JP5119398B2 - 磁性粒子保持担体、およびその調製方法 - Google Patents
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Description
今後、遺伝子の機能解析や医薬品のリード化合物の探索等さらに幅広い応用を目指す際には、様々な機能性タンパク質を、活性を損なうことなく構築することができる新しい磁性粒子の開発が望まれている。
さらに、分離の際に磁性細菌粒子がチップ内壁に非特異的に吸着するために、再懸濁の効率が低下してしまう場合がある。
これは、ナノサイズの磁性粒子である磁性細菌粒子は表面積/体積比が大きいため試薬の吸引・吐出による再懸濁の影響を受けにくく、チップへの吸着力が強いためであると考えられる。この問題を解決するために、ピペットチップの壁面の疎水性を高めたり、溶媒に界面活性剤を加えるといった方法が試みられてきたが、安定した磁気分離率を得るための条件設定が非常に困難であった。
また、担体として、例えば、繊維状体、多孔質体、ゲル状体であっても良い。
これら非磁性のマイクロサイズの粒子状担体と、該担体に保持した多数のナノサイズの磁性粒子とを有する磁性粒子保持担体の構成により、非磁性の担体に磁性を持たせる作用を有する。また非磁性体に多数のナノサイズの磁性粒子をマイクロサイズの粒子状担体に集積させ、粒子あたりに作用する磁力を増加させる作用を有する。同時に保持担体がマイクロビーズであり、かつ表面がナノビーズで覆われているので、表面積を増大する構成となり、粒子あたりの表面積/体積比を小さくする作用を有する。
なお、共有結合を行う場合に、架橋剤として、例えば、EDC(二塩化エチレン)、または、Sulfo-LC-SPDP(Sulfosuccinimidyl-6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate)およびSulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)を用いた、化学結合法によるのが好ましい。また、水素結合を行わしめるには、水素原子より電気的に陰性な原子XとY(窒素、酸素、リン、硫黄、ハロゲン等)を有するような物質で前記担体を形成しまたは担体および磁性粒子の表面に被覆させて、水素原子を介して結合させる必要がある。また、静電的結合を行うには、陽イオンと陰イオンを有する物質(イオン結晶物質)で前記担体を形成しまたは担体および磁性粒子の各々を被覆する必要がある。
図1(a)に示すように、第1の実施の形態に係る磁性粒子保持担体11は、非磁性であって、粒径が約1μmのマイクロサイズで、その表面が前記受容体としてのストレプトアビディン13によって被覆されているラテックスの粒子状担体12(例えば、Polysciences, Ink製のStreptavidin Coated Beads, 1μmYG)と、前記磁性粒子として、リガンドとしてのビオチン15およびアミノ基を有する物質によって被覆されているナノサイズの超磁性単一ドメイン粒子14と、前記アミノ基に導入された蛍光色素16(Cy3-NHS)とを有するものである。なお、超磁性単一ドメイン粒子については、例えば、国際公開WO96/03653またはWO97/35200にその開示がある。
ここで、前記磁性細菌粒子33にビオチン34および蛍光色素36を導入したものをビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37とする。
図2に示すように、磁性粒子保持担体31を調製するには、ステップS1で、磁性粒子としての磁性細菌粒子33を調製し、ステップS2で、該磁性細菌粒子33にビオチン34および蛍光色素36を導入し、ステップS3で、ストレプトアビディン13で標識化されたポリスチレンのマイクロサイズの粒子状担体32へ、ビオチン34および蛍光色素36を導入したビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37を結合することによって行う。
炭酸緩衝溶液にそれぞれの濃度が0.35 mM、0.035 mMとなるようにビオチン34(Sulfo-NHS-LC-LC-biotin)、蛍光色素36(Cy3 bis NHS ester)を溶解させた混合溶液 1 mlに、磁性細菌粒子33について 1 mgを懸濁し、5分毎に超音波攪拌により分散状態を保たせながら、室温で1時間反応させた。その後、1 ml のPBSで3回洗浄して得た粒子をビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37(Cy3-BMP-biotin)とした。ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37(Cy3-BMP-biotin)は再度1 mlのPBSに懸濁し、4℃で保存した。
該磁性粒子保持担体31を調製する過程で、ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37(Cy3-BMP-biotin)の懸濁液を0、3、5、7、8、9、10回(結合工程回数)逐次添加した後の粒子を蛍光顕微鏡により観察した。さらにフローサイトメーターにより蛍光強度分布を解析し、縦軸に事象数、横軸に相対的蛍光強度を表したヒストグラムを得た。また、調製した磁性粒子保持担体31を蒸留水で3回洗浄した後に走査型電子顕微鏡(SEM)により観察した。
図4に示すように、調製した磁性粒子保持担体31の懸濁液を遠心分離により5.0×107 beads/ml、30μlに調製した後、ステップS11において、該磁性粒子保持担体31を液体中に懸濁させた懸濁液51をPCRチューブ50に入れ、ステップS12において、前記チューブ50の上部壁面にNd-B磁石52を接触させ、5 分間磁気分離した後、ステップS13において上清を除去し、ステップS14において、新たに30μlのPBSを加えた。ステップS15においてヘマサイトメーターを用いて磁気分離前後のビーズ濃度を測定し、磁気分離率(磁気分離後のビーズ濃度[B]/磁気分離前のビーズ濃度[A]×100%)を算出した。また、ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37(Cy3-BMP-biotin)を添加していない粒子状担体32に対しても同様の操作を行い、磁気分離率を比較した。
ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37の懸濁液(50 μg/ml、8 ml)をストレプトアビジンで標識化された粒子状担体32(ポリスチレンビーズ)の懸濁液(3.0×106 beads/ml、4 ml)に添加し、ピペッティングにより分散状態を保ちながら15分間反応させる操作を10回繰り返して、磁性粒子保持担体31を調製した。
最初に磁性細菌粒子33にビオチン34、蛍光色素36を導入したビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37に対する抗体35の導入の可能性について調べる。
図9に示すように、ステップS31で、前記抗体35が固定化された磁性粒子保持担体41の懸濁液(1.0×108beads/ml,20μl)を用意し、ステップS32において、終濃度8, 4, 0.8, 0.4, 0.08, 0.04, 0.008, 0.004μg/mlとなるように調製した標識化抗原40(ALP標識Goat由来抗MouseIgG抗体)の溶液(20μl)を加え室温で30分間反応させる。ステップS33において、Nd-B磁石をチューブに5分間接触させてビーズを磁気回収し、PBS40μlで3回洗浄する。ステップS34において発光基質のルミホス530を50μlを添加する。ステップS35で、20分後の発光強度を測定した。
(1)磁性細菌粒子(BMPs)上への抗体固定化濃度の検討
図11のステップS41において、プロテイン AのIgG結合部位であるZZドメイン発現株から得たZZドメイン38をディスプレイした磁性細菌粒子33'(ZZ-BMPs)を蛍光色素36(Cy3)、ビオチン34(biotin)で標識したビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37'(Cy3-[ZZ-BMP]-biotin )(20 μg)に、ステップS42において、種々の濃度のマウス由来抗ヒトPSA抗体60(IgG2a)の溶液(0-60 μg/ml、20 μl)を加え、室温で1時間撹拌してインキュベーションを行い前記抗体60を固定化した。この抗体固定化ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子61をPBSで3回洗浄した後に、ステップS43において、抗体として、アルカリフォスファターゼ(ALP)標識Goat由来抗マウス IgG抗体62(10 μg/ml、20 μl)を添加し、室温で30分撹拌してインキュベーションを行った。PBSで3回洗浄した後にルミホス530(3.3×10-4 mol/l、80 μl)を加え、種々の濃度の前記抗体60溶液を用いた前記抗体固定化ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子61について発光強度を測定した。
図11に示すように、ステップS42において、ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37'(Cy3-[ZZ-BMP]-biotin) (1 mg)上にマウス由来抗ヒト PSA抗体60(40 μg/ml、1 ml)を加え、室温で1時間撹拌することで抗体を固定化して、抗体固定化ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子61を調製した。ステップS44において、この抗体固定化ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子61(Cy3-[ZZ-BMP]-biotin)懸濁液を粒径5 μmの粒子状担体32としてのストレプトアビディン標識ポリスチレンビーズに逐次添加して抗体固定化された磁性粒子保持担体63を調製した。ステップS45において、この抗体固定化された磁性粒子保持担体63(2.0×106 beads)にPSA(抗原)64(400 μg/ml、40 μl)を添加し、室温で30分間撹拌してインキュベーションを行って、PSAが結合した抗体固定化磁性粒子保持担体65が調製される。PBSで3回洗浄した後、ステップS46において、種々の濃度のALP標識マウス由来抗ヒトPSA抗体66の溶液(40 μl)を添加し室温で30分間撹拌してインキュベーションを行って、ALPで標識化されたPSA結合抗体固定化された磁性粒子保持担体67を調製した。PBSで3回洗浄した後にビーズ濃度を測定し、1.0×106個のビーズを50 μlのPBSに懸濁し、ルミホス530(3.3×10-4 mol/l、50 μl)を加え、発光強度を測定した。またコントロールとして、PSAを添加せずに同様の操作を行った。
図11に示すように、ステップS44に示すマウス由来抗ヒトPSA抗体60を固定化した抗体固定化磁性粒子保持担体63 (2.0×106 beads)に、ステップS45において、種々の濃度のPSA溶液(40 μl)を添加して、PSAが結合した抗体固定化磁性粒子保持担体65を調製した。PBST(10 mM PBS, 0.05 % tween 20)で3回洗浄した後、ステップS46において、ALP標識マウス由来抗ヒトPSA抗体66の抗体溶液(10 μg/ml、40 μl)を添加して、ALP標識化PSA結合抗体固定化磁性粒子保持担体67を調製した。PBSTで3回洗浄した後にTris-HCl緩衝液(5 μl)に懸濁し、ルミホス530(3.3×10-4 mol/l、100 μl)を加え、発光強度を測定した。
前記ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子37(Cy3-BMP-biotin)の懸濁液(50 μg/ml、2 ml)を、その表面が前記受容体としてのストレプトアビディン13によって被覆されているポリスチレンのマイクロサイズ、ここでは、例えば、直径5 μmの、粒子状担体32であるストレプトアビディン標識ポリスチレンビーズの懸濁液(3.0×106 beads/ml、10 ml)に添加し、ピペッティングにより分散状態を保ちながら15分間反応させる操作を10回繰り返して、前記第3の実施の形態に係る磁性粒子保持担体31を調製した。
次に、前記磁性粒子保持担体処理装置(全自動免疫測定装置SX-8PC)による磁性粒子保持担体の磁気分離効率の評価を行う。実験1と同様の操作で磁気分離・再懸濁(1回乃至5回繰り返して)を経て、前記次工程のウェル71bに運搬された磁性粒子保持担体31の濃度を測定した。この時、磁気分離前の磁性粒子保持担体31 は1.0×107 個とし、 磁性粒子保持担体31を懸濁する緩衝液として非イオン性界面活性剤であるアデカノール(ADK)を0.05 %含むPBS(200 μl)を用いた。磁気分離効率は以下の式で計算した。
磁気分離効率=(磁気分離後の磁性粒子保持担体濃度/磁気分離前の磁性粒子保持担体濃度)×100(%)
1.0×107個のアミノ基83が提示された粒子状担体82(Spherotech, Inc. のAP-60-10、直径6〜8 μm)を20400 Gで10分間、遠心分離した。その後、100 μgの前記架橋剤成分88b(Sulfo-SMCC)を含む0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH7.0)を加え室温で1時間反応させた。1 mlのPBSで3回洗浄して得られた粒子を架橋剤成分導入粒子状担体89とする。
架橋剤としてSulfosuccinimidyl-6'-(biotinamido)-6-hexanamido hexanote(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin)(PIERCEより購入)を用い、蛍光色素としてCy3 bis NHS ester(Amersham Biosciencesより購入)を用いた。マイクロビーズには、Spherotech,Inc.のStreptavidin Polystyrene Particles 5.0-5.9μmを利用した。免疫測定を行う際に利用した抗体として、Rabbit由来抗Goat IgG抗体をSIGMA-ALDRICHより、アルカリフォスファターゼ(ALP)標識Rabbit由来抗Goat IgG抗体をSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,Inc.より、ALP標識Goat由来抗Mouse IgG抗体をベックマン・コールター株式会社より購入した。またALPの発光基質には和光純薬株株式会社のLumigen PPD,4-Methoxy-4(3-phosphatephenyl)spiro[1,2-dioxeteane-3,2'adamantane]disodium salt(ルミホス530:3.3×10-4M)を用いた。磁性細菌組み換え体の培養、破砕の際、SIGMA-ALDRICHのAmpicillin sodium salt及びProtease inhibitor cocktailを用いた。その他の試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は蒸留水及び蒸留水を日本ミリポア株式会社のMilliQ Labで処理した超純水を用いた。
磁性細菌の集菌及び磁性細菌粒子(BMPs)の洗浄には株式会社トミー精工の高速遠心機CX-210、有限会社大岳製作所のフレンチプレス5501M、株式会社柴田科学の超音波洗浄機SU-25を利用した。磁性細菌粒子(BMPs)やマイクロビーズ等の顕微鏡観察にはオリンパス株式会社のシステム生物顕微鏡BX51、及び株式会社日立ハイテクノロジーズの走査型電子顕微鏡S-2250Nを用いた。また、調製した磁性粒子保持担体の蛍光強度分布の解析にはベックマン・コールター株式会社の自動細胞解析分取装置(フローサイトメーター) EPICS ALTRAを使用した。発光強度測定にはアロカ株式会社のルミノメーター Lucy-2を利用した。磁性粒子保持担体の分離、濃縮には株式会社トミー精工の微量高速冷却遠心機MX-300及びTX-160を用いた。磁性粒子の自動磁気分離にはプレシジョン・システム・サイエンス株式会社の全自動免疫測定装置SX-8PCを用いた。
12,22,32,82 粒子状担体
14,24 超磁性単一ドメイン粒子(磁性粒子)
33,33’,84 磁性細菌粒子(磁性粒子)
37,37’ ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子
39,61 抗体固定化ビオチン・蛍光色素導入磁性細菌粒子
90 蛍光色素・架橋剤成分導入磁性細菌粒子
Claims (16)
- 非磁性のマイクロサイズの粒子状担体と、
該担体の表面を覆うように保持された多数のナノサイズの磁性粒子とを有し、前記磁性粒子は、磁性細菌粒子からなるとともに、
前記磁性細菌粒子は、所定の機能性ペプチドまたは機能性タンパク質を発現し、
前記磁性細菌粒子が1または複数種類の標識物質を有する磁性粒子保持担体。 - 前記担体は、表面にリガンドまたは受容体を有し、前記磁性細菌粒子はその受容体またはそのリガンドを有し、該リガンドと該受容体との結合によって、前記磁性細菌粒子を前記担体に保持した請求項1に記載の磁性粒子保持担体。
- 前記磁性細菌粒子を共有結合、水素結合、または静電的結合によって前記担体に保持した請求項1または請求項2に記載の磁性粒子保持担体。
- 前記標識物質はリガンドまたは受容体を有し、前記磁性細菌粒子がその受容体またはリガンドを有し、該リガンドと該受容体との結合によって、前記標識物質を前記磁性細菌粒子に導入した請求項1に記載の磁性粒子保持担体。
- 前記標識物質を共有結合、水素結合、または静電的結合によって前記磁性細菌粒子に導入した請求項1または請求項4に記載の磁性粒子保持担体。
- 前記受容体またはリガンドは前記磁性細菌粒子において発現されている請求項1または請求項4に記載の磁性粒子保持担体。
- 前記磁性細菌粒子は磁性細菌より単離された請求項1、または請求項2乃至請求項6のいずれかに記載の磁性粒子保持担体。
- 前記機能性ペプチドまたは機能性タンパク質は、前記磁性細菌粒子の外表面を覆う脂質二重膜上に発現したアンカータンパク質と融合した請求項1に記載の磁性粒子保持担体。
- マイクロサイズの非磁性の粒子状の担体に多数のナノサイズの磁性粒子を表面を覆うように保持した磁性粒子保持担体を調製する方法であって、
前記磁性粒子および/または前記担体に対する加工処理を行う加工処理工程と、
多数の前記磁性粒子、および多数の担体を液中に懸濁させる懸濁工程とを有するとともに、前記磁性粒子は磁性細菌粒子からなり、前記加工処理工程は、該磁性細菌粒子に特定の機能性ペプチドまたは機能性タンパク質を発現する発現工程を有する磁性粒子保持担体調製方法。 - 前記加工処理工程は、前記担体にリガンドまたは受容体を導入する担体導入工程、および/または、前記磁細菌性粒子にその受容体またはそのリガンドを導入する磁性粒子導入工程を有する請求項9に記載の磁性粒子保持担体調製方法。
- 前記懸濁工程において、共有結合、水素結合または静電的結合を行わしめる請求項9または請求項10に記載の磁性粒子保持担体調製方法。
- 前記加工処理工程において、前記磁性細菌粒子に、標識物質を導入する工程を有する請求項9、請求項10または請求項11のいずれかに記載の磁性粒子保持担体調製方法。
- 前記標識物質にリガンドまたは受容体を導入する工程、および/または、前記磁性細菌粒子にその受容体またはそのリガンドを導入する工程を有する請求項12に記載の磁性粒子保持担体調製方法。
- 前記加工処理工程において、共有結合、水素結合または静電的結合を行わしめる請求項13に記載の磁性粒子保持担体調製方法。
- 前記加工処理工程において、前記受容体またはリガンドを前記磁性細菌粒子において発現させる工程を有する請求項13または請求項14に記載の磁性粒子保持担体調製方法。
- 磁性細菌から磁性細菌粒子を単離する単離工程をさらに有する請求項9、または請求項10乃至請求項15のいずれかに記載の磁性粒子保持担体調製方法。
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