ES2625468T3 - Dispositivo y método para separar, mezclar y concentrar partículas magnéticas con un fluido y uso del mismo en métodos de purificación - Google Patents

Abstract

Un conjunto que comprende: un envase de reacción (3) constituido por un compartimento superior grande con una forma de embudo (4), un compartimento inferior alargado con una sección transversal sustancialmente constante (5, 6) y una base cerrada (7), en donde el compartimento superior (4) comprende una primera parte que tiene una sección transversal constante y un primera parte en forma de embudo, en donde el tamaño de una sección transversal de la primera parte es mayor que el tamaño de una sección transversal del compartimento inferior alargado (5, 6), en donde el eje longitudinal de la primera parte es paralelo pero está espaciado del eje longitudinal del compartimento inferior (5, 6), en donde el compartimento inferior está constituido por un compartimento medio (5) conectado en un lado a la primera parte en forma de embudo, y un compartimento inferior (6), que se conecta en un lado al compartimento medio (5) y en otro lado a dicha base cerrada (7); y un dispositivo para extraer posibles moléculas de interés de un fluido al que se añade una suspensión de partículas magnéticas o paramagnéticas contenidas en el envase de reacción (3) y que pueden unir las moléculas de interés que comprende: al menos una estación de separación para capturar las partículas magnéticas presentes en el compartimento superior grande (4) del envase de reacción (3), al menos una estación de lavado para mezclar dichas partículas magnéticas presentes en el compartimento medio (5) del envase de reacción (3), al menos una estación de concentración para mezclar dichas partículas magnéticas presentes en el compartimento inferior (6) del envase de reacción (3), y al menos unos medios de pipeteo para dispensar y/o para retirar parte o todo el fluido, el líquido de lavado y el tampón de salida.

Description

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DESCRIPCION

Dispositivo y metodo para separar, mezclar y concentrar partlcuias magneticas con un fluido y uso del mismo en metodos de purificacion

Esta invencion esta relacionada con el uso de partlcuias magneticas o magnetizables, y, en particular, con metodos para separar, mezclar y concentrar eficientemente partlculas magneticas o (super) paramagneticas con un fluido y opcionalmente seguido por resuspension de las partlculas en otro fluido. La invencion proporciona ademas un dispositivo para hacer lo mismo. En la invencion expuesta mas adelante, las partlculas magneticas, partlculas paramagneticas y partlculas superparamagneticas se denominaran partlculas magneticas.

Estado de la tecnica concerniente a la etapa de separacion:

En muchos metodos de analisis biologico, se tiene que separar una fase solida de una fase llquida y posteriormente ser lavada. Para lavar la fase solida, una cantidad definida de solucion tampon se pipetea en el envase de reaccion que contiene la fase solida para suspender la fase solida en la solucion tampon. Entonces se separan las fases solida y llquida. La fase llquida se retira entonces por succion (aspiracion) y empieza un nuevo proceso de lavado. Usualmente se realizan varios ciclos de lavado, cada uno incluye un proceso de suspension, separacion y aspiracion.

El uso de partlculas magneticas como fase solida y la separacion mediante imanes permanentes se conocen en principio. Los imanes permanentes atraen las partlculas a la pared del envase de reaccion y las mantienen ahl.

A menudo se usan partlculas magneticas en procesos de separacion. Hay muchos metodos de ensayos biologicos y metodos de purificacion en los que se usan partlculas magneticas. Por ejemplo metodos de inmunoensayo, ensayos de hibridacion de acido nucleico y similares. Tambien se pueden usar partlculas magneticas en metodos de purificacion, para aislar componentes particulares, protelnas, acidos nucleicos, del material en el que estan contenidos. Las partlculas se pueden usar para separar ciertos componentes de una mezcla, por ejemplo, porque estan recubiertas con un reactivo con una afinidad especlfica para el componente. Las partlculas magneticas se pueden atraer, por ejemplo, a la pared de un recipiente en el que estaba contenido el fluido con las partlculas magneticas y el fluido se puede retirar y, opcionalmente, reemplazar con otro fluido. Asl, las partlculas se puede mezclar con el fluido del que se va a retirar el componente especlfico, el componente se unira a la partlcula magnetica, y se puede usar un iman para separar las partlculas con el componente del resto de la mezcla en el fluido. Opcionalmente las partlculas magneticas se pueden lavar y se pueden separar en otro fluido. O el componente se puede retirar de las partlculas de nuevo a otro fluido.

La solicitud de patente europea BP-A-0.136.126 describe un dispositivo para separacion durante inmunoensayos en fase solida. El extremo inferior de un envase de reaccion que contiene partlculas magneticas se dispone entre dos imanes permanentes. Los ejes de magnetizacion estan en angulos rectos con la pared del envase de reaccion, reduciendo asl campos magneticos de extravlo.

La solicitud internacional WO-A-92/05443 describe un dispositivo para separar partlculas magneticas. Los envases de reaccion que contienen las partlculas magneticas se disponen en filas. Entre la filas se posiciona un bloque magnetico. Los envases de reaccion se disponen en el bloque magnetico de manera que dos imanes estan diametralmente opuestos respecto al envase de reaccion. Los imanes tienen polaridades alternantes y sus ejes de magnetizacion se extienden paralelos. Las partlculas separadas estan unicamente en un lado del envase de reaccion.

La patente US-A-4.895.650, cuyo contenido se incorpora en esta memoria por referencia, describe un dispositivo de separacion en el que se separan partlculas mediante un iman permanente. El iman esta unicamente en un lado del envase de reaccion. La relacion entre el nivel de la solucion de ensayo en el tubo de ensayo y la posicion del iman es el centro de atencion. La posicion del iman, mas particularmente su altura, debe coincidir con el nivel de la solucion de ensayo en el envase de reaccion, y se lleva a la altura deseada mediante material de relleno en la parte inferior del dispositivo que contiene el iman.

Durante un inmunoensayo, el nivel de fluido en los envases de reaccion tras anadir los reactivos necesarios no es necesariamente uniforme. Por ejemplo, el nivel en el envase de reaccion tras anadir solucion de conjugado puede ser menor que el nivel tras anadir solucion tampon de lavado. El metodo de analisis descrito en esta patente US-A- 4.895.650 anterior no tiene en cuenta estas diferencias de nivel.

Dispositivos conocidos para separar partlculas magneticas tienen la desventaja de que necesitan un tiempo relativamente largo antes de que todas las partlculas magneticas se separen de la fase llquida. El tiempo de separacion puede ser considerable, particularmente para volumenes mas grandes.

Un dispositivo para separacion rapida de partlculas magneticas se describe en la solicitud de patente europea EP-A- 0.317.286. En este dispositivo, el envase de reaccion esta rodeado por cuatro imanes permanentes (imanes 1, 2, 3 y 4), que se distribuyen uniformemente alrededor de un envase de reaccion. La direccion del campo magnetico de los

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imanes 1 y 3 esta rotada 180° respecto a la direction del campo magnetico de los imanes 2 y 4. Este dispositivo tiene la desventaja de que necesita un numero relativamente grande de imanes permanentes para acelerar la separation. Tambien excluye muchos posibles movimientos de celulas.

En la patente EP-B-0.644.425 se presenta un analizador que tiene un dispositivo para separar partlculas magneticas de una suspension, el dispositivo de separacion contiene dos imanes permanentes entre los que se ubica el envase de reaction que contiene una suspension. Para una separacion mas rapida y mas completa de las micropartlculas magneticas, los imanes se ubican diametralmente opuestos con respecto al envase de reaccion y los ejes polares de los imanes formando un angulo agudo con el eje longitudinal del envase de reaccion. Una intention de esta invention es proporcionar un dispositivo analltico que comprenda un dispositivo para separar partlculas magneticas de manera que las partlculas magneticas en suspension se puedan separar rapidamente incluso cuando el envase de reaccion se llena con niveles diferentes. Otra intencion es proporcionar un dispositivo analltico para separar partlculas magneticas de manera que las partlculas magneticas en suspension se puedan separar de una manera focalizada.

Si estos documentos se pueden considerar para la separacion de partlculas magneticas de un llquido de interes, no pueden autorizar una mezcla eficaz que puede lavar eficientemente las partlculas y darles a todas la oportunidad de unirse sobre las superficies de las partlculas magneticas. Esta etapa eficiente de mezcla es absolutamente necesaria para purificar objetivos de acido nucleico de una muestra biologica.

Estado de la tecnica concerniente a la etapa de mezcla:

Metodos de purification para acido nucleico que usan partlculas magneticas se han descrito por ejemplo en diversas solicitudes tales como EP-A-0.757.106 y WO-A-96/41811. En estas solicitudes se describen metodos en donde una solution de muestra que contiene acidos nucleicos se trata con una sustancia caotropica para liberar el acido nucleico. Tras liberar los acidos nucleicos de la entidad biologica en el tampon de lisis, los acidos nucleicos se unen a las partlculas magneticas. Para este proposito se usan tanto partlculas recubiertas con una sonda especlfica de objetivo as! como partlculas que tienen un recubrimiento de oxido de metal (por ejemplo, sllice), que dan una union generica de todos los acidos nucleicos contenidos en la muestra. Tras unir el objetivo, se eliminan componentes interferentes tales como restos celulares, enzimas, protelnas y coagulantes y sal mediante lavado de las partlculas magneticas en un (set de) tampon (o tampones) de lavado. Finalmente, los acidos nucleicos purificados se liberan de las partlculas al mezclar las partlculas en un pequeno volumen de tampon de elucion.

Para un lavado y elucion eficientes las partlculas magneticas tienen que dispersarse y mezclarse bien en los tampones pertinentes. En general, este proceso de lavado y elucion puede ser dificultado por la agregacion u obstruction de las partlculas magneticas ya sean provocados por la adsorcion de componentes especlficos en la muestra lisada (por ejemplo, ADN genomico) o por campos magneticos dipolo residuales inducidos en las partlculas. En particular, el uso de partlculas (magneticas) recubiertas de sllice con muestras que contienen cantidades significativas de ADN genomico (sangre completa, esputo, tejido), da como resultado una pastilla apretada que es diflcil de procesar.

Metodos muy conocidos para mezclar perlitas (magneticas) en un tampon llquido son mediante vortice, sonido o pipeteo. Estos metodos sin embargo son diflciles de automatizar, y/o suponen un riesgo de contamination de una muestra a otra por generation de aerosol o pueden degradar el acido nucleico objetivo.

Ademas, estos metodos no son muy idoneos para volumenes muy pequenos de llquido (tlpicamente 0,01 ml) como pueden requerirse para el proceso de elucion.

El metodo y el dispositivo segun la invencion son especialmente adecuados para uso con procedimientos de aislamiento, en los que usualmente se tiene que aislar un ingrediente en forma bastante pura a partir de un volumen relativamente grande de fluido de muestra, y concentrarse en un volumen mas pequeno de otro fluido para ser adecuado para un uso adicional.

En el caso de un metodo para el aislamiento de acido nucleico, tal uso adicional puede ser un metodo de amplificacion de acido nucleico o un ensayo para la deteccion de acido nucleico o ambos.

Un metodo y un aparato para separar y resuspender partlculas superparamagneticas se describen en la solicitud WO-A-91/09308. En esta solicitud, se describio que se pueden agregar y resuspender partlculas superparamagneticas mediante aplicacion subsiguiente de diferentes campos magneticos. Se podrlan proporcionar aplicaciones primera y segunda del campo magnetico con el mismo iman, que luego se rota alrededor del recipiente que contiene las partlculas a una ubicacion diferente. Sin embargo, tambien se podrlan usar dos electroimanes espaciados opuestos. Estos electroimanes se energizaban alternadamente para producir los campos magneticos primero y segundo que mantienen las partlculas en suspension y las mezclan con el fluido en el que estaban contenidas.

Un metodo para la separacion de partlculas magneticas de un fluido se describe en la patente de EE. UU. numero 3.985.649. Las partlculas se pueden separar de un fluido al llevar las partlculas a una cercana proximidad con un

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iman y moverlas a traves del llquido a lo largo de la pared de un recipiente. Incluso se pueden mover afuera del llquido de esta manera y se pueden transportar a un segundo recipiente.

En la patente US-A-4.988.618, se describe un dispositivo para uso con ensayos en donde se ensayan multiples muestras de volumen pequeno al mismo tiempo. Este tipo de ensayo se puede realizar, por ejemplo, en placas de microtitulacion. Las micropartlculas magneticas estan presentes en cada poceta de la placa de microtitulacion. El dispositivo tiene as! multiples orificios y cada uno de los orificios esta rodeado por multiples imanes permanentes, preferiblemente cuatro. La estructura resultante de imanes y orificios es rlgida; los imanes no estan pensados para moverse y se montan en una relacion fija con respecto a ellos mismos y a la base del dispositivo. Todos los imanes estan alineados y la orientacion de campo de los imanes puede ser de manera que todos imanes tengan la misma direccion de campo o imanes vecinos tengan direcciones de campo opuestas. La orientacion de los imanes da como resultado as! cuatro lugares puntuales de atraccion por orificio. Los imanes estan pensados puramente para propositos de separacion. En la patente se describe que el dispositivo puede comprender ademas medios para agitar los reactivos dentro de los recipientes.

El solicitante ya ha presentado una solicitud internacional WO-A-01/05510 que propone una solucion para mejorar la mezcla. Esta relacionada con un metodo y un dispositivo, que permiten la mezcla eficiente de partlculas magneticas o magnetizables en un fluido y opcionalmente la separacion de las partlculas de dicho fluido. Se hace uso de campo magnetico de direcciones opuestas y cambiantes. Se ha encontrado que, cuando partlculas magneticas o magnetizables en un fluido se someten a estos campos magneticos, las partlculas, bajo la influencia del campo, contactan eficientemente con el fluido. Dichas partlculas normalmente pueden tender a formar un coagulo, que puede impedir una mezcla eficiente con un fluido. Se ha encontrado que, al someter el recipiente, en el que estan el fluido y las partlculas, a campos magneticos de direcciones diferentes y cambiantes, las partlculas se separan eficientemente unas de otras y son atraldas a traves del fluido de tal manera que se produce un proceso de mezcla muy eficiente. El metodo permite una mezcla eficiente de partlculas incluso con volumenes de fluido muy pequenos. El metodo de la invencion por lo tanto tiene la ventaja de que puede ahorrar, por ejemplo, fluidos de lavado y puede permitir la reduccion del volumen de fluido necesario. Asl, por ejemplo en procedimientos de aislamiento, el metodo de la invencion permite la purification de reactivos en concentraciones altas. Ademas, mientras metodos de la tecnica anterior pueden ser laboriosos y consumir mucho tiempo; el metodo es rapido y facil de realizar.

Asl, con esta solicitud se proporciona un metodo de mezcla, en uno o mas recipientes(s), partlculas magneticas o (super) paramagneticas con un fluido, usando mas de un iman, por lo que los recipientes se someten a campos magneticos con direcciones diferentes y cambiantes al mover los imanes con respecto a la position de los recipientes(s) y/o al mover los recipientes con respecto a las posiciones del imanes.

Estado de la tecnica concerniente a la etapa de concentration:

Se realizan muchos ensayos de diagnosis despues de etapas para extraer analitos objetivo de muestras biologicas, purificar con el fin de eliminar productos parasitos que penalizan las prestaciones del ensayo, concentrar los analitos objetivo con el fin de aumentar la cantidad de analito por unidad de volumen de tampon, y disolver los analitos objetivo en un tampon con el fin de hacerlos qulmicamente accesibles.

Ademas, con el fin de aumentar la sensibilidad y la especificidad de un ensayo para manifestar un analito, a veces es necesario reducir el volumen del tampon en el que se encuentran las copias del analito buscado, mientras al mismo tiempo se conserva dicho analito en su totalidad.

Los biologos tienen medios enteramente convencionales para concentrar un analito, en particular usando tecnicas de sedimentation por centrifugation, filtration y/o magnetica. Estas tecnicas requieren la transferencia de soluciones y manipulaciones del analito, que llevan a una disminucion inevitable de la cantidad de analito que se puede analizar.

Por ejemplo, en metodos de sedimentacion por centrifugacion y magnetica, pueden ser necesario repetir varias veces las etapas reales de sedimentacion por centrifugacion o magnetica, el llmite del numero de repeticiones es establecido por el volumen mlnimo de solucion que se puede manejar facilmente y de manera fiable con una pipeta convencional. Este volumen mlnimo es del orden de aproximadamente 10 microlitros. Por debajo esto, transportarla en recipientes "grandes" tales como pipetas, frascos, etc. pierde llquido, por lo tanto analito. Adicionalmente, existen problemas de evaporation y adsorcion en las paredes de los recipientes durante estas manipulaciones.

En el caso de una baja concentracion del analito en la muestra inicial, esto puede provocar la completa desaparicion del analito o una disminucion de la cantidad del mismo de manera que puede ser indetectable.

Ademas de los inconvenientes mencionados anteriormente, estas manipulaciones son caras en terminos de material y llevan mucho tiempo. Esto sigue siendo un problema constante para muchas aplicaciones industriales, por ejemplo la detection de microorganismos patogenos en una muestra biologica o una muestra industrial.

La solicitud internacional, WO-A-02/43865, concierne a un metodo para trasportar un analito presente en una muestra, un metodo para concentrar un analito presente en una muestra, y un dispositivo para implementar dichos

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metodos. El metodo para trasportar un analito presente en una muestra consiste en preparar una solucion a partir de la muestra en donde el analito se fija sobre partlculas magneticas; introducir esta solucion en un primer recipiente conectado por medio de un cuello de botella a un segundo recipiente; desplazar con un sistema magnetico el analito fijado sobre partlculas magneticas desde el primer recipiente al segundo recipiente por medio del cuello de botella; el segundo recipiente se llena con toda o parte de dicha solucion y/o con otra solucion.

Aqul de nuevo, la solucion se proporciona para como concentrar partlculas magneticas en un pequeno volumen de llquido. Sin embargo, la separacion no se trata eficientemente, especialmente si el iman es de tamano pequeno comparado con el primer recipiente, e incluso no se trata la mezcla.

Por lo tanto existe la necesidad real de un metodo y un dispositivo para tratar analito unido a partlculas magneticas mientras al mismo tiempo se conserva la cantidad de analito presente en el inicio, por ejemplo con el fin de aumentar la sensibilidad y la especificidad de ensayos diagnosticos y de cualquier reaccion qulmica dirigida hacia el analito, y vencer los inconvenientes mencionados anteriormente.

La presente invention satisface esta necesidad, y no tiene unicamente la ventaja de vencer los inconvenientes mencionados anteriormente, sino tambien muchas otras ventajas, que apreciaran los expertos en la tecnica.

As! ninguno de los documentos descritos anteriormente presenta un proceso que ofrezca las ventajas de separar, mezclar y concentrar moleculas de interes de una muestra llquida en unicamente un recipiente. De manera semejante, no proponen un recipiente que tenga caracterlsticas tecnicas que autoricen la ejecucion de dicho proceso. Independientemente del metodo reivindicado, puede ser manual o automatico, o accionado por un dispositivo automatizado o no.

La meta principal de la presente invencion es proponer un conjunto segun la revindication 1.

En una realization del conjunto, la estacion de separacion comprende al menos dos imanes, los ejes polares de los imanes forman juntos un angulo diferente de 180°, preferiblemente incluido entre 60 y 150° y mas preferiblemente incluido entre 80 y 120°.

En otra realizacion del conjunto, la estacion de lavado comprende al menos dos imanes, los ejes polares de los imanes son paralelos entre si.

Segun otra realizacion del conjunto descrito anteriormente, el volumen del compartimento medio es menor comparado con el compartimento superior (y mayor comparado con el compartimento inferior.

Ahora se describira la invencion aun mas, por medio de ejemplos, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es una vista en perspectiva de un set constituido por ocho recipientes segun la invencion.

La figura 2 es una vista en section transversal del set de recipientes segun A-A de la figura 1.

La figura 3 es una vista en seccion transversal del set de recipientes segun B-B de la figura 2.

La figura 4 representa el detalle C de la figura 3.

La figura 5 representa una vista, que es similar a la figura 2, en el caso de que el envase llenado con la muestra biologica se disponga entre dos imanes, actuando simultaneamente sobre el fluido.

La figura 6 representa una vista, que es identica a la figura 5, despues de que los dos imanes han atraldo todas las partlculas magneticas presentes en la muestra inicial.

La figura 7 representa una vista, que es similar a la figura 6, cuando dichos dos imanes se mueven en direction descendente y transfieren las partlculas magneticas desde el compartimento de incubation al compartimento de lavado.

La figura 8 representa una vista, que es similar a la figura 7, cuando los imanes han llegado a su position final y todas las partlculas magneticas han formado una unica pastilla.

La figura 9 es una vista en seccion transversal de un envase de reaccion segun D-D de la figura 5.

La figura 10 representa una vista, que es similar a la figura 8, cuando el envase se dispone entre otros dos

imanes, y despues de la retirada de la parte llquida de la muestra biologica.

La figura 11 representa una vista, que es similar a la figura 10, cuando el llquido de lavado se anade por medio de una punta oblicua para evitar salpicaduras.

La figura 12 representa una vista, que es similar a la figura 11, que muestra el movimiento de aqul para alla de las partlculas magneticas dentro del llquido de lavado.

La figura 13 es una vista en seccion transversal de un envase de reaccion segun E-E de la figura 12 que explica el vinculo entre el movimiento de aqui para alla de las partlculas magneticas y el movimiento relativo del set de envases con respecto a los imanes.

La figura 14 representa una vista, que es similar a la figura 10, cuando el envase se dispone entre los mismos dos imanes, pero despues de la retirada de dicho llquido de lavado.

La figura 15 representa una vista, que es similar a la figura 14 concerniente a la posicion de los imanes, cuando se anade el tampon de salida o elucion por medio de la punta, descrita en la figura 11, o por medio de otra punta.

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La figura 16 representa una vista, que es bastante similar a la figura 7, cuando los otros dos imanes se mueven hacia abajo y transfieren las particulas magneticas desde el compartimento de lavado al compartimento de salida.

La figura 17 representa una vista, que es similar a la figura 16, despues de la retirada de tampon de salida presente en el compartimento de lavado. En esta fase, el tampon de salida esta sometido a un sistema de calentamiento con el fin de lograr la elucion de molecula de interes.

La figura 18 representa una vista, que es similar a la figura 13, que explica el movimiento de aqui para alla de las particulas magneticas en el tampon de salida debido al movimiento relativo del set de envases con respecto a los imanes.

La figura 19 representa una vista, que es bastante similar a la figura 16, pero que usa los dos primeros imanes para mover hacia arriba y transferir las particulas magneticas desde el compartimento de salida al compartimento de lavado donde no hay presente Kquido

La figura 20 representa una vista, que es bastante similar a la figura 19, donde se mantiene el movimiento hacia arriba de modo que los imanes transfieren las particulas magneticas desde el compartimento de lavado al compartimento de incubacion para autorizar la retirada del resto de tampon de salida que contiene la moleculas de interes eluidas desde el compartimento de salida.

La figura 21 es una vista en perspectiva de un cuerpo principal del soporte de puntas separado de ocho puntas, puntas que se podrian conectar a soportes de punta que tienen una forma complementaria.

La figura 22 es una vista inferior de un cuerpo principal al que se han conectado las puntas.

Finalmente la figura 23 muestra una presentacion grafica del resultado de un set de reacciones PCR en tiempo real en las que se ha amplificado un fragmento de ADN del virus herpes porcino (PhHV-1) tras el aislamiento del virus de diferentes muestras usando el dispositivo descrito en esta solicitud de patente. A lo largo del eje horizontal se indican diferentes numeros de muestra. El eje vertical muestra el ciclo umbral para cada muestra cuando se observa senal PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) positiva. Se han usado cuatro tipos diferentes de muestra (LCR, plasma, suero y sangre). Con cada tipo de muestra se han usado 20 muestras individuales.

1 - Descripcion de la realizacion preferida:

1.1 - Detalles del envase de reaccion:

El envase 3 se describe bien en las figuras 1-4. Consiste en tres compartimentos:

un compartimento grande superior de incubacion 4 con forma de embudo del envase 3, un compartimento medio alargado de lavado 5 con una seccion transversal constante del envase 3 un compartimento inferior alargado de salida 6 con una seccion transversal constante del envase 3 Esta configuracion obliga a tener una abertura superior 19 donde es posible introducir/dispensar o retirar liquido presente dentro de dicho envase 3, pero tambien una base cerrada 7. Finalmente, segun la figura 4, el envase 3 tiene un eje longitudinal 8.

Haciendo referencia ahora mas particularmente a la figura 1, los envases 3 en una configuracion preferencial se disponen para constituir un set 23, que tiene una lengua de manipulacion 24 que facilita el manejo por parte de los usuarios. Se podrian anadir medios de posicionamiento no representados en las figuras, con el fin de proporcionar la instalacion en un dispositivo automatico incluso mas eficiente que lo usual.

Las caracteristicas principales son:

Preferiblemente, la altura total del envase 3 son 40 mm para facilitar la recuperacion del tampon de salida 21 desde el compartimento de salida 6 usando una punta de filtro desechable estandar, como 22, 25, 26.

El volumen del compartimento de incubacion 4 son 2-6 ml, preferiblemente 4 ml. En la ultima configuracion, que es el diseno en este momento, las dimensiones con 20 mm de altura, 25 mm de profundidad, 9 mm de anchura.

El volumen del compartimento de lavado 5 son 0,1-1 ml, preferiblemente 0,2 ml. En la ultima configuracion, que es el diseno en este momento, la forma cilindrica tiene 5 mm de diametro y 8 mm de altura.

El volumen del compartimento de salida 6 son 10-100 pl, preferiblemente 20 pl. En la ultima configuracion, que es el diseno en este momento, el cilindro es de 5 mm de altura y 2 mm de diametro.

El grosor de la pared del envase es de entre 0,2 mm y 1 mm (diseno en este momento: 0,5 mm).

Preferiblemente, el envase de reaccion es un plastico desechable producido mediante moldeo por inyeccion, por ejemplo usando polipropileno. Para permitir una manipulacion conveniente para un operador, se recomienda integrar varios envases de reaccion 3 en un set 23. La solicitante ha realizado un diseno en el que un set comprende ocho envases 3. Por la misma razon es conveniente integrar las puntas 21, 25, 26 con su base comun 29 para obtener una unica unidad en la que el numero de puntas sea igual al numero de envases de reaccion 3 y en la que el espaciamiento entre puntas coincida con la posicion de los envases en un set 23.

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Preferiblemente, el dispositivo usa imanes fabricados de neodimio (NdFeB) con un campo remanente de 1,2 Tesla. Con el dispositivo de este momento, imanes cillndricos de 6 mm diametro y 7 mm de longitud han demostrado ser adecuados para los imanes 9, 10 13 y 14.

Cuando se separan partlculas magneticas 2 del llquido 1 en el compartimento de incubacion 4, el espaciamiento entre la cara de los imanes 9 y 10 y la pared del envase de reaccion es tlpicamente de 0,5 mm. Durante el movimiento de lavado (F11, figura 13) los imanes 13 y 14 se trasladan con respecto al envase con una velocidad tlpica de 1 cm por segundo. Cuando se pasa el envase, la distancia a la pared del compartimento de lavado 5 es tlpicamente de 1 mm. Durante el movimiento de elucion (F11, figura 18) los imanes 13 y 14 se trasladan con respecto al envase con una velocidad tlpica de 1 cm por segundo. Cuando se pasa el envase, la distancia a la pared del compartimento de salida 6 es tlpicamente de 2 mm.

1.2- Metodo segun la Invencion:

En una realizacion preferida, el dispositivo descrito en esta solicitud se combina con algunos componentes estandar tales como una bomba de succion y una llnea de llquido para aspirar llquido, un modulo dispensador de llquido y algunos medios mecanicos para trasladar los imanes, la punta de aspiracion y el dispensador con respecto a los envases de reaccion. En una realizacion preferida, este dispositivo es util para aislar acidos nucleicos de una muestra biologica inicial compleja, tales como sangre completa, suero de sangre, capa leucocitaria (la capa leucoplaquetaria o fraccion de leucocitos de la sangre), orina, heces, llquido cefalorraquldeo, esperma, saliva, tejidos, cultivos celulares y similares. El acido nucleico, aislado del material biologico mencionado anteriormente, tambien puede comprender el acido nucleico endogeno del organismo del que se deriva la muestra y cualquier acido nucleico extrano (vlrico, fungico, bacteriano o parasitario).

El dispositivo se usa segun el siguiente procedimiento:

(a) Adicion de mezcla llquida al envase de reaccion

Se anade una mezcla 1 de la muestra primaria, un tampon de lisis y partlculas magneticas 2 al envase de reaccion 3. Las moleculas objetivo (acido nucleico, no mostrado en las figuras) se liberan de las celulas u organismos en la muestra y se unen a las partlculas magneticas 2. Esta etapa de proceso se define como "incubacion". En esta etapa, todos los compartimentos, que constituyen dicho envase 3, se rellenan con el fluido 1, es decir, el compartimento de incubacion 4, el compartimento de lavado 5 y el compartimento de salida 6. Debido a la diferencia de tamano entre dichos compartimentos 4-6, la mayorla de dicho fluido 1 esta contenido en el compartimento de incubacion 4 del envase de reaccion 3. Tlpicamente, el tiempo de incubacion es de aproximadamente 5 minutos.

(b) Separacion de partlculas de la muestra

Tas la incubacion, la mezcla llquida 1 en el envase 3 se dispone entre dos imanes 9A o 9B o 9C, etc. y respectivamente 10A o 10B o 10C, etc.; cada uno 9 o 10 genera un campo magnetico respectivamente 11 y 12, como se describe en la figura 5. La configuracion tambien se define bien en la figura 9. Como resultado, las partlculas magneticas 2 se recogen - como pastilla - en dos posiciones en la pared lateral del compartimento de incubacion 4 correspondiente a la ubicacion de los imanes (figura 6). El tiempo de recogida es tlpicamente alrededor de 1 minuto.

(c) Transferencia de partlculas al compartimento de lavado

Segun la figura 7, las pastillas de partlculas magneticas 2 se transfieren desde el compartimento de incubacion 4 al compartimento de lavado 5 al mover los imanes 9 y 10 en direction descendente segun F2. Tambien es posible lograr este movimiento moviendo el envase 3 en direccion ascendente segun F1, o combinar movimientos hacia abajo (F2) y hacia arriba (F1) respectivamente de dichos imanes 9 y 10 y dicho envase 3. Durante ese movimiento(s), las partlculas 2 inicialmente recogidas por el iman 10, saltan hacia el iman 9, segun F3, donde se unen con las partlculas 2 inicialmente recogidas por el iman 9. Tras esta consolidation, todas las partlculas magneticas 2 se transfieren al compartimento de lavado 5 como se muestra en la figura 8.

(d) Lavado de partlculas magneticas

Se lavan las partlculas magneticas 2 para retirar todos componentes de muestra as! como otros reactivos que podrlan interferir con la aplicacion aguas abajo. Se logra lavar al disponer el envase de reaccion 3 a los imanes 13 y 14 y la retirada subsiguiente (F5) de la muestra llquida del envase de reaccion 3 usando la punta 22 (figura 10), que se introduce verticalmente, segun F4, en dicho envase 3. A continuation, segun la figura 11, se anade un llquido de lavado fresco 20 a dicho envase 3 segun F9 por medio de una punta 25 introducida en el envase segun F8, que esta en un angulo oblicuo comparado con la position vertical del envase 3 con el fin de eliminar cualquier riesgo de salpicaduras que podrlan generar gotitas sobre la pared lateral interna, perjudiciales para etapas de proceso futuras adicionales. Durante la retirada de muestras y adicion de llquido, las partlculas magneticas 2 son retenidas en la pared lateral del compartimento de lavado 5 bajo la action de los imanes 13 y 14. A continuacion, los imanes 13 y 14 se mueven en la direccion F11, como se representa en la figura 13, para transferir las partlculas 2 adelante y atras, segun F10 de la figura 12, entre lados opuestos del compartimento de lavado 5 para llevarlas al contacto con el llquido de lavado 20. En esas circunstancias, como alternativa se someten las partlculas magneticas 2 a dos campos magneticos opuestos 15 y 16.

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Obviamente tambien es posible lograr este movimiento en la direccion F11 al mover el envase 3 con respecto a los imanes 13 y 14, o combinar movimientos de dichos dos imanes 13 y 14 y dicho envase 3.

La etapa (d) se puede repetir hasta que se han obtenido suficientes prestaciones de lavado. En caso apropiado, se puede usar una secuencia de diferentes llquidos de lavado. En caso de que se usen diferentes llquidos de lavado, estara claro que la punta de dispensacion se lava adecuadamente cuando se cambian tampones.

Los imanes 13 y 14 se colocan en geometrlas de distribucion intermedias. Esta disposicion permite el uso del metodo de la invention para dar un formato de alto rendimiento. Una realization en donde los envases y los imanes se colocan en geometrlas de distribucion intermedias se ilustra en la figura 13. Los envases 3 se colocan en geometrla de distribucion con los imanes 13A, 13B, 13C, etc., en un lado y 14A, 14B, 14C, etc., en el otro lado, fijados a una segunda distribucion 18, usada como soporte para los imanes, que se traslada con respecto a los envases 3.

De esta manera se procesa simultaneamente una serie grande de muestras. La adicion y aspiration de llquidos puede ser a mano o mediante un instrumento dispensador automatizado multipunta como se conoce en la tecnica. El solicitante expone bien una configuration de este tipo en una solicitud anterior presentada con el numero de solicitud WO-A-01/05510 0 publicada el 25 de enero de 2001 y titulada: "Device and method for mixing magnetic particles with a fluid and optionally separating the particles from the fluid and use thereof in purification methods". Los lectores pueden encontrar information pertinente acerca de dicha configuracion en este documento. Esta es la razon por la que su contenido se adjunta como referencia.

(e) Preparation para la elucion

Mientras las partlculas magneticas 2 son retenidas en la pared lateral del compartimento de lavado 5, se retira todo el llquido de lavado del envase 3, segun F13, usando la punta 26 que se introduce en el envase 3 segun F12, para terminar en la configuracion que se representa en la figura 14. A continuation, se anade un tampon de salida o elucion 21 por medio de la punta 26 o una nueva punta, no representada en el dibujo, introducida segun F14, al envase de reaction 3 para llenar (F15) los compartimentos de salida y de lavado 6 y 5. Tras esos, las partlculas magneticas 2 se transfieren desde el compartimento de lavado 5 al compartimento de salida 6 al mover los imanes 13 y 14 en la direccion descendente (F16) y/o al mover los envases 3 en la direccion ascendente (F17) (figura 16). A continuacion, se establece el volumen del tampon de salida 21 al hacer descender la punta 26 adentro del envase de reaccion 3, segun F18, mientras se aspira parte del llquido, segun F19, hasta un nivel que corresponde con el volumen especificado del tampon de salida (figura 17).

Aunque las partlculas magneticas 2 estan en contacto con el tampon de elucion 21 no tiene lugar una significativa liberation de objetivo debido al hecho de que:

el tiempo de contacto es corto,

se recogen dichas partlculas magneticas 2 como aglutinacion, y el tampon de elucion 21 esta a temperatura ambiente.

(f) Calentamiento del tampon de elucion

Un elemento calentador 33 encierra el compartimento de salida 6 del envase de reaccion 3 para calentar el tampon de salida a una temperatura especificada (figura 17). Una temperatura tlpica para el proceso de elucion son 60 a 80° C. Esta temperatura se aplica durante aproximadamente de 15 segundos a 10 minutos, preferiblemente de 1 minute a 6 minutos y mas preferiblemente 3 minutos. Estas condiciones autorizan una liberacion significativa de objetivo

(g) Elucion de acido nucleico de partlculas magneticas

Las moleculas objetivo se liberan de las partlculas magneticas 2 y se recuperan en el tampon de salida 21, unicamente presente en el compartimento inferior 6, al mover los imanes 13 y 14 en la direccion F11, segun la figura

18. De manera similar a la etapa de lavado (d), las partlculas 2 se trasladan adelante y atras entre lados opuestos del compartimento de salida 6 para llevar dichas partlculas 2 a un contacto eficiente con el tampon de salida 21. Durante esta etapa el calentador 33 encierra el compartimento de salida 6 para controlar la temperatura del tampon de salida 21.

(h) Separation de partlculas magneticas del tampon de salida

Tras la etapa de elucion, las partlculas magneticas 2 se despejan (separan) del tampon de salida 21 al disponer el envase 3 de muestra o los imanes 9 y 10, vease la figura 19, para permitir que el iman 9 recoja las partlculas 2 en la pared lateral del compartimento de salida 6 y posteriormente mueva el envase 3 en la direccion descendente, segun F20, y/o mueva los imanes 9 y 10 en la direccion ascendente, segun F21, con el fin de mantener dichas partlculas 2 en la pared lateral del compartimento de incubation 4, como se describe en la figura 20, u opcionalmente del compartimento de lavado 5.

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Entonces el tampon de elucion 21 presente en el compartimento de salida 6 se podrla usar para procesamiento adicional o, segun la figura 20, ser transferido por medio de la punta 26, que se introduce (F22) en el envase 3 y el tampon de elucion 21, que contiene las moleculas objetivo, se retira por aspiracion (F23).

Estara claro para cualquier experto en la tecnica que el dispositivo descrito anteriormente as! como el metodo para usar el dispositivo se integran facilmente en un sistema automatizado al realizar las traslaciones para el envase de reaccion, los imanes, el calentador y las puntas de una manera automatizada, por ejemplo usando un conjunto de accionadores lineales controlados por motores paso a paso. Tambien es obvio que, dependiendo de la aplicacion particular, se puedan omitir etapas particulares del protocolo anterior, tales como (f), (g) o (h).

Las figuras 10 y 14 son bastante similares, ya que las partlculas magneticas 2 son mantenidas en posicion en un unico envase por unicamente un iman 13, por ejemplo. Cada envase vecino 3 del set 23 contiene tambien partlculas magneticas 2 que son atraldas por el iman 14. En otras palabras, envases vecinos 3 tienen sus partlculas magneticas 2 en paredes laterales opuestas. Para facilitar la introduccion de las puntas 22 o 25 en el set 23 de ocho envases, el posicionamiento de dichas ocho puntas se ha implementado de una manera mejorada, como se describe en las figuras 21 y 22. Asl, todas las puntas que colaboran con un set 23 de envases 3 se asocian con un cuerpo principal 29, este ultimo tiene ocho soportes 30 de punta, cada 30 desplazado de otro. Mas especlficamente cada punta comprende dos extremos libres, uno es el extremo inferior 27 y el otro es el extremo superior 28 de la punta. Los extremos libres 27 o 28 se disponen simetricamente a lo largo de dos llneas, cada llnea dibujada por cuatro extremos inferiores 27 o cuatro extremos superiores 28, y las dos llneas son paralelas entre si.

Obviamente cuando las puntas 22 o 25 se introducen en los envases 3, segun las figuras 10 y 14, las puntas se alejan tanto como sea posible de las partlculas magneticas 2, para evitar un contacto prejudicial para etapas de proceso futuras adicionales.

Haciendo referencia ahora mas particularmente a la figura 21, el cuerpo principal 29 en una configuration preferencial comprende una lengua de manipulation 32 que facilita el manejo por parte de los usuarios. Se podrlan anadir medios de posicionamiento no representados especlficamente en las figuras, con el fin de proporcionar la instalacion en un dispositivo automatico incluso mas eficiente que lo usual. Ademas, dicho cuerpo principal 29 comprende una abertura de admision/escape 31 para permitir la dispensation o la retirada de fluido. Esta abertura 31 tambien podrla servir como medios de posicionamiento.

Se presentan cuatro ejemplos en los que se alslan acidos nucleicos de una muestra aportada usando la invention presentada anteriormente. Con estos ejemplos se obtuvieron los tampones de lavado, el tampon de elucion y las partlculas magneticas a partir de "reactivos de extraction magnetica de NucliSens" (codigo de artlculo 200297). El tampon de lisis es "tampon de lisis de NucliSens" (codigo de artlculo 200295). Los productos NucliSens son suministrados por bioMerieux B. V. (Boxtel, Palses Bajos)

2 - Ejemplo 1: Concentration de ARN ribosomico de muestras de plasma:

2.1 - Materiales y metodos:

Se extrae ARN objetivo de celulas de Escherichia coli usando el kit Qiagen ARN/ADN maxi (codigo de artlculo 14162, Qiagen, Hilden, Alemania). Para cada muestra, se usan como aporte 2 microgramos (pg).

La muestra esta constituida por muestras de plasma normal de EDTA/citrato a partir de un grupo de 100 donaciones de sangre individuales.

La cuantificacion de ARN se realiza usando un marcador luminiscente para ARN (Sybr Green-II, suministrado por Molecular Probes: artlculo S-7564) en combination con un lector luminiscente para placas de microtitulacion ("Victor 2", proveedor Wallac Oy, Turku, Finlandia: 1420-contador multietiqueta).

Tambien se determina la pureza del tampon de salida a partir del valor relativo para la absorcion espectral a 260 nm y 280 nm (A260/A280) usando un espectrometro de UV (proveedor Unicam, Cambridge, Gran Bretana: Unicam UV- 1).

2.2 - Preparation de la muestra:

Se prepara un set de veinticuatro muestras de plasma de la siguiente manera:

Con cada muestra, se anade 1 ml de plasma al envase de reaccion y se mezcla con 2 ml de tampon de lisis de NucliSens.

A continuation se anade el ARNr objetivo a esa mezcla usando un aporte de 2 pg de ARN para cada muestra.

Posteriormente, se anade 1 mg de partlculas magneticas a las muestras de plasma lisadas y se produce una dispersion homogenea usando una pipeta manual.

2.3 - Metodo de extraccion:

5

10

15

20

25

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45

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65

Se procesa simultaneamente un lote de veinticuatro muestras segun el procedimiento indicado anteriormente como etapas (a) a (g). Las muestras se anaden a tres sets de envases de reaccion, cada set comprende ocho envases identicos.

Tras recoger las partlculas magneticas del compartimento de incubacion (el tiempo de recogida fue 1 minuto), las partlculas se transfieren al compartimento de lavado y se lavan usando tampon de lavado 1 y tampon de lavado 2 de NucliSens, usando dos ciclos de 3 ml y 1 ml en el primer y segundo ciclo respectivamente.

Tras el lavado, las partlculas se transfieren al compartimento de salida, en el que se libera el ARN objetivo de las partlculas al mezclar las partlculas en el tampon de elucion de NucliSens (tampon de lavado 3) durante 5 minutos. Durante la elucion, la temperatura del tampon son 60° C. El volumen del tampon de salida son 20 pl.

Tras la elucion, las partlculas magneticas se separan del tampon de salida usando los imanes 9.

Tras completar el protocolo, se mide la cantidad de ARN recuperado en el compartimento de salida de cada envase usando un marcador de ARN luminiscente. Para esa finalidad, se transfieren 10 pl del tampon de salida desde cada envase de reaccion a la poceta de una placa de microtitulacion y a cada poceta se anaden 190 pl de solucion Sybr Green. En cada poceta, la senal optica detectada por el lector de placa luminiscente (Victor2 es una medida directa de la cantidad de ARN que esta presente en esa poceta.

2.4 - Resultado

Para las veinticuatro muestras, la cantidad promedio de ARNr objetivo en el compartimento de salida del envase son 132 pg con una desviacion estandar de 50 ng. Esto corresponde a un rendimiento medio del 66 %.

La pureza de la salida es excelente segun se concluye de la proportion A260/A280 usando el espectrometro de UV. El tampon de salida muestra una proporcion de 2,1 mientras que ARN puro en este tampon tiene una proporcion A260/A280 entre 1,9 y 2,1.

La consistencia del ARN objetivo se determina usando el 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, Palses Bajos). Este instrumento detecta las dos bandas discretas de ARN correspondientes a ARN 16S y 23S. No se han detectado otros productos tales como fragmentos de ARN mas pequenos.

El tiempo total para completar el procedimiento de extraction para este lote de veinticuatro muestras son 30 minutos, empezando despues de anadir las partlculas magneticas a las muestras lisadas. No se necesita intervention del operador para producir el ARN concentrado en la salida.

3 - Ejemplo 2: Concentration de ADN plasmido de muestras de plasma:

3.1 - Materiales y metodos:

El objetivo es ADN plasmido, pBR322 (artlculo N3033L, New England Biolabs Inc., Beverly, MA), linealizado por BamH1 (artlculo E1010WH, Amersham Bioscience Corp, NY, EE. UU.). Se usan seis pg de ADN como aporte por muestra

La muestra esta constituida por 0,1 ml de plasma normal de EDTA/citrato de donaciones de sangre

3.2 - Preparation de la muestra:

Se procesan simultaneamente veinticuatro muestras, usando el mismo procedimiento que con el ejemplo 1. Las muestras de plasma individuales se anaden a los envases de reaccion. A continuation se anaden 2 ml de tampon de lisis de NucliSens. Posteriormente, el ADN plasmido se anade a la muestra y se anade 1 mg de partlculas magneticas a la mezcla.

3.3 - Metodo de extraccion:

La etapa de recogida, las etapas de lavado y la etapa de elucion del procedimiento de extraccion son identicas al ejemplo 1.

3.4 - Resultado:

Tras completar el procedimiento, se determina la cantidad de ADN extraldo a partir de la densidad optica del tampon de salida a 260 nm.

La cantidad promedio de ADN recuperada del envase de reaccion son 3,1 pg con un coeficiente de variation del 4 % entre diferentes envases. Esto corresponde a un rendimiento de aislamiento del 52 % usando 6 pg de ADN como aporte.

La proporcion media A260/A280 para el tampon de salida es 1,9. Para ADN puro en el tampon de salida esta proporcion es entre 1,7 y 2,1.

5

10

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20

25

30

35

40

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Como con el ejemplo 1, el tiempo necesario para completar el procedimiento de extraccion son 30 minutos empezando despues de anadir las partlculas magneticas.

4 - Ejemplo 3: Recuperacion de ARN virico de muestras de esputo:

4.1 - Materiales y metodos:

En este experimento, la recuperacion del ARN VIH que se anade a nueve muestras de esputo se determina usando el ensayo NucliSens EasyQ HIV-1 version 1.1 (artlculo 285029, bioMerieux B.V., Boxtel, Palses Bajos).

El ARN es ARN VIH obtenido de un stock de virus cultivado VIH-1 tipo B (HXB2) que se lisa usando el tampon de lisis de NucliSens y se calibra usando la norma internacional WHO de ARN VIH-1.

Las muestras de esputo se obtuvieron de University Hospital de Antwerpen (Belgica).

4.2 - Preparacion de la muestra:

Con cada muestra de esputo se mezcla un volumen de 1 ml con 0,5 ml de solucion de proteasa (100 mg/ml) y se incuba sobre un agitador de placa durante 20 minutos a temperatura ambiente para obtener una muestra licuada.

El ARN HIV objetivo se anade a un tubo que contiene 2 ml de tampon de lisis de NucliSens, usando un aporte de 30,000 para cada muestra. Junto con el ARN VIH, al tampon de lisis se anade un calibrador ARN que es parte del kit EasyQ. A continuacion las muestras de esputo licuadas se anaden al vaso de reaccion junto con el tampon de lisis (2 ml) que contiene el ARN. Tras 10 minutos, se anade 1 mg de partlculas magneticas a cada muestra. Se obtiene una dispersion homogenea al mezclar con una pipeta manual.

4.3 - Extraccion de ARN:

El procedimiento de extraccion continua como con los ejemplos 1 y 2 descritos anteriormente.

4.4- Detection de ARN:

Al final del procedimiento de extraccion, la ARN HIV y el calibrador ARN se concentran en 12 pl de tampon de elucion en el compartimento de salida. Del compartimento de salida se aspiran dos fracciones de 5 pl cada una y se usan como aporte a un ensayo NucliSens EasyQ. Para la deteccion, se sigue el procedimiento que se indica en el manual del ensayo EasyQ.

4.5 - Resultado:

Los resultados se presentan en la siguiente tabla:

Numero de muestras

Resultado de EasyQ (copias viricas)

Reaccion 1

Reaccion 2

1

11,000 10,000

2

11,000 9,700

3

9,600 9,200

4

12,000 13,000

5

11,000 16,000

6

18,000 13,000

7

9,200 10,000

8

12,000 14,000

9

20,000 12,000

A partir de estos resultados, se concluye que el dispositivo descrito en esta solicitud puede aislar bien ARN virico de muestras de esputo y lo concentra en una forma que facilita la deteccion usando metodos de amplification estandar.

5 - Experimento 4: Recuperacion de ADN virico de diferentes tipos de muestras:

5.1 - Materiales y metodos:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Este experimento representa una serie de cuatro rondas de extraccion en veintidos muestras cada una. Con cada ronda se usa un tipo de muestra diferente:

Ronda 1: muestras de plasma de donaciones individuales (1 ml por muestra)

Ronda 2: Llquido cefalorraquldeo (LCR) (0,1 ml por muestra)

Ronda 3: muestras de suero de donaciones individuales usando 1 ml por muestra Ronda 4: muestras de sangre completa (0,1 ml por muestra).

5.2 - Preparacion de la muestra:

Cada muestra se anade a 2 ml de tampon de lisis de NucliSens.

Como objetivo, se anade el virus herpes porcino (PhHV-1) a veinte de las muestras lisadas en cada ronda. Se usaron dos muestras (21a y 22a) como control negativo (sin ADN anadido).

5.3 - Extraccion de ADN:

El metodo de extraccion para cada ronda (tipo de muestra) es identico al procedimiento descrito en los ejemplos 1,2 y 3.

5.4 - Deteccion de ADN:

El ADN que se recupera en el tampon de salida se detecta usando PCR en tiempo real. Para cada muestra se determina el numero de ciclos PCR (TC) necesarios para producir una senal positiva.

La figura 23 muestra una presentacion grafica de estos valores TC para todas las muestras. Las muestras de control negativo fueron todas negativas.

5.5 - Resultado:

De este conjunto de experimentos, se concluye que el dispositivo descrito en esta solicitud de patente puede aislar bien acido nucleico de partlculas de virus de tipos de muestras diferentes con excelente rendimiento.

REFERENCIAS

1. : Fluido o mezcla

2. : Partlculas magneticas

3. : Envase de reaccion

4. : Compartimento grande superior de incubacion con una forma de embudo del envase 3

5. : Compartimento medio alargado de lavado con una seccion transversal constante del envase 3

6. : Compartimento inferior alargado de salida con una seccion transversal constante del envase 3

7. : Base cerrada del envase 3

8. : Eje longitudinal del envase 3

9. : Imanes (A, B, C, D, etc.) presentes en un lado del set de recipientes usados para la etapa de separacion

10. : Imanes (A, B, C, D, etc.) presentes en el otro lado del set de recipientes usados para la etapa de

separacion

11. : Eje polar (A, B, C, D, etc.) del iman (9A, 9B, 9C, 9D, etc.)

12. : Eje polar (A, B, C, D, etc.) del iman (10A, 10B, 10C, 10D, etc.)

13. : Imanes (A, B, etc.) presentes en un lado del set de recipientes usados para la(s) etapa(s) de mezcla y/o concentracion

14. : Imanes (A, B, etc.) presentes en el otro lado del set de recipientes usados para la(s) etapa(s) de mezcla y/o concentracion

15. : Eje polar (A, B, C, D, etc.) del iman (13A, 13B, 13C, 13D, etc.)

16. : Eje polar (A, B, C, D, etc.) del iman (14A, 14B, 14C, 14D, etc.)

17. : Soporte de los imanes (9A, 9B, 9C, 9D, etc., o 10A, 10B, 10C, 10D, etc.)

18. : Soporte de los imanes (13A, 13B, 13C, 13D, etc., o 14A, 14B, 14C, 14D, etc.)

19. : Abertura superior del envase 3

20. : Llquido de lavado

21. : Tampon de salida

22. : Punta para anadir o retirar fluido 1

23. : Set de envases 3

24. : Lengua de manipulacion del set de envases 23

25. : Punta para anadir llquido de lavado 20 y/o tampon de elucion 21

26. : Punta para retirar llquido de lavado 20 y/o tampon de salida 21

27. : Extremo inferior de la punta 25

28. : Extremo superior de la punta 25

29. : Cuerpo principal del soporte 30 de puntas

30. : Soporte de punta

31. : Abertura de admision/escape del cuerpo principal 29

32. : Lengua de manipulacion del cuerpo principal 29

33. : Sistema de calentamiento

F1.

F2.

F3.

F4.

5 F5.

F8. F9. F10. F11. 10 F12.

F13. F14. F15. F16. 15 F17.

F18. F19. F20. F21. 20 F22.

F23.

Movimiento hacia arriba del envase 3 Movimiento hacia abajo de los imanes 9 y 10 Atraccion magnetica de las partlculas 2 Movimiento hacia abajo de la punta 22 Retirada del fluido 1 por aspiracion con la punta 22 Movimiento hacia abajo de la punta 25

Dispensacion de llquido de lavado 20 expulsado desde la punta 25 Movimiento de aqul para alla de las partlculas magneticas 2 Movimiento relativo del set 23 con respecto a los imanes 13 y 14 Movimiento hacia abajo de la punta 25

Retirada del llquido de lavado 20 por aspiracion con la punta 25 Movimiento hacia abajo de la punta 26

Dispensacion de tampon de salida 21 expulsado desde la punta 26 Movimiento hacia abajo de los imanes 13 y 14 Movimiento hacia arriba del envase 3 Movimiento hacia abajo de la punta 26

Retirada del tampon de salida 21 presente en el compartimento de lavado 5 Movimiento hacia abajo del envase 3 Movimiento hacia arriba de los imanes 13 y 14 Movimiento hacia abajo de la punta 26

Retirada del tampon de salida 21 por aspiracion con la punta 26

Claims (4)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un conjunto que comprende:

   un envase de reaccion (3) constituido por un compartimento superior grande con una forma de embudo (4), un compartimento inferior alargado con una seccion transversal sustancialmente constante (5, 6) y una base cerrada (7), en donde el compartimento superior (4) comprende una primera parte que tiene una seccion transversal constante y un primera parte en forma de embudo, en donde el tamano de una seccion transversal de la primera parte es mayor que el tamano de una seccion transversal del compartimento inferior alargado (5, 6), en donde el eje longitudinal de la primera parte es paralelo pero esta espaciado del eje longitudinal del compartimento inferior (5, 6), en donde el compartimento inferior esta constituido por un compartimento medio (5) conectado en un lado a la primera parte en forma de embudo, y un compartimento inferior (6), que se conecta en un lado al compartimento medio (5) y en otro lado a dicha base cerrada (7); y un dispositivo para extraer posibles moleculas de interes de un fluido al que se anade una suspension de partlculas magneticas o paramagneticas contenidas en el envase de reaccion (3) y que pueden unir las moleculas de interes que comprende:

   al menos una estacion de separacion para capturar las partlculas magneticas presentes en el compartimento superior grande (4) del envase de reaccion (3),

   al menos una estacion de lavado para mezclar dichas partlculas magneticas presentes en el compartimento medio (5) del envase de reaccion (3),

   al menos una estacion de concentration para mezclar dichas partlculas magneticas presentes en el compartimento inferior (6) del envase de reaccion (3), y

   al menos unos medios de pipeteo para dispensar y/o para retirar parte o todo el fluido, el llquido de lavado y el tampon de salida.
2. 2. El conjunto segun la reivindicacion 1, en donde la estacion de separacion comprende al menos dos imanes, los ejes polares de los imanes forman juntos un angulo diferente de 180°, preferiblemente incluido entre 60 y 150° y mas preferiblemente incluido entre 80 y 120°.
3. 3. El conjunto segun la reivindicacion 1 o 2, en donde la estacion de lavado comprende al menos dos imanes, los ejes polares de los imanes son paralelos entre si.
4. 4. El conjunto segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el volumen del compartimento medio (5) es mas pequeno comparado con el compartimento superior (4) y mas grande comparado con el compartimento inferior (6).