ES2660295T3 - Método de capturar bacterias sobre microesferas revestidas de polilisina - Google Patents

Abstract

Un complejo de soporte sólido de polímero sintético de la fórmula general (I):**Fórmula** donde n es de 10 a 100, que comprende un polímero sintético que comprende unidades monoméricas de repetición de polilisina, un enlazador, y un soporte sólido, donde el enlazador es sulfo-succidinimil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1- carboxilato (sSMCC), y donde el polímero sintético forma un complejo con el soporte sólido mediante el enlazador y dicho complejo de soporte sólido de polímero sintético es eficaz para unirse a los microorganismos.

Description

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DESCRIPCION

Método de capturar bacterias sobre microesferas revestidas de polilisina Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a composiciones, métodos y kits para la detección, separación y/o aislamiento de microorganismos. Específicamente, la divulgación se refiere a composiciones, métodos, y kits para utilizar microesferas revestidas de polilisina para capturar microorganismos tales como bacterias.

Antecedentes

Los microorganismos tales como bacterias y virus en muestras biológicas son difíciles de detectar a bajas concentraciones, y usualmente requieren una inducción o tiempos de incubación largos antes de que se pueda llevar a cabo un análisis adicional. Actualmente, la identificación de microorganismos en muestras biológicas es un proceso laborioso. Para la detección bacteriana, las muestras de fluidos corporales deben incubarse durante largos periodos de tiempo antes de que se puedan identificar positivamente cualesquiera cultivos bacterianos. Los métodos que pueden detectar bacterias a concentraciones ultrabajas sin procesos de incubación o amplificación laboriosos tienen, de esta manera, algunas ventajas en el diagnóstico clínico, seguridad alimentaria, biodefensa, y/o aplicaciones de vigilancia ambiental.

Actualmente, la identificación de bacterias en orina es un proceso laborioso. Las muestras de orina deben incubarse durante días antes de que se puede realizar una identificación positiva de cualesquiera cultivos bacterianos.

El documento EP1108743 A2 describe partículas de unión a virus y métodos relacionados para separar o detectar virus utilizando dichas partículas.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones y se dirige a una novedosa estrategia que utiliza microesferas revestidas de polilisina para capturar y detectar microorganismos y/o patógenos a concentraciones muy bajas. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos y composiciones útiles para minimizar el tiempo necesario para identificar positivamente la presencia de microorganismos tales como bacterias en muestras biológicas en un algo parecido a "tiempo real". La divulgación proporciona compuestos, composiciones y métodos para preparar y utilizar los compuestos y atraer e inmovilizar bacterias sobre una matriz de soporte sólido. Esta matriz de soporte sólido, a su vez, puede concentrarse (concentrando por tanto los microbios tales como bacterias) lo que conduce a una identificación positiva y rápida de las bacterias en un tiempo corto tras obtener la muestra. Esta divulgación proporciona métodos específicos y eficaces para la separación y/o la detección microbiana.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a composiciones que comprenden microesferas revestidas de poli- L-lisina, y a sus métodos de uso para la detección, separación por afinidad, enriquecimiento, y/o reducción de la concentración de microorganismos, por ejemplo, patógenos, en una muestra. Las microesferas pueden incluir microesferas de proteínas funcionalizadas, o partículas magnéticas funcionalizadas, donde los grupos funcionales pueden unirse a dichos microorganismos mediante interacciones de tipo receptor-ligando, antígeno-anticuerpo, iónica, o metal-ligando. Se describen también en el presente documento kits que comprenden microesferas revestidas de poli-L-lisina.

La presente divulgación describe también un kit para detectar o reducir patógenos en una muestra, que comprende un receptáculo o compartimento que contiene una cantidad adecuada de soportes sólidos funcionalizados revestidos con poli-L-lisina, que pueden unirse a dichos microbios y/o patógenos. En algunos aspectos de la invención, los soportes sólidos son perlas o partículas, que pueden incluir, por ejemplo, microesferas o nanopartículas. En algunos aspectos, las perlas y partículas tales como microesferas o nanopartículas pueden ser magnéticas.

En un aspecto, como se define en las reivindicaciones, la presente divulgación proporciona un complejo de soporte sólido de polímero sintético de la fórmula general (I):

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donde n es de 10 a 100, donde el complejo de soporte sólido de polímero sintético comprende un polímero sintético que comprende unidades monoméricas de repetición de polilisina, un enlazador, y un soporte sólido, donde el enlazador es sulfo-succidinimil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sSMCC), y donde el polímero sintético forma un complejo con el soporte sólido mediante el enlazador y dicho complejo de soporte sólido de polímero sintético es eficaz para unirse a los microorganismos. En una realización, el soporte sólido comprende microesferas, que pueden ser microesferas de proteínas.

En un aspecto, como se define en las reivindicaciones, la divulgación proporciona un método de detectar, capturar, concentrar o reducir microorganismos en una muestra de ensayo que comprende:

a) proporcionar complejos de soporte sólido de polímero sintético como se define en el presente documento;

b) poner en contacto la muestra con los complejos de soporte sólido de polímero sintético, por lo cual, los complejos de soporte sólido de polímero sintético se unen a los microorganismos;

c) separar los complejos de soporte sólido de polímero sintético en dicha muestra; y

d) detectar, capturar, concentrar o reducir los microorganismos que se unen a los complejos de soporte sólido de polímero sintético.

En una realización, los microorganismos son bacterias gram positivas. En una realización, los microorganismos son bacterias gram negativas. En una realización, los microorganismos se seleccionan entre Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gallolyticus, Escherichia coli, y Proteus mirabilis. De acuerdo con todas las realizaciones, el enlazador es succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sSMCC). En una realización, el complejo de soporte sólido de polímero sintético comprende además una tinción fluorescente que es una tinción de ácido nucleico con fluorescencia de color verde. En una realización, el soporte sólido comprende microesferas. En una realización, las microesferas comprenden un revestimiento de albúmina de suero humana.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un proceso para preparar un complejo de soporte sólido de polímero sintético de fórmula general (I) que comprende las etapas:

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donde n es de 10 a 100,

a) hacer reaccionar polilisina con (N-succinimidil S-acetiltioacetato) (II) para dar el compuesto de fórmula (III):

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b) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) de la etapa a) con un agente desprotector para dar el compuesto de fórmula (IV):

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c) hacer reaccionar sulfo-succinimidil-4-(A/-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sSMCC) con microesferas 15 revestidas con albúmina de suero humana para producir el compuesto de fórmula (V):

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cSHCC

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Microcsfcra revestida con albúmina de suer o humano

(V)

d) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (IV) de la etapa b) con el compuesto de fórmula (V) de la etapa c) para producir el complejo de soporte sólido de polímero sintético de acuerdo con la fórmula general (I).

En una realización, el agente desprotector es clorhidrato de hidroxilamina.

En determinadas realizaciones, las microesferas son microesferas magnéticas y la separación se consigue mediante la agregación del complejo de microesfera-especie en un campo magnético. En determinados ejemplos fuera del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la PLL se une a la microesfera mediante un enlace de avidina o estreptavidina. En determinadas realizaciones, la muestra es un líquido seleccionado entre cualquiera de los siguientes: fluidos corporales; orina, sangre, suero, plasma, fluido espinal, fluido sinovial, saliva, orina, semen, homogenados de células y/o tejidos. En determinadas realizaciones, la muestra contiene una especie de una bacteria. En determinadas realizaciones, la especie es una bacteria gram-positiva. En determinadas realizaciones, la especie es una bacteria gram-negativa. En determinadas realizaciones, la bacteria es Staphylococcus o Enterococcus.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición para detectar una especie en una muestra, que comprende un complejo de soporte sólido de polímero sintético como se define en el presente documento.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición para concentrar o reducir una especie en una muestra, que comprende un complejo de soporte sólido de polímero sintético como se define en el presente documento. En determinadas realizaciones, las microesferas son microesferas magnéticas y la separación se consigue mediante la agregación del complejo de microesfera-especie en un campo magnético.

En determinados ejemplos fuera del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la PLL se une a la microesfera mediante un enlace de avidina o estreptavidina. En determinadas realizaciones, la muestra es un líquido de un fluido corporal seleccionado entre el grupo que consiste en sangre, suero, plasma, fluido espinal, fluido sinovial, saliva, orina, semen, homogenados de células y/o tejidos. En determinadas realizaciones, el peso molecular de la poli-L- lisina es de aproximadamente 4200 a aproximadamente 130.000 kd. En determinadas realizaciones, el peso molecular de la poli L-lisina es de aproximadamente 68000 kd.

Se describe también en el presente documento un kit que comprende el complejo de soporte sólido de polímero sintético de la reivindicación 1 e instrucciones para su uso.

Además, se describe en el presente documento un dispositivo que está configurado para llevar a cabo el método para detectar o reducir microorganismos, que comprende cualquiera de los anteriores métodos.

Descripción detallada de la invención

En general, existen dos estrategias para fabricar estructuras multifuncionales basadas en micropartículas magnéticas o no magnéticas. La primera estrategia es la funcionalización molecular. Se pueden usar moléculas funcionales (por ejemplo, anticuerpos, ligandos, o receptores) para revestir las micropartículas magnéticas o no magnéticas y hacerlas interactuar con una entidad biológica con elevada afinidad, proporcionando de esta forma un medio controlable de "etiquetado". Tras la funcionalización molecular, las micropartículas magnéticas o no magnéticas funcionales tales como las microesferas ilustrativas pueden transmitir una elevada selectividad y sensibilidad para muchas aplicaciones biológicas. La segunda estrategia general para la fabricación es combinar nanomateriales o micromateriales magnéticos o no magnéticos y otras estructuras funcionales mediante revestimiento secuencial, que produce una única entidad que transmite múltiples funciones a nanoescala o microescala. Se han notificado anteriormente preparaciones de partículas ilustrativas, incluyendo, por ejemplo, el documento US 7.754.444.

Como se define en las reivindicaciones, la presente divulgación proporciona novedosos compuestos, composiciones, y métodos de uso que comprenden varias moléculas de poli-L-lisina que pueden unirse a una superficie sólida mediante enlaces sSMCC, dicho compuesto, composición, y métodos son útiles para la separación, detección, concentración, reducción y/o purificación de microorganismos. La divulgación se basa generalmente, al menos en

parte, en el sorprendente e inesperado descubrimiento de que el compuesto y la composición que comprenden restos de poli-L-lisina o restos similares a poli-L-lisina se pueden modificar para unirse a una superficie sólida pequeña que forma un complejo y someterse a manipulación in situ. La manipulación de la superficie sólida permite la detección, captura, concentración, reducción, separación e identificación de los microorganismos ilustrativos de 5 una muestra (por ejemplo, bacterias).

El compuesto y las composiciones ilustrativas descritas en el presente documento pueden comprender diversos componentes relacionados a continuación de acuerdo con las realizaciones ilustrativas de la presente divulgación. Estas incluyen:

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1) La poli-L-lisina adecuada ilustrativa. La polilisina se usa para unirse a un soporte sólido ilustrativo (por ejemplo, una microesfera). La función de la polilisina es atraer e inmovilizar muestras microbianas tales como 15 bacterias.

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La poli-L-lisina es un homopolímero natural del aminoácido lisina. La fórmula general de la poli-L-lisina es - (C6H12N2O)n- donde "n" tiene normalmente 25-30 subunidades de lisina. Las aminas primarias de cada subunidad de lisina proporcionan a la molécula global una carga positiva neta. Esta carga positiva neta atrae electrostáticamente la carga negativa neta que se encuentra en la mayoría de las paredes de las paredes celulares bacterianas. La poli-L-lisina se ha utilizado históricamente como antibacteriano en alimentos (estatus GRAS en los Estados Unidos) y como fijador en cultivos de tejidos para promover la adherencia celular.

Microesfera - Una microesfera es normalmente cualquier partícula o perla con una relación grande entre el área superficial y el volumen que forma un coloide cuando se mezcla con una solución acuosa. De forma ideal, la partícula puede permanecer en solución durante un periodo de tiempo significativo (necesario para entrar en contacto con las bacterias) dando tiempo para interactuar y atraer las bacterias. Asimismo, una vez que ha transcurrido un tiempo suficiente para atraer las bacterias u otros microorganismos ilustrativos, la partícula puede extraerse a continuación del ambiente acuoso mediante una fuerza externa aplicada (por ejemplo, campo magnético, centrifugación, filtración, campo eléctrico).

En una realización, las microesferas pueden ser una microesfera de proteína, por ejemplo, una microesfera de albúmina de suero humana. En algunas realizaciones, las microesferas son microesferas sin estabilizar que no se han estabilizado, por ejemplo, mediante tratamiento con un agente de reticulación, un agente de curtido (tal como Cr+++ u otro agente de curtido de metal alcalino), o un fijador (tal como un aldehído, por ejemplo, un glutaraldehído o formaldehído). En otras realizaciones, se pueden estabilizar las microburbujas. Las microesferas que no están estabilizadas pueden destruirse de forma ventajosa mediante solubilización con un detergente.

Como se usa en el presente documento, se entiende que microorganismo incluye cualquier organismo procariota (incluyendo bacterias) o organismo microscópico eucariota (incluyendo protozoos, algas, levaduras y hongos), y/o virus. Las bacterias pueden incluir aquellas generalmente conocidas como bacterias patógenas, tales como, por ejemplo, especies de Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Bacillus, Escherichia, Streptococcus, Pseudomonas, Salmonella, Legionella, Enterobacter, etc. En algunas realizaciones, las bacterias son bacterias gram negativas. En otras realizaciones, la muestra es una bacteria gram positiva.

Como se usa en el presente documento, se entiende que un soporte incluye un sólido formado por un material polimérico que tiene, sobre su superficie, un gran número de grupos químicos necesarios para fijar moléculas de interés.

Como se usa en el presente documento, cuantificar se entiende como determinar de una manera exacta la concentración o cantidad del microorganismo de interés en la muestra. Semicuantificar se entiende como determinar de una manera aproximada la concentración del microorganismo de interés en la muestra. Detectar se entiende como determinar la presencia-ausencia del microorganismo de interés en la muestra.

Como se usa en el presente documento, una "muestra" incluye cualquier muestra que se sospecha que contiene el microorganismo. La muestra será generalmente de origen diagnóstico, ambiental y/o animal, y en determinados casos será de fluidos biológicos.

Como se usa en el presente documento, el término "selección" incluye la selección "negativa" y la selección "positiva". Los procesos de selección negativa son procesos donde los componentes no deseados se unen a las partículas de separación mediante afinidad funcionalidad y se aíslan durante el procedimiento, dejando los componentes deseados en la muestra. Por otro lado, los procesos de selección "positiva" incluyen procesos de separación en los componentes deseados se unen a las partículas de separación mediante afinidad funcionalizada y se aíslan durante el procedimiento. En determinadas realizaciones, los procesos de separación se usan para conseguir un enriquecimiento de la muestra deseada o la reducción de la muestra no deseada.

Como se usa en el presente documento, la detección puede implicar, por ejemplo, un ensayo de fluorescencia, un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), microscopio óptico, microscopio de electrones, o una de sus combinaciones.

En algunas realizaciones, la muestra de ensayo biológica incluye un fluido biológico. Los fluidos biológicos son normalmente líquidos a temperaturas fisiológicas y pueden incluir líquidos de origen natural presentes en, que se extraen de, que se expresan o se extraen de otra forma de un sujeto o fuente biológica. Determinados fluidos biológicos se derivan de tejidos, órganos o regiones localizadas concretas y determinados fluidos biológicos diferentes pueden situarse de forma más general o sistémica en un sujeto o fuente biológica. Los ejemplos no limitantes de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y linfa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, fluidos serosos, plasma, linfa, secreciones mucosales de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, leche de mama, lágrimas, y son también adecuados los fluidos de ascitis tales como los asociados con tumores no sólidos. Los ejemplos adicionales incluyen fluidos de la pleura, del pericardio, del peritoneo, abdominales y otras cavidades corporales, y similares. Los fluidos biológicos pueden incluir además soluciones líquidas que entran en contacto con un sujeto o muestra biológica, por ejemplo, medio de cultivo de células y órganos que incluye medio acondicionado de células u órganos, fluidos de lavado y similares. En otras realizaciones, la muestra biológica es suero sanguíneo,

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plasma o el sobrenadante de la orina centrifugada.

En determinadas realizaciones, los compuestos y las composiciones de polilisina ilustrativos adecuados para la captura de bacterias pueden incluir cualesquiera compuestos de poli-L-lisina [HBr] de peso molecular variable, incluyendo, por ejemplo, compuestos que varían desde aproximadamente MW(vis) de 130.000, aproximadamente MW(vis) 68.000, hasta aproximadamente MW(vis) de 4.200 para la funcionalización del material de soporte sólido tal como micropartículas y/o microesferas. Esta composición ilustrativa tiene eficacia en aislar bacterias gram (+) y gram (-). En determinadas realizaciones, los compuestos y composiciones de la divulgación pueden utilizarse en combinación con otros restos de captura, tales como por ejemplo, polimixina B, antilípido A, antígeno, (pAb) dirigido contra E. coli, lisozima, lisozima desactivada, ampicilina, anti-FLIC, cecropina, y bactenecina, según sea necesario para conseguir la detección, separación, concentración, reducción, y/o detección.

Se describe también un kit para la determinación/detección/separación/concentración/purificación de muestras que contienen microorganismos. El alcance de dicha determinación/detección/separación/concentración/purificación puede ser semicuantitativo o cuantitativo; se entiende la determinación semicuantitativa como aquella donde el resultado es una estimación del orden de magnitud de la concentración del microorganismo de interés en la muestra. El kit permite la captura selectiva del microorganismo de interés en muestras acuosas, agua y/o muestras de sangre, su concentración y separación de los componentes restantes de la muestra, y su detección colorimétrica, de una manera sencilla y rápida, siendo posible la determinación in situ. El kit utiliza moléculas vanco-PVA dirigidas contra el microorganismo de interés, inmovilizado sobre su superficie, que en los medios de reacción suministrados se une específicamente al microorganismo de interés que está presente en la muestra.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para detectar microorganismos en una muestra de ensayo que comprende las etapas de: (a) proporcionar complejos de soporte sólido de polímero sintético como se define en el presente documento (b) poniendo en contacto la muestra con los complejos de soporte sólido de polímero sintético durante un periodo de tiempo adecuado por lo cual, los complejos de soporte sólido de polímero sintético se unen a los microorganismos; (c) separar los complejos de soporte sólido de polímero sintético en dicha muestra; y (c) detectar los microorganismos que se han unido a los complejos de soporte sólido de polímero sintético.

En una realización, la sensibilidad de detección del método puede ser al menos tan baja como 10 unidades formadoras de colonias (ufc) de los microorganismos en un mililitro de solución. El método ilustrativo de la presente invención es capaz de detectar cualquiera de aproximadamente 20, 40, 60, 80, o 100 ufc/ml. En otra realización, para virus, el método ilustrativo de la presente invención puede detectar concentraciones al menos tan bajas como de 10 unidades formadoras de placas por un mililitro (ufp/ml) y hasta aproximadamente 100, 500, o 1000 ufp/ml.

En una realización, los microorganismos son patógenos. Como se usa en el presente documento, los patógenos se definen como cualesquiera microorganismos productores de enfermedades. Los patógenos incluyen, aunque no de forma limitativa, bacterias, virus, micoplasmas, algas, amebas, u otros organismos unicelulares. Las bacterias pueden ser tanto Gram positivas como Gram negativas, que pueden capturarse y/o separarse por afinidad. Las bacterias pueden incluir, aunque no de forma limitativa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, estafilococos coagulasa negativos (CNS), E. coli, o enterococos resistentes a la vancomicina (VRE).

La muestra puede ensayarse para ser una muestra clínica, que puede incluir, aunque no de forma limitativa, muestras de fluidos corporales, muestras de frotis, o muestras de hisopo. La muestra puede tomarse también del medio ambiente, que puede incluir, aunque no de forma limitativa, fuentes ambientales tales como agua, aire, o suelo.

Además, la muestra puede tomarse de productos alimenticios, que puede incluir, aunque no de forma limitativa, alimentos líquidos o sólidos que se procesan, concentran, o modifican artificialmente de otra forma. La presente invención puede ser muy beneficiosa para la industria alimentaria, donde se desea la detección sensible de patógenos. Las muestras, tanto si están en forma sólida, líquida, o gaseosa, pueden prepararse de acuerdo con ello (por ejemplo, dilución, disolución, inmersión) con el fin de que estén en forma de solución, para usar en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, biofuncional significa la capacidad de participar en una interacción ligando- receptor, antígeno-anticuerpo, iónica, o metal-ligando. Por lo tanto, biofuncional describe los tipos de interacciones específicas posibles entre las micropartículas/microesferas y microorganismos en la muestra. Las partículas magnéticas biofuncionales pueden ser un conjugado de micropartículas o nanopartículas magnéticas o no magnéticas y un grupo funcional.

En determinadas realizaciones, el soporte sólido puede comprender una microesfera/micropartícula magnética. Las partículas magnéticas pueden estar compuestas de, aunque no de forma limitativa, hierro, metales nobles (tales como oro, plata, platino, o paladio), cobalto, óxidos metálicos, níquel, o sus aleaciones. En una realización, las nanopartículas magnéticas son hierro-platino (FePt), SmCo5, Fe3O4, Fe2O3, FePd, CoPt, SmxCoy@Fe2O3, SmxCoy@Fe3O4, M@Fe2O3, o M@Fe3O4, por lo cual x=1 a 4, y=5 a 20 y M es un metal magnético seleccionado entre el grupo que consiste en cobalto, níquel, hierro, y sus aleaciones magnéticas. En la realización anteriormente

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descrita que implica SmxCoy@Fe2O3, SmxCoy@Fe3O4, M@Fe2O3, y M@Fe3O4, el símbolo "@" indica meramente que las nanopartículas magnéticas tienen un núcleo de SmxCoy o M y una envoltura de Fe2O3 o Fe3O4. Son bien conocidos en la técnica los metales que pueden ser magnéticos. Véase Magnetic Nanoparticles Having Passivated Metallic Cores. El grupo funcional puede ser un antibiótico, ligando, receptor, o complejo metálico.

En una realización, la muestra puede ser una muestra biológica seleccionada entre el grupo que consiste en sangre, suero, fluido fluidos seroso, plasma, linfa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, una secreción mucosal, una secreción vaginal, fluido de ascitis, fluido pleural, fluido pericardial, fluido peritoneal, fluido abdominal, medio de cultivo, medio de cultivo acondicionado y fluido de lavado.

El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por las personas normalmente expertas en la materia al cual puede unirse el anticuerpo, tal como un pocillo de ensayo en una placa de microvaloración, un filtro de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Como alternativa, el soporte puede ser una perla o un disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o plástico tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El complejo de polilisina puede inmovilizarse sobre el soporte sólido usando una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la materia, que se describen ampliamente en la patente y en la bibliografía científica.

En determinadas realizaciones, el resto de polilisina puede contener un resto indicador o marca detectable tal como una enzima, colorante, radionucleido, grupo luminiscente, grupo fluorescente o biotina, o similares. Cualquier resto indicador o marca podría utilizarse con los métodos divulgados en el presente documento siempre que la señal del mismo esté directamente relacionada o sea proporcional a la cantidad de anticuerpo que permanece sobre el soporte tras el lavado. A continuación se determina la cantidad del segundo anticuerpo que permanece unido al soporte sólido utilizando un método adecuado específico para el resto indicador o marca detectable. Para los grupos radioactivos, el recuento por centelleo o los métodos autorradiográficos son generalmente adecuados. Se pueden preparar conjugados de anticuerpos-enzimas utilizando una variedad de técnicas de acoplamiento (a modo de ejemplo, véase Scouten, W. H. (1987) A survey of enzyme coupling techniques. Methods in Enzymology 135, 30-65). Se puede usar el método espectroscópico para detectar colorantes (incluyendo, por ejemplo, productos colorimétricos y reacciones enzimáticas), grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. Se puede detectar biotina utilizando avidina o estreptavidina, acoplarse a un grupo indicador diferente (comúnmente a un grupo radioactivo o fluorescente o una enzima). Se pueden detectar generalmente grupos indicadores de enzimas mediante la adición de un sustrato (generalmente, durante un periodo de tiempo específico), seguido por análisis espectroscópico, espectrofotométrico u otros análisis de los productos de reacción. Se pueden usar patrones y adiciones normalizadas para determinar el nivel de antígeno en una muestra, utilizando técnicas bien conocidas.

Son bien conocidos en la técnica el ADN recombinante normalizado y las técnicas de clonación moleculares utilizadas en los ejemplos.

Aunque se ha descrito la presente invención junto con las realizaciones específicas que se muestran anteriormente, muchas alternativas, modificaciones y sus variaciones serán evidentes a las personas normalmente expertas en la materia.

Ejemplos

Aunque se han descrito anteriormente diversas realizaciones de la presente invención, debe entenderse que se han presentado únicamente a modo de ejemplo, y no de limitación. Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de la invención.

Ejemplo 1

Demostración de la eficacia de una microesfera de albúmina revestida de polilisina ilustrativa que es capaz de capturar microorganismos Gram positivos y Gram negativos.

Síntesis de la microesfera de albúmina revestida de polilisina

Producción de microesferas de albúmina de suero humana al 1% (HSA) Se diluyeron 20 ml de microesferas de albúmina (Human) al 5%, USP [Talecris] hasta el 1% con la adición de 80 ml de solución de cloruro de sodio al 0,9% (p/p). A continuación, se distribuyeron en alícuotas 20 ml de HSA al 1% en cinco tubos de ensayo de polipropileno de 60 cc separados [Falcon]. En serie, cada tubo de ensayo se calentó a 73,5°C en un baño de agua a 80°C, a continuación se sometieron a sonicación con una sonda de diámetro ©" a 20.000 hertzios a un 80% de potencia durante 10 segundos [Digital Sonifier modelo 450; Branson]. Cada solución sonicada se colocó en hielo inmediatamente y se dejó enfriar por debajo de 30°C. Una vez fría, las cinco soluciones sonicadas se combinaron en un recipiente flexible de 150 cc [Flexboy; Stedim]. Los tubos de ensayo Falcon se enjuagaron con solución salina (dos veces) y los enjuagues se añadieron a la solución sonicada combinada en el recipiente Flexboy. A continuación se añadió una solución de azida de sodio al 10% a la solución combinada hasta una concentración final de 0,05% (p/p) para actuar como un conservante. Los contenidos de la bolsa Flexboy se mezclaron a continuación suavemente y se almacenaron en la parte superior derecha en un refrigerador.

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Para lavar el exceso de albúmina en solución lejos de las microesferas, la solución se dejó sedimentar en un refrigerador durante la noche. Durante este tiempo, las microesferas se elevaron a la parte superior de la solución. A continuación se retiró la bolsa Flexboy (cuidadosamente) del refrigerador y la parte líquida de la solución (sin microesferas) drenó desde la bolsa Flexboy. Se añadieron aproximadamente 50 ml de solución salina tamponada con fosfato saturada en aire frío (PBS)/alcohol polivinílico al 0,2% (PVA) en la bolsa Flexboy y se mezclaron suavemente para resuspender las microesferas. A continuación, los contenidos completos de la bolsa Flexboy drenados en una jeringuilla de plástico de 60 cc [Becton Dickinson] se ajustaron con una llave de pasos de plástico de 2 vías. A continuación la solución se refrigeró en una centrífuga refrigerada [Sorvall RT6000B] a 1000 rpm durante 3 minutos a 5°C, momento en el cual, las microesferas se elevaron de nuevo a la parte superior de la solución. La solución sin microesferas se drenó mediante la llave de paso ajustada sobre la parte inferior de la jeringuilla, a continuación se añadieron aproximadamente 50 cc de PBS/PVA saturada en aire frío a las microesferas para resuspender suavemente las microesferas de nuevo. El ciclo centrifugar-drenar-resuspender se repitió dos veces más durante un total de tres lavados separados. El volumen de la suspensión final fue de 30 cc.

Acetilación de polilisina

Se disolvieron 32 mg de poli-L-lisina HBr (peso molecular promedio = 68.300; Sigma] en 2 ml de PBS. Para añadir un sulfhidrilo protegido a la polilisina, se añadieron 52|jl de 6,5 mg/ml(DMSO) de SATA [Pierce] y se sometieron a vortización inmediatamente. Se dejó continuar la reacción durante 2 horas a temperatura ambiente. Esto daría como resultado aproximadamente 3 SATA por molécula de polilisina.

Después de dos horas, la reacción se transfirió a un dispositivo de filtro de centrífuga [Ultra 30K MWCO; Amicon] y se lavó 4X con 4 ml de PBS bajo centrifugación. El volumen final de la reacción lavada fue de aproximadamente 0,160 ml.

Para desproteger los sulfhidrilos, se añadieron 16|jl de una solución 500mM de HCl de hidroxilamina [Pierce] a la solución de la polilisina en SATA, a continuación se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. La reacción se lavó 4X con PBS/EDTA 10 mM bajo centrifugación. El volumen final de la reacción lavada se mantuvo a 4 ml.

Activación de las microesferas con sSMCC

Se transfirieron 10 mg de sulfo-SMCC en polvo [Pierce] directamente en 10 cc de microesferas HSA al 1% bajo vortización constante. Se dejó continuar esta reacción en hielo durante 30 minutos con mezclado intermitente para mantener las microburbujas en suspensión a través de la reacción. Después de A hora, las microesferas se lavaron 3X en una jeringuilla de 30 cc (con llave de paso) con 20 cc de PBS/PVA bajo centrifugación como se ha descrito anteriormente. Tras el lavado final, se drenó todo el líquido de la jeringuilla para dejar únicamente una capa pura de microesferas por detrás de la jeringuilla.

Adición de polilisina-SH a microesferas de sSMCC

Inmediatamente después del lavado final de la polilisina-SH, se añadieron los 4 ml de la solución a la capa de microesferas de sSMCC puras bajo vortización constante. Se dejó continuar esta reacción en hielo durante 2 horas con mezclado intermitente para mantener las microesferas en suspensión. Después de 2 horas, las microesferas se lavaron 3X en una jeringuilla de 30 cc (con llave de paso) con 20 cc de PBS/PVA bajo centrifugación como se ha descrito anteriormente. Tras el lavado final, se resuspendieron las microesferas en 10 cc de PBS/PVA. A continuación se almacenaron las microesferas en un refrigerador hasta que se necesitaron.

Atracción de bacterias con microesferas revestidas con polilisina

Preparación de bacterias Gram positivas y Gram negativas

Cultivos de Escherichia coli0157:h7 (gram negativa), Proteus mirabilis (gram negativa), Staphylococcus epidermidis (gram positiva), y Streptococcus gallolyticus (gram positiva) se iniciaron a partir de cultivos de colonias de placas conocidas y se incubaron en caldo nutriente (P. mirabilis únicamente) [IPM Scientific] o caldo LB (los demás) [IPM Scientific] a 37°C durante la noche. se transfirió 1 ml de cada solución bacteriana en tubos de ensayo de plástico de 1,5 ml separados y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. La centrifugación formó un aglomerado de bacterias en la parte inferior de cada tubo de ensayo. Todo el líquido anterior del aglomerado bacteriano se eliminó mediante succión con 1 ml de PBS reciente. Cada aglomerado bacteriano se resuspendió en el PBS mediante el vórtice. A continuación se tiñeron las células añadiendo 2pl de Syto 13, una tinción fluorescente verde de ácidos nucleico [Molecular Probes], se dejaron incubar durante A hora en la oscuridad a temperatura ambiente, a continuación se lavaron 3X con 1 ml de PBS mediante centrifugación. Las células se volvieron a suspender en un volumen final de 1 ml de PBS.

5

10

15

20

25

Adición de microesferas revestidas con polilisina a bacterias

se añadieron 200 |jl de microesferas revestidas con polilisina por separado a 200 |jl de los cultivos de E. coli, P. mirabilis, S. epidermidis, y S. gallolyticus, se sometieron a vortización, a continuación se dejaron reaccionar durante A hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Como control negativo, se añadieron microesferas de HSA al 1% no revestidas con polilisina en las mismas relaciones a las 4 bacterias y se incubaron en las mismas condiciones. Después de A h., ambas muestras no revestidas y revestidas con polilisina se lavaron 4X con PBS/PVA mediante centrifugación y la recuperación/lavado de las microesferas que flotaban en la parte superior. Después del cuarto lavado, se volvieron a suspender las microesferas en un volumen final de 500 jl.

Resultados

10 jl de cada muestra se transfirieron a un porta de vidrio de microscopio y se superpusieron con un cubre de vidrio. Se examinó cada muestra en primer lugar bajo luz visible para verificar la presencia y la integridad de las microesferas, a continuación bajo campo oscuro (iluminado con una lámpara de mercurio filtrada) para ver la fluorescencia. En la tabla 01 se presentan las observaciones visuales:

Tabla 01 Presencia de bacterias fluorescentes con microesferas revestidas con polilisina

Muestra

Bacterias Observación de las microesferas Observación de las bacterias

Microesferas + polilisina

E.coli0157:h7 aspecto grumoso muchas bacterias fluorescentes presentes

Microesferas + polilisina

P. Mirabilis aspecto grumoso muchas

Microesferas + polilisina

S. epidermidis aspecto grumoso muchas

Microesferas + polilisina

S. gallolyticus aspecto grumoso muchas

Microesferas únicamente (control negativo)

E.coii0157:h7 monodispersas escasas

Microesferas únicamente (control negativo)

P. Mirabilis monodispersas escasas

Microesferas únicamente (control negativo)

S. epidermidis monodispersas escasas

Microesferas únicamente (control negativo)

S. gallolyticus monodispersas escasas

Con respecto a la tabla anterior, es evidente que cuando las bacterias se exponen a microesferas de albúmina que se han revestido con polilisina o dejado al descubierto (sin revestir), las 4 bacterias en este experimento son atraídas preferentemente por la polilisina en las microesferas revestidas.

Basándose en los datos anteriores, la presencia de polilisina sobre la superficie de una microesfera de albúmina es capaz y es eficaz para capturar bacterias gram positivas y bacterias gram negativas en solución.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un complejo de soporte sólido de polímero sintético de la fórmula general (I):

   imagen1

   donde n es de 10 a 100,

   que comprende un polímero sintético que comprende unidades monoméricas de repetición de polilisina, un enlazador, y un soporte sólido, donde el enlazador es sulfo-succidinimil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1- carboxilato (sSMCC), y donde el polímero sintético forma un complejo con el soporte sólido mediante el enlazador y dicho complejo de soporte sólido de polímero sintético es eficaz para unirse a los microorganismos.
2. 2. El complejo de soporte sólido de polímero sintético de la reivindicación 1, donde el soporte sólido comprende una microesfera, opcionalmente, donde la microesfera comprende un revestimiento de albúmina de suero humana.
3. 3. Un método de detectar, capturar, concentrar o reducir microorganismos en una muestra de ensayo que comprende:

   a) proporcionar complejos de soporte sólido de polímero sintético de acuerdo con la reivindicación 1 o 2;

   b) poner en contacto la muestra con los complejos de soporte sólido de polímero sintético, por lo cual, los complejos de soporte sólido de polímero sintético se unen a los microorganismos;

   c) separar los complejos de soporte sólido de polímero sintético en dicha muestra; y

   d) detectar, capturar, concentrar o reducir los microorganismos que se unen a los complejos de soporte sólido de polímero sintético.
4. 4. El método de la reivindicación 3, donde los microorganismos son bacterias.
5. 5. El método de la reivindicación 4, donde los microorganismos son bacterias gram positivas o bacterias gram negativas.
6. 6. El método de la reivindicación 5, donde los microorganismos se seleccionan entre Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gallolyticus, Escherichia coli, y Proteus mirabilis.
7. 7. El método de la reivindicación 3, donde el complejo sólido de polímero sintético comprende además una tinción fluorescente.
8. 8. El método de la reivindicación 7, donde la tinción fluorescente es una tinción de ácido nucleico con fluorescencia de color verde.
9. 9. El método de la reivindicación 3, donde el soporte sólido es una microesfera que comprende opcionalmente un revestimiento de albumina de suero humana.
10. 10. El método de la reivindicación 9, donde la microesfera es una microesfera magnética y se consigue la separación mediante la agregación de los complejos de soportes sólidos de polímeros sintéticos unidos a microorganismos bajo un campo magnético.
11. 11. El método de la reivindicación 3, donde la muestra es un fluido corporal seleccionado entre el grupo que consiste en orina, sangre, suero, plasma, fluido espinal, fluido sinovial, saliva, orina, semen, homogenados de células y tejidos.

    5 12. Un proceso para preparar un complejo de soporte sólido de polímero sintético de fórmula general (I) que

    comprende las etapas:

    imagen2

    10 donde n es de 10 a 100,

    a) hacer reaccionar polilisina con (N-succinimidil S-acetiltioacetato) (II) para dar el compuesto de fórmula (III):

    imagen3

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    b) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) de la etapa a) con un agente desprotector para dar el compuesto de fórmula (IV):

    imagen4

    c) hacer reaccionar sulfo-succ¡n¡m¡d¡l-4-(A/-maleim¡domet¡l)c¡clohexano-1-carbox¡lato (sSMCC) con microesferas

    revestidas con albúmina de suero humana para producir el compuesto de fórmula (V):

    tSMCC

    6

    Microesfera revestida con albúmina de suero humano

    (V)

    5 d) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (IV) de la etapa b) con el compuesto de fórmula (V) de la etapa c) para producir el complejo de soporte sólido de polímero sintético de acuerdo con la fórmula general (I).
12. 13. El proceso de la reivindicación 12, donde el agente desprotector es clorhidrato de hidroxilamina.

    10 14. Una composición que comprende un complejo de soporte sólido de polímero sintético de acuerdo con la

    reivindicación 1, opcionalmente donde:

    (i) es soporte sólido es una microesfera, opcionalmente una microesfera magnética; y/o

    (ii) el peso molecular de la poli-L-lisina es de aproximadamente 4200 a aproximadamente 130.000 kd.

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