溶液中での磁性粒子の分散性が向上する。
された磁性粒子が水溶性のポリマーで被覆されるため、
水溶液中での磁性粒子の分散性が向上する。
【００３３】(4) 本発明によれば、疎水性材質で被覆
された磁性粒子が水溶性のポリマーで被覆されるため、
検出目的とする核酸以外の生体内物質などの磁性粒子へ
の非特異的な吸着が防止され、測定時のノイズレベルが
減少する。
された磁性粒子が水溶性のポリマーで被覆されるため、
検出目的とする核酸以外の生体内物質などの磁性粒子へ
の非特異的な吸着が防止され、測定時のノイズレベルが
減少する。
【００３４】(5) 本発明によれば、従来の磁性粒子の
疎水性固相表面と固定化核酸の間に、ポリマー分子又は
複数連結を繰り返したポリマー分子を介しているため、
検出対象とする核酸と磁性粒子上の固定化核酸分子との
接近が容易になり、ハイブリダイゼーション反応の効率
が向上し、検出感度を高くすることが可能となる。
疎水性固相表面と固定化核酸の間に、ポリマー分子又は
複数連結を繰り返したポリマー分子を介しているため、
検出対象とする核酸と磁性粒子上の固定化核酸分子との
接近が容易になり、ハイブリダイゼーション反応の効率
が向上し、検出感度を高くすることが可能となる。
【００３５】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
【００３６】実施例１ バイオマグアミンへポリグルタ
ミン酸を結合した磁性粒子BM-Eの作製：ポリ-D-グルタ
ミン酸のナトリウム塩２mgを無水DMF 0.1mlに懸濁し、1
-(3-ジエチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド
塩酸塩（EDC）1.2mgを加え、30分室温で攪拌した。これ
を、反応容器に磁性粒子バイオマグアミン（官能基はア
ミノ基，パーセプティブ社製）２mgを100mMリン酸バッ
ファー（pH7.8）１mlに懸濁したものに加えて室温で２
時間攪拌した。磁性粒子を１Ｍ塩化ナトリウム水と水で
洗浄し、100mMリン酸バッファー（pH7.8）１mlに懸濁し
た後、無水コハク酸２mgを無水DMF 0.1mlに溶解したも
のを加えて２時間室温で攪拌し、水で磁性粒子を洗浄し
た。（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナトリウム，15mMクエン酸
バッファー）0.2mlに懸濁し、４℃で保存した。
ミン酸を結合した磁性粒子BM-Eの作製：ポリ-D-グルタ
ミン酸のナトリウム塩２mgを無水DMF 0.1mlに懸濁し、1
-(3-ジエチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド
塩酸塩（EDC）1.2mgを加え、30分室温で攪拌した。これ
を、反応容器に磁性粒子バイオマグアミン（官能基はア
ミノ基，パーセプティブ社製）２mgを100mMリン酸バッ
ファー（pH7.8）１mlに懸濁したものに加えて室温で２
時間攪拌した。磁性粒子を１Ｍ塩化ナトリウム水と水で
洗浄し、100mMリン酸バッファー（pH7.8）１mlに懸濁し
た後、無水コハク酸２mgを無水DMF 0.1mlに溶解したも
のを加えて２時間室温で攪拌し、水で磁性粒子を洗浄し
た。（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナトリウム，15mMクエン酸
バッファー）0.2mlに懸濁し、４℃で保存した。
【００３７】実施例２ 磁性粒子BM-Eへポリリジンを結
合した磁性粒子BM-EKの作製：反応容器に実施例１で作
製したポリグルタミン酸結合磁性粒子BM-Eの20mgを100m
M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸バッファー（pH6.
1，MESバッファー）10mlに懸濁し、磁石で分離した後、
液相を除去する操作を繰り返すことによって洗浄した。
この操作を２回繰り返した後、100mM N-ヒドロキシサク
シンイミドバッファー（pH6.1，HOSuバッファー）10mM
に懸濁して、EDC 400mgを加え、室温で30分振盪して、
磁性粒子を水で洗浄した。これにポリ-D-リジン臭化水
素塩10mgを100mMトリエチルアミン酢酸バッファー（pH
7.8）に溶解したものを加え、室温で２時間振盪した。
その後、磁性粒子を１Ｍ塩化ナトリウム水及び水で洗浄
し、（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナトリウム，15mMクエン酸
バッファー）１mlに懸濁し、４℃で保存した。
合した磁性粒子BM-EKの作製：反応容器に実施例１で作
製したポリグルタミン酸結合磁性粒子BM-Eの20mgを100m
M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸バッファー（pH6.
1，MESバッファー）10mlに懸濁し、磁石で分離した後、
液相を除去する操作を繰り返すことによって洗浄した。
この操作を２回繰り返した後、100mM N-ヒドロキシサク
シンイミドバッファー（pH6.1，HOSuバッファー）10mM
に懸濁して、EDC 400mgを加え、室温で30分振盪して、
磁性粒子を水で洗浄した。これにポリ-D-リジン臭化水
素塩10mgを100mMトリエチルアミン酢酸バッファー（pH
7.8）に溶解したものを加え、室温で２時間振盪した。
その後、磁性粒子を１Ｍ塩化ナトリウム水及び水で洗浄
し、（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナトリウム，15mMクエン酸
バッファー）１mlに懸濁し、４℃で保存した。
【００３８】試験例１ 磁性粒子バイオマグアミンと磁
性粒子BM-EK（実施例２）に結合しているアミノ基の量
のニンヒドリン発色による比較：磁性粒子バイオマグア
ミンと実施例２で作製したポリグルタミン酸−ポリリジ
ン結合磁性粒子BM-EKをそれぞれ水及びメタノールで洗
浄し、減圧乾燥した。0.0002Ｍシアン化カリウムのピリ
ジン溶液200μl、76％フェノールのエタノール溶液100
μl及び0.28Ｍニンヒドリンエタノール溶液100μlを加
えて100℃で５分間放置し、60％エタノール３mlを加え
て反応を止めた。磁性粒子を分離し、溶液の570nmの吸
収を測定したところ、それぞれ0.188，0.363であった。
別にコントロールとして磁性粒子を入れずに同様の操作
をしたものについて570nmの吸光度を測定したところ、
0.016であった。残った磁性粒子をメタノールで洗浄
し、乾燥させて重量を測定したところ、それぞれ9.1m
g，8.7mgであった。各磁性粒子の１mg当たりのニンヒド
リン発色を計算した結果を表１に示す。
性粒子BM-EK（実施例２）に結合しているアミノ基の量
のニンヒドリン発色による比較：磁性粒子バイオマグア
ミンと実施例２で作製したポリグルタミン酸−ポリリジ
ン結合磁性粒子BM-EKをそれぞれ水及びメタノールで洗
浄し、減圧乾燥した。0.0002Ｍシアン化カリウムのピリ
ジン溶液200μl、76％フェノールのエタノール溶液100
μl及び0.28Ｍニンヒドリンエタノール溶液100μlを加
えて100℃で５分間放置し、60％エタノール３mlを加え
て反応を止めた。磁性粒子を分離し、溶液の570nmの吸
収を測定したところ、それぞれ0.188，0.363であった。
別にコントロールとして磁性粒子を入れずに同様の操作
をしたものについて570nmの吸光度を測定したところ、
0.016であった。残った磁性粒子をメタノールで洗浄
し、乾燥させて重量を測定したところ、それぞれ9.1m
g，8.7mgであった。各磁性粒子の１mg当たりのニンヒド
リン発色を計算した結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】表１から、ポリリジンを結合させることに
よってアミノ酸の量が増加していることが確認された。
よってアミノ酸の量が増加していることが確認された。
【００４１】実施例３ 磁性粒子BM-EKへDNAプローブを
固定化した磁性粒子BM-EK-DNAの作製：５′末端にアミ
ノアルキル基を結合した20鎖長のDNAプローブＡ、0.625
ODを100mMトリエチルアミン酢酸バッファー（pH7.8）50
μlに溶解し、DMF 50μlを加えてジサクシンイミジルス
ベレート１mgをDMF 50μlに溶解したものを加え、10分
間室温で攪拌した。これに水0.4mlを加えて、酢酸エチ
ル0.4mlで洗浄し、有機溶媒層を取り除く操作を２回繰
り返した。これをイソブタノール0.4mlで２回洗浄し、
水0.2mlを加えて、100mMリン酸バッファー（pH7.8）３m
lに懸濁した実施例２で作製した磁性粒子BM-EK 10mgに
加えて４時間室温で攪拌した。磁性粒子を１Ｎ塩化ナト
リウム水及び水で洗浄して、100mMリン酸バッファー（p
H7.8）３mlに懸濁し、スルホサクシンイミジルアセテー
ト８mgを加えて室温で４時間反応させた。１Ｎ塩化ナト
リウム水及び水で洗浄して（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナト
リウム，15mMクエン酸バッファー）0.2mlに懸濁し、４
℃で保存した。
固定化した磁性粒子BM-EK-DNAの作製：５′末端にアミ
ノアルキル基を結合した20鎖長のDNAプローブＡ、0.625
ODを100mMトリエチルアミン酢酸バッファー（pH7.8）50
μlに溶解し、DMF 50μlを加えてジサクシンイミジルス
ベレート１mgをDMF 50μlに溶解したものを加え、10分
間室温で攪拌した。これに水0.4mlを加えて、酢酸エチ
ル0.4mlで洗浄し、有機溶媒層を取り除く操作を２回繰
り返した。これをイソブタノール0.4mlで２回洗浄し、
水0.2mlを加えて、100mMリン酸バッファー（pH7.8）３m
lに懸濁した実施例２で作製した磁性粒子BM-EK 10mgに
加えて４時間室温で攪拌した。磁性粒子を１Ｎ塩化ナト
リウム水及び水で洗浄して、100mMリン酸バッファー（p
H7.8）３mlに懸濁し、スルホサクシンイミジルアセテー
ト８mgを加えて室温で４時間反応させた。１Ｎ塩化ナト
リウム水及び水で洗浄して（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナト
リウム，15mMクエン酸バッファー）0.2mlに懸濁し、４
℃で保存した。
【００４２】比較例１ 磁性粒子バイオマグアミンヘDN
Aプローブを固相化した磁性粒子BM-DNAの作製：実施例
３において、磁性粒子BM-EKの代わりにバイオマグアミ
ンを用いる以外は同様に操作して、DNAプローブ固相化
磁性粒子BM-DNAを得た。
Aプローブを固相化した磁性粒子BM-DNAの作製：実施例
３において、磁性粒子BM-EKの代わりにバイオマグアミ
ンを用いる以外は同様に操作して、DNAプローブ固相化
磁性粒子BM-DNAを得た。
【００４３】試験例２ 磁性粒子BM-EK-DNA（実施例
３）と磁性粒子BM-DNA（比較例１）の核酸捕獲能力の比
較：実施例３及び比較例１で磁性粒子に固定化したDNA
プローブＡに相補的でかつその５′末端にアルカリフォ
スファターゼを結合させたAP-プローブＢをハイブリダ
イゼーションバッファー〔0.5％ブロッキング試薬（ベ
ーリンガー社製），0.05％アジ化ナトリウム，0.48Ｍ塩
化ナトリウム，0.048Ｍクエン酸三ナトリウム〕に0.05
μg/mlになるように調整した。実施例３及び比較例１で
作製した磁性粒子のそれぞれ10μgに溶液0.1mlを加え、
53℃で15分間インキュベーションし、室温で10分間冷却
した。磁性粒子を（0.1％SDS，0.015Ｍ塩化ナトリウ
ム，0.0015Ｍクエン酸三ナトリウム）で２回、（0.015
Ｍ塩化ナトリウム，0.0015Ｍクエン酸三ナトリウム）で
２回洗浄した後、基質溶液（10mMパラニトロフェニルリ
ン酸ナトリウム，25mM塩化マグネシウム，１Ｍジエタノ
ールアミン−塩酸バッファーpH9.8）を0.2ml加えて37℃
で30分間インキュベーションした。その後、磁性粒子を
磁石で分離し、上清の100μlをマイクロタイタープレー
トウエルに移して、イムノリーダーで405nmの波長の吸
光度を測定した。この結果を表２に示す。
３）と磁性粒子BM-DNA（比較例１）の核酸捕獲能力の比
較：実施例３及び比較例１で磁性粒子に固定化したDNA
プローブＡに相補的でかつその５′末端にアルカリフォ
スファターゼを結合させたAP-プローブＢをハイブリダ
イゼーションバッファー〔0.5％ブロッキング試薬（ベ
ーリンガー社製），0.05％アジ化ナトリウム，0.48Ｍ塩
化ナトリウム，0.048Ｍクエン酸三ナトリウム〕に0.05
μg/mlになるように調整した。実施例３及び比較例１で
作製した磁性粒子のそれぞれ10μgに溶液0.1mlを加え、
53℃で15分間インキュベーションし、室温で10分間冷却
した。磁性粒子を（0.1％SDS，0.015Ｍ塩化ナトリウ
ム，0.0015Ｍクエン酸三ナトリウム）で２回、（0.015
Ｍ塩化ナトリウム，0.0015Ｍクエン酸三ナトリウム）で
２回洗浄した後、基質溶液（10mMパラニトロフェニルリ
ン酸ナトリウム，25mM塩化マグネシウム，１Ｍジエタノ
ールアミン−塩酸バッファーpH9.8）を0.2ml加えて37℃
で30分間インキュベーションした。その後、磁性粒子を
磁石で分離し、上清の100μlをマイクロタイタープレー
トウエルに移して、イムノリーダーで405nmの波長の吸
光度を測定した。この結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】表２より、実施例３の磁性粒子は比較例１
の磁性粒子よりも多くのDNAプローブＡが固定化されて
おり、核酸の捕獲能力に優れていることが確認された。
の磁性粒子よりも多くのDNAプローブＡが固定化されて
おり、核酸の捕獲能力に優れていることが確認された。
【００４６】実施例４ 磁性粒子M450ヘアミノ基を導入
した磁性粒子M450Aの作製：ダイナビーズ磁性粒子M450
（Uncoated，官能基は水酸基，ダイナテック社製）0.5m
gをメタノール2.7mlに懸濁し、3-アミノプロピルトリエ
トキシシラン0.3mlを加えて65℃で２時間反応させるこ
とによりアミノ基を導入した。磁性粒子を水及び0.1％S
DSで洗浄し、（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナトリウム，15mM
クエン酸バッファー）0.2mlに懸濁し、４℃で保存し
た。
した磁性粒子M450Aの作製：ダイナビーズ磁性粒子M450
（Uncoated，官能基は水酸基，ダイナテック社製）0.5m
gをメタノール2.7mlに懸濁し、3-アミノプロピルトリエ
トキシシラン0.3mlを加えて65℃で２時間反応させるこ
とによりアミノ基を導入した。磁性粒子を水及び0.1％S
DSで洗浄し、（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナトリウム，15mM
クエン酸バッファー）0.2mlに懸濁し、４℃で保存し
た。
【００４７】実施例５ 磁性粒子M450Aヘポリグルタミ
ン酸を結合させた磁性粒子M450A-Eの作製：実施例１に
おいて、バイオマグアミンの代わりに実施例４で作製し
た磁性粒子M450Aを用いる以外は同様に操作してポリグ
ルタミン酸を結合させ、ポリグルタミン酸結合磁性粒子
M450A-Eを得た。
ン酸を結合させた磁性粒子M450A-Eの作製：実施例１に
おいて、バイオマグアミンの代わりに実施例４で作製し
た磁性粒子M450Aを用いる以外は同様に操作してポリグ
ルタミン酸を結合させ、ポリグルタミン酸結合磁性粒子
M450A-Eを得た。
【００４８】実施例６ 磁性粒子M450A-Eヘポリリジン
を結合させた磁性粒子M450A-EKの作製：実施例２におい
て、磁性粒子BM-Eの代わりに実施例５で作製したポリグ
ルタミン酸結合磁性粒子M450A-Eを用いる以外は同様に
操作してポリリジンを結合させ、ポリグルタミン酸−ポ
リリジン結合磁性粒子M450A-EKを得た。
を結合させた磁性粒子M450A-EKの作製：実施例２におい
て、磁性粒子BM-Eの代わりに実施例５で作製したポリグ
ルタミン酸結合磁性粒子M450A-Eを用いる以外は同様に
操作してポリリジンを結合させ、ポリグルタミン酸−ポ
リリジン結合磁性粒子M450A-EKを得た。
【００４９】実施例７ 磁性粒子M450A-EKへポリリジン
を結合させた磁性粒子M450A-EKKの作製：実施例６で作
製した磁性粒子M450A-EK ５mgを100mMリン酸バッファー
（pH7.8）1.5mlに懸濁し、無水コハク酸15mlを無水DMF
0.1mlに溶解したものを加えて室温で２時間攪拌した。
磁性粒子を１Ｍ塩化ナトリウム水及び水で洗浄した。こ
の磁性粒子に実施例２と同様の操作を行って更にポリリ
ジンを結合させ、ポリグルタミン酸−ポリリジン−ポリ
リジン結合磁性粒子M450A-EKKを得た。
を結合させた磁性粒子M450A-EKKの作製：実施例６で作
製した磁性粒子M450A-EK ５mgを100mMリン酸バッファー
（pH7.8）1.5mlに懸濁し、無水コハク酸15mlを無水DMF
0.1mlに溶解したものを加えて室温で２時間攪拌した。
磁性粒子を１Ｍ塩化ナトリウム水及び水で洗浄した。こ
の磁性粒子に実施例２と同様の操作を行って更にポリリ
ジンを結合させ、ポリグルタミン酸−ポリリジン−ポリ
リジン結合磁性粒子M450A-EKKを得た。
【００５０】実施例８ 磁性粒子M450A-EKKへDNAプロー
ブを固相化した磁性粒子M450A-EKK-DNAの作製：実施例
３において、磁性粒子BM-EKの代わりに実施例７で作製
した磁性粒子M450A-EKKを用いる以外は同様に操作し、D
NAプローブ固相化磁性粒子M450A-EKK-DNAを得た。
ブを固相化した磁性粒子M450A-EKK-DNAの作製：実施例
３において、磁性粒子BM-EKの代わりに実施例７で作製
した磁性粒子M450A-EKKを用いる以外は同様に操作し、D
NAプローブ固相化磁性粒子M450A-EKK-DNAを得た。
【００５１】比較例２ 磁性粒子M450AへDNAプローブを
固相化した磁性粒子M450A-DNAの作製：実施例３におい
て、磁性粒子BM-EKの代わりに実施例４で作製した磁性
粒子M450Aを用いる以外は同様に操作し、DNAプローブ固
相化磁性粒子M450A-DNAを得た。
固相化した磁性粒子M450A-DNAの作製：実施例３におい
て、磁性粒子BM-EKの代わりに実施例４で作製した磁性
粒子M450Aを用いる以外は同様に操作し、DNAプローブ固
相化磁性粒子M450A-DNAを得た。
【００５２】試験例３ M450A-DNA（比較例２）と磁性
粒子M450A-EKK-DNA（実施例８）の核酸捕獲能力の比
較：実施例８で作製した磁性粒子M450A-EKK-DNAと比較
例２で作製した磁性粒子M450A-DNAを試験例２と同様に
して比較した。この結果を表３に示す。
粒子M450A-EKK-DNA（実施例８）の核酸捕獲能力の比
較：実施例８で作製した磁性粒子M450A-EKK-DNAと比較
例２で作製した磁性粒子M450A-DNAを試験例２と同様に
して比較した。この結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】表３より、実施例８の磁性粒子は比較例２
の磁性粒子よりも格段に多くのDNAプローブが固定化さ
れ、核酸捕獲能力に優れていることが確認された。
の磁性粒子よりも格段に多くのDNAプローブが固定化さ
れ、核酸捕獲能力に優れていることが確認された。
【００５５】実施例９ 磁性粒子CM-MPヘポリリジンを
結合した磁性粒子CMMP-Kの作製：実施例２において、磁
性粒子BM-Eの代わりに磁性粒子CM-MP（官能基はカルボ
キシル基，セラダイン社製）を用いる以外は同様に操作
してポリリジンを結合させ、ポリリジン結合磁性粒子CM
MP-Kを得た。
結合した磁性粒子CMMP-Kの作製：実施例２において、磁
性粒子BM-Eの代わりに磁性粒子CM-MP（官能基はカルボ
キシル基，セラダイン社製）を用いる以外は同様に操作
してポリリジンを結合させ、ポリリジン結合磁性粒子CM
MP-Kを得た。
【００５６】実施例10 磁性粒子CMMP-Kヘポリグルタミ
ン酸を結合した磁性粒子CMMP-KEの作製：実施例１にお
いて、バイオマグアミンの代わりに実施例９で作製した
ポリリジン結合磁性粒子CMMP-Kを用いる以外は同様に操
作してポリグルタミン酸を結合させ、ポリリジン−ポリ
グルタミン酸結合磁性粒子CMMP-KEを得た。
ン酸を結合した磁性粒子CMMP-KEの作製：実施例１にお
いて、バイオマグアミンの代わりに実施例９で作製した
ポリリジン結合磁性粒子CMMP-Kを用いる以外は同様に操
作してポリグルタミン酸を結合させ、ポリリジン−ポリ
グルタミン酸結合磁性粒子CMMP-KEを得た。
【００５７】実施例11 磁性粒子CMMP-KEヘポリリジン
を結合した磁性粒子CMMP-KEKの作製：実施例２におい
て、磁性粒子BM-Eの代わりに実施例10で作製したポリリ
ジン−ポリグルタミン酸結合磁性粒子CMMP-KEを用いる
以外は同様に操作してポリリジンを結合させ、ポリリジ
ン−ポリグルタミン酸−ポリリジン結合磁性粒子CMMP-K
EKを得た。
を結合した磁性粒子CMMP-KEKの作製：実施例２におい
て、磁性粒子BM-Eの代わりに実施例10で作製したポリリ
ジン−ポリグルタミン酸結合磁性粒子CMMP-KEを用いる
以外は同様に操作してポリリジンを結合させ、ポリリジ
ン−ポリグルタミン酸−ポリリジン結合磁性粒子CMMP-K
EKを得た。
【００５８】実施例12 磁性粒子CMMP-KEKへDNAプロー
ブを固相化した磁性粒子CMMP-KEK-DNAの作製：実施例３
において、磁性粒子BM-EKの代わりに実施例11で作製し
た磁性粒子CMMP-KEKを用いる以外は同様に操作し、DNA
プローブ固相化磁性粒子CMMP-KEK-DNAを得た。
ブを固相化した磁性粒子CMMP-KEK-DNAの作製：実施例３
において、磁性粒子BM-EKの代わりに実施例11で作製し
た磁性粒子CMMP-KEKを用いる以外は同様に操作し、DNA
プローブ固相化磁性粒子CMMP-KEK-DNAを得た。
【００５９】比較例３ 磁性粒子CM-MPへDNAプローブを
固相化した磁性粒子CMMP-DNAの作製：反応容器に磁性粒
子CM-MP（セラダイン社製）10mgを100mM 2-(N-モルホリ
ノ)エタンスルホン酸バッファー（pH6.1，MESバッファ
ー）５mlに懸濁し、磁石で分離した後、液相を除去する
ことによって洗浄した。この操作を２回繰り返した後、
100mM N-ヒドロキシサクシンイミドバッファー（pH6.
1，HOSuバッファー）10mlに懸濁して、EDC 400mgを加
え、室温で30分振盪して、磁性粒子を水で洗浄した。更
に、100mMリン酸バッファー（pH7.8）５mlに懸濁し、こ
れに実施例３で用いたDNAプローブＡ、0.625ODを加えて
４時間振盪した。磁性粒子を１Ｍ塩化ナトリウム水及び
水で洗浄し、（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナトリウム，15Ｍ
クエン酸バッファー）0.5mlに懸濁し、４℃で保存し
た。
固相化した磁性粒子CMMP-DNAの作製：反応容器に磁性粒
子CM-MP（セラダイン社製）10mgを100mM 2-(N-モルホリ
ノ)エタンスルホン酸バッファー（pH6.1，MESバッファ
ー）５mlに懸濁し、磁石で分離した後、液相を除去する
ことによって洗浄した。この操作を２回繰り返した後、
100mM N-ヒドロキシサクシンイミドバッファー（pH6.
1，HOSuバッファー）10mlに懸濁して、EDC 400mgを加
え、室温で30分振盪して、磁性粒子を水で洗浄した。更
に、100mMリン酸バッファー（pH7.8）５mlに懸濁し、こ
れに実施例３で用いたDNAプローブＡ、0.625ODを加えて
４時間振盪した。磁性粒子を１Ｍ塩化ナトリウム水及び
水で洗浄し、（0.1％SDS，0.15Ｍ塩化ナトリウム，15Ｍ
クエン酸バッファー）0.5mlに懸濁し、４℃で保存し
た。
【００６０】試験例４ 磁性粒子CMMP-DNA（比較例３）
及び磁性粒子CMMP-KEK-DNA（実施例12）を用いたWT1mRN
Aの測定結果の比較：比較例３の磁性粒子CMMP-DNAを用
いて癌抑制遺伝子WT1mRNAの測定を行った。測定方法
は、クオンティプレックスHCV-RNA測定キット（カイロ
ン社製）の手法に従って行った。WT1mRNAはRnessy Tota
l RNA Kit（QIAVEN社製）を用いてヒト白血病細胞株（K
562）から抽出し、PBSで希釈して検体とした。抽出緩衝
液、増幅プローブ希釈液、標識プローブ希釈液、増幅プ
ローブ、標識プローブ、基質液、Wash A及びWash Bはク
オンティプレックスHCV-RNA測定キットのものを用い
た。また、キット中の特異プローブＡ及び特異プローブ
Ｂは、WT1mRNAの一部に相補的なものを合成して調製し
た。反応用容器として、ダイナテックラボラトリーズ社
のマイクロライン１を用いた。抽出緩衝液4.6ml、酵素
液350μl、特異プローブＡ 2.8μl及び特異プローブＢ
2.8μlを混合し、100μlを４μg/10μlのWT1mRNAに加
え、53℃で16時間インキュベーションした。更に、比較
例３の磁性粒子20μgを抽出緩衝液20μlに懸濁したもの
を加え、53℃で4.5時間インキュベーションした。更に
室温で10分間放置し、磁気分離を行い、上清を除いた。
Wash Bで２回洗浄した後、増幅プローブ希釈液5.6mlと
増幅プローブ40μlを混合したものを100μl加えて53℃
で30分インキュベーションした。室温で10分間冷却した
後、磁気分離を行い、Wash A 200μlで洗浄した後、標
識プローブ希釈液5.6mlと標識プローブ32μlを混合した
もの100μlを加えて53℃で15分間インキュベーションし
て、室温で10分間放置した。磁気分離を行い、Wash A及
びWash Bでそれぞれ３回ずつ洗浄した後、基質液100μl
を加え、ルミノメーターQ-1000で発光量を測定した。ま
た、試験する磁性粒子を実施例12のもの10μgに変え
て、同様の試験を行った。発光量の測定結果を表４に示
す。
及び磁性粒子CMMP-KEK-DNA（実施例12）を用いたWT1mRN
Aの測定結果の比較：比較例３の磁性粒子CMMP-DNAを用
いて癌抑制遺伝子WT1mRNAの測定を行った。測定方法
は、クオンティプレックスHCV-RNA測定キット（カイロ
ン社製）の手法に従って行った。WT1mRNAはRnessy Tota
l RNA Kit（QIAVEN社製）を用いてヒト白血病細胞株（K
562）から抽出し、PBSで希釈して検体とした。抽出緩衝
液、増幅プローブ希釈液、標識プローブ希釈液、増幅プ
ローブ、標識プローブ、基質液、Wash A及びWash Bはク
オンティプレックスHCV-RNA測定キットのものを用い
た。また、キット中の特異プローブＡ及び特異プローブ
Ｂは、WT1mRNAの一部に相補的なものを合成して調製し
た。反応用容器として、ダイナテックラボラトリーズ社
のマイクロライン１を用いた。抽出緩衝液4.6ml、酵素
液350μl、特異プローブＡ 2.8μl及び特異プローブＢ
2.8μlを混合し、100μlを４μg/10μlのWT1mRNAに加
え、53℃で16時間インキュベーションした。更に、比較
例３の磁性粒子20μgを抽出緩衝液20μlに懸濁したもの
を加え、53℃で4.5時間インキュベーションした。更に
室温で10分間放置し、磁気分離を行い、上清を除いた。
Wash Bで２回洗浄した後、増幅プローブ希釈液5.6mlと
増幅プローブ40μlを混合したものを100μl加えて53℃
で30分インキュベーションした。室温で10分間冷却した
後、磁気分離を行い、Wash A 200μlで洗浄した後、標
識プローブ希釈液5.6mlと標識プローブ32μlを混合した
もの100μlを加えて53℃で15分間インキュベーションし
て、室温で10分間放置した。磁気分離を行い、Wash A及
びWash Bでそれぞれ３回ずつ洗浄した後、基質液100μl
を加え、ルミノメーターQ-1000で発光量を測定した。ま
た、試験する磁性粒子を実施例12のもの10μgに変え
て、同様の試験を行った。発光量の測定結果を表４に示
す。
【００６１】
【表４】
【００６２】この結果から、表面官能基のカルボキシル
基に直接DNA固定化した比較例３の磁性粒子よりも、ポ
リアミノ酸をコーティングし、磁性粒子の官能基をアミ
ノ基に変換した実施例12の磁性粒子を使用した方が感度
が向上していることが確認された。
基に直接DNA固定化した比較例３の磁性粒子よりも、ポ
リアミノ酸をコーティングし、磁性粒子の官能基をアミ
ノ基に変換した実施例12の磁性粒子を使用した方が感度
が向上していることが確認された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５Ｇ (72)発明者 野沢 正之 茨城県那珂郡東海村村松2117 第一化学薬 品株式会社診断薬研究所東海研究グループ 内
Claims (8)
- 【請求項１】 表面に官能基Ａを有する磁性粒子に、官
能基Ａと反応する官能基Ｂを３個以上有する多官能基性
ポリマーを、官能基ＡとＢとの反応によって結合させて
多官能基性磁性粒子を調製し、次いでこれの遊離官能基
Ｂに核酸を反応させることを特徴とする核酸の固定化方
法。 - 【請求項２】 請求項１で調製した遊離官能基Ｂを有す
る多官能基性磁性粒子に、官能基Ｂと反応する官能基Ａ
を３個以上有する多官能基性ポリマーを、官能基ＡとＢ
との反応によって結合させて多官能基性磁性粒子を調製
し、次いでこれの遊離官能基Ａに核酸を反応させること
を特徴とする核酸の固定化方法。 - 【請求項３】 磁性粒子表面の官能基がアミノ基で、多
官能基性ポリマーがポリ酸性アミノ酸である請求項１又
は２記載の核酸の固定化方法。 - 【請求項４】 ポリ酸性アミノ酸が、ポリグルタミン酸
及びポリアスパラギン酸から選ばれるものである請求項
３記載の核酸の固定化方法。 - 【請求項５】 磁性粒子表面の官能基がカルボキシル基
で、多官能基性ポリマーがポリ塩基性アミノ酸である請
求項１又は２記載の核酸の固定化方法。 - 【請求項６】 ポリ塩基性アミノ酸が、ポリリジン及び
ポリオルニチンから選ばれるものである請求項５記載の
核酸の固定化方法。 - 【請求項７】 磁性粒子が、表面のアミノ基を、これに
環状酸無水物を反応させてカルボキシル基に変換させた
ものである請求項１又は２記載の核酸の固定化方法。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載の核酸の
固定化方法を利用することを特徴とする核酸検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03446798A JP4098872B2 (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | 核酸の固定化方法及びこれを利用した核酸検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03446798A JP4098872B2 (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | 核酸の固定化方法及びこれを利用した核酸検出法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008024128A Division JP4545200B2 (ja) | 2008-02-04 | 2008-02-04 | 核酸固定用磁性粒子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11225759A true JPH11225759A (ja) | 1999-08-24 |
| JP4098872B2 JP4098872B2 (ja) | 2008-06-11 |
Family
ID=12415062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03446798A Expired - Lifetime JP4098872B2 (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | 核酸の固定化方法及びこれを利用した核酸検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4098872B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063982A1 (ja) * | 2003-12-29 | 2005-07-14 | Universal Bio Research Co., Ltd. | 標的物質の検出方法 |
| JP2005524751A (ja) * | 2002-05-06 | 2005-08-18 | キャボット コーポレイション | 変性顔料の調製方法 |
| JP2014504730A (ja) * | 2011-01-18 | 2014-02-24 | アメリカ合衆国 | プリオンの増幅および検出のための方法 |
| JP2016536003A (ja) * | 2013-09-09 | 2016-11-24 | ラボ − オン − ア − ビード エービー | 磁性粒子の製造 |
-
1998
- 1998-02-17 JP JP03446798A patent/JP4098872B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005524751A (ja) * | 2002-05-06 | 2005-08-18 | キャボット コーポレイション | 変性顔料の調製方法 |
| JP4808958B2 (ja) * | 2002-05-06 | 2011-11-02 | キャボット コーポレイション | 変性顔料の調製方法 |
| WO2005063982A1 (ja) * | 2003-12-29 | 2005-07-14 | Universal Bio Research Co., Ltd. | 標的物質の検出方法 |
| JP2014504730A (ja) * | 2011-01-18 | 2014-02-24 | アメリカ合衆国 | プリオンの増幅および検出のための方法 |
| JP2017134080A (ja) * | 2011-01-18 | 2017-08-03 | アメリカ合衆国 | プリオンの増幅および検出のための方法 |
| JP2016536003A (ja) * | 2013-09-09 | 2016-11-24 | ラボ − オン − ア − ビード エービー | 磁性粒子の製造 |
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|---|---|
| JP4098872B2 (ja) | 2008-06-11 |
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