KR20010101573A - 핵산 리간드의 자동 발생을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

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도미니크 에이. 지치
로버트 제니슨
다니엘 제이. 슈네이더
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소마로직, 인크.
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Abstract

본 발명은 자동화 SELEX를 수행하기 위한 방법 및 장치를 포함한다. 상기 SELEX의 단계를 컴퓨터로 제어된 카티션 로봇 조작에 의해 작업 표면상의 하나 이상의 작업 스테이션에서 수행된다.

Description

핵산 리간드의 자동 발생을 위한 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR THE AUTOMATED GENERATION OF NUCLEIC ACID LIGANDS}
수년 동안 핵산은 일차적으로 정보적인 역할만을 가진다는 것이 기본 신념이였다. SELEX 공정으로 명명된 지수 축적에 의한 리간드의 계통적 진화(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)로서 알려진 방법을 통해 핵산이 단백질과 다르지 않은 3차원의 구조적 다양성을 가지고 있다는 것이 명확해졌다. 상기 SELEX 공정은 타겟 분자에 고특이성 결합을 갖는 핵산 분자의 시험관내 진화에 대한 방법이고, 1990년 6월 11일에 "지수 축적에 의한 핵산의 계통적 진화"라는 명칭으로 출원되었고 현재는 포기된 미국특허출원번호 제07/536,428호, 1991년 6월 10일에 "핵산 리간드"라는 명칭으로 출원되어 현재 미국특허번호 제5,475,096호로 남아 있는 미국특허출원번호 제07/714,131호, 1992년 8월 17일에 "핵산 리간드의동정방법"이라는 명칭으로 출원되어 현재 미국특허번호 제5,270,163호(WO 91/19813 참조)로 남아 있는 미국특허출원번호 제07/931,473호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 특별히 포함된다. 본 명세서에서 SELEX 특허출원으로 합쳐서 언급되는 이들 출원 각각은 임의의 요구된 타겟 분자에 핵산 리간드를 만들기 위한 신규한 방법을 기초부터 설명한다. 상기 SELEX 방법은 핵산 리간드로 언급되고, 각각의 리간드는 독특한 시퀀스를 가지며, 요구된 타겟 화합물 또는 분자에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는 한 부류의 생성물을 제공한다. 각각의 SELEX-동정된 핵산 리간드는 주어진 타겟 화합물 또는 분자의 특이 리간드이다. 상기 SELEX 공정은 핵산이 다양한 2- 및 3-차원 구조를 형성할 수 있는 충분한 용량과 모노머인지 폴리머인지 상관없이 실질적으로 임의의 화학 화합물를 갖는 리간드(특이 결합쌍을 형성)로서 작용하는 그들의 모노머내에서 유용한 충분한 화학적 다양성을 갖는 다는 독특한 관점에 기초한다. 임의의 크기의 분자 또는 조성물은 타겟으로서 제공할 수 있다.
상기 고친화성 결합의 적용에 사용된 SELEX 공정은 동일한 일반 선별 스케임을 사용하여 결합 친화성과 선택성의 실질적으로 요구된 임의의 기준을 얻기 위해 후보 올리고뉴클레오티드의 혼합물로부터의 선별을 포함하고 및 결합, 분리 및 증폭의 계단식 반복을 포함한다. 바람직하게 랜덤화된 시퀀스의 세그먼트를 포함하는 핵산의 혼합물로부터 시작해서, 상기 SELEX 방법은 혼합물을 결합하기 좋은 조건하에서 접촉하는 단계, 비결합된 핵산을 타겟분자와 특이적으로 결합하는 핵산분자들로부터 분리하는 단계, 핵산-타겟 복합체를 해리하는 단계, 리간드 풍부한 핵산 혼합물을 얻기 위해 핵산-타겟 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭하는 단계, 이어서 결합, 분리, 해리 및 증폭 단계를 수회 반복하여 타겟 분자에 고특이 고친화성 핵산 리간드를 요구된 만큼 얻는 단계를 포함한다.
본 발명자들에 의해, 상기 SELEX 방법은 화학 화합물로서 핵산이 광범위한 어레이(array)의 형태, 크기 및 배치(configuration)를 형성할 수 있고, 생물 시스템중의 핵산에 의해 보여진 것 보다 결합과 다른 작용의 레퍼터리를 더 넓게 할 수 있다는 것을 보여준다는 것을 인식하게 되었다.
본 발명자들은 SELEX 또는 SELEX 유사 공정은 핵산 리간드가 임의의 주어진 타겟을 위해 동정될 수 있는 것과 유사한 방식으로 임의의 선별된 반응을 촉진할 수 있는 핵산을 동정하기 위해 사용될 수 있다는 것을 인식하고 있다. 이론적으로, 대략 1013내지 1018핵산의 후보 혼합물내에서, 본 발명자들은 적어도 하나의 핵산은 광범위하게 다양한 물리적 및 화학적 상호작용 각각을 촉진하는 적합한 형태로 존재한다는 것을 가정했다.
기본적인 SELEX 방법은 다수의 특이 목적을 얻기 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, 1992년 10월 14일에 "기본 구조의 핵산을 선별하는 방법"이라는 명칭으로 출원된 미국특허출원번호 제07/960,093호(미국특허번호 제5,707,796호 참조)에는 굽어진 DNA와 같은 특이 구조적 특성을 갖는 핵산 분자를 선별하기 위해 겔 전기영동과 조합된 SELEX 공정의 사용에 대해서 기재되어 있다. 1993년 9월 17일에 "핵산리간드의 광선별(Photoselection of Nucleic Acid Ligands)"의 명칭으로 출원된 미국특허출원번호 제08/123,935호에는 타겟 분자를 결합 및/또는 광가교 및/또는 광불활성할 수 있는 광반응성 기를 포함한 핵산 리간드를 선별하기 위한 SELEX 기본 방법이 설명되어있다. 1993년 10월 7일에 "티오필린과 카페인 사이를 식별하는 고친화성 핵산 리간드(High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine)"의 명칭으로 출원되고, 현재는 포기된 미국특허출원번호 제08/134,028호(미국특허번호 제5,580,737호 참조)에는 밀접하게 관련된 분자들 사이에서 식별할 수 있는 고특이성 핵산 리간드를 동정하는 방법에 대해 기재되어 있고, 이것은 비펩티드성일 수 있고, Counter-SELEX라고 명명된다. 1993년 10월 25일에 "지수 축적에 의해 리간드의 계통적 진화 : 용액 SELEX"의 명칭으로 출원되어, 현재는 포기된 미국특허출원번호 제08/143,564호(미국특허번호 제5,567,588호 참조)에는 타겟 분자에 대해 높은 및 낮은 친화성을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이를 높은 효율로 분리하는 SELEX 기본 방법에 대해서 기재되어 있다.
상기 SELEX 방법은 리간드 상에 개선된 특성, 예를 들면 개선된 시험관 실험내의 안정성 또는 개선된 전달 특성을 부여하는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 고친화성 핵산 리간드의 동정을 포함한다. 이런 변형의 실예로는 리보스 및/또는 인산염 및/또는 염기 위치에서 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드를 포함한 SELEX 공정으로 동정된 핵산 리간드는 1993년 9월 8일에 "변형된 뉴클레오티드를 포함한 고친화성 핵산 리간드"의 명칭으로 출원되어 현재는 포기된 미국특허출원번호 제08/117,991호(미국특허번호 제5,660,985호 참조)에 설명되어 있고,여기에는 피리미딘의 5- 및 2'-위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 함유한 올리고뉴클레오티드가 설명되어 있다. 상기 미국특허출원 제08/134,028호에는 2'-아미노(2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F), 및/또는 2'-O-메틸(2'-OMe)로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한 고특이성 핵산 리간드를 설명한다. 1994년 6월 22일에 " 분자간 친핵성 치환에 의해 공지된 및 신규한 2' 변형된 뉴클레오사이드의 신규한 제조방법"의 명칭으로 출원된 미국특허출원번호 제08/264,029호에는 다양한 2-변형된 피리미딘을 함유한 올리고뉴클레오티드가 기재되어 있다.
상기 SELEX 방법은 1994년 8월 2일에 "지수 축적에 의해 리간드의 계통적 진화 : 화학적 SELEX"의 명칭으로 출원되어 현재 미국특허번호 제5,637,459호로 존재하는 미국특허출원번호 제08/284,063호 및 1994년 4월 28일에 "지수 축적에 의해 리간드의 계통적 진화 : 혼합된 SELEX"로 출원되어 현재 미국특허번호 제5,683,867호로 존재하는 미국특허출원번호 제08/234,997호에 각각 설명된 바와 같이 선별된 올리고뉴클레오티드를 다른 선별된 올리고뉴클레오티드 및 비-올리고뉴클레오티드 작용 유니트와 합치는 것을 포함한다. 이들 출원은 다른 분자의 바람직한 특성을 올리고뉴클레오티드의 넓은 어레이의 형태와 다른 특성, 및 효율적인 증폭 및 반복 특성을 조합한다.
상기 SELEX 방법은 1995년 5월 4일에 "핵산 리간드 복합체"의 명칭으로 출원된 미국특허출원번호 제08/434,465호에 설명된 바와 같이 진단 또는 치료 복합체에서 친유성 화합물 또는 비-면역성의 고분자량 화합물을 선별된 핵산 리간드와 결합하는 것을 더 포함한다. 기본 SELEX 공정의 변형을 설명하는 상기 설명된 특허출원 각각은 이들 전체를 본 명세서에 참조로서 특별히 포함한다.
실질적으로 임의의 타겟 분자를 위한 리간드를 제공하는 SELEX의 독특한 능력이 부여됨에 따라, 자동화되고 생산량을 높이는 핵산 리간드 발생 방법을 갖는 것이 크게 요구되고 있다. 종합적으로 자동화 SELEX로 명명되는 본 명세서에 설명된 방법 및 장치는 작동자의 개입을 거의 없거나 전혀없게 하여 핵산 리간드를 대량 생산할 수 있다. 특히, 본 발명에서 제공된 방법은 고친화성 핵산 리간드를 종전 요구되는 수 주일 또는 심지어 몇달이 걸리는 것을 단 몇일 동안에 루틴하게 발생되도록 한다. 자동화 SELEX 공정의 매우 유사한 특성은 단일 자동화 SELEX 공정 설비중에서 다양한 타겟에 대한 리간드의 동시적인 단리를 허용한다. 유사하게, 자동화 SELEX 방법은 단일 실험에서 많은 다른 선별 조건을 사용하여 단일 타겟에 대한 핵산 리간드를 발생하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 SELEX 방법의 능력을 크게 보강한 것이고, SELEX를 리간드 단리를 위한 일상적인 방법으로 만들것이다.
본 발명은 SELEX 공정을 사용하여 타겟 분자에 대해 특이 기능을 갖는 핵산 리간드를 발생시키는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 설명된 방법은 종래 기술을 사용하여 가능했던 것보다 매우 짧은 시간 안에 그리고 작동자의 개입을 크게 적게하여 핵산 리간드를 발생시킬 수 있다. 본 발명은 작동자의 개입을 거의 없거나 또는 전혀 없게 하여 핵산 리간드를 발생시킬 수 있는 장치를 포함한다.
도 1은 마이크로역가 플레이트에 RNA의 바탕 결합에 대한 블록킹 시약의 효과를 나타낸 것이다. 이하에 설명되는 바와 같이 QPCR로 정량된 이뮬론(Immulon) 1 폴리스티렌 플레이트의 웰에 남아 있는 RNA 분자의 전체 갯수를 다양한 블록킹 시약으로 처리된 웰에 대해서 나타낸다. 블록킹 시약으로는 (1) SHMCK 단독, (2) SuperBlock, (3) SCHMK + Iblock, (4) SCHMK + SuperBlock, (5) SCHMK + 카세인, (6) SCHMK + BSA이 있다.
도 2는 마이크로역가 플레이트에 RNA의 바탕 결합에 대한 완충 시약의 효과를 나타낸다. 이하에 설명되는 QPCR로 정량된 이뮬론 1 플리스티렌 플레이트의 불록화되지 않은 웰에 남아 있는 RNA 분자의 전체 갯수를 다양한 완충 시약, (1) SHMCK + 0.1% Iblock + 0.05% Tween 20(SIT), (2) SHMCK + 0.01% HSA(SA), (3) SCHMK + 0.05% Tween 20(ST), (4) SCHMK + 0.01% HSA + 0.05% Tween 20(SAT), (5) SCHMK을 포함한 용액으로 배양하고 세척한 웰에 대해서 나타낸다.
도 3은 이뮬론 1 폴리스티렌 플레이트에 수동적이며 소수성으로 결합된 쥐의PS-Rg로부터 앞타머(aptamer) 1901의 결합과 EDTA 용출을 나타낸다. 4.0㎎/㎖로 적재된 쥐의 PS-Rg로 코팅된 웰에의32P 표지된 앞타머 1901의 전체 결합은 전체 앞타머 농도(채워진 원)의 함수로서 작성되었다. 이들 각각의 농도에 대한 용출된 앞타머의 양은 채워진 삼각형으로 나타내고, 용출후 단백질 코팅된 웰에 남아 있는 앞타머의 양은 채워지지 않은 사각형으로 나타낸다. 모든 시료는32P 신틸레이션 카운팅에 의해 정량된다.
도 4는 이뮬론 1 폴리스티렌 플레이트에 PS-Rg의 수동적인 흡수량을 나타낸다. 소수성 상호작용(채워진 원)을 통한 단백질 고정화 후에 앞타머 1901을 결합할 수 있는 PS-Rg의 양은 투입된 단백질 농도의 함수로서 나타낸다. 활성 단백질의 양은 앞타머 결합 곡선의 플래토(plateau) 값으로부터 얻는다.
도 5는 자동화된 시험관내 실험의 선별 방법의 진행을 나타낸다. 수동(사각형) 및 자동(원) 실험에 대한 플레이트 웰로부터 용출된 RNA 분자의 갯수는 수행된 SELEX의 5회의 각각에 대해 나타낸 것이다. 단백질 코팅된 웰로부터 용출된 RNA의 양은 채워진 표시로 나타내고, 배경 결합 RNA는 채워지지 않는 표시로 나타내고, 각 회에 사용된 코팅된 단백질의 양은 x 표시로 나타낸다.
도 6은 쥐의 PS-Rg 단백질에 대한 라운드 5 RNA 풀(pool)의 용액 상 결합 곡선을 나타낸다. 자동 SELEX 공정(+)으로 발생된 풍부한 라운드 5 RNA 풀에 대해 측정된 결합 곡선은 시작 랜덤 RNA 풀(채워진 다이아몬드) 뿐만 아니라 수동 공정(채워진 원)과 비교되어 진다.
도 7은 본 발명에 따른 자동화 SELEX를 수행하기 위한 하나의 구현예의 장치의 개략도이다.
도 8은 본 발명에 따른 자동화 SELEX를 수행하기 위한 하나의 구현예의 장치를 위에서 내려다 본 입면도이다.
도 9는 본 발명에 따른 자동화 SELEX를 수행하기 위한 하나의 구현예의 장치를 앞에서 본 입면도이다.
도 10은 본 발명에 따른 자동화 SELEX를 수행하기 위한 하나의 구현예의 장치를 오른쪽에서 본 입면도이다.
본 발명은 실질적으로 임의의 타겟 분자에 대해 핵산 리간드를 자동적으로 발생할 수 있는 방법 및 장치를 포함한다. 이 방법은 자동화 SELEX 방법으로 명명된다. 그의 가장 기본적인 구현예에서, 상기 방법은 SELEX 방법의 개개의 단계가 수행되도록 작업 표면상의 하나 이상의 작업 스테이션으로 시약(reagent)을 이동시키는 로봇 조작을 사용한다. 상기 개개의 단계로는 1) 후보 핵산 리간드를 고형의지지체 상에 고정화된 흥미로운 타겟 분자와 접촉하는 단계; 2) 그렇게 하는 것에 실패한 이들 핵산들로부터 고형의 지지체 상의 타겟 분자와 바람직한 방법으로 상호작용하는 핵산 리간드를 분리하는 단계; 및 3) 타겟 분자와 상호작용하는 핵산 리간드를 증폭하는 단계;를 포함한다. 상기 단계 1) 내지 3)은 자동화 SELEX 방법과 장치에 의해 요구되는 횟수 만큼 수행되고, 얻어진 핵산 리간드는 이어서 단리되고 정제된다.
정의
다양한 용어가 본 발명의 태양과 관련되어 본 명세서에 사용된다. 본 발명의 구성요소에 대한 설명을 명확하게 하기 위해, 다음과 같은 정의가 제공된다.
본 명세서에 사용된 "핵산 리간드"는 타겟에 대한 바람직한 작용을 갖는 비-천연적으로 발생하는 핵산이다. 또한, 핵산 리간드는 때때로 본 출원에서 "앞타머" 또는 "클론"으로서 언급된다. 바람직한 작용은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 타겟의 결합, 타겟의 촉매적 변화, 타겟 또는 타겟의 기능적인 활성을 변형/변경하는 방법으로 타겟과 반응, 자살 억제제에서 타겟에의 공유적 부착, 타겟과 다른 분자 사이의 반응을 촉진하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 작용은 타겟 분자에 대한 특이 결합 친화성이고, 이와 같은 타겟 분자는 Watson/Crick 염기 쌍 또는 삼중 나선형 결합에 우세하게 의존하는 메카니즘을 통해 핵산 리간드에 결합하는 폴리뉴클레오티드 이외의 3차원 화학적 구조이며, 여기서 핵산 리간드는 타겟 분자에 의해 결합되는 공지된 생리학적인 기능을 갖는 핵산이 아니다. 핵산 리간드는 하기와 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 핵산의 후보 혼합물로부터 동정된 핵산을 포함하고, 상기 핵산 리간드는 주어진 타겟의 리간드이다. 상기 방법은 a) 후보 혼합물을 타겟과 접촉하는 단계, 여기서 후보 혼합물과 관계되는 타겟에 대한 증가된 친화성을 갖는 핵산이 후보 혼합물의 나머지로부터 분리되어진다; b) 후보 혼합물의 나머지로부터 증가된 친화성 핵산을 분리하는 단계; 및 c) 핵산의 리간드 풍부한 혼합물을 얻기 위해 증가된 친화성 핵산을 증폭하는 단계를 포함하고, 여기서 타겟 분자의 핵산 리간드는 동정된다.
본 명세서에 사용된, "후보 혼합물"이란 바람직한 리간드를 선별하기 위해 시퀀스가 다른 핵산의 혼합물이다. 후보 혼합물의 소스는 자연적으로 발생하는 핵산 또는 그의 프래그먼트, 화학적으로 합성된 핵산, 효소적으로 합성된 핵산 또는 상기 기술의 조합으로 만들어진 핵산일 수 있다. 본 발명에서, 후보 혼합물은 "40N8 RNA" 또는 "RNA 풀"로 언급된다. 바람직한 구현예에서, 각각의 핵산은 증폭 과정을 촉진하기 위해 랜덤화된 영역을 둘러싸는 고정된 시퀀스를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 "핵산"은 DNA, RNA, 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드, 및 이들의 임의의 화학적 변형중 어느 하나를 의미한다. 변형에는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 부가적인 전하를 포함하는 다른 화학적 기를 제공하는 것, 극성화, 수소 결합, 정전기적 인력 및 핵산 리간드 염기 또는 전체로서 핵산 리간드에 대한 유동화(fluxionality)를 포함한다. 이와 같은 변형은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 2'-위치 슈거 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 푸린 변형, 외향고리 아민에서 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-아이오도-우라실의 치환; 골격 변형, 메틸화, 이소베이스, 이소시티딘 및 이소구아닌 등과 같은 비정상적인 염기-쌍 조합을 포함한다. 변형은 또한 캐핑과 같은 3' 및 5' 변형을 포함한다.
"SELEX" 방법론은 바람직한 방식, 예를 들면 단백질과의 결합과 같은 방식으로 타겟과 상호작용하는 핵산 리간드의 선별과, 이들 선별된 핵산의 증폭과의 조합을 포함한다. 선별/증폭 단계의 선택적인 반복 사이클링은 다량의 핵산을 포함하는 풀로부터 타겟과 강하게 상호작용하는 하나 또는 작은 수의 핵산을 선별하게 한다. 선별/증폭 공정의 사이클링은 선별된 목적이 성취될 때까지 계속되는 것이다. 상기 SELEX 방법론은 SELEX 특허 출원에 설명된 것이다.
"SELEX 타겟" 또는 "타겟"은 리간드가 요구되어지는 흥미있는 임의의 화합물 또는 분자를 의미한다. 타겟은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 폴리사카라이드, 글리코프로테인, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 기질, 대사 물질, 전이상태 동족체, 보조 요인, 억제제, 약, 염료, 영양제, 성장 인자일 수 있고, 제한은 없다.
본 명세서에서 사용된 "고형의 지지체"는 분자가 공유 또는 비공유 결합을 통해 부착될 수 있는 임의의 표면으로서 정의된다. 이것은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 멤브레인, 플라스틱, 상자성 비드, 충전된 페이퍼, 나일론, 랭무어 보제뜨 필름(Langmuir-Bodgett films), 관능화된 유리, 게르마늄, 실리콘, PTFE, 폴리스티렌, 비화 갈륨, 금 및 은을 포함한다. 표면상에 결합되는 아미노, 카르복실,티올 또는 히드록실기와 같은 관능기를 가질 수 있는 이 분야에서 공지된 임의의 다른 물질이 또한 예상된다. 이것은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 구형 표면, 홈패인 표면 및 원통형 표면을 포함한 임의의 토폴로지를 갖는 표면을 포함한다.
"분리"는 타겟 분자에 결합된 리간드가 타겟 분자에 결합되지 않는 핵산 분자로부터 분리될 수 있는 임의의 공정을 의미한다. 보다 넓게 진술하면, 분리는 타겟 분자에 대한 그들의 상대적인 친화성에 기초된 적어도 두개의 풀로 후보 혼합물내의 모든 핵산을 분리하는 것을 허용한다. 분리는 이 분야의 공지된 여러가지 방법에 의해 성취될 수 있다. 핵산-단백질 쌍은 결합되지 않는 핵산이 존재하지 않는 동안 니트로셀룰로스 필터에 결합될 수 있다. 핵산-타겟 복합체를 특이하게 보유하는 컬럼은 분리를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 컬럼에 결합된 타겟 분자와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 가장 높은 친화성 핵산 리간드를 분리 및 단리하기 위한 컬럼 크로마토그래피의 사용을 허용한다. 타겟 분자가 컨쥬케이트되는 비드는 또한 혼합물중에서 핵산 리간드를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 기술(Surface plasmon resonance technology)은 혼합물 중의 핵산 리간드를 센서 칩상에 타겟을 고정화하고 및 칩위로 혼합물을 흐르게 하는 것으로 분리하는데 사용될 수 있고, 여기서 타겟에 대한 친화성을 갖는 이들 핵산은 타겟에 결합될 수 있고, 남은 핵산은 세척되어 떨어져 나갈 수 있다. 여과 겔 지연(filtration gel retardation) 및 밀도 기울기 원심분리 뿐만 아니라 액체-액체 분리가 사용될 수 있다.
그의 가장 기본적인 형태에서, 상기 SELEX 공정은 다음과 같은 일련의 단계에 의해 정의될 수 있다:
1) 시퀀스가 다른 핵산의 후보 혼합물이 준비된다. 상기 후보 혼합물은 일반적으로 고정된 시퀀스 영역(예를 들면, 후보 혼합물의 각각의 구성요소는 동일한 위치에 동일한 시퀀스를 포함한다) 및 랜덤화된 시퀀스 영역을 일반적으로 포함한다. 고정된 시퀀스 영역은 a) 이하에 설명되는 증폭 단계에서 보조; b) 타겟에 결합하는 공지된 시퀀스 모방; 또는 c) 후보 혼합물중에 주어진 구조적 배열의 핵산의 농도를 보강하기 위해 선별되어진다. 랜덤화된 시퀀스는 전체적으로 랜덤화(예를 들면, 네개 중에 하나일 수 있는 임의의 위치에서 염기를 발견할 가능성)될 수 있거나 또는 부분적으로만 랜덤화(예를 들면, 임의의 위치에서 염기를 발견할 수 있는 가능성이 0 내지 100% 사이의 임의로 선별되어질 수 있다)될 수 있다.
2) 후보 혼합물은 타겟과 다수의 후보 혼합물 사이에 결합하기에 바람직한 조건하에서 선별된 타겟과 접촉된다. 이런 상황하에서, 타겟과 후보 혼합물의 핵산 사이의 상호작용은 타겟과 타겟에 대해 가장 강한 친화성을 갖는 이들 핵산과의 사이에 핵산-타겟 쌍을 형성하는 것으로 여겨질 수 있다.
3) 타겟에 대해 가장 높은 친화성을 갖는 핵산은 타겟에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는 이들 핵산으로부터 분리되어진다. 가장 높은 친화성 핵산에 대응하는 매우 작은 수의 시퀀스(및 오로지 핵산 한 분자일 수도 있다)만이 후보 혼합물내에 존재하기 때문에, 후보 혼합물중의 핵산의 특정 양이 분리동안 유지되도록 그중에서 분리 기준을 잡는 것이 일반적으로 바람직하다.
4) 타겟에 대해 비교적 높은 친화성을 갖는 것으로 분리동안 선별된 이들 핵산은 이어서 타겟에 대해 비교적 높은 친화성을 갖는 핵산이 풍부한 새로운 후보 혼합물을 만들기 위해 증폭되어진다.
5) 상기 분리와 증폭 단계가 반복되어짐에 따라서, 새로이 형성된 후보 혼합물은 소수의 독특한 시퀀스를 포함하고, 타겟에 대한 핵산의 친화성 평균 정도가 일반적으로 증가될 것이다. 그의 극단적임에 의해, SELEX 공정은 타겟 분자에 대해 가장 높은 친화성을 갖는 원래의 후보 혼합물로부터 이들 핵산을 대표하는 하나 또는 소수의 독특한 핵산을 포함한 후보 혼합물을 얻을 것이다.
상기 SELEX 특허 출원은 매우 상세하게 이 방법을 설명하고 묘사한다. 포함된 것은 공정에 사용될 수 있는 타겟; 초기 후보 혼합물의 제조방법; 후보 혼합물내에서 핵산 분리방법; 및 분리된 핵산을 풍부한 후보 혼합물을 만들기 위해 증폭하는 방법이다. 상기 SELEX 특허 출원은 또한 단백질 타겟을 포함한 다수의 타겟 종류로부터 얻을 수 있는 리간드 용액을 설명하고 있으며, 여기서 단백질은 핵산 결합 단백질이거나 또는 아닐 수 있다.
하나의 구현예에서, 자동화 SELEX 방법은 작업 표면상에 위치된 작업 스테이션으로 또는 작업 스테이션으로부터 이동하는 하나 이상의 컴퓨터 제어된 카티션 로봇 조작(cartesian robotic manipulators)을 사용한다. 상기 SELEX 방법의 개개의 단계는 작업 스테이션에서 수행된다. 일부의 구현예에서, 각각의 로봇 조작은 수평 및 수직 평면 모두로 툴(tool)을 운반할 수 있는 이동가능한 아암(arm)이다. 하나의 고려된 툴은 피펫팅 툴(pipetting tool)이다. 로봇 조작은 작업 표면 상에 한정된 위치로부터 액체를 들어올리고, 이어서 다른 위치로 액체를 분배하는 피펫팅 툴을 사용한다. 또한 피펫팅 툴은 액체를 끌어올리고 분출하는 것을 반복적으로 하여 액체를 혼합(예를 들면 "마시고 뺏음" 혼합)하는데 또한 사용될 수 있다. 로봇 조작은 또한 피펫팅 툴로부터 일회용 팁(disposable tip)을 폐용기로 방출할 수 있고, 이어서 작업 표면상의 적절한 스테이션으로부터 신선한 팁을 끌어올린다.
바람직한 구현예에서, 피펫팅 툴은 SELEX 공정을 위한 다양한 완충액의 일부와 대량으로 필요되는 시약을 함유한 하나 이상의 액체 용기와 연결된다. 컴퓨터 제어된 밸브는 용액이 피펫팅 툴에 의해 분배되는 지를 결정한다. 상기 피펫팅 툴은 또한 이미 그 위치에 존재하는 액체와 접촉해서 팁의 밖으로 나오게 하지 않으면서 작업 표면상의 바람직한 위치에 액체를 분출할 수 있다. 이것은 각각의 액체 분배 단계에서 피펫 팁이 오염될 수 있는 가능성을 크게 줄이고, 자동화 SELEX 공정 동안 이루어져야 되는 피펫 팁 교환 갯수를 감소시킨다.
일부의 구현예에서, 자동화 SELEX 공정의 특정 단계에서 사용된 팁은 재사용될 수 있다. 예를 들면, 팁은 이것이 동일한 시약을 분배하는 SELEX 공정의 각각의 사이클에 사용된다면 다시 사용될 수 있다. 상기 팁은 린스 스테이션에서 각각의 사용후에 린스될 수 있고, 이어서 이것이 다시 필요해질 때까지 작업 표면상의 선반(rack)에 저장된다. 이런 방식으로 재사용되는 팁은 자동화 SELEX 공정 동안 사용되는 팁의 갯수를 현저하게 감소시킬 수 있다.
바람직한 구현예에서, 진공 흡인 시스템은 또한 분리 로봇 조작에 부착된다. 이 시스템은 액체속에 침을 침지시킬 필요없이 작업 표면상의 바람직한 위치로부터 액체를 회수하기 위해 진공원에 연결된 미세 침을 사용한다. 피펫팅 툴과 진공 흡인기가 분리 로봇 조작과 합쳐지는 구현예에서, 피펫팅 툴과 흡인 시스템은 작업 표면상의 다른 위치에서 동시에 작업할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 로봇 조작은 또한 작업 표면상의 한정된 위치로 또는 위치로부터 목적물을 이동시킬 수 있다. 이와 같은 목적물에는 멀티-웰 플레이트에 대한 뚜껑(lid), 및 또한 이하에 설명되는 구현예에서 사용된 다양한 종류의 장치를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서 로봇 조작은 목적으로 기계적으로 잡을 수 있는 "그리퍼(gripper)"를 사용한다. 다른 구현예에서, 상기 설명된 진공 흡인 시스템은 또한 이동되어지는 목적물에 부착할 수 있는 흡인 컵을 동력화하는데 사용된다. 예를 들면, 상기 설명된 미세 침은 흡인 컵을 끌어올릴 수 있고, 컵에 진공을 적용할 수 있고, 흡인 컵을 사용하여 목적물을 끌어올릴 수 있고, 목적물을 새로운 위치로 이동시킬 수 있고, 진공을 풀어 목적물을 새로운 위치로 방출할 수 있고, 이어서 흡인 컵을 작업 표면상의 저장 위치에 저장할 수 있다.
본 발명에서 고려된 적합한 로봇 시스템은 MultiPROBETM시스템(Packard), Biomek200TM(Beckman Instruments) 및 TecanTM(Cavro)을 포함한다. 도 7 내지 10을 나타낸 구현예에서, 상기 시스템은 피펫팅 툴을 운반하는 것, 진공 흡인기를 운반하는 것 및 형광분석기 커버(이하 참조)를 운반하는 것을 포함한 세개의 로봇 조작을 사용한다.
가장 기본적인 구현예에서, 자동하 SELEX 공정 방법은 다음을 포함한다:
(a) 고형 지지체와 합쳐지는 타겟 분자로 봉쇄 용기중의 핵산 리간드의 후보혼합물과 접촉하는 단계;
(b) 봉쇄 용기중의 후보 혼합물과 고형 지지체를 예정된 온도에서 후보 핵산 리간드가 타겟과 상호작용하도록 배양하는 단계;
(c) 결합된 타겟과 합쳐진 핵산 리간드를 갖는 고형 지지체를 후보 혼합물로부터 멀리 분리하는 단계;
(d) 예정된 조건하에서 고형 지지체 또는 봉쇄 용기와 비특이적으로 합쳐진 핵산을 제거하기 위해 고형 지지체를 선택적으로 세척하는 단계;
(e) 고형 지지체로부터 타겟과 특이적으로 상호작용하는 핵산 리간드를 방출하는 단계;
(f) 방출된 핵산 리간드를 증폭, 정제 및 정량하는 단계;
(g) 예정된 횟수로 상기 단계 (a) 내지 (f)를 반복하는 단계;
(h) 얻어진 핵산 리간드를 단리하는 단계.
단계 (a) 내지 (g)는 컴퓨터-제어 로봇 조작에 의해 자동적으로 수행된다. 상기 컴퓨터는 또한 각각의 증폭 단계 전에 타겟 분자로부터 용출된 핵산 리간드의 양을 포함하여 자동화 SELEX 공정 처리의 진행에 대한 정보를 측정하고 저장한다. 또한, 컴퓨터는 자동화 SELEX 방법에 대해 요구된 여러가지 가열 및 냉각 단계를 제어한다.
바람직한 구현예에서, 작업 표면은 개개의 SELEX 반응이 일어나는 단일 작업 스테이션을 포함한다. 이 스테이션은 요구된 온도에서 반응 혼합물을 배양하기 위해 컴퓨터에 의해 제어된 가열 및 냉각 수단을 포함한다. 하나의 적합한 가열 및냉각수단은 펠티에 소자(Peltier element)이다. 상기 작업 스테이션은 또한 SELEX 반응 성분이 적절하게 혼합되도록 교반 메카니즘을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 작업 표면은 또한 SELEX를 위해 필요한 효소가 냉각하에서 저장되는 스테이션, 세척 용액과 완충액이 저장되는 스테이션, 툴과 장비가 저장되는 스테이션, 툴과 장비가 린스되는 스테이션, 및 피펫 팁과 시약이 버려지는 스테이션을 또한 포함한다. 상기 작업 표면은 또한 SELEX 반응 혼합물의 작은 분취량의 아키이벌 기억(archival storage)를 위한 스테이션을 포함한다. 이들 혼합물은 이후의 분석을 위해 선별된 시기에서 피펫팅 툴에 의해 작업 스테이션으로부터 자동적으로 제거될 것이다. 상기 작업 표면은 또한 로봇 조작이 사용전에 바로 제조 바이얼에 효소 시약 용액의 배치를 제조하는 시약 제조 스테이션을 포함한다.
다른 구현예에서, 작업 표면은 하나 이상의 작업 스테이션을 포함한다. 이런 방식으로, 비동시적으로 자동화 SELEX 방법의 개개의 단계를 수행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 제 1세트의 후보 핵산 리간드는 단계(f)의 제 1 작업 스테이션상에서 증폭되어지고, 다른 실험으로부터 나온 다른 세트는 다른 작업 스테이션에서 단계 (b)의 지지체-결합 타겟 분자와 접촉될 수도 있다. 다중 작업 스테이션을 사용하여 로봇 조작의 유휴 시간을 최소화한다.
또 다른 구현예에서, 자동화 SELEX 방법의 개개의 단계는 단일의 다중 기능 작업 스테이션에서 보다는 불연속 작업 스테이션에서 수행된다. 이들 구현예에서, 후보 핵산 혼합물의 용액은 작업 스테이션으로부터 다른 곳으로 로봇 조작에 의해 전달된다. 분리 작업 스테이션은 반응 혼합물을 가열 및 냉각하기 위해 제공되어질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 자동화 SELEX 공정의 개개의 단계는 어레이 형식(array format)으로 배열된 봉쇄 용기에서 수행된다. 이것은 다른 타겟 또는 다른 반응 조건을 사용하여 많은 다른 SELEX 반응이 단일 작업 스테이션에서 동시에 일어나도록 한다. 예를 들면, 일부의 구현예에서, 개개의 단계는 마이크로역가 플레이트(예를 들면 이뮬론 1 플레이트와 같은)의 웰에서 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 작은 플라스틱 튜브의 어레이가 사용된다. 전형적인 튜브 어레이는 8×12 형식으로 규정된 96 0.5㎖ 둥근 바닥이면서 얇은 벽 폴리프로필렌 튜브를 포함한다. 어레이는 증발로부터 액체 손실을 방지하고, 또한 오염을 방지하기 위해, 가열 및 냉각 단계 동안 덮여질 수 있다. 임의의 다양한 뚜껑(가열된 뚜껑 포함)은 이들 공정동안 로봇 조작에 의해 어레이 위에 위치될 수 있다. 게다가, 어레이는 다중피펫 장치를 사용하며, 이것은 요구된 피펫팅 단계의 수를 크게 줄일 수 있다. 본 명세서의 목적에 비추어, 상기 "웰"이라는 용어는 임의의 어레이 형식에서 개개의 봉쇄 용기로 언급되어 사용될 것이다.
타겟 분자를 부착하기 위한 적합한 고형 지지체는 이 분야에서 공지되어 있다. 타겟 분자가 공유적으로 또는 비공유적으로 부착될 수 있는 임의의 고형 지지체는 본 발명에 의해 고려되어진다. 고형 지지체에 분자의 공유적 부착은 이 분야에 잘 알려져 있고, 광범위하게 다양한 유도 화학을 사용하여 얻을 수 있다. 타겟의 비공유적 부착은 소수성 상호작용에 의존할 수 있고; 선택적으로, 고형상의 지지체는 바이오틴과 컨쥬케이티드된 타겟 분자에 강하게 결합하는스트랩타비딘(streptavidin)으로 코팅될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 고형 지지체는 상자성 비드이다. 타겟 분자가 상자성 비드에 부착되는 경우, 타겟 분자와 핵산 리간드의 복합체는 웰에 자기장을 적용하는 것으로 후보 혼합물로부터 빠르게 분리될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 자기장은 각각의 웰의 벽에 근접한 전자석의 어레이에 의해 적용되고; 전자석이 컴퓨터에 의해 활성화되는 경우, 상자성 타겟 비드는 웰의 측면에 고정된다. 자석은 작업 스테이션의 내부에 있을 수 있거나, 또는 이들은 로봇 조작에 의해 작업 스테이션 위에 낮게 위치된 커버에 부착될 수 있다. 이 후자의 구현예에서, 자성 분리기 커버는 그 자체가 웰에 접근하는 것을 막지 않으면서 자석이 웰에 근접하게 위치되게 한다. 이런 방식으로, 웰은 커버가 자리를 잡는 경우, 피펫 및 흡인 유니트에 의해 접근하기 쉬어진다. 자석 활성에 이어서, 액체가 웰로부터 흡인될 수 있고, 이어서 세척 용액이 첨가된다. 전자석이 불활성화되는 경우, 또는 커버가 제거되는 경우, 비드는 용액중에서 재현탁되어진다. 자성 분리기 커버는 작업 표면상에 저장될 수 있다. 다른 구현예에서, 분리 커버중의 자석은 영구 자석이다. 이 경우, 커버를 철수하는 것은 자석의 영향을 제거하는 것이고, 비드가 현탁물이 되도록 한다.
여전히 또 다른 구현예에서, 비드 분리에 사용된 자석은 웰의 근접한 줄들 사이에서 슬라이드할 수 있는 일련의 막대에 부착된다. 각각의 막대는 그의 길이와 나란히 규칙적으로 떨어져 있는 자석들을 갖고, 이는 자석이 완전히 웰들 사이로 삽입되는 경우, 각각의 웰이 적어도 하나의 자석에 근접하도록 하기 위해서이다.예를 들면, 웰의 8×12 어레이는 8개의 자석 막대를 가지며, 각각의 막대는 12개의 자석을 갖는다. 이 구현예에서, 비드 분리는 웰 사이에 막대를 삽입하는 것으로 얻어질 수 있고; 비드 방출은 웰 사이로부터 막대를 회수하는 것에 의해 성취될 수 있다. 막대의 어레이는 컴퓨터 제어된 스테퍼 모터에 의해 이동될 수 있다.
상기 구현예에서 사용된 상자성 타겟 비드는 작업 스테이션 상에 어레이 형식의 지면 배치를 비추는 어레이 형식으로 작업 표면상에 저장되는 것이 바람직하다. 비드 저장 어레이는 냉각되고, 비드가 사용전에 현탁물로로 존재하도록 교반되는 것이 바람직하다.
비드는 제 2 어레이의 자석을 사용하는 작업 스테이션의 웰로부터 완전히 제거될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제 2 어레이는 작업 스테이션 상의 개개의 웰의 표면 위에 로봇 조작에 의해 위치될 수 있는 커버상에 설치된 전자석의 어레이를 포함한다. 상기 비드 제거 커버상의 전자석은 이들이 웰의 액체로 투입될 수 있는 형태일 수 있다. 전자석이 활성화되는 경우, 상기 비드는 이들에 부착된다. 이어서, 비드 제거 커버를 웰로부터 회수하여, 상기 비드가 작업 스테이션으로부터 효과적으로 제거될 수 있다. 상기 비드는 버려지거나 다음 번의 자동화 SELSX에 사용하기 위해 비드 저장 어레이의 후면에 저장될 수 있다. 상기 비드 제거 커버는 이어서 다음의 비드 제거 단계 이전에 작업 표면상에 세척 스테이션에서 세척될 수 있다.
상자성 비드를 포함하는 전형적인 구현예에서, 자동화 SELEX 공정은, 피펫팅 툴이 비드의 분취량을 분배하는 경우, 그들의 결합된 타겟을 가지고 작업 스테이션상에 위치된 마이크로역가 플레이트의 개개의 웰에서 시작한다. 각각의 웰은 로봇 조작에 의해 미리 분배된 핵산 리간드의 후보 혼합물의 분취량을 이미 포함한다. 비드를 분배한 후에, 로봇은 전체적으로 혼합이 잘되도록 각각의 웰의 내용물을 상하 여러번 선택적으로 "마시고 뺏는다" 상기 마이크로역가 플레이트는 이어서 예정된 온도의 작업 스테이션에서 배양되어, 후보 혼합물중의 핵산 리간드가 비드-결합된 타겟 분자에 결합하게 한다. 플레이트의 교반은 상기 비드가 현탁물로 남아있게 한다.
적절한 시간동안 배양한 후, 자성 분리기 커버가 로봇 조작에 의해 마이크로역가 플레이트 위에 위치된다. 이어서 상기 비드는 웰의 측면에 고정되고, 흡인기 툴은 비결합된 후보 핵산을 포함한 용액을 웰로부터 제거한다. 저염 용액과 같은 세척 용액은 이어서 각각의 웰에 피펫팅 툴에 의해 분배될 수 있다. 상기 비드는 자성 분리기 커버를 회수하는 것으로 또는 전자석을 불활성화하는 것으로 웰의 측면으로부터 떨어져 나가고, 이어서 교반 및 "마시고 뺏음" 혼합에 의해 세척 용액중에 재현탁된다. 상기 자성 분리기 커버는 다시 플레이트 위에 위치되고, 이어서 세척 용액이 흡인되어진다. 이 세척 루프는 미리 선택된 횟수동안 반복될 수 있다. 세척 루프의 말단에서, 상기 비드가 빈 웰의 측면에 자석으로 고정되어진다.
이어서, 상기 비드는 핵산 리간드를 타겟 분자로부터 용출하기 위해 고안된 용액(예를 들면 dH2O)중에 재현탁될 수 있다. 타겟으로부터 핵산 리간드의 해리는 비드를 작업 스테이션 상에서 고온으로 가열하는 것으로 또한 얻을 수 있다.
상기 비드-결합 타겟으로부터 핵산 리간드의 해리 후에, 피펫팅 툴이 후보 핵산 리간드의 증폭을 수행하는데 필요한 효소 및 완충 성분을 웰로 분배할 수 있다. 증폭, 정제 및 정량(이하 참조) 후에, 예정된 양의 증폭 후보 혼합물이 이어서 다음 번의 자동화 SELEX 방법에 사용될 수 있다. 사이클 동안 임의의 포인트에서, 피펫팅 툴은 후보 혼합물의 분취량을 제거할 수 있고, 이후의 특성화를 위한 아카이브 플레이트에서 저장할 수 있다. 게다가, 배양 기간 동안, 피펫팅 툴은 SELEX 공정중의 다른 단계를 위한 반응 혼합물을 제조할 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 자동화 SELEX 공정 방법 및 장치의 바람직한 구현예는 아카이브 선별에 대한 마이크로역가 플레이트 및 자성 비드를 사용한다. 그러나, 결합된 핵산 리간드를 비결합된 것으로부터 분리하기 위한 임의의 다른 방법도 본 발명에서 고려된다. 예를 들면, 일부의 구현예에서, 타겟 분자는 마이크로역가 플레이트의 표면에 직접적으로 결합된다. 이와 같은 방식으로 결합하는 적합한 방법은 이 분야에 잘 알려져 있다.
다른 구현예에서, 타겟 분자는 이 분야에 공지된 친화성 분리 컬럼에 연결된다. 로봇 장치는 후보 혼합물을 이와 같은 컬럼으로 분배하고, 결합된 핵산 리간드는 적절한 세척 단계 후에 마이크로역가 플레이트의 웰로 용출될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 자동화 SELEX 공정 방법에서 사용된 고형 지지체는 표면 플라스몬 공명(SPR) 센서 칩이다. 핵산 리간드의 단리에서 SPR 센서 칩의 사용은 WO 98/33941(명칭 : 흐름 셀 SELEX(Flow Cell SELEX))에 설명되어 있고, 이것은 전체로서 본 명세서에 참조를 위해 포함한다. 흐름 셀 SELEX 방법에서, 타겟 분자는 표면 플라스몬 공명 센서 칩의 표면에 결합된다. 상기 칩의 표면과 둘러싸는 배지의 교차점에서의 굴절 지수는 칩의 표면에 결합된 물질에 매우 민감하다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 핵산 리간드의 후보 혼합물은 로봇 장치에 의해 칩위로 지나가고, 칩-결합 타겟과 핵산 리간드의 사이의 결합 작용의 속도는 칩으로부터 공명 신호를 읽는 것으로 모니터된다. 이와 같은 읽기는 BIACore 2000TM(BIAcore, Inc.)과 같은 장치를 사용하여 할 수 있다. 이어서, 결합 핵산 리간드는 칩으로부터 용출될 수 있고; 해리 속도는 공명 신호를 측정하는 것에 따른다. 이런 방식에서, 흥미있는 타겟과의 매우 빠른 결합 속도 및 느린 속도를 갖는 핵산 리간드를 자동적으로 수집하는 자동화 SELEX 공정을 제어하는 컴퓨터를 프로그램하는 것이 가능하다. 상기 수집된 핵산 리간드는 이어서 증폭되고, 자동화 SELEX 공정 사이클을 다시 시작할 수 있다.
다른 구현예에서, 고형 지지체는 비-파라마그네틱 비드이다. 용액은 이와 같은 비드를 포함한 웰로부터 비드의 통행을 배제하기에 충분히 작은 웰에 있는 구멍을 통해 액체를 흡인하는 것으로 제거될 수 있다. 예를 들면, 0.2μM 필터를 갖는 진공 매니폴드가 100μM 비드를 분리하는데 사용될 수 있다.
자동화 SELEX 공정의 말기에서, 얻어진 핵산 리간드는 시퀀스 분석 및 클로닝을 위해 자동화 SELEX 공정 장치로부터 단리될 수 있다.
후보 핵산 리간드의 증폭
자동화 SELEX 공정 방법중에서 각각의 결합 및 분리 단계의 말기에, 후보 핵산 리간드는 증폭되어야 한다. 바람직한 구현예에서, 상기 증폭은 중합효소 사슬 반응(PCR)을 사용하여 이룰 수 있다. 자동화 SELEX 공정 방법중에 후보 핵산 리간드로써는 고정된 5' 및 3' 영역을 가지는 것이 바람직하고, 이들 영역에 결합하는 프라이머는 PCR을 촉진하기 위해 사용되어진다.
타겟 비드를 사용하는 구현예에서, 비드는 증폭 공정 시작전에 웰로부터 제거된다. 상자성 비드가 사용되는 경우, 이것은 상기에 설명된 자성 제거 시스템을 사용하여 할 수 있다.
후보 핵산 리간드는 단일 스트랜드 DNA 분자, 이중 스트랜드 DNA 분자, 단일 스트랜드 RNA 분자 또는 이중 스트랜드 RNA 분자일 수 있다. 후보 혼합물중에서 RNA 핵산 리간드를 증폭하기 위해서, RNA를 cDNA로 첫번째 역전사하는 것이 필요하고, 이어서 cDNA 상에서 PCR을 행한다. RT-PCR로서 알려진 이 공정은 용출된 리간드를 포함한 작업 스테이션위의 웰에 필요한 효소, 프라이머 및 완충액을 분배하는 것으로 자동화 SELEX 공정 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이어서, 얻어지는 반응 혼합물은 역전사를 촉발하는 온도에서 작업 스테이션 상에서 우선 배양된다. 역전사 후에, 작업 스테이션은 cDNA 생성물을 증폭하기 위해 반응 혼합물을 열적으로 순환한다. 증폭된 생성물의 양은 이어서 타겟으로부터 용출된 후보 핵산 리간드의 양에 대한 값을 얻기 위해 측정된다.
RNA 리간드에 대해서, 증폭된 DNA 분자들은 다음 번의 자동화 SELEX를 위한 후보 RNA 리간드의 풀을 재발생하기 위해 전사되어야 한다. 이것은 T7 중합효소 사이트와 같은 전사를 촉진하는 사이트를 포함한 증폭 단계에서 프라이머를 사용하는 것으로 얻을 수 있다. 이들 프라이머는 PCR 단계 동안 증폭 생성물로 병합된다.이들 사이트로부터의 전사는 적절한 효소와 완충 성분을 증폭된 혼합물로 분배하고, 이어서 적절한 온도에서 배양하는 것으로 간단히 얻어질 수 있다. 이어서, 증폭된 혼합물의 예정량이 다음 번의 자동화 SELEX 공정에 사용된다.
증폭 혼합물로부터 RNA 리간드의 정제
일부의 구현예에서, 증폭된 RNA 리간드는 다음 번의 자동화 SELEX 시작 전에 그들의 DNA 템플리트로부터 정제된다. 이것은 RNA 리간드의 3' 상수 영역에 상보적인 프라이머가 부착되는 제 2세트의 상자성 비드를 사용하여 할 수 있다. 이들 프라이머 비드가 전사된 증폭 혼합물에 첨가되는 경우, 새로이 전사된 전장 RNA 리간드는 비드-결합된 프라이머와 혼성화하고, 반면에 증폭된 이중 스트랜드 DNA 분자는 용액중에 남는다. 상기 비드는 상기에 설명된 바와 같이 웰에 자기장을 적용하고 및 웰중의 액체를 흡인하는 것으로 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 상기 비드는 이어서 미리 선택된 온도에서 적절한 완충액으로 세척될 수 있고, 이어서 RNA 리간드는 용출 완충액(전형적으로 dH2O)에서 가열하는 것으로 비드로부터 용출될 수 있다. 최종적으로, 상기 비드는 상기에 설명된 바와 같이 웰중에 남아 있는 후보 RNA 리간드의 용액만을 남기기 위해 작업 스테이션상의 웰로부터 제거될 수 있다. 이 지점은 1회의 자동화 SELEX 공정의 완성을 나타낸다.
첨가된 프라이머 비드의 양은 웰에 보유되는 RNA 리간드의 양을 결정한다. 따라서, 다음 번의 자동화 SELEX 공정에 사용되는 RNA 리간드의 양은 증폭 혼합물로 첨가되는 프라이머 비드의 양을 다양하게 하여 조절될 수 있다. 사용되어질 수 있는 RNA 리간드의 양은 PCR 생성물의 양을 정량하는 것을 통해 결정될 수 있다(아래 참조)
각각의 증폭 혼합물에서 용출된 핵산 리간드 양의 결정
특정 구현예에서, 다음 번의 자동화 SELEX 공정을 시작하기 전에 타겟으로부터 용출된 후보 핵산 리간드의 양을 측정하는 것은 중요할 수 있다. 이와 같은 측정은 선별 공정의 효율과 진행에 대한 정보를 얻는다. 증폭 반응에 대한 템플리트로서 제공되는 용출된 핵산 리간드의 측정은 각각의 PCR 반응으로부터 나오는 증폭 생성물의 양을 측정하는 것에 기초하여 계산되어질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 자동화 SELEX 공정 방법은 증폭동안 PCR 생성물의 자동화된 실시간 정량에 대한 신규한 시스템을 사용한다. 이것은 교대로 자동화 SELEX 방법 동안 실시간으로 모니터될 수 있는 선별 실험의 진행을 허용한다. 바람직한 구현예에서, 자동화된 SELEX 공정 방법은 형광단/퀸쳐(fluorophore/quencher) 쌍 프라이머 시스템을 사용한다. 이 시스템은 증폭된 혼합물의 형광체 방출을 측정하는 것으로 반응 혼합물로 도입된 용출된 핵산 리간드의 양을 자동적으로 계산한다. 본 발명의 하나의 이와 같은 구현예에서, 상기 PCR 반응은 5' 말단에 부착된 짧은 헤어핀 영역을 갖는 프라이머를 사용하여 수행되어진다. 헤어핀의 줄기(stem)는 일측에 부착된 형광단과 형광단의 반대쪽 타측에 부착된 퀸쳐를 갖는다. 상기 퀸쳐와 형광단은 효율적인 에너지 전달이 일어나는 줄기중에 서로서로 충분히 근접해서 위치되고, 그래서 매우 적은 형광 신호가 형광단의 자극에 따라 발생된다. 이와 같은 프라이머의 실예는 실시예 2중에 설명되어 있다. PCR 반응동안, 프라이머와 어닐링되는 DNA 분자의 3' 말단의 중합효소 확장은 헤어핀의 줄기를 분열시킨다. 결과적으로 퀸쳐와 형광단 사이의 거리는 증가하고, 퀸칭(quenching) 에너지 전달의 효율은 크게 떨어진다. 따라서, 결합된 프라이머는 결합되지 않은 프라이머보다 더 높은 형광 방출 신호를 갖는다. PCR 사이클 회수의 기능으로서 형광 신호를 모니터링하는 것으로, PCR 반응 속도는 실시간으로 모니터될 수 있다. 이런 방식에서, 각각의 반응에서 타겟으로부터 용출된 후보 핵산 리간드의 양은 정량될 수 있다. 교대로 이 정보는 선별 공정을 진행하는데 사용된다.
다른 구현예에서, 후보 핵산 리간드 템플리트는 Roche Molecular Systems으로부터 유용한 TaqManTMprobe PCR 시스템을 사용하여 정량될 수 있다. 간략히, TaqManTMprobe는 검출되는 템플리트에 상보적인 시퀀스, 5' 말단의 형광단 및 3' 말단의 퀸쳐를 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 표준 PCR 반응에 첨가되고, 각각의 PCR 사이클의 어닐링 단계동안 프라이머 결합 사이트 사이에서 템플리트에 어닐링한다. 확장 단계 동안, 프로브는 Taq 중합효소의 5'→3' 핵산말단가수분해효소 활성에 의해, 퀸쳐로부터 형광단을 분리하는 것에 의해 및 신호를 발생시키는 것에 의해 강등된다. PCR 시작 전에, 프로브는 손상되지 않고, 형광단의 자극 에너지는 퀸쳐로 비방사성으로 전달된다. PCR 동안, 템플리트가 증폭되면서, 프로브는 강등되고, 발생된 형광 신호의 양은 형성된 PCR 생성물의 양에 직접적으로 비례한다.
현재의 발명에서 열적-순환 동안 작업 스테이션 상에서 반응 혼합물의 형광 방출 프로파일을 모니터할 수 있는 형광분석 기기의 사용이 고려되어진다. 고려된 적합한 기기는 레이져와 같은 형광단의 자극을 위한 소스, 전하 결합된 장치(CCD) 카메라와 같은 반응 혼합물로부터 형광 방출을 측정하기 위한 수단을 포함한다. 적절한 필터는 정정 자극과 방출 파장을 선별하기 위해 사용된다. 특별히 바람직한 구현예는 로봇 조작에 의해 작업 스테이션상의 웰 위에 위치될 수 있는 광학적으로-투명한 커버상에 설치된 형광분석 기기를 사용한다. 웰위에 위치되고, 이어서 광차폐물로 덮여지는 경우, 이 형광분석기 커버는 예정된 간격에서 전체 어레이의 이미지를 포착할 수 있다. 컴퓨터는 그당시 각각의 웰에 증폭된 생성물의 양에 대한 값을 계산하기 위해 상기 이미지를 판단한다. 증폭 단계의 말기에서, 로봇 조작은 광차폐물과 형광분석기 커버를 제거하고, 이들은 작업 스테이션상의 저장 스테이션에 돌려놓는다.
바람직한 구현예에서, PCR 생성물 분량의 측정은 증폭 반응 혼합물로 템플리트로서 도입된 용출된 핵산 리간드의 양에 대한 값을 결정하는데 사용한다. 이것은 동일한 조건하에서 증폭된 템플리트의 공지된 농도로부터 미리 얻은 컴퓨터에 저장된 값과 증폭된 생성물의 양을 비교하는 것으로 행한다. 다른 구현예에서, 자동화 SELEX 공정 장치는 후보 핵산 증폭 반응과 함께 템플리트의 공지된 분량을 가지고 제어 PCR 실험을 자동적으로 수행한다. 이것은 컴퓨터가 자동화 SELEX 공정의 각각의 증폭 단계 후에 내부적으로 형광체 검출 수단을 재보정하게 한다.
타겟으로부터 용출된 후보 핵산 리간드의 양에 대한 값은 이어지는 자동화SELEX 공정 방법의 임의의 단계에 최적화하여 조정하기 위해 컴퓨터에 의해 사용된다. 예를 들면, 컴퓨터는 후보 핵산 리간드와 타겟 사이에 상호작용의 엄중성을 증가 또는 감소하기 위해 선별 조건을 변화시킬 수 있다. 컴퓨터는 또한 얼마나 많은 핵산 리간드 혼합물 및/또는 타겟 비드가 다음 번의 SELEX에 사용되었는지 계산할 수 있다. 프라이머 비드(상기)를 사용하는 구현예에서, 컴퓨터는 이 정보를 작업 스테이션상의 각각의 웰에 첨가되어지는 프라이머 비드 현탁물의 양을 결정하기 위해 사용한다. 유사하게, 상기 컴퓨터는 후보 핵산 리간드가 증폭되어지게 하는 조건을 변화시킬 수 있다. 이 모든 것은 작동자의 개입에 대한 필요성 없이 자동적으로 최적화될 수 있다.
도 7 내지 10은 본 발명에 따른 자동화 SELEX를 수행하기 위한 하나의 구현예의 장치를 여러 면에서 나타낸 도면이다. 이 구현예는 TecanTM(Cavro) 로봇 시스템에 기초한다. 각각의 면은 자동화 SELEX 공정의 PCR 증폭 단계동안 장치를 보여주고 있다.
도 7에서는 이 장치의 개략도는 나타내고 있다. 나타낸 시스템은 작업 스테이션(72)이 위치된 작업 표면(71)을 포함한다(작업 스테이션은 개략도로서 부분적으로 어둡지만, 도 8, 9 및 10에서는 부호 72로서 보여진다). 피펫팅 툴(74)과 흡인기(75)는 분리 가이드 레일(77) 및 (78) 각각에 의해 중앙 가이드 레일(73)에 부착된다. 따라서, 피펫팅 툴(74)은 가이드 레일(77)의 가로축과 나란하게 이동하고; 가이드 레일(77)은 이어서 중앙 가이드 레일(73)의 가로축에 나란하면서 이 축에직각으로 이동한다. 이런 방식으로, 피펫팅 툴(74)은 수평면 전체를 이동할 수 있고; 피펫팅 툴(74)은 작업표면(71)으로부터 올라갈 수 있고, 아래로 향할 수 있다. 유사하게, 흡인기(75)는 가이드 레일(78)에 부착되고, 가이드 레일(78)은 흡인기(75)가 수평면으로 이동하고; 흡인기(75)는 수직면으로 이동할 수 있도록 중앙 가이드 레일(73)에 부착된다.
형광분석기 커버(76)은 브라켓(710)을 통해 가이드 레일(79)에 부착된다. 브라켓(710)은 가이드 레일(79)의 수직축과 나란히 이동할 수 있고, 이것으로 작업 스테이션(72) 위로 형광분석기 커버(76)는 올라간다. 형광분석기 커버(76)가 가이드 레일(79)의 정상에 위치되어 있는 경우, 이어서 가이드 레일(77)과 (78)은 피펫팅 툴(74)와 흡인기(75)가 작업 스테이션(72)에 접근하도록 형광분석기 커버 밑으로 이동할 수 있다. 이와 같은 일러스트레이션에서, 형광분석기 커버(76)는 작업 스테이션(72) 정상의 그의 작업 위치로 내려가는 것으로 보여진다.
형광분석기 커버(76)는 CCD 카메라(711a)와 관련된 광학기(711b)에 부착된다. 형광 자극 광의 소스는 또한 커버(76)와 관련된다(도시되지 않음). 작업 스테이션(72)의 정상에 위치되는 경우, 커버(76)는 CCD 카메라(711a)가 PCR 증폭동안 작업 스테이션(72)상에 포함된 시료로부터 형광 방출을 측정하게 한다. 명확하게 하기 위해, 주위 빛이 형광분석기 커버로 들어가는 것을 방지하는 광 차폐물은 도면에 생략되었다. PCR 증폭이 끝나는 경우, 부착된 CCD 카메라(711a)와 광학기(711b)를 갖는 형광분석기 커버(76)는 간단하게 가이드 레일(79)까지 올라간다.
또한, 이 도면에 보여지지 않지만, 도 9 및 10에 보여지는 것은 가열된 뚜껑(91)이고, 이것은 형광분석기 커버(76) 아래의 작업 스테이션(72)의 정상에 정지되어 있다.
작업 표면(71)은 또한 다수의 다른 스테이션을 포함하며, 다른 스테이션으로는 4℃ 시약 저장 스테이션(712), -20℃ 효소 저장 스테이션(713), 주변 온도 시약 저장 스테이션(714), 용액 배출 스테이션(715), 피펫 팁 저장 스테이션(716) 및 아카이브 저장 스테이션(717)을 포함한다. 피펫팅 툴(74)는 또한 이들 여러가지 저장 스테이션에 대한 작업 표면(71) 주위로 목적물을 이동할 수 있는 그리퍼 툴(718)과 연결된다. 뚜껑 파크(719)(여기서 도시 되지 않음)은 가열된 뚜껑의 저장을 위한 것이다(도 9 및 10 참조).
도 8은 도 7의 장치를 위에서 본 입면도을 나타낸다. 상기 장치의 각각의 부품은 도 7에서와 동일한 번호로 표시한다.
도 9는 도 7의 장치를 앞에서 본 입면도이다. 상기 장치의 각각의 부품은 도 7 및 도 8과 동일한 번호로 표시된다. 이 도면에서, 작업 스테이션(72) 및 급냉 효소와 시약 저장 스테이션(712)은 교반하는 모터(92)와 각각 합쳐져서 있다는 것이 보여질 수 있다. 이들 모터의 작동은 자동화 SELEX 공정 동안 혼합된 다양한 시약을 유지할 수 있다. 상기 모터(92)는 각각 컴퓨터로 제어되고, 교반되어지는 용기로 적절하게 시약을 첨가하거나 제거하도록 순간적으로 멈출 수 있다. 또한, 이 도면에서 보여지는 것은 가열된 뚜껑(91)이고, 이것은 시료가 균일하게 가열되도록 작업 스테이션(72)의 정상에 정지하고 있다.
도 10은 도 7, 8, 및 9에서 나타낸 장치를 오른쪽에서 본 입면도이다. 상기 장치의 각각의 부품은 도 7, 8 및 9와 동일한 번호로 표시한다.
실시예
이하 실시예로 본 발명의 구현예를 나타낸다. 그러나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
로봇 작업 스테이션의 기초는 핵산 오염을 최소화하기 위해서 일회용 피펫 팁을 사용하는 4개의 프로브 피펫팅 스테이션인 Packard MULTIProbe 204DTTM이다. 작업 공간은 결합 반응과 시험관내 전사의 평형을 위해 사용되는 37℃ 항온 열 차단기, RT와 PCR 반응을 위한 컴퓨터 제어 열 순환기, 냉각된 효소 저장을 위한 냉동기 유니트, 예를 들어 완충액, 프라이머 및 미네랄 오일과 같은 시약 저장용의 다양한 용기 및 일회용 피펫 팁 선반을 포함한다. 팁 선반은 작업 표면에서 최대 면적을 사용하고 병행하여 처리되는 시료의 수에 따라 변한다. 시험관내 선별을 위한 모든 단계는 열 차단기 또는 열 순환기에서 일어나고, 약간의 효소 완충액이 플레이트 또는 열 순환기로의 전달 전에 인접한 시약 차단기에서 예비혼합된다고 하더라도 액체는 주로 이들 두 스테이션 사이로 전달된다.
전 공정은 HAM(High levelAccessMethod: 고 수준 액세스 방법)으로 사내 개발된 소프트웨어인, Packard MULTIProbe을 위한 액체 처리 기능이 증대된 DOS 기본의 C 프로그래밍 언어 해석 프로그램을 사용하여 PC에 의해 조절된다. 표준 C작용성 및 유체의 흡인, 분배 및 혼합과 같은 액체 처리 외에도, HAM은 윈도우 기본 스크린 io, 파일 처리 및 RS-232 시리즈 커뮤니케이션을 지원한다. 상기 소프트웨어는 1 내지 96의 다수의 시료를 실행시키기 위해서 공정을 자동적으로 조절하여, 현 실행 도중에 필요한 효소 용액만을 제조한다. RS-232 연결로 설정된 열 순환기와의 2 방향 커뮤니케이션은 메인 컴퓨터가 뚜껑 개폐 작업을 수행하게 하고, 열 순환기에서 저장된 프로그램을 개시하고, 완료를 위해 열 순환기 프로그램을 모니터링하게 한다. 전반적인 소프트웨어 디자인은 전사를 통한 결합 반응 배양으로부터 공정의 완벽한 컴퓨터 제어가 어떠한 유저(user) 개입도 없이 일어날 수 있게 한다.
공정은 단백질로 코팅된 마이크로역가 플레이트를 37℃ 차단기에 배치시킴으로써 시작된다. 농축된 RNA 풀의 겔 정제까지의 모든 후속적인 액체 처리는 소프트웨어에 의해 제어된다. 고정화된 단백질 타겟으로의 RNA의 초기 2시간 배양 동안, dH2O를 시료에 주기적으로 첨가하고(증발 손실을 조절하기 위해) 각각의 용액을 반복된 흡인 및 분배, 소위 마시고 뱉음(sip and spit)에 의해 혼합한다. 결합 반응이 평형화된 후, 유리 RNA로부터 결합된 분리는 RNA 용액을 각 웰로부터 단순히 제거함으로써 이 형식(format)에서 용이하게 달성되고; 결합된 핵산은 고정화된 타겟에 남고 결합되지 않은 분자는 처분된다. 분리 후에, 일련의 세척단계가 이어지고, 각 세척 단계는 세척 완충 용액을 각 웰로 피펫팅하고 이어서 반복 마시고 뱉음 혼합이 이루어진 다음 최종적으로 세척 용액을 처분하는 것을 포함한다. 용출공정은 EPTA 첨가에 의해 시작되고 이어서 주기적으로 마시고 뱉음 혼합하면서 30분 배양된다. 배양 후, 용액을 열 순환기로 전달하고, 각 세척 용액을 순환기내 용출된 물질로 첨가하는 것을 제외하고는 상기와 같이 웰을 세척한다. 그런 다음, 효소 증폭을 위해서 시료를 준비한다.
세개의 효소 반응 각각을 위한 첫번째 단계는 신선한 효소 용액의 제조를 요한다. 이는 분취량의 효소를 냉동기로부터 시약 차단기내에 위치하는 적합한 완충액으로 피펫팅함으로써 이루어진다. 효소 용액내에서 세정제의 발포를 피하기 위해서, 다양한 효소 용액을 느린 마시고 뱉음 혼합을 사용하여 주의깊게 완전히 혼합한다. 세척제가 웰에 잔존하는 용출된 RNA를 가능한한 제거하도록 분취량의 신선하게 제조된 RT 반응 혼합물을 용출된 플레이트의 건조 웰에 첨가한다. 이어서 RT 반응 혼합물 세척제를 열 순환기내 적합한 웰에 첨가하고 48℃에서 반응 배양 동안 증발 손실을 막기 위해서 실리콘 오일로 캡핑한다. 열 순환기 뚜껑을 닫고 프로그램을 RT 반응을 위해 개시한다. 메인 컴퓨터는 반응 진행을 모니터링하고 프로그램 완료의 감지시 뚜껑이 열리고 Taq 중합효소 반응 혼합물이 제조되어 각각의 완료된 RT 반응에 첨가된다. 그런 다음, 뚜껑이 닫히고, PCR 프로그램이 개시되며, 모니터링된 다음, PCR 완료시 뚜껑이 열린다. DNA 템플리트의 시험관내 전사를 위해 분취량의 증폭된 DNA가 열 순환기로부터 37℃ 플레이트 중의 적합한 웰로 이동된다. 신선하게 제조된 T7 RNA 중합효소 용액이 각각의 완전히 혼합된 웰에 첨가된다. 실리콘 오일의 층이 반응 혼합물을 캡핑한 다음, 4시간 동안 배양된다. 이것은 자동화된 공정을 완료하고; 생성된 전사 RNA가 오프라인에서 겔 정제되고,다음 번의 SELEX를 위해서 신선하게 코팅된 단백질 웰이 있는 마이크로역가 플레이트에 첨가된다.
전형적인 자동화 SELEX 공정 실행
다수 웰 플레이트를 사용하는 전형적인 자동화 SELEX 공정 실행은 다양한 시약과 필요한 물질을 작업 표면 상의 적합한 위치에 로딩시킴으로써 시작된다. 그런 다음, 하기 단계가 일어난다(각 단계는 로봇에 의해 수행됨):
1) 후보 핵산 혼합물을 하나의 팁을 갖는 작업 스테이션 상의 96 웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고; 팁을 처분한다.
2) 타겟 상자성 비드를 작업 스테이션 상의 96 웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고; 팁을 처분한다.
3)결합
핵산 리간드가 비드 상에서 타겟과 상호작용하도록 하기 위해서 플레이트를 37℃에서 30 내지 120 분 동안 교반하면서 배양한다.
4)비드 분리 및 세척
자성 분리기 커버를 플레이트에 배치함으로써 비드를 분리하고; 액체를 웰로부터 흡인하며; 자성 분리기 커버를 제거하고; 세척 완충액을 각 웰에 분배한 다음; 37℃에서 5분 동안 교반하면서 배양한다.
5) 원하는 수 만큼의 세척 사이클을 위해 단계 4)를 반복한다.
6)용출 1
자성 분리기 커버를 플레이트에 배치함으로써 비드를 분리하고 액체를 웰로부터 흡인하며; 자성 분리기 커버를 제거하고 각 웰 중의 비드를 dH2O 90㎕에 재현탁시키며; 핵산 리간드를 용출하기 위해서 플레이트를 교반하면서 90℃로 가열한다.
7) 플레이트를 48℃로 냉각시킨다.
8) 완충액과 역전사 효소를 사용하여 PCR 반응 혼합물을 작업 표면 상의 제조 바이얼 내에 제조한다.
9) 분취량의 PCR 반응 혼합물을 작업 스테이션 상의 각 웰에 피펫팅한다.
10)역전사
역전사가 일어나도록 하기 위해서 작업 스테이션 상의 플레이트를 교반하면서 48℃에서 30분 동안 배양한다.
11)비드 제거 1
자석위의 비드를 포획하기 위해서 비드 제거 커버를 플레이트 위에 배치하고; 제거 커버와 부착된 비드를 적하 스테이션으로 이동시키고; 비드를 적하 스테이션에서 적하시킨 다음, 커버를 세척 스테이션에서 세척한다.
12) 형광분석기; 커버를 작업 스테이션 상의 플레이트 위에 배치하고; 광차폐물을 작업 스테이션 위에 배치한다.
13)증폭
형광분석 커버가 DNA 포화가 일어났음을 표시할 때까지 플레이트를 열 순환시키고; 형광분석기 해독을 사용하여 각 웰 내 증폭 생성물의 양을 계산한다.
14) 광차폐물과 형광분석기 커버를 제거하고; 각 웰로부터 분취량을 제거한 다음, 저장을 위해 아카이브(archive) 어레이로 분배한다.
15) 완충액과 RNA 중합효소를 사용하여 전사 혼합물을 작업 표면 상의 제조 바이얼에 제조한다.
16) 분취량의 전사 혼합물을 작업 표면 상의 각 웰에 피펫팅한다.
17)전사
전사가 일어나도록 하기 위해서 작업 표면 상의 플레이트를 교반하면서 37℃에서 4시간 동안 배양한다.
18)정제
각 웰로부터 원하는 양의 RNA를 보유하기 위해서 필요한 프라이머 상자성 비드의 용적을 결정하고; 계산된 양의 비드를 작업 표면 상의 각 웰에 분배한다.
19) 작업 표면 상의 플레이트를 교반하면서 48℃에서 5분 동안 배양한다.
20)비드 분리 및 세척
자성 분리 커버를 플레이트에 배치함으로써 프라이머 비드를 분리하고; 각각의 웰을 흡인하고; 분리 커버를 제거하고; 세척 완충액을 각 웰에 피펫팅하며; 플레이트를 교반하면서 48℃에서 5분 동안 배양한다.
21) 원하는 수 만큼의 세척 사이클을 위해 단계 20)을 반복한다.
22)용출 2
자성 분리 커버를 플레이트에 배치함으로써 비드를 분리하고; 각각의 웰을흡인하며; 분리 커버를 제거하고; dH2O 100㎕을 각 웰에 피펫팅하며; RNA를 프라이머 비드로부터 용출하기 위해서 작업 스테이션 상의 플레이트를 교반하면서 95℃에서 3분 동안 배양한다.
23)비드 제거 2
자석위의 비드를 포획하기 위해서 비드 제거 커버를 플레이트 위에 배치하고; 제거 커버와 부착된 비드를 적하 스테이션으로 이동시키며; 비드를 적하 스테이션에서 적하시킨 다음, 커버를 세척 스테이션에서 세척한다.
24) 원하는 수 만큼의 사이클을 위해 단계 2)에서 다시 시작한다.
실시예 2
하기 실시예는 재조합 쥐의 셀렉틴/IgG 융합 단백질에서의 자동화된 SELEX의 성능을 설명한다. 타겟 선별에 대한 수동의 SELEX의 설명에 대해서 파아마(Parma) 등의 미국 특허 제5,780,228호(발명의 명칭 "렉틴에 대한 고 친화성 핵산 리간드")를 참조한다.
자동화 선별
재조합 쥐의 셀렉틴/IgG 융합물인 쥐의 PS-Rg(D. Vestweber로부터 판매됨)을 둥근 바닥 이뮬론 1 폴리스티렌 96 웰 마이크로역가 플레이트에 결과적으로 75㎕ SHMCK 완충액(10mM HEPES pH7.3, 120mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2)라고 언급되는 농도로 2시간 동안 실온(23℃)에서 수동적으로 코팅하였다. SHMCK만으로 코팅함으로써 대조군 웰을 제조하였다. 이어서 플레이트를 150㎕ SAT(SHMCK, 0.01%HSA(Sigma), 0.05% Tween 20(Aldrich)으로 6회 세척하고 200pmol의 겔 정제 RNA 풀을 75㎕ SAT 완충액에 첨가하였다. 플레이트를 MultiPROBE 204DT 피펫팅 작업 스테이션(Packard)에 장착된 37℃ 열 차단기(USA Scientific)에 배치하고 시료는 뚜껑을 덮지 않은 채로 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 후속의 모든 단계는 주지된 바를 제외하고 로봇 작업 스테이션에 의해 수행하였다. 플레이트로의 RNA 배양동안 20분마다 증발 손실(손실율이 14.5+0.4㎕/시간으로 측정됨)을 보상하고 반응물을 혼합하기 위해서 5㎕ dH2O를 첨가하였다. 이어서 플레이트를 15㎕ SAT 완충액으로 6회 세척하였다.
건조된 플레이트에 SHKE 75㎕(10mM HEPES pH7.3, 120mM NaCl, 5mM KCl, 5mM EDTA)를 첨가하고 10분마다 혼합하면서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, 상청액을 플레이트로부터 제거하여 원격 제어능이 있는 작업 스테이션에 장착된 MJ Research 열순환기에 첨가하였다.
자동화 증폭
0℃ 이하에서 작업 표면에 장착된 예비-냉장된 스티로폼(Styrofoam) 냉각기에 저장된 AMV 역 전사효소(Boeringer Mannheim)를 제조된 RT 완충액에 첨가하고 완전히 혼합하였다. 생성된 RT 혼합물 25㎕(50mM 트리스-HCl pH8.3, 60mM NaCl, 11mM Mg(OAc)2, 10mM DTT, 1mM dATP, 1mM dTTP, 1mM dGTP, 1mM dCTP, 400pmol 3P8, 20 유니트 AMV-RT/반응물)를 비어있는 배양 웰에 첨가하고 웰을 위한 세척을 제공하기 위해서 혼합하였다. 그런 다음, RT 혼합물을 열순환기로 이동시키고 용출된RNA에 첨가하여 완전히 혼합하였다. 이것에 증발을 막기 위해서 실리콘 오일(Aldrich) 25 ㎕을 첨가하였다. 이어서, 열순환기를 컴퓨터에 의해서 원격으로 전원을 켰다. 뚜껑을 닫고 반응물을 48℃에서 30분 동안, 그런 다음 60℃에서 5분 동안 배양하였다. RT 반응의 완료시 뚜껑을 당겨서 열고 반응물 10㎕를 정량 PCR(qPCR)에 의해 수동적으로 측정되도록 수동적으로 제거하였다.
스티로폼 냉각기에 저장된 Taq 중합효소(Perkin Elmer)를 제조된 PCR 완충액(퍼킨 엘머 완충제 2(50mM KCl, 10mM 트리스-HCl pH8.3), 7.5mM MgCl2, 400pmole 5P8)에 첨가하고 완전히 혼합하였다. 이어서, Taq 혼합물 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 뚜껑을 닫은 다음, PCR를 개시하였다. 93℃에서 3분 동안, 그런 다음 n 사이클(n은 RT 반응으로의 RNA 주입량에 의해 결정됨(qPCR 기재 참조)) 동안 93℃에서 1분, 53℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 이루어진 루프(loop)의 조건 하에서 PCR을 실행하였다. PCR 완료시, 뚜껑을 열고 50㎕를 제거한 다음, 고정된 37℃ 열 차단기 상의 비어있는 플레이트 웰에 첨가하였다.
스티로폼 냉각기에 저장된 T7 RNA 중합효소(Enzyco)를 제조된 전사 완충액(40 mM 트리스-HCl pH8, 4%(w/v) PEG-8000, 12mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM 스퍼미딘, 0.002% 트리톤 X-100, 100 유니트/ml 피로포스파타제(Sigma))에 첨가하고 완전히 혼합하였다. 전사 완충액 200㎕를 PCR 생성물 웰에 첨가하고 혼합하였다. 이러한 반응물에 실리콘 오일층 25㎕를 첨가하고 반응물을 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 완료된 반응물을 제거하고 PAGE에 의해 수동으로 정제하였다.
플레이트 특성화
1. 다양한 블록킹제의 시험
비어있는 이뮬론 1 웰에, 하기와 같은 것을 포함한 다양한 완충액 150㎕를 실온에서 30분 동안 배양하였다:
(1) SHMCK
(2) SuperBlock(Pierce)
(3) SHMCK + 0.1% I-Block(Tropix)
(4) SHMCK + 0.1% 카세인(Sigma)
(5) SHMCK + SuperBlock(1:1)
(6) SHMCK + 1% BSA
그런 다음, 웰을 SIT 완충제 150㎕로 6회 세척하였다. 이어서 SIT 완충액 중의 40N8 RNA 200pmol을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 웰을 SIT 완충액 150㎕로 6회 세척하였다. 각 웰에 dH2O 75㎕를 첨가하고 플레이트로부터 RNA를 용출하기 위해서 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 여기에 RT 혼합물 25㎕를 첨가하고 상기와 같이 배양하였다. 그런 다음, 용출물을 qPCR에 의해 존재하는 RNA 양에 대해 오프라인으로 측정하였다. 이 실험의 결과가 도 1에 도시되어 있다.
2. 바탕 중의 완충액 성분의 비차단 이뮬론 1 플레이트에 대한 역할
비어있는 이뮬론 1 웰에, 40N8 200pmol을 하기와 같은 완충액 100㎕ 중에서첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다:
(1) SIT(SHMCK, 0.1% I-Block, 0.05% Tween20)
(2) SHMCK
(3) SA(SHMCK, 0.01% HSA)
(4) ST(SHMCK, 0.05% Tween 20)
(5) SAT(SHMCK, 0.01% HSA, 0.05% Tween20)
그런 다음, 웰을 적합한 완충액 150㎕로 6회 세척하고 상기와 같이 SHKE로 용출하였다. 이어서, 용출물을 상기의 RT에 이어 qPCR에 의해 존재하는 RNA 양에 대해 측정하였다. 이 실험의 결과가 도 2에 도시되어 있다.
쥐의 PS-Rg로의 EDTA 용출 연구
4㎍/ml 쥐의 PS-Rg를 비어있는 웰에 SHMCK 75㎕ 중에서 실온에서 2시간 동안 코팅하고 상기와 같이 세척하였다. 이어서 이전의 수동 SELEX 실험으로부터 단리된, RNA 클론 #395 20pmol로의 3fmol의 적정물을 두 세트의 대조군 및 PS-Rg 웰에서 37℃에서 2시간 동안 코팅하고 상기와 같이 세척하였다. 그런 다음, 한 세트의 대조군 및 PS-Rg 웰을 제거하고 신틸레이션 카운팅에 의해 결합된32P-RNA에 대해 모니터링한다. 이어서 SHKE 50㎕를 다른 세트의 건조 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 혼합하면서 배양하였다. 그런 다음, 완충액을 제거하고32P 표지된 RNA를 신틸레이션 카운팅에 의해 측정하였다. 이 실험의 결과가 도 3에 도시되어 있다.
SELEX 진행
하기 표 1은 PS-Rg SELEX 실험 진행을 요약한 것이다. PS-Rg 로딩은 ㎍/ml 농도로 표시되었다. PS-Rg의 플레이트 표면으로의 결합은 고정된 양의 PS-Rg를 로딩하고, 상기와 같이 세척한 다음, 고 친화성 앞타머 #1901을 적정하여 결합 곡선을 실행시킴으로써 측정되었다. 이것은 여러 단백질 농도를 가지고 행하였다.
그런 다음, 이들 결합 곡선의 플레토우 값을 1:1 화학양론적 양으로 가정하여 표면에 결합된 활성 단백질 양의 표시로서 채택하였다. 도 4를 참조한다. 이들 데이터를 사용하여, 4㎍/ml 로딩시 플레이트가 거의 포화되는 것으로(계산된 포화는 220fmol/웰 PS-Rg) 측정되어 150fmol의 결합된 PS-Rg을 나타낸다. 측정된 신호(signal)는 각 시료에 대해 qPCR에 의해 측정된 바와 같이 PS-Rg를 함유하는 웰에 결합된 RNA 분자의 수를 나타낸다. 유사하게, 소음(noise)은 단백질을 함유하지 않는 대조군 웰에 결합된 RNA 분자 수의 표시이다.
라운드 로딩된 PS-Rg ㎍/ml 수동 신호 수동 소음 수동 신호/소음 로봇 신호 로봇 소음 로봇 신호/소음
1 4 4.8e+8 1.8e+7 2.7 1.5e+9 1.8e+6 833
2 4 1.6e+10 6.6e+6 2424 4.2e+9 1.5e+6 2800
3 0.2 4e+7 1e+7 4 2.8e+7 3.4e+6 8.2
4 0.2 1.1e+8 4.5e+7 2.5 2e+8 1.5e+7 13.3
5 0.2 3.1e+8 3.1e+7 10 1.4e+8 1e+6 140
실시예 3
정량적 PCR
밑줄친 부분이 N7 및 N8 템플리트에 상보적인 하기의 프라이머(5P7-FD2 및 5P8-FD2)가 고안되었다.
각 프라이머의 헤어핀은 ~85℃의 Tm을 가지며, 5' 말단의 형광단(6-FAM)과 이 줄기 상의 형광단 맞은 편의 퀸쳐(DABCYL)를 포함한다. 495nm의 여기시, 6-FAM에 의해 방출된 양자는 형광 공명 에너지 전달에 의해 DABCYL에 의해 흡수된다. 에너지 전달의 효율은 형광단과 퀸쳐 사이 거리의 여섯번째 동력에 의해 좌우된다. 형광단와 퀸쳐가 폐쇄된 헤어핀 배좌에서 매우 근접해 있기 때문에, 신호는 비병합 프라이머에 의해 거의 생성되지 않는다. 그러나, 프라이머가 PCR 동안 생성물에 병합되므로 형광단과 퀸쳐는 10 염기쌍 거리에 의해 더 분리되고 신호는 증가된다. 신호에서 증가는 형성된 생성물의 양에 직접적으로 비례된다.
PCR 반응에서 40N8 cDNA 템플리트, 프라이머 5P8 및 3P8 (80pmol)와 형광 프라이머 5P8-FD2(16pmol)를 사용하는 표준 곡선의 예가 도 5에서 직선 플로팅으로, 도 6에서 세미-로그 플로팅으로 도시되어 있다. 템플리트 농도는 106내지 1010카피/25㎕ 반응물의 범위이다. 형광 신호(내부 참고 염색약으로 표준화되고 배경-인출됨)을 PCR 사이클 수의 함수로서 플로팅한다. 초기 PCR 사이클에서, 생성물이 모든 반응에서 기하급수적으로 생성되지만; 바탕 신호는 생성물 신호를 초과한다. 생성물 신호가 바탕을 초과하는 사이클은 시작하는 템플리트 카피 수에 의해 좌우된다. 신호 역치 수준(y=0.03에서 꺽어진 선)은 바탕 수준을 초과하여 선별되고, 각 반응이 역치(Ct)를 교차하는 사이클은 템플리트 카피 수의 함수로서 플로팅되어 표준 곡선을 생성한다. 그런 다음, Ct 값을 기초로 하여 미지의 것에서의 템플리트 카피 수를 계산하기 위해서 표준 곡선을 위한 등식이 사용될 수 있다.
이러한 정량적 PCR 기술은 폴리스티렌 플레이트에 흡수된 PDGF를 타겟으로 하는 SELEX에서 신호 대 소음의 비와 절대 템플리트 카피 수를 측정하기 위해서 사용된다. 매우 낮은 단백질 로딩이 사용되므로(100amol/반응물 미만), 방사에 의한 정량은 가능하지 않다. 증폭 플롯은 60인 신호 대 소음 비에 대하여 바탕 웰에 결합된 10amol RNA와 타겟 웰에 결합된 600amol RNA의 정량을 나타낸다.

Claims (17)

  1. a) 타겟과 후보 혼합물을 접촉하는 단계, 여기서 후보 혼합물과 관련된 타겟에 대한 증가된 친화성을 갖는 핵산은 후보 혼합물의 나머지로부터 분리되어지고;
    b) 증가된 친화성 핵산을 후보 혼합물의 나머지로부터 분리하는 단계; 및
    c) 리간드 풍부한 핵산의 혼합물을 얻기 위해 증가된 친화성 핵산을 증폭하는 단계를 포함하고, 여기서 단계(a) 내지 (c)는 컴퓨터로 제어된 카티션 로봇 조작에 의해 작업 표면상의 하나 이상의 작업 스테이션에서 수행되어지는 것을 특징으로 하는 핵산의 후보 혼합물로부터 주어진 타겟에 대한 리간드인 핵산 리간드를 자동적으로 동정하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    d) 요구되는 수준으로 리간드 농축을 얻기 위해 요구되어지는 횟수만큼 각각 연속적으로 반복하여 얻은 리간드 풍부한 혼합물을 사용하여 단계 a) 내지 c)를 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 타겟은 고형 지지체에 부착되고, 단계(d)는 상기 후보 혼합물로부터 고형 지지체를 분리하는 것을 성취되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 고형 지지체는 다중-웰 마이크로역가 플레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 플레이트는 폴리스티렌으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 타겟은 소수성 상호작용에 의해 상기 플레이트에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 고형 지지체는 상자성 비드이고, 상기 상자성 비드의 분리는 상기 컴퓨터에 의해 제어된 자성 비드 분리기에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 후보 핵산 리간드는 고정된 시퀀스 영역을 가지고, 단계(c)는 상기 고정된 시퀀스 영역에 상보적인 프라이머로 중합효소 사슬 반응을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 컴퓨터는 증폭된 생성물의 양을 측정하고, 상기 측정을 사용하여 타겟으로부터 용출된 핵산 리간드의 초기 농도에 대한 값을 계산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 컴퓨터는 상기 값에 대응해서 예정된 방식으로 단계(a) 내지 (c)의 반응 조건을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 프라이머는 상기 프라이머의 형광 방출 프로파일이 증폭된 생성물로의 병합에 의해 변하도록, 상기 프라이머가 증폭된 생성물로 병합되는 경우, 서로서로 상대적으로 이동하는 뉴클레오티드 위치에서 형광단과 퀸칭 기로 표지되고, 상기 컴퓨터는 상기 변화를 감지하는 것으로 증폭된 생성물의 양의 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 컴퓨터는 형광체 검출 수단을 제어하고, 상기 컴퓨터는 상기 검출 수단이 증폭된 생성물의 양을 측정하도록 작동하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 프라이머의 하나 이상은 (a) 상기 고정된 시퀀스 영역에 상보적인 단일 스트랜드 DNA 분자; (b) 상기 단일 스트랜드 DNA 분자의 5'-말단에 부착된 줄기-루프 구조를 포함하고, 상기 줄기는 상기 줄기-루프 구조의 줄기의 반대 면상의 뉴클레오티드 자리에 위치된 형광단과 퀸칭제를 포함하고, 상기 위치된 뉴클레오티드 자리는 상기 형광단으로부터 나온 형광 신호가 상기 퀸칭제에 의해 실질적으로 퀸칭되도록 서로서로 충분히 가깝고; 상기 중합효소 사슬 반응동안 상기 프라이머에 어닐링되는 후보 핵산 리간드의 3' 말단의 확장은 상기 줄기구조를 파괴하고, 상기 형광 그룹은 상기 퀸칭 그룹에 의해 더이상 퀸칭되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 프라이머는 다음 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
    및
  15. a) 타겟과 후보 혼합물을 접촉하는 단계, 여기서 후보 혼합물과 관련된 타겟에 대해 증가된 친화성을 갖는 핵산은 후보 혼합물의 나머지로부터 분리되어지고;
    b) 증가된 친화성 핵산을 후보 혼합물의 나머지로부터 분리하는 단계; 및
    c) 리간드 풍부한 핵산의 혼합물을 얻기 위해 증가된 친화성 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 방법에 있어서, 컴퓨터에 의해서 제어된 자동화 기계에 의해 단계(a) 내지 (c)를 수행하는 것이 개선점인 것을 특징으로 하는 핵산의 후보 혼합물로부터 주어진 타겟에 대한 리간드인 핵산 리간드를 자동적으로 동정하는 방법.
  16. a) 타겟과 후보 혼합물을 접촉하는 단계, 여기서 후보 혼합물과 관련된 타겟에 대해 증가된 친화성을 갖는 핵산은 후보 혼합물의 나머지로부터 분리되어지고;
    b) 증가된 친화성 핵산을 후보 혼합물의 나머지로부터 분리하는 단계; 및
    c) 리간드 풍부한 핵산의 혼합물을 얻기 위해 증가된 친화성 핵산을 증폭하는 단계를 포함하고, 여기서 단계(a) 내지 (c)는 컴퓨터로 제어된 자동화 기계에 의해 실질적으로 수행되어지는 것을 특징으로 하는 핵산의 후보 혼합물로부터 주어진 타겟에 대한 리간드인 핵산 리간드를 자동적으로 동정하는 방법.
  17. 제 1항의 방법을 수행하는 자동화 기계.
KR1020017009027A 1999-01-19 2000-01-14 핵산 리간드의 자동 발생을 위한 방법 및 장치 KR20010101573A (ko)

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