JP2002534985A

JP2002534985A - 核酸リガンドの自動化生成のための方法および装置

Info

Publication number: JP2002534985A
Application number: JP2000594942A
Authority: JP
Inventors: ゴールド，ラリー; ズィチ，ドミニク・エイ; ジェニソン，ロバート; シュナイダー，ダニエル・ジェイ
Original assignee: Somalogic Inc
Current assignee: Somalogic Operating Co Inc
Priority date: 1999-01-19
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2002-10-22
Also published as: EP1144669A1; AU3209200A; WO2000043534A1; AU777823B2; MXPA01007352A; KR20010101573A; CA2360748A1; EP1144669A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、自動化ＳＥＬＥＸを行うための方法および装置を含む。ＳＥＬＥＸ法の工程は、コンピューターにより制御されるデカルトロボット操作装置により、作業面上の１つまたはそれ以上の作業ステーションで行われる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、ＳＥＬＥＸ法を用い、標的分子に対し特定の機能を有する核酸リガ
ンドを生成するための方法に関する。本明細書に記載される方法は、先行技術を
用いて以前可能であったより、劇的に短い時間で、そしてより少ないオペレータ
ー介入で、核酸リガンドが生成されることを可能にする。本発明は、オペレータ
ー介入をほとんどまたはまったく伴わず、核酸リガンドを生成することが可能な
装置を含む。

【０００２】発明の背景核酸は主に情報上の役割を持つというのが長年の定説であった。ＳＥＬＥＸ法
と称される、指数的濃縮によるリガンドの計画的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ
ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）として知られる方法を通じ、核酸がタンパク質と異なら
ない三次元構造多様性を有することが明らかになってきている。ＳＥＬＥＸ法は
、標的分子に対する非常に特異的な結合を持つ、核酸分子のｉｎｖｉｔｒｏ進
化のための方法であり、そして１９９０年６月１１日に提出された、現在放棄さ
れている、“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄ
ｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”と題される米国特
許出願第０７／５３６，４２８号、１９９１年６月１０日に提出された“Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／７１４
，１３１号、現在は米国特許第５，４７５，０９６号、１９９２年８月１７日に
提出された“ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＮｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／９３１，４７
３号、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３も参照
されたい）に記載され、これらの各々は、特に本明細書に援用される。これらの
出願の各々は、本明細書において、集合的にＳＥＬＥＸ特許出願と称され、いか
なる望ましい標的分子に対しても核酸リガンドを作成するための根本的に新規な
方法を記載する。ＳＥＬＥＸ法は、核酸リガンドと称される種類の産物を提供し
、各リガンドは特有の配列を有し、そして望ましい標的化合物または分子に特異
的に結合する特性を有する。各ＳＥＬＥＸ同定核酸リガンドは、既定の標的化合
物または分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ法は、核酸が多様な二次およ
び三次元構造を形成するのに十分な能力、並びに、モノマーまたはポリマーの実
質的にいかなる化学化合物ともリガンドとして作用する（特異的な結合対を形成
する）、モノマー内で利用可能な十分な化学的万能性を有するという、特有の洞
察に基づく。いかなる大きさまたは組成の分子を標的としてもよい。

【０００３】高親和性結合適用に適用されるＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合
物からの選択、並びに同じ一般的選択計画を用いた、結合、分配および増幅の段
階的反復を伴い、実質的にいかなる望ましい規準の結合親和性および選択性も達
成する。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくはランダム配列セグメントを含む核酸混合物
から出発し、結合に好ましい条件下で標的と混合物を接触させ、標的分子に特異
的に結合している核酸から非結合核酸を分配し、核酸・標的複合体を解離させ、
核酸・標的複合体から分離した核酸を増幅し、核酸のリガンド濃縮混合物を生じ
、その後、結合、分配、分離および増幅を、望ましいだけ再反復し、標的分子に
対する非常に特異的な高親和性核酸リガンドを生じる工程を含む。

【０００４】本発明により、ＳＥＬＥＸ法は、化学化合物としての核酸が、広範囲の形状、
大きさおよび配置のアレイを形成することが可能であり、そして生物学的系にお
いて核酸に示される以外のはるかに広いレパートリーの結合および他の機能が可
能であることを立証すると認識されている。

【０００５】本発明らは、いかなる既定の標的に関しても、核酸リガンドを同定することが
可能なものと同様の方式で、ＳＥＬＥＸ法またはＳＥＬＥＸ様の方法を用い、い
かなる選択された反応を促進することが可能な核酸も同定することが可能である
ことを認識した。理論的には、核酸およそ１０¹³ないし１０¹⁸の候補混合物内に
、多様な物理的および化学的相互作用各々を促進するのに適した形状を持つ核酸
が、少なくとも１つ存在すると推定される。

【０００６】いくつかの特定の目的を達成するように、基本的なＳＥＬＥＸ法が修飾されて
きている。例えば、１９９２年１０月１４日に提出された“Ｍｅｔｈｏｄｆｏ
ｒＳｅｌｅｃｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｄｉｓｏｎｔｈｅＢａｓ
ｉｓｏｆＳｔｒｕｃｔｕｒｅ”と題される米国特許出願第０７／９６０，０
９３号（米国特許第５，７０７，７９６号を参照されたい）は、特定の構造特性
を持つ核酸分子、例えば折れ曲がりＤＮＡを選択するための、ゲル電気泳動と組
み合わせたＳＥＬＥＸ法の使用を記載する。１９９３年９月１７日に提出された
“ＰｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａ
ｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／１２３，９３５号は、標的分子に結合
しおよび／または光架橋しおよび／または該分子を光不活性化することが可能な
光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸに基づく方法を記載
する。１９９３年１０月７日に提出された“Ｈｉｇｈ−ＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓＴｈａｔＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ
ＢｅｔｗｅｅｎＴｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅａｎｄＣａｆｆｅｉｎｅ”と題
される、現在放棄されている、米国特許出願第０８／１３４，０２８号（米国特
許第５，５８０，７３７号を参照されたい）は、非ペプチド性であってもよい、
非常に近縁の分子の間を区別することが可能な非常に特異的な核酸リガンドを同
定するための、対抗ＳＥＬＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と称される方法
を記載する。１９９３年１０月２５日に提出された“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥ
ｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌＥ
ｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＳｏｌｕｔｉｏｎＳＥＬＥＸ”と題される、現在放棄
されている、米国特許出願第０８／１４３，５６４号（米国特許第５，５６７，
５８８号を参照されたい）は、標的分子に高い親和性を有するオリゴヌクレオチ
ドおよび低い親和性を有するものの間の非常に効率的な分配を達成する、ＳＥＬ
ＥＸに基づく方法を記載する。

【０００７】ＳＥＬＥＸ法は、リガンドに改善された特性、例えば改善されたｉｎｖｉｖ
ｏ安定性または改善された搬送特性を与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性核
酸リガンドの同定を含む。こうした修飾の例には、リボースおよび／またはリン
酸および／または塩基位での化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含む、
ＳＥＬＥＸ法で同定された核酸リガンドは、１９９３年９月８日に提出された“
ＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓＣ
ｏｎｔａｉｎｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題される
、現在放棄されている、米国特許出願第０８／１１７，９９１号（米国特許第５
，６６０，９８５号を参照されたい）に記載され、該出願は、ピリミジンの５−
および２’−位で化学的に修飾されているヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌク
レオチドを記載する。上記の米国特許出願第０８／１３４，０２８号は、２’−
アミノ（２’−ＮＨ₂）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−
Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾されている１つまたはそれ以上のヌクレオチ
ドを含む、非常に特異的な核酸リガンドを記載する。１９９４年６月２２日に提
出された“ＮｏｖｅｌＭｅｔｈｏｄｏｆＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆ
ＫｎｏｗｎａｎｄＮｏｖｅｌ２’ ＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｓｉ
ｄｅｓｂｙＩｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＮｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃＤ
ｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０８／２６４，０２９号は
、多様な２’−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。

【０００８】１９９４年８月２日に提出された“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏ
ｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅ
ｎｔ：ＣｈｉｍｅｒｉｃＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２８
４，０６３号、現在は米国特許第５，６３７，４５９号および１９９４年４月２
８日に提出された“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇ
ａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｂｌｅｎ
ｄｅｄＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２３４，９９７号、現在
は米国特許第５，６８３，８６７号にそれぞれ記載されるように、ＳＥＬＥＸ法
は、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよ
び非オリゴヌクレオチド官能単位と組み合わせることを含む。これらの出願によ
り、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状および他の特性のアレイ、並びに効率的
な増幅および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能に
なる。

【０００９】ＳＥＬＥＸ法は、さらに、１９９５年５月４日に提出された“Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄＬｉｇａｎｄＣｏｍｐｌｅｘｅｓ”と題される米国特許出願第０８
／４３４，４６５号に記載されるように、診断用または療法用化合物中で、選択
された核酸リガンドを、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と組み合
わせることを含む。基本的ＳＥＬＥＸ法の修飾を記載する上述の特許出願の各々
は、特に、完全に本明細書に援用される。

【００１０】実質的にいかなる標的分子に対するリガンドも提供するＳＥＬＥＸの特有の能
力を仮定すると、核酸リガンドを生成するための自動化高処理法を持つことが非
常に望ましいであろう。本明細書に記載される方法および装置は、集合的に自動
化ＳＥＬＥＸと称され、ほとんどまたはまったくオペレーター介入を伴わず、大
きいプールの核酸リガンドを生成することを可能にする。特に、本発明に提供さ
れる方法は、核酸リガンドが、以前必要であったように、数週間または数ヶ月の
期間に渡るのではなく、わずか数日で日常的に生成されることを可能にするであ
ろう。自動化ＳＥＬＥＸ法の非常に平行な性質により、単一の自動化ＳＥＬＥＸ
法実験で、多様な標的に対するリガンドを同時に単離することが可能になる。同
様に、自動化ＳＥＬＥＸを用い、単一の実験で多くの異なる選択条件を用い、単
一の標的に対する核酸リガンドを生成してもよい。本発明は、ＳＥＬＥＸ法の能
力を非常に亢進し、そしてＳＥＬＥＸをリガンドの単離のための日常的な方法に
するであろう。

【００１１】発明の概要本発明は、実質的にいかなるものでもよい標的分子に対する核酸リガンドの自
動化生成のための方法および装置を含む。本方法は、自動化ＳＥＬＥＸ法と称さ
れる。最も基本的な態様において、該方法は、ロボット操作装置を用い、ＳＥＬ
ＥＸ法の個々の工程を行う作業面上の１つまたはそれ以上の作業ステーションに
試薬を移動させる。個々の工程は：１）候補核酸リガンドを、固体支持体上に固
定されている単数または複数の標的分子と接触させ；２）固体支持体上の標的分
子と望ましい方式で相互作用している核酸リガンドを、相互作用できなかった核
酸から分配し；そして３）標的分子と相互作用している核酸リガンドを増幅する
ことを含む。工程１−３は、自動化ＳＥＬＥＸ法および装置により望ましい周期
数行い；生じた核酸リガンドをその後、単離しそして精製する。

【００１２】発明の詳細な説明定義本明細書において、多様な用語が本発明の側面を指すよう用いられる。本発明
の構成要素の説明を明確にするのを補助するため、以下の定義が提供される：本明細書において、「核酸リガンド」は、標的に対する望ましい作用を有する
、非天然発生核酸である。核酸リガンドはまた、本明細書において、ときに、「
アプタマー」または「クローン」と称される。望ましい作用には、限定されるわ
けではないが、標的の結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を
修飾する／改変する方式での標的との反応、自殺阻害剤におけるような、標的へ
の共有結合、標的および別の分子の間の反応の促進が含まれる。好ましい態様に
おいて、作用は、標的分子への特異的結合親和性であり、こうした標的分子は、
主にワトソン／クリック塩基対形成または三重鎖らせん結合に依存する機構を通
じ核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここ
で核酸リガンドは、標的分子に結合される既知の生理学的機能を有する核酸では
ない。既定の標的のリガンドである核酸リガンドには、核酸候補混合物より：ａ
）候補混合物を標的と接触させ、ここで候補混合物に比較し、標的に増加した親
和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である；ｂ）増加
した親和性の核酸を残りの候補混合物から分配し；そしてｃ）増加した親和性の
核酸を増幅し、リガンド濃縮核酸混合物を生じ、これにより標的分子の核酸リガ
ンドが同定される、ことを含む方法により、同定される核酸が含まれる。

【００１３】本明細書において、「候補混合物」は、そこから望ましいリガンドを選択しよ
うとする、異なる配列の核酸の混合物である。候補混合物の供給源は、天然発生
核酸またはその断片、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸または
前述の技術の組み合わせにより作成された核酸由来であってもよい。本発明にお
いて、候補混合物はまた、「４０Ｎ８ＲＮＡ」または「ＲＮＡプール」とも称
される。好ましい態様において、各核酸は、ランダム領域で囲まれた固定配列を
有し、増幅過程を促進する。

【００１４】本明細書において、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、およ
びそのいかなる化学修飾物をも意味する。修飾には、限定されるわけではないが
、核酸リガンド塩基または全体としての核酸リガンドに、さらなる電荷、極性、
水素結合、静電相互作用、および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取り込
む他の化学基を提供するものが含まれる。こうした修飾には、限定されるわけで
はないが、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外ア
ミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシ
ルの置換；骨格修飾、メチル化、異常塩基対の組み合わせ、例えばイソ塩基、イ
ソシチジンおよびイソグアニジン、並びにそれらに匹敵するものが含まれる。修
飾はまた、キャッピングなどの３’および５’修飾も含んでもよい。

【００１５】「ＳＥＬＥＸ」方法論は、望ましい方式で標的と相互作用する、例えばタンパ
ク質に結合する、核酸リガンドの選択と、選択された核酸の増幅との組み合わせ
を伴う。所望による、選択／増幅工程の反復周期により、非常に多数の核酸を含
むプールから、標的と最も強く相互作用する１つまたは少数の核酸の選択が可能
になる。選択／増幅法の周期は、選択された目的が達成されるまで続ける。ＳＥ
ＬＥＸ方法論はＳＥＬＥＸ特許出願に記載される。

【００１６】「ＳＥＬＥＸ標的」または「標的」は、リガンドが望ましい、目的のいかなる
化合物または分子も意味する。標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖
、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷
移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、染色剤、栄養物、増殖因子などであって
もよく、制限はない。

【００１７】本明細書において、「固体支持体」は、共有または非共有結合を通じ、分子が
結合することが可能である、いかなるものでもよい表面と定義される。これには
、限定されるわけではないが、膜、プラスチック、常磁性ビーズ、荷電紙、ナイ
ロン、ラングミュア・ブロジェット膜、官能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン
、ＰＴＦＥ、ポリスチレン、ヒ化ガリウム、金および銀が含まれる。表面上に取
り込まれたアミノ、カルボキシル、チオールまたはヒドロキシルなどの官能基を
有することが可能な、当業に知られるいかなる他の素材も意図される。これには
、いかなるトポロジーの表面も含まれ、限定されるわけではないが、球状表面、
溝付き表面、および筒状表面が含まれる。

【００１８】「分配」は、標的分子に結合しているリガンドを、標的分子に結合していない
核酸から分離することが可能な、いかなる方法も意味する。より広く言及すると
、分配は、標的分子への相対的親和性に基づき、候補混合物中のすべての核酸を
少なくとも２つのプールに分離することを可能にする。分配は、当業者に知られ
る多様な方法により、達成してもよい。核酸・タンパク質対は、ニトロセルロー
スフィルターに結合することが可能であるが、非結合核酸は不可能である。核酸
・標的複合体を特異的に保持するカラムを、分配に用いてもよい。例えば、カラ
ム上に結合している標的分子と結合することが可能なオリゴヌクレオチドの場合
、最も高い親和性の核酸リガンドを分離しそして単離するのに、カラムクロマト
グラフィーを使用することが可能である。標的分子が結合しているビーズもまた
、混合物中の核酸リガンドを分配するのに用いることが可能である。表面プラズ
モン共鳴技術を用い、センサーチップ上に標的を固定し、そして該チップ上に混
合物を流すことにより、混合物中の核酸を分配してもよく、ここで標的に対し親
和性を有する核酸は、標的に結合することが可能であり、そして残った核酸を洗
い流すことが可能である。液体・液体分配と共にろ過ゲル遅延、および密度勾配
遠心分離を用いてもよい。

【００１９】最も基本的な形で、ＳＥＬＥＸ法は、以下の一連の工程により定義することが
可能である：１）異なる配列の核酸候補混合物を調製する。候補混合物は、一般的に固定配列
の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一部位に同一配列を含む）およ
びランダム配列の領域を含む。固定配列領域は：ａ）以下に記載される増幅工程
を補助するよう；ｂ）標的に結合する既知の配列を模倣するよう；またはｃ）候
補混合物中の既定の構造配置の核酸の濃度を亢進するよう、選択される。ランダ
ム配列は、完全にランダム（すなわちいかなる位でも塩基が４つのうち１つであ
ることを見出すことが可能）でもまたは部分的にのみランダム（例えば、塩基を
見出す可能性が、いかなる部位でも０および１００パーセントの間のいずれでも
よいレベルで選択することが可能である）でもよい。２）候補混合物を、標的および候補混合物のメンバーの間の結合に好ましい条件
下で、選択された標的と接触させる。これらの状況下では、標的および候補混合
物核酸の間の相互作用は、標的および標的に対し最も強い親和性を有する核酸の
間の核酸・標的対を形成するとみなすことが可能である。３）標的に対し最も高い親和性を持つ核酸を、標的に対しより少ない親和性の核
酸から分配する。最も高い親和性の核酸に相当する配列は、候補混合物中に非常
に少数のみ（そしておそらくわずか１つの核酸分子が）存在するため、一般的に
、候補混合物中の核酸の特定の量が分配中に保持されるように、分配規準を設定
することが望ましい。４）その後、分配中、標的に対し相対的に高い親和性を有すると選択された核酸
を増幅し、標的に対し相対的に高い親和性を有する核酸が濃縮された、新規候補
混合物を生成する。５）上記の分配および増幅工程を反復することにより、新たに形成される候補混
合物は、より少ない特有配列を含み、そして標的に対する核酸親和性の平均的度
合いは、一般的に増加するであろう。極端な場合、ＳＥＬＥＸ法は、標的分子に
対し最も高い親和性を有する、元来の候補混合物由来の核酸に相当する、１つま
たは少数の特有の核酸を含む、候補混合物を生じるであろう。

【００２０】ＳＥＬＥＸ特許出願は、本方法を非常に詳細に記載し、そして詳述する。含ま
れるのは、本方法に用いることが可能な標的；最初の候補混合物を調製する方法
；候補混合物中の核酸を分配する方法；および分配された核酸を増幅し、濃縮候
補混合物を生成する方法である。ＳＥＬＥＸ特許出願はまた、タンパク質が核酸
結合タンパク質であるまたはない、タンパク質標的を含む、標的種の数まで得ら
れるリガンド溶液も記載する。

【００２１】１つの態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法は、１つまたはそれ以上のコンピュ
ーター制御デカルトロボット操作装置を用い、作業面上に位置する作業ステーシ
ョンから作業ステーションへ、溶液を移動させる。ＳＥＬＥＸ法の個々の工程は
、作業ステーションで行う。いくつかの態様において、各ロボット操作装置は、
水平および垂直平面でツールを運ぶことが可能な、移動可能アームである。意図
される１つのツールは、ピペッティングツールである。ロボット操作装置は、ピ
ペッティングツールを用い、作業面上の明示された位置から液体を採取し、そし
てその後、異なる位置に液体を分配する。ピペッティングツールはまた、液体を
繰り返し採取しそして排出する、すなわち“吸い込みそして吐き出す”混合によ
り、液体を混合するのに用いてもよい。ロボット操作装置はまた、ピペッティン
グツールから使い捨てチップを廃棄物容器に排出し、そしてその後、作業面上の
適切なステーションから新鮮なチップを取ることも可能である。

【００２２】好ましい態様において、ピペッティングツールは、ＳＥＬＥＸ法にバルクで必
要とされる多様な緩衝液および試薬のいくつかを含む、１つまたはそれ以上の液
体容器につながれている。ピペッティングツールにより、どの溶液を分配するか
は、コンピューター制御バルブが決定する。ピペッティングツールはさらに、作
業面の望ましい位置で、その部位にすでに存在している液体とチップの外側が接
触することなく、液体を排出することが可能である。これは、ピペットチップが
、各液体排出工程で汚染される可能性を非常に減少させ、そして自動化ＳＥＬＥ
Ｘ法中に行わなければならないピペットチップ交換数を減少させる。

【００２３】いくつかの態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法の特定の工程で用いられるチッ
プは、再使用してもよい。例えば、チップは、ＳＥＬＥＸ法の各周期で同一試薬
を分配するのに用いる場合、再使用することが可能である。チップは、各使用後
、リンスステーションでリンスし、そしてその後、再び必要とされるまで、作業
面上のラックに保管される。この方式でのチップの再使用は、自動化ＳＥＬＥＸ
法中に用いられるチップ数を劇的に減少させることが可能である。

【００２４】好ましい態様において、真空吸引系もまた、別個のロボット操作装置につない
でもよい。本系は、真空供給源につながれた細針を用い、作業面上の望ましい位
置から、針を液体に浸すことなく、液体を回収する。ピペッティングツールおよ
び真空吸引装置が別個のロボット操作装置につながれている態様では、ピペッテ
ィングツールおよび吸引系は、作業面上の異なる位置で、同時に作動することが
可能である。

【００２５】好ましい態様において、ロボット操作装置はまた、作業面上の明示された位置
から位置へ、物体を移動させることが可能である。こうした物体には、マルチウ
ェルプレートのふた、およびまた、以下に略述される態様で用いられる装置の多
様な部品が含まれる。本発明の１つの態様において、ロボット操作装置は、物体
を機械的につかむための「グリッパー」を用いる。他の態様において、上述の真
空吸引系をやはり用い、移動しようとする物体に付着することが可能な吸引カッ
プに動力を供給する。例えば、上述の細針を吸引カップに取り付け、カップに真
空を適用し、吸引カップを用いて物体を取り上げ、物体を新たな位置に移動させ
、真空を解除することにより、新たな位置で物体を放し、その後、作業面上の保
管位置に吸引カップを置いてもよい。

【００２６】本発明に意図される適切なロボット系には、ＭｕｌｔｉＰＲＯＢＥ^TM系（Ｐａ
ｃｋａｒｄ）、Ｂｉｏｍｅｋ２０００^TM（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ）およびＴｅｃａｎ^TM（Ｃａｖｒｏ）が含まれる。図７−１０に示される
態様において、系は３つのロボット操作装置を用いる：１つはピペッティングツ
ールを運び、１つは真空吸引装置を運び、そして１つは蛍光測定カバー（以下を
参照されたい）を運ぶ。

【００２７】最も基本的な態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法は：（ａ）包含容器中の核酸リガンド候補混合物を、固体支持体に結合している標的
分子と接触させ；（ｂ）包含容器中で候補混合物および固体支持体をあらかじめ決められた温度で
インキュベーションし、候補核酸リガンドが標的と相互作用するのを可能にし；
（ｃ）固体支持体を結合標的および結合核酸リガンドと共に候補混合物から分配
し；（ｄ）所望により、あらかじめ決められた条件下で固体支持体を洗浄し、固体支
持体または包含容器と非特異的に結合している核酸を除去し；（ｅ）標的と特異的に相互作用する核酸リガンドを、固体支持体から遊離させ；
（ｆ）遊離核酸リガンドを増幅し、精製し、そして定量化し；（ｇ）あらかじめ決められた回数、工程（ａ）−（ｆ）を反復し；そして（ｈ）生じた核酸リガンドを単離することを伴う。工程（ａ）−（ｇ）は、コンピューター制御ロボット操作装置によ
り、自動的に行われる。コンピューターはまた、各増幅工程前に、標的分子から
溶出された核酸リガンドの量を含め、自動化ＳＥＬＥＸ法の進行に関する情報も
測定しそして記憶する。コンピューターはまた、自動化ＳＥＬＥＸ法に必要な多
様な加熱および冷却工程も制御する。

【００２８】好ましい態様において、作業面は、個々のＳＥＬＥＸ反応が行われる単一の作
業ステーションを含む。本ステーションは、必要とされる温度で反応混合物をイ
ンキュベーションするため、コンピューターにより制御される加熱および冷却手
段を含む。１つの適切な加熱および冷却手段はペルチエ元素である。作業ステー
ションはまた、好ましくは、ＳＥＬＥＸ反応構成要素が適切に混合されることを
確実にする、震蘯機構も含む。作業面はまた、ＳＥＬＥＸに必要な酵素が冷蔵下
に保管されるステーション、洗浄溶液および緩衝液が保管されるステーション、
ツールおよび装置が保管されるステーション、ツールおよび装置をリンスするこ
とが可能なステーション、およびピペットチップおよび試薬が廃棄されるステー
ションも含む。作業面はまた、ＳＥＬＥＸ反応混合物の少量のアリコットの記録
（ａｒｃｈｉｖａｌ）保管のためのステーションも含んでもよい。これらの混合
物は、後の解析のため、選択された時点でピペッティングツールにより作業ステ
ーションから自動的に除去することが可能である。作業面はまた、ロボット操作
装置が、使用直前に、調製バイアル中に酵素試薬溶液のバッチを調製する、試薬
調製ステーションも含んでもよい。

【００２９】他の態様において、作業面は、１つ以上の作業ステーションを含む。この方式
では、自動化ＳＥＬＥＸ法の個々の工程を非同時的に行うことが可能である。例
えば、第一の組の候補核酸リガンドが工程（ｆ）の第一の作業ステーション上で
増幅されている間、異なる実験由来の別の組を、異なる作業ステーション上で工
程（ｂ）の支持体結合標的分子と接触させてもよい。多数の作業ステーションを
使用することで、ロボット操作装置が作動していない時間を最小にする。

【００３０】さらに他の態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法の個々の工程を、単一の多機能
作業ステーションではなく、別個の作業ステーションで行う。これらの態様にお
いて、候補核酸混合物の溶液を、ロボット操作装置により、１つの作業ステーシ
ョンから別の作業ステーションに移す。反応混合物の加熱および冷却のため、別
個の作業ステーションを提供してもよい。

【００３１】好ましい態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法の個々の工程を、アレイ形式に配
置した包含容器内で行う。これにより、異なる標的または異なる反応条件を用い
た、多くの異なるＳＥＬＥＸ反応を、単一の作業ステーション上で同時に行うこ
とが可能になる。例えば、いくつかの態様において、個々の工程は、Ｉｍｍｕｌ
ｏｎ１プレートなどのマイクロタイタープレートのウェル中で行うことが可能
である。他の態様において、小さいプラスチック試験管のアレイを用いてもよい
。典型的な試験管アレイには、８ｘ１２形式で並べられた９６の０．５ｍ
ｌ丸底薄壁ポリプロピレン試験管が含まれる。アレイは、加熱および冷却工程中
、蒸発による液体損失を防ぎ、そしてまた混入を防ぐため、覆ってもよい。これ
らの間、ロボット操作装置により、アレイ上に、加熱されたふたを含む、いかな
る多様なふたを置いてもよい。さらに、アレイは、マルチピペッター装置の使用
を可能にし、これは必要とされるピペッティング工程数を非常に減少させること
が可能である。本明細書の目的のため、「ウェル」という用語は、いかなるアレ
イ形式でもよい、個々の包含容器を指すよう、用いられるであろう。

【００３２】標的分子を結合させるのに適した固体支持体は当業に周知である。共有または
非共有的に、標的分子を結合させることが可能な、いかなる固体支持体も本発明
に意図される。固体支持体への分子の共有結合は当業に周知であり、そして非常
に多様な誘導体化化学反応を用い、達成することが可能である。標的の非共有結
合は、疎水性相互作用に依存してもよく；あるいは、ストレプトアビジンで固体
支持体を被覆してもよく、これはビオチンに結合している標的分子に強く結合す
るであろう。

【００３３】特に好ましい態様において、固体支持体は常磁性ビーズである。標的分子が常
磁性ビーズに結合している場合、標的分子および核酸リガンドの複合体は、ウェ
ルに磁気場を適用することにより、候補混合物から迅速に分配することが可能で
ある。好ましい態様において、磁気場は、各ウェルの壁に隣接する電磁石のアレ
イにより適用される；電磁石がコンピューターにより活性化されると、常磁性標
的ビーズが壁の側面に保持される。磁石は、作業ステーションの不可欠な部分に
あってもよいし、またはロボット操作装置により作業ステーション上に下げても
よいカバーに取り付けてもよい。後者の態様では、磁気分離カバーにより、ウェ
ル自体への接近可能性を遮断することなく、磁石をウェルに隣接して置くことが
可能になる。この方式で、カバーが適所にある場合、ウェルにピペッティングお
よび吸引装置が接近することが可能である。磁石活性化後、液体をウェルから吸
引した後、洗浄溶液を添加することが可能である。電磁石を不活性化すると、ま
たはカバーを除くと、ビーズは溶液に再懸濁される。磁気分離カバーは作業面上
に保管してもよい。他の態様において、分離カバー中の磁石は、永久磁石である
。この場合、カバーを取り去ることにより、磁石の影響が除かれ、そしてビーズ
が懸濁されることが可能になる。

【００３４】さらに別の態様において、ビーズ分離に用いられる磁石は、ウェルの隣接する
列の間にスライドさせることが可能な一連のバーに取り付けられている。各バー
は、バーがウェルの間に完全に挿入された場合、各ウェルに、少なくとも１つの
磁石が隣接するように、その長さに沿って規則的な間隔で置かれる磁石を有する
。例えば、８ｘ１２アレイのウェルは、８つの磁石バーを持ち、各バーは１
２の磁石を持つであろう。本態様において、ビーズ分離は、ウェルの間にバーを
挿入することにより達成され；ビーズ遊離は、ウェルの間からバーを取り去るこ
とにより達成される。バーのアレイは、コンピューター制御ステッパーモーター
により移動させてもよい。

【００３５】上述の態様に用いられる常磁性標的ビーズは、好ましくは、作業ステーション
上のアレイ形式のレイアウトを反映するアレイ形式で作業面上に保管される。ビ
ーズ保管アレイは、好ましくは冷却し、そして使用前にビーズが懸濁されたまま
であることを確実にするため、攪拌する。

【００３６】ビーズは、第二の磁石アレイを用い、作業ステーションのウェルから完全に除
いてもよい。好ましい態様において、この第二のアレイは、ロボット操作装置に
より、作業ステーション上の個々のウェルの表面上に置くことが可能なカバー上
に搭載された電磁石のアレイを含む。本ビーズ除去カバー上の電磁石は、ウェル
中の液体中に突き出すように成形されている。電磁石が活性化されると、ビーズ
がこれらに引き寄せられる。その間に、ビーズ除去カバーをウェルから取り去る
と、作業ステーションから効率的にビーズを除去することが可能である。ビーズ
は廃棄してもよいし、または自動化ＳＥＬＥＸの次の周期に使用するため、ビー
ズ保管アレイ中に戻してもよい。その後、次のビーズ除去工程前に、作業面上の
洗浄ステーションで、ビーズ除去カバーを洗浄してもよい。

【００３７】常磁性ビーズを伴う典型的な態様では、自動化ＳＥＬＥＸ法は、ピペッティン
グツールが、ビーズのアリコットを――それに結合した標的と共に――作業ステ
ーション上に位置するマイクロタイタープレートの個々のウェルに分配したとき
に開始する。個々のウェルは、すでに、先にロボット操作装置により分配されて
いる核酸リガンド候補混合物のアリコットを含む。ビーズを分配した後、ロボッ
トは、所望により、各ウェルの内容物を上下に“吸い込みそして吐き出し”、完
全な混合を促進する。その後、候補混合物中の核酸リガンドがビーズに結合して
いる標的分子に結合するのを可能にするため、マイクロタイタープレートを、作
業ステーション上で、あらかじめ選択された温度でインキュベーションする。プ
レートを攪拌することで、ビーズが懸濁されたままであることが確実になる。

【００３８】適切な時間、インキュベーションした後、ロボット操作装置により、磁気分離
カバーをマイクロタイタープレート上に置く。その後、ビーズをウェルの側面に
保持し、そして吸引ツールが非結合候補核酸を含む溶液を、ウェルから除去する
。その後、低塩溶液などの洗浄溶液を、ピペッティングツールにより、各ウェル
に分配してもよい。磁気分離カバーを取り去ることによりまたは電磁石を不活性
化することにより、ウェルの側面からビーズを遊離させ、その後、攪拌および“
吸い込みそして吐き出す”混合により、洗浄溶液中に再懸濁する。磁気分離カバ
ーを再びプレート上に置き、そして洗浄溶液を吸引する。この洗浄ループを、あ
らかじめ選択された周期数、繰り返してもよい。洗浄ループの最後に、ビーズを
空のウェルの側面に保持する。

【００３９】その後、標的分子から核酸リガンドを溶出させるよう設計された溶液、例えば
ｄＨ₂Ｏに、ビーズを再懸濁してもよい。標的からの核酸リガンドの解離はまた
、作業ステーション上で、ビーズを高温に加熱することにより、達成してもよい
。

【００４０】ビーズ結合標的からの核酸リガンドの解離後、ピペッティングツールにより、
候補核酸リガンドの増幅を行うのに必要な酵素および緩衝液構成要素を、ウェル
に分配してもよい。増幅、精製および定量化後（以下を参照されたい）、あらか
じめ決定された量の増幅候補混合物を、自動化ＳＥＬＥＸ法の次の周期で用いて
もよい。周期中のいかなる時点でも、ピペッティングツールは、候補混合物のア
リコットを除去し、そして後の性質決定のため、記録プレート中に保管すること
が可能である。さらに、インキュベーション期間中、ピペッティングツールは、
ＳＥＬＥＸ法の他の工程のための反応混合物を調製することが可能である。

【００４１】上述のように、自動化ＳＥＬＥＸ法および装置の好ましい態様は、マイクロタ
イタープレートおよび磁気ビーズを用い、選択を達成する。しかし、結合核酸リ
ガンドを非結合リガンドから分配するいかなる他の方法も、本発明に意図される
。例えば、いくつかの態様において、標的分子はマイクロタイタープレートの表
面に直接カップリングされる。本方式でカップリングするのに適した方法は、当
業者に周知である。

【００４２】他の態様において、標的分子は、当業に知られる親和性分離カラムにカップリ
ングされる。ロボット装置は候補混合物をこうしたカラムに分配するであろうし
、そして結合核酸リガンドは、適切な洗浄工程後、マイクロタイタープレートの
ウェルに溶出させることが可能である。

【００４３】さらに他の態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法で用いられる固体支持体は、表
面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップである。核酸リガンドの単離におけ
るＳＰＲセンサーチップの使用は、本明細書に完全に援用される、“Ｆｌｏｗ
ＣｅｌｌＳＥＬＥＸ”と題される、ＷＯ９８／３３９４１に記載される。フ
ローセルＳＥＬＥＸ法では、標的分子を表面プラズモン共鳴センサーチップの表
面にカップリングする。チップの表面および周囲の媒体の接合部での屈折指数は
、チップの表面に結合する物質に非常に感受性である。本発明の１つの態様にお
いて、核酸リガンドの候補混合物を、ロボット装置によりチップ上に通過させ、
そしてチップ結合標的および核酸リガンドの間の結合相互作用の動力学を、チッ
プからの共鳴シグナルの読み取りを行うことによりモニターする。こうした読み
取りは、ＢＩＡＣｏｒｅ２０００^TM（ＢＩＡＣｏｒｅ，Ｉｎｃ．）などの装
置を用い、行ってもよい。その後、結合核酸リガンドをチップから溶出させても
よい；解離動力学は、共鳴シグナルを測定することにより、追ってもよい。この
方式で、自動化ＳＥＬＥＸ法を制御するコンピューターをプログラミングし、目
的の標的との非常に迅速な結合速度および遅い解離速度を有する核酸リガンドを
自動的に収集することが可能である。その後、収集核酸リガンドを増幅してもよ
く、そして自動化ＳＥＬＥＸ法周期を再び開始してもよい。

【００４４】さらに他の態様において、固体支持体は、非常磁性ビーズである。ビーズの通
過を遮断するのに十分に小さいウェル中の穴を通じて液体を吸引することにより
、こうしたビーズを含むウェルから溶液を除去してもよい。例えば、０．２μＭ
フィルターを備えた真空マニホールドを用い、１００μＭビーズを分配してもよ
い。

【００４５】自動化ＳＥＬＥＸ法の最後に、配列解析およびクローニングのため、生じた核
酸リガンドを自動化ＳＥＬＥＸ法装置から単離してもよい。

【００４６】候補核酸リガンドの増幅自動化ＳＥＬＥＸ法の各結合および分配工程の最後に、候補核酸リガンドを増
幅しなければならない。好ましい態様において、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）を用いて達成する。自動化ＳＥＬＥＸ法において候補核酸リガンドは、
好ましくは、すべて固定５’および３’領域を有するため、これらの領域に結合
するプライマーを用い、ＰＣＲを容易にする。

【００４７】標的ビーズを用いる態様において、増幅法を開始する前に、ビーズをウェルか
ら除去する。常磁性ビーズを用いる場合、これは、上述の磁気除去系を用い、行
うことが可能である。

【００４８】候補核酸リガンドは、一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、一本鎖ＲＮＡ分
子、または二本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。候補混合物中のＲＮＡ核酸リガン
ドを増幅するため、まずＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後ｃＤＮＡに対して
ＰＣＲを行うことが必要である。本方法はＲＴ−ＰＣＲとして知られ、自動化Ｓ
ＥＬＥＸ法を用い、必要な酵素、プライマーおよび緩衝液を溶出リガンドを含む
作業ステーション上のウェルに分配することにより、行うことが可能である。そ
の後、生じた反応混合物をまず、逆転写を促進する温度で、作業ステーション上
でインキュベーションする。逆転写後、作業ステーションは、反応混合物を熱反
復し、ｃＤＮＡ産物を増幅する。その後、増幅産物の量を測定し、標的から溶出
された候補核酸リガンドの量に関する値を得る（以下を参照されたい）。

【００４９】ＲＮＡリガンドでは、増幅ＤＮＡ分子を転写し、自動化ＳＥＬＥＸの次の周期
のため、候補ＲＮＡリガンドのプールを再生しなければならない。これは、増幅
工程で、転写を促進する部位、例えばＴ７ポリメラーゼ部位を含むプライマーを
用いることにより、達成することが可能である。これらのプライマーは、ＰＣＲ
工程中の増幅産物中に取り込まれる。これらの部位からの転写は、単に、増幅混
合物中に適切な酵素および緩衝液構成要素を分配し、そしてその後、適切な温度
でインキュベーションすることにより、達成することが可能である。その後、あ
らかじめ決定された量の増幅混合物を、自動化ＳＥＬＥＸ法の次の周期で用いる
。

【００５０】増幅混合物からのＲＮＡリガンドの精製いくつかの態様において、自動化ＳＥＬＥＸの次の周期を開始する前に、増幅
ＲＮＡリガンドをそのＤＮＡテンプレートから精製する。これは、ＲＮＡリガン
ドの３’定常領域に相補的なプライマーが結合している常磁性ビーズの第二の組
を用い、行うことが可能である。これらのプライマービーズを転写増幅混合物に
添加すると、新たに転写された全長ＲＮＡリガンドがビーズ結合プライマーにハ
イブリダイズし、一方、増幅二本鎖ＤＮＡ分子は溶液中に残る。ビーズは、上述
のように、ウェルに磁気場を適用し、そしてウェル中の液体を吸引することによ
り、反応混合物から分離することが可能である。その後、ビーズをあらかじめ選
択された温度で、適切な緩衝液中で洗浄し、そしてその後、溶出緩衝液（典型的
にはｄＨ₂Ｏ）中で加熱することにより、ビーズからＲＮＡリガンドを溶出させ
てもよい。最後に、ビーズを作業ステーション上のウェルから除去し、上述のよ
うに、ウェル中に候補ＲＮＡリガンドが残存する溶液のみを残してもよい。この
点は、自動化ＳＥＬＥＸ法の１つの周期の完了を示す。

【００５１】添加されたプライマービーズの量は、ウェルに保持されるＲＮＡリガンドの量
を決定する。したがって、自動化ＳＥＬＥＸ法の次の周期に用いられるＲＮＡリ
ガンドの量は、増幅混合物に添加されるプライマービーズの量を変化させること
により、調節することが可能である。用いるＲＮＡリガンドの量は、ＰＣＲ産物
量の定量化を通じ、決定することが可能である（以下を参照されたい）。

【００５２】各増幅混合物中の溶出核酸リガンド量の計算特定の態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法の次の周期を開始する前に、標的か
ら溶出された候補核酸リガンドの量を測定することが重要である可能性がある。
こうした測定は、選択法の効率および進行に関する情報を生じる。増幅反応のテ
ンプレートとして作用する、溶出核酸リガンドの測定は、各ＰＣＲ反応から生じ
る増幅産物量の測定に基づき、計算することが可能である。

【００５３】好ましい態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法は、増幅中のＰＣＲ産物の自動化
リアルタイム定量化の新規の系を用いる。これは続いて、自動化ＳＥＬＥＸ法中
、リアルタイムでモニターしようとする選択実験の進行を可能にする。好ましい
態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法は、フルオロフォア／消光対プライマー系を
用いる。本系を用い、増幅混合物の蛍光発光を測定することにより、反応混合物
中に導入された溶出核酸リガンド量を自動的に計算する。本発明の１つのこうし
た態様において、その５’端に結合した短いヘアピン領域を有するプライマーを
用い、ＰＣＲ反応を行う。ヘアピンのステムは、一方の側に結合したフルオロフ
ォアおよびフルオロフォアの反対側に結合した消光剤を有する。消光剤およびフ
ルオロフォアは、ステム中で、効率的なエネルギー移動が起こるのに十分近くに
位置し、そしてしたがって、フルオロフォアの励起に際し、蛍光シグナルはほと
んど生成されない。こうしたプライマーの例は、実施例２に記載される。ＰＣＲ
反応中、プライマーにアニーリングするＤＮＡ分子の３’端のポリメラーゼ伸長
が、ヘアピンのステムを破壊する。その結果、消光剤およびフルオロフォアの間
の距離が増加し、消光エネルギー移動の効率が劇的に低下する。したがって、取
り込まれたプライマーは取り込まれていないプライマーより、はるかに高い蛍光
発光シグナルを有する。ＰＣＲ周期数の関数として蛍光シグナルをモニターする
ことにより、ＰＣＲ反応動力学をリアルタイムでモニターすることが可能である
。本方式で、各反応において、標的から溶出される候補核酸リガンドの量を定量
化することが可能である。この情報を続いて、選択法の進行を追うのに用いても
よい。

【００５４】他の態様において、候補核酸リガンドテンプレートを、ＲｏｃｈｅＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓから入手可能なＴａｑＭａｎ^TMプローブＰＣＲ系を
用いて定量化する。簡潔には、ＴａｑＭａｎ^TMプローブは、検出されるテンプレ
ートに相補的な配列、５’端上のフルオロフォアおよび３’端上の消光剤を持つ
、オリゴヌクレオチドである。該プローブを標準的ＰＣＲ反応に添加し、そして
各ＰＣＲ周期のアニーリング期中、プライマー結合部位の間でテンプレートにア
ニーリングさせる。伸長期中、プローブはＴａｑポリメラーゼの５’→３’エキ
ソヌクレアーゼ活性により分解され、消光剤からフルオロフォアを分離し、そし
てシグナルを生じる。ＰＣＲ開始前には、プローブは損なわれておらず、そして
フルオロフォアの励起エネルギーは、非放射能的に消光剤に移動する。ＰＣＲ中
、テンプレートが増幅されるにつれ、プローブが分解され、そして生成される蛍
光シグナルの量は、形成されるＰＣＲ産物の量に正比例する。

【００５５】本発明は、作業ステーション上で、熱反復中の単数または複数の反応混合物の
蛍光発光プロフィールをモニターすることが可能な蛍光測定装置の使用を意図す
る。意図される適切な装置には、フルオロフォアの励起供給源、例えばレーザー
、および反応混合物からの蛍光発光を測定する手段、例えば電荷結合素子（ＣＣ
Ｄ）カメラが含まれる。適切なフィルターを用い、正しい励起および発光波長を
選択する。特に好ましい態様は、ロボット操作装置により、作業ステーション上
のウェル上に置いてもよい、光学的に透明なカバー上に搭載された蛍光測定装置
を用いる。ウェル上に置かれ、そしてその後、光遮蔽で覆われた際、本蛍光測定
カバーは、あらかじめ選択された間隔で全アレイの画像を捉えることが可能であ
る。コンピューターはこの画像を分析し、その時点の各ウェル中の増幅産物の量
に関する値を計算する。増幅工程の最後に、ロボット操作装置は、光遮蔽および
蛍光測定カバーを除き、そしてこれらを作業面上の保管ステーションに戻す。

【００５６】好ましい態様において、ＰＣＲ産物量の測定を用い、増幅反応混合物にテンプ
レートとして取り込まれる溶出核酸リガンドの量に関する値を決定する。これは
、増幅産物の量を、同一条件下で増幅された既知の濃度のテンプレートからあら
かじめ得られた、コンピューターに記憶されている値と比較することにより、行
うことが可能である。他の態様において、自動化ＳＥＬＥＸ法装置は、候補核酸
増幅反応と平行して、既知の量のテンプレートを用い、自動的にコントロールＰ
ＣＲ実験を行う。これにより、自動化ＳＥＬＥＸ法の各増幅工程後、コンピュー
ターが蛍光検出手段を内部で再較正することが可能になる。

【００５７】コンピューターにより、標的から溶出される候補核酸リガンド量に関する値を
用い、それに続く自動化ＳＥＬＥＸ法のいずれでもよい工程に対する調整を最適
化する。例えば、コンピューターは、候補核酸リガンドおよび標的の間の相互作
用のストリンジェンシーを増加させまたは減少させるため、選択条件を変更する
ことが可能である。コンピューターはまた、次のＳＥＬＥＸ周期で、どのくらい
の量の核酸リガンド混合物および／または標的ビーズを用いるべきであるか、計
算することも可能である。プライマービーズを用いる態様（上記）において、コ
ンピューターは本情報を用い、作業ステーション上の各ウェルに添加すべきプラ
イマービーズ懸濁物の量を決定する。同様に、コンピューターは、候補核酸リガ
ンドが増幅される条件を変更することが可能である。これらはすべて、オペレー
ターの介入なしに、自動的に最適化することが可能である。

【００５８】図７−１０は、本発明にしたがい、自動化ＳＥＬＥＸを行う装置の態様の多様
な図を示す。本態様は、Ｔｅｃａｎ^TM（Ｃａｖｒｏ）ロボット系に基づく。各図
は、自動化ＳＥＬＥＸ法のＰＣＲ増幅工程中の装置を示す。

【００５９】図７では、本装置の斜視図が示される。例示される系は、作業ステーション７
２が上に位置する作業面７１を含む（作業ステーションは本斜視図では一部不明
瞭であるが、図８、９および１０で特徴７２として見ることが可能である）。ピ
ペッティングツール７４および吸引装置７５は、それぞれ別個のガイドレール７
７および７８により、中央ガイドレール７３に取り付けられている。したがって
、ピペッティングツール７４は、ガイドレール７７の長軸に沿って移動すること
が可能であり；ガイドレール７７はその後、中央ガイドレール７３の長軸に沿っ
て、この軸に対し、直交して移動することが可能である。この方式で、ピペッテ
ィングツール７４は、水平面をくまなく移動することが可能であり；ピペッティ
ングツールはまた、作業面７１から上昇し、そして７１に向かって下降すること
も可能である。同様に、吸引装置７５はガイドレール７８に取り付けられ、そし
てガイドレール７８は、吸引装置７５が水平面を移動することが可能である方式
で、中央ガイドレール７３に取り付けられ；吸引装置７５はまた、垂直面で移動
することも可能である。

【００６０】蛍光測定カバー７６は、支え７１０を介し、ガイドレール７９に取り付けられ
ている。支え７１０は、ガイドレール７９の垂直軸に沿って移動することが可能
であり、それにより作業ステーション７２上に蛍光測定カバー７６を上昇させる
。蛍光測定カバー７６がガイドレール７９の最上部に位置する場合、ガイドレー
ル７７および７８は、その下を移動することが可能であり、ピペッティングツー
ル７４および吸引装置７５が作業ステーション７２に接近することを可能にする
。この例では、蛍光測定カバー７６は、作業ステーション７２の最上部の作業位
置に下降して示される。

【００６１】蛍光測定カバー７６は、ＣＣＤカメラ７１１ａおよび関連レンズ７１１ｂに取
り付けられている。蛍光励起光の供給源もまた、カバー７６に関連している（未
提示）。作業ステーション７２の最上部に位置する場合、カバー７６は、ＣＣＤ
カメラ７１１ａが、ＰＣＲ増幅中、作業ステーション７２に含まれる試料からの
蛍光発光を測定するのを可能にする。明瞭にするため、周囲光が蛍光測定カバー
に進入するのを妨げる光遮蔽は図から省かれている。ＰＣＲ増幅が終了すると、
蛍光測定カバー７６は、取り付けられているＣＣＤカメラ７１１ａおよびレンズ
７１１ｂと共に、単にガイドレール７９の上に上げられる。

【００６２】本図ではやはり示されておらず、図９および１０に示されているのは、加熱ふ
た９１であり、蛍光測定カバー７６の下の作業ステーション７２の最上部に置か
れている。

【００６３】作業面７１はまた、いくつかの他のステーションを含み：４℃試薬保管ステー
ション７１２、−２０℃酵素保管ステーション７１３、周囲温度試薬保管ステー
ション７１４、溶液廃棄ステーション７１５、ピペットチップ保管ステーション
７１６および記録保管ステーション７１７が含まれる。ピペッティングツール７
４はまた、作業面７１をあちこち、これらの多様な保管位置に移動することが可
能なグリッパーツール７１８とも関連している。ふたパーク７１９（ここでは占
められていない）は加熱ふたの保管のためである（図９および１０を参照された
い）。

【００６４】図８は、図７の装置を平面図で示す。装置の各要素は、図７と同一の用語体系
で表示されている。図９は、図７の装置の正面図である。装置の各要素が、図７および図８と同一
の用語体系で表示されていることに注目されたい。また、本図では、作業ステー
ション７２、並びに冷却酵素および試薬保管ステーション７１２が、互いに震蘯
モーター９２と関連していることを見ることが可能であることにも注目されたい
。これらのモーターの操作は、自動化ＳＥＬＥＸ法中に、多様な試薬を混合しつ
づける。モーター９２は、各々コンピューターの制御下にあり、そしてわずかの
間停止し、適切なように、攪拌されている容器への試薬添加または除去を可能に
することが可能である。本図にやはり見られるのは、試料の均一な加熱を確実に
するため、作業ステーション７２上に置かれている加熱ふた９１である。

【００６５】図１０は、図７、８および９に示される装置の右側面図である。装置の各要素
は、図７、８、および９と同一の用語体系で表示されている。

【００６６】

【実施例】

以下の実施例は、本発明の態様を例示する。これらは、本発明の範囲を限定す
るとみなしてはならない。

【００６７】実施例１ロボット作業ステーションの基本は、核酸混入を最小限にするため、使い捨て
ピペットを利用する、４プローブピペッティングステーション、Ｐａｃｋａｒｄ
ＭＵＬＴＩＰｒｏｂｅ２０４ＤＴ^TMである。作業スペースは、結合反応およ
びｉｎｖｉｔｒｏ転写の平衡化に用いられる３７℃定常温度熱ブロック、ＲＴ
およびＰＣＲ反応両方のためのコンピューター制御熱反復装置、冷酵素保管のた
めの冷凍装置、試薬保管、例えば緩衝液、プライマーおよびミネラルオイルのた
めの多様な容器、並びに使い捨てピペットチップラックを含む。チップラックは
、作業面の最大面積を利用し、そして平行して処理される試料の数に応じて変化
する。ｉｎｖｉｔｒｏ選択のためのすべての工程は、熱ブロックまたは熱反復
装置いずれかで行われ、液体は主にこれらの２つのステーション間を移動するが
、いくつかの酵素緩衝液は、プレートまたは熱反復装置に移される前に、隣接す
る試薬ブロックであらかじめ混合される。

【００６８】全過程は、ＨＡＭ（高レベルアクセス法（ＨｉｇｈｌｅｖｅｌＡｃｃｅｓ
ｓＭｅｔｈｏｄ））で社内開発されたソフトウェアを備えたＰＣ、Ｐａｃｋａ
ｒｄＭＵＬＴＩＰｒｏｂｅのため液体取り扱い機能を増大させたＤＯＳに基づ
くＣプログラミング言語インタープリターにより、制御される。標準的Ｃ機能、
並びに液体取り扱い、例えば液体の吸引、分配、および混合に加え、ＨＡＭは、
ウィンドウに基づくスクリーンｉｏ、ファイル取り扱い、およびＲＳ−２３２シ
リアルコミュニケーションをサポートする。該ソフトウェアは、過程を自動的に
調整し、１および９６の間のいかなる数でもよい試料を作動させ、現在の作動中
、必要な酵素溶液のみを調製する。ＲＳ−２３２接続で確立されている、熱反復
装置との二方向コミュニケーションは、メインコンピューターがふた開閉操作を
行い、熱反復装置に記憶されているプログラムを開始し、そして完了のため熱反
復プログラムをモニターすることを可能にする。総合的なソフトウェア設計によ
り、結合反応インキュベーションから転写までの過程の完全なコンピューター制
御が、使用者の介入なしに行われることが可能になる。

【００６９】過程は、３７℃ブロック上に、タンパク質に被覆されているマイクロタイター
プレートを置くことで開始する。濃縮ＲＮＡプールのゲル精製までの続く液体取
り扱いはすべて、ソフトウェアにより制御される。ＲＮＡの固定タンパク質標的
との最初の２時間のインキュベーションの間、試料に定期的にｄＨ₂Ｏを添加し
（蒸発損失を調節し）、そして吸引および分配、いわゆる吸い込みおよび吐き出
しを反復することにより、各溶液を混合する。結合反応が平衡化された後、遊離
ＲＮＡからの結合ＲＮＡの分配は、単に、各ウェルからＲＮＡ溶液を除去するこ
とにより、この形式で容易に達成され；結合核酸は、固定標的上に残り、そして
非結合分子は廃棄される。分配に続き、一連の洗浄工程を行い、各洗浄は、各ウ
ェルに洗浄緩衝溶液をピペッティングし、続いて吸い込みそして吐き出す混合を
反復し、そして最後に洗浄溶液を廃棄することからなる。溶出過程は、ＥＤＴＡ
を添加することにより開始し、その後、定期的な吸い込みそして吐き出す混合と
共に３０分間インキュベーションする。インキュベーション後、溶液を熱反復装
置に移し、そして各洗浄溶液をここでは熱反復装置の溶出成分に添加することを
除き、上述のようにウェルを洗浄する。その後、試料は、酵素増幅を行うことが
できる。

【００７０】３つの酵素反応の各々の第一の工程は、新鮮な酵素溶液の調製を必要とする。
これは、試薬ブロックに位置する適切な緩衝液に、冷凍庫から酵素のアリコット
をピペッティングすることにより、行われる。ゆっくり吸い込みそして吐き出す
混合を用い、酵素溶液中の界面活性剤を泡立てることを避け、注意深く完全に、
粘性の酵素溶液を混合する。新たに調製されたＲＴ反応混合物のアリコットを、
洗浄のため、溶出プレートの乾いたウェルに添加し、ウェルに残存する可能性が
ある溶出ＲＮＡを除く。ＲＴ反応混合物洗浄を、その後、熱反復装置の適切なウ
ェルに添加し、そしてシリコンオイルでふたをし、４８℃での反応インキュベー
ション中の蒸発損失を防ぐ。熱反復装置のふたを閉め、そしてＲＴ反応のため、
プログラムを開始する。メインコンピューターは反応進行をモニターし、そして
プログラム完了検出に際し、ふたを開け、Ｔａｑポリメラーゼ反応混合物を調製
し、そして各完了ＲＴ反応に添加する。これに続き、ふたを閉め、ＰＣＲプログ
ラムを開始し、モニターし、そしてＰＣＲ完了に際し、ふたを開ける。ＤＮＡテ
ンプレートのｉｎｖｉｔｒｏ転写のため、熱反復装置から３７℃プレート中の
適切なウェルに、増幅ＤＮＡのアリコットを移動させる。新たに調製されたＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ溶液を各ウェルに添加し、完全に混合する。シリコンオイ
ル層で反応混合物にふたをし、その後、４時間インキュベーションする。これで
自動化過程は完了し；生じた転写ＲＮＡを、オフラインでゲル精製し、そして次
の周期のＳＥＬＥＸのため、新たに被覆されたタンパク質ウェルを持つマイクロ
タイタープレートに添加する。

【００７１】典型的な自動化ＳＥＬＥＸ法実行マルチウェルプレートを用いた典型的な自動化ＳＥＬＥＸ法実行は、作業面上
の適切な位置に、必要とされる多様な試薬および材料を装填することで開始する
。その後、以下の工程が行われる（各工程はロボットにより行われる）：１）候補核酸混合物を、１つのチップで、作業ステーション上の９６ウェルプレ
ートの各ウェルにピペッティングし；チップを廃棄する。２）常磁性ビーズを、作業ステーション上の９６ウェルプレートの各ウェルにピ
ペッティングし；チップを廃棄する。３）結合プレートを、３７℃で震蘯しながら３０−１２０分間インキュベーションし、
核酸リガンドがビーズ上の標的に相互作用するのを可能にする。４）ビーズ分離および洗浄磁気分離カバーをプレート上に置くことにより、ビーズを分離し；ウェルから
液体を吸引し；磁気分離カバーを除去し；洗浄緩衝液を各ウェルに分配し；震蘯
しながら３７℃で５分間インキュベーションする。５）望ましい洗浄周期数、工程４）を反復する。６）溶出１プレート上に磁気分離カバーを置くことにより、ビーズを分離し、そしてウェ
ルから液体を吸引し；磁気分離カバーを除去し、そして各ウェル中のビーズを９
０μｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁し；プレートを震蘯しながら９０℃に加熱し、核酸リ
ガンドを溶出させる。７）プレートを４８℃に冷却する。８）緩衝液および逆転写酵素を用い、作業面上の調製バイアルにＰＣＲ反応混合
物を調製する。９）ＰＣＲ反応混合物のアリコットを作業ステーション上の各ウェルにピペッテ
ィングする。１０）逆転写作業ステーション上でプレートを震蘯しながら４８℃で３０分間インキュベー
ションし、逆転写反応が起こるのを可能にする。１１）ビーズ除去１プレート上にビーズ除去カバーを置き、磁石にビーズを捕捉し；除去カバーお
よび付着したビーズを滴下ステーションに移動させ；ビーズを滴下ステーション
に滴下し、そして洗浄ステーションでカバーを洗浄する。１２）作業ステーション上のプレート上に蛍光測定カバーを置き；光遮蔽を作業
ステーション上に置く。１３）増幅蛍光測定カバーが、ＤＮＡ飽和が起きたことを示すまで、プレートを熱反復さ
せ；蛍光測定装置読み取りを用い、各ウェル中の増幅産物量を計算する。１４）光遮蔽および蛍光測定カバーを除去し；各ウェルからアリコットを除去し
、そして保管のため記録アレイに分配する。１５）緩衝液およびＲＮＡポリメラーゼを用い、作業面上の調製バイアル中に転
写混合物を調製する。１６）作業面上の各ウェルに転写混合物のアリコットをピペッティングする。１７）転写作業面上で、プレートを震蘯しながら３７℃で４時間インキュベーションし、
転写が起こるのを可能にする。１８）精製各ウェルから望ましい量のＲＮＡを保持するのに必要なプライマー常磁性ビー
ズの体積を決定し；作業面上の各ウェルに計算された量のビーズを分配する。１９）作業面上で、プレートを震蘯しながら４８℃で５分間インキュベーション
する。２０）ビーズ分離および洗浄プレート上に磁気分離カバーを置くことにより、プライマービーズを分離し；
各ウェルを吸引し；分離カバーを除去し；洗浄緩衝液を各ウェルにピペッティン
グし；プレートを震蘯しながら４８℃で５分間インキュベーションする。２１）望ましい洗浄周期数、工程２０）を反復する。２２）溶出２プレート上に磁気分離カバーを置くことにより、ビーズを分離し；各ウェルを
吸引し；分離カバーを除去し；１００μｌのｄＨ₂Ｏを各ウェルにピペッティン
グし；作業ステーション上で、プレートを震蘯しながら９５℃で３分間インキュ
ベーションし、プライマービーズからＲＮＡを溶出させる。２３）ビーズ除去２プレート上にビーズ除去カバーを置き、磁石にビーズを捕捉し；除去カバーお
よび付着したビーズを滴下ステーションに移動させ；ビーズを滴下ステーション
に滴下し、そして洗浄ステーションでカバーを洗浄する。２４）望ましい周期数、工程２）から再び開始する。

【００７２】実施例２以下の実施例は、組換えネズミセレクチン／ＩｇＧ融合タンパク質に対する自
動化ＳＥＬＥＸの実行を記載する。選択標的に対する手動ＳＥＬＥＸの説明に関
しては、“ＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａ
ｎｄｓｔｏＬｅｃｔｉｎｓ”と題される、Ｐａｒｍａら、米国特許第５，７
８０，２２８号を参照されたい。

【００７３】自動化選択ネズミＰＳ−Ｒｇ、組換えネズミセレクチン／ＩｇＧ融合体（Ｄ．Ｖｅｓｔ
ｗｅｂｅｒより購入）で、丸底Ｉｍｍｕｌｏｎ１ポリスチレン９６ウェルマイ
クロタイタープレートを、７５μｌのＳＨＭＣＫ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥ
ＳｐＨ７．３、１２０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭ
ｇＣｌ₂、１ｍＭＣａＣｌ₂）中、結果に言及される濃度で、室温（２３℃）
で２時間、手動で被覆した。コントロールウェルは、ＳＨＭＣＫのみで被覆する
ことにより調製した。その後、プレートを、１５０μｌＳＡＴ（ＳＨＭＣＫ、
０．０１％ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ａｌｄｒ
ｉｃｈ））で６回洗浄し、そして２００ｐｍｏｌのゲル精製ＲＮＡプールを７
５μｌＳＡＴ緩衝液中で、添加した。プレートを、ＭｕｌｔｉＰＲＯＢＥ２
０４ＤＴピペッティング作業ステーション（Ｐａｃｋａｒｄ）上に搭載された３
７℃熱ブロック（ＵＳＡＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置き、そして試料を覆わ
ずに、３７℃で２時間インキュベーションした。続くすべての工程は、明記され
る場合を除き、ロボット作業ステーションにより、行った。プレートとＲＮＡの
インキュベーション中、２０分ごとに、５μｌのｄＨ₂Ｏを添加し、蒸発損失（
損失速度は、１４．５＋０．４μｌ／時間と測定された）を相殺し、そして反
応を混合した。その後、プレートを、１５０μｌＳＡＴ緩衝液で６回洗浄した
。

【００７４】乾いたプレートに、７５μｌのＳＨＫＥ（１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７
．３、１２０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ）を添
加し、そして１０分ごとに混合しながら３７℃で３０分間インキュベーションし
た。その後、上清をプレートから除去し、そして遠隔指令能力を備えた、作業ス
テーション上に搭載されたＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ熱反復装置に添加した。

【００７５】自動化増幅作業面上に搭載されたあらかじめ冷却したＳｔｙｒｏｆｏａｍ冷却装置に０℃
以下で保管されているＡＭＶ逆転写酵素（ＢｏｅｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ）を、調製ＲＴ緩衝液に添加し、そして完全に混合した。その後、生じたＲＴ
混合物（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、６０ｍＭＮａＣｌ
、１１ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭｄＡＴＰ、
１ｍＭｄＴＴＰ、１ｍＭｄＧＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、４００ｐｍ
ｏｌ３Ｐ８、２０単位ＡＭＶ−ＲＴ／反応）２５μｌを、空のインキュベーシ
ョンウェルに添加し、そして混合し、ウェルを洗浄した。その後、ＲＴ混合物を
熱反復装置に移動させ、溶出ＲＮＡに添加し、そして完全に混合した。これに２
５μｌのシリコンオイル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、蒸発を防いだ。その後、
熱反復装置をコンピューターにより、遠隔から作動させる。ふたを閉じ、そして
反応を４８℃で３０分間、その後、６０℃で５分間インキュベーションした。Ｒ
Ｔ反応の完了に際し、ふたを誘発して開き、そして反応１０μｌを手動で除き、
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、手動で測定した。

【００７６】Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ冷却装置に保管されているＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋ
ｉｎＥｌｍｅｒ）を調製ＰＣＲ緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ緩衝液２（
５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３）、７．５
ｍＭＭｇＣｌ₂、４００ｐｍｏｌ５Ｐ８）に添加し、そして完全に混合
した。その後、１００μｌのＴａｑ混合物を各ウェルに添加し、ふたを閉め、そ
してＰＣＲを開始した。ＰＣＲは以下の条件下で実行した：９３℃３分間の後、
９３℃１分間、５３℃１分間、および７２℃１分間からなるループをｎ周期、こ
こでｎはＲＴ反応へのＲＮＡの投入量により決定された（ｑＰＣＲの説明を参照
されたい）。ＰＣＲの完了に際し、ふたを開け、そして５０μｌを除去し、そし
て固定３７℃熱ブロック上の空のプレートウェルに添加した。

【００７７】Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ冷却装置に保管されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅ
ｎｚｙｃｏ）を、調製転写緩衝液（４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８、
４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００、１２ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＤＴＴ
、１ｍＭスペルミジン、０．００２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００単
位／ｍｌピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ））に添加し、そして完全に混合し
た。その後、２００μｌの転写緩衝液をＰＣＲ産物ウェルに添加し、そして混合
した。本反応に２５μｌのシリコンオイル層を添加し、そして反応を３７℃で４
時間インキュベーションした。その後、完了反応を除去し、そしてＰＡＧＥによ
り手動で精製した。

【００７８】プレート性質決定１．多様なブロッキング試薬の試験空のＩｍｍｕｏｎ１ウェルに：（１）ＳＨＭＣＫ（２）ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）（３）ＳＨＭＣＫ＋０．１％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ｔｒｏｐｉｘ）（４）ＳＨＭＣＫ＋０．１％カゼイン（Ｓｉｇｍａ）（５）ＳＨＭＣＫ＋ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（１：１）（６）ＳＨＭＣＫ＋１％ＢＳＡを含む、１５０μｌの多様な緩衝液を添加し、そして室温で３０分間インキュベ
ーションした。

【００７９】その後、ウェルを、１５０μｌのＳＩＴ緩衝液で６回洗浄した。その後、ＳＩ
Ｔ緩衝液中の２００ｐｍｏｌの４０Ｎ８ＲＮＡを各ウェルに添加し、そして
３７℃で２時間インキュベーションした。１５０μｌのＳＩＴ緩衝液でウェルを
６回洗浄した。各ウェルに７５μｌのｄＨ₂Ｏを添加し、そして９５℃で５分間
加熱し、ＲＮＡをプレートから溶出させた。これに２５μｌのＲＴ混合物を添加
し、そして記載されるようにインキュベーションした。その後、ｑＰＣＲにより
、存在するＲＮＡ量に関し、溶出物をオフラインで測定した。本実験の結果を図
１に示す。２．非ブロッキングＩｍｍｕｌｏｎ１プレートに対するバックグラウンドにお
ける緩衝液構成要素の役割空のＩｍｍｕｌｏｎ１ウェルに、２００ｐｍｏｌの４０Ｎ８を、１００μ
ｌの以下の緩衝液中で添加し、そして３７℃で２時間インキュベーションした：
（１）ＳＩＴ（ＳＨＭＣＫ、０．１％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０）（２）ＳＨＭＣＫ（３）ＳＡ（ＳＨＭＣＫ、０．０１％ＨＳＡ）（４）ＳＴ（ＳＨＭＣＫ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）（５）ＳＡＴ（ＳＨＭＣＫ、０．０１％ＨＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０）続いて、ウェルを１５０μｌの適切な緩衝液で６回洗浄し、そして記載される
ようにＳＨＫＥで溶出した。その後、存在するＲＮＡ量に関し、記載されるよう
にＲＴにより、その後ｑＰＣＲにより、溶出物を測定した。本実験の結果を図２
に示す。

【００８０】ネズミＰＳ−Ｒｇを用いたＥＤＴＡ溶出研究７５μｌＳＨＭＣＫ中、４μｇ／ｍｌのネズミＰＳ−Ｒｇで、空のウェルを
室温で２時間、被覆し、そして記載されるように洗浄した。その後、先の手動Ｓ
ＥＬＥＸ実験から単離されたＲＮＡクローン＃３９５の３ｆｍｏｌないし２０
ｐｍｏｌの滴定で、２組のコントロールおよびＰＳ−Ｒｇウェルを、３７℃で
２時間、被覆し、そして記載されるように洗浄した。その後、１組のコントロー
ルおよびＰＳ−Ｒｇウェルを除去し、そしてシンチレーション計測により、³²Ｐ
−ＲＮＡに関しモニターした。その後、５０μｌのＳＨＫＥをもう一方の組の乾
いたウェルに添加し、そして混合しながら３７℃で３０分間インキュベーション
した。その後、緩衝液を除去し、そしてシンチレーション計測により、³²Ｐ標識
ＲＮＡを測定した。本実験の結果を図３に示す。

【００８１】ＳＥＬＥＸ進行以下の表１は、ＰＳ−ＲｇＳＥＬＥＸ実験の進行を略述する。ＰＳ−Ｒｇ装
填は、μｇ／ｍｌ濃度で示す。（プレート表面へのＰＳ−Ｒｇの結合は、ＰＳ−
Ｒｇの固定量を装填し、記載されるように洗浄し、そしてその後、高親和性アプ
タマー＃１９０１を滴定することによって、結合曲線を実行することにより、測
定されている。これはいくつかのタンパク質濃度で行う。

【００８２】その後、これらの結合曲線のプラトー値を、１：１化学量論と仮定し、表面に
結合した活性タンパク質の量の代表とする。図４を参照されたい。これらのデー
タを用い、４μｇ／ｍｌＰＳ−Ｒｇを装填した際、プレートがほぼ飽和してい
ると決定され（計算された飽和は、２２０ｆｍｏｌ／ウェルＰＳ−Ｒｇであ
る）、これは結合ＰＳ−Ｒｇ１５０ｆｍｏｌに相当した。測定されたシグナ
ルは、各試料に関し、ｑＰＣＲにより決定されるように、ＰＳ−Ｒｇを含むウェ
ルに結合しているＲＮＡ分子の数に相当する。同様に、ノイズは、タンパク質を
まったく含まないコントロールウェルに結合しているＲＮＡ分子の数に相当する
。

【００８３】表１．ＰＳ−ＲｇＳＥＬＥＸ実験の進行

【００８４】

【表１】

【００８５】実施例３定量的ＰＣＲ以下のプライマー（５Ｐ７−ＦＤ２および５Ｐ８−ＦＤ２）を設計し、ここで
下線部分はＮ７およびＮ８テンプレートに相補的である。

【００８６】

【化３】

【００８７】各プライマー中のヘアピンは、〜８５℃のＴｍを有し、そして５’末端にフル
オロフォア（６−ＦＡＭ）を、そしてそのステム上のフルオロフォアの反対側に
消光剤（ＤＡＢＣＹＬ）を含む。４９５ｎｍでの励起に際し、６−ＦＡＭより
放出された光子は、蛍光共鳴エネルギー移動により、ＤＡＢＣＹＬに吸収される
。エネルギー移動の効率は、フルオロフォアおよび消光剤の間の距離の六乗に従
属する。フルオロフォアおよび消光剤が、閉じたヘアピンコンホメーションで非
常に近接しているため、取り込まれていないプライマーではほとんどシグナルが
生成されない。しかし、プライマーがＰＣＲ中、産物に取り込まれるにつれ、フ
ルオロフォアおよび消光剤が、１０塩基対の距離で分離され、そしてシグナルが
増加する。シグナルの増加は、形成される産物量に正比例する。

【００８８】ＰＣＲ反応に、４０Ｎ８ｃＤＮＡテンプレート、プライマー５Ｐ８および３
Ｐ８（８０ｐｍｏｌ）および蛍光プライマー５Ｐ８−ＦＤ２を用いた標準曲線
の例は、直線プロットで図５に、そして半対数プロットで図６に例示される。テ
ンプレート濃度は、１０⁶−１０¹⁰コピー／２５μｌ反応の範囲であった。フル
オレセインシグナル（内部参照染色剤に対し規準化し、そしてバックグラウンド
を引いたもの）をＰＣＲ周期数の関数としてプロットする。初期のＰＣＲ周期で
は、産物は、すべての反応で指数的に生成される；が、バックグラウンドシグナ
ルが産物シグナルを上回る。産物シグナルがバックグラウンドを上回る周期は、
出発テンプレートコピー数に依存する。シグナル閾値レベル（ｙ＝０．０３の点
線）は、バックグラウンドレベルの上に選択され、そして各反応が閾値を越える
周期（Ｃｔ）は、標準曲線を生成するため、テンプレートコピー数の関数として
プロットする。その後、標準曲線の等式を用い、Ｃｔ値に基づき、未知の試料中
のテンプレートコピー数を計算することが可能である。

【００８９】ポリスチレンプレートに吸着したＰＤＧＦを標的とするＳＥＬＥＸにおいて、
本定量的ＰＣＲ技術を用い、ノイズに対するシグナル比および絶対テンプレート
コピー数を測定した。非常に低いタンパク質装填（＜１００ａｍｏｌ／反応）
を用いるため、放射能による定量化は不可能であった。増幅プロットは、シグナ
ル対ノイズ比６０に関し、バックグラウンドウェルに結合する１０ａｍｏｌの
ＲＮＡおよび標的ウェルに結合する６００ａｍｏｌのＲＮＡの定量化を例示す
る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、マイクロタイタープレートへのＲＮＡのバックグラウン
ド結合に対するブロッキング試薬の影響を示す。本明細書中に記載されるような
ＱＰＣＲで定量化された、Ｉｍｍｕｌｏｎ１ポリスチレンプレートのウェルに
残存するＲＮＡ分子の総数を、多様なブロッキング試薬、（１）ＳＨＭＣＫのみ
、（２）ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ、（３）ＳＣＨＭＫ＋Ｉｂｌｏｃｋ、（４）
ＳＣＨＭＫ＋ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ、（５）ＳＣＨＭＫ＋カゼイン、（６
）ＳＣＨＭＫ＋ＢＳＡで処理したウェルに関し、示す。

【図２】図２は、マイクロタイタープレートへのＲＮＡのバックグラウン
ド結合に対する緩衝試薬の影響を示す。本明細書中に記載されるようなＱＰＣＲ
で定量化された、Ｉｍｍｕｌｏｎ１ポリスチレンプレートのウェルに残存する
ＲＮＡ分子の総数を、多様な緩衝試薬、（１）ＳＨＭＣＫ＋０．１％Ｉｂ
ｌｏｃｋ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＴ）、（２）ＳＨＭＣＫ
＋０．０１％ＨＡＳ（ＳＡ）、（３）ＳＣＨＭＫ＋０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０（ＳＴ）、（４）ＳＣＨＭＫ＋０．０１％ＨＳＡ＋０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＡＴ）、（５）ＳＣＨＭＫを含む溶液でインキュベ
ーションしそして洗浄したウェルに関し、示す。

【図３】図３は、受動的に疎水的にＩｍｍｕｌｏｎ１ポリスチレンプレ
ートに付着したネズミＰＳ−Ｒｇへのアプタマー１９０１の結合および該ＰＳ−
Ｒｇからの該アプタマーのＥＤＴＡ溶出を示す。４．０ｍｇ／ｍｌで装填した
ネズミＰＳ−Ｒｇで被覆されたウェルに対する³²Ｐ標識アプタマー１９０１の総
結合を、総アプタマー濃度の関数としてプロットする（黒丸）。これらの濃度の
各々に関する溶出アプタマー量は、黒い三角形で示し、そして溶出後のタンパク
質被覆ウェル中に残存するアプタマーの量は、白い正方形で示す。すべての試料
は、³²Ｐのシンチレーション計測により定量化した。

【図４】図４は、Ｉｍｍｕｌｏｎ１ポリスチレンプレートに対するＰＳ
−Ｒｇの受動吸着の定量化を示す。疎水性相互作用を通じたタンパク質固定後の
アプタマー１９０１に結合することが可能なＰＳ−Ｒｇの量（黒丸）を、投入タ
ンパク質濃度の関数としてプロットする。活性タンパク質量は、アプタマー結合
曲線のプラトー値から得た。

【図５】図５は、自動化ｉｎｖｉｔｒｏ選択法の進行を示す。手動（正
方形）および自動化（丸）実験両方のプレートウェルから溶出されたＲＮＡ分子
の数を、行った各５回のＳＥＬＥＸに関し、示す。タンパク質被覆ウェルから溶
出されたＲＮＡ量は、黒いマークで示し、そしてバックグラウンド結合ＲＮＡは
白いマークで示し、そして各回で用いられた被覆タンパク質の量は、ｘマークで
示す。

【図６】図６は、ネズミＰＳ−Ｒｇタンパク質に対する第５回のＲＮＡプ
ールの溶液相結合曲線を示す。自動化ＳＥＬＥＸ法（＋）で生成された濃縮第５
回ＲＮＡプールに関し測定された結合曲線を、手動法（黒丸）と共に出発時のラ
ンダムＲＮＡプール（黒いひし形）と比較する。

【図７】図７は、本発明にしたがった自動化ＳＥＬＥＸを行うための装置
の態様の斜視図を示す。

【図８】図８は、本発明にしたがった自動化ＳＥＬＥＸを行うための装置
の態様の平面図を示す。

【図９】図９は、本発明にしたがった自動化ＳＥＬＥＸを行うための装置
の態様の正面図を示す。

【図１０】図１０は、本発明にしたがった自動化ＳＥＬＥＸを行うための
装置の態様の右側面図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ズィチ，ドミニク・エイアメリカ合衆国コロラド州80304，ボウルダー，カルミア・アベニュー 2200 (72)発明者ジェニソン，ロバートアメリカ合衆国コロラド州80304，ボウルダー，エイス・ストリート 3025 (72)発明者シュナイダー，ダニエル・ジェイアメリカ合衆国コロラド州80020，ブルームフィールド，イェイツ・サークル 12786 Ｆターム(参考） 2G054 AA06 AB10 BA04 CA22 CE02 EA03 4B024 AA19 AA20 BA43 BA80 GA07 HA19 4B029 AA09 AA23 AA27 BB20 CC04 HA09 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸候補混合物から核酸リガンドを自動的に同定するため
の方法であって、前記核酸リガンドが既定の標的のリガンドであり：ａ）候補混合物を標的と接触させ、ここで候補混合物に比較し、標的に増加した
親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である；ｂ）増加した親和性の核酸を残りの候補混合物から分配し；そしてｃ）増加した親和性の核酸を増幅し、リガンド濃縮核酸混合物を生じる、ここで
核酸リガンドが同定され、工程（ａ）−（ｃ）はコンピューターにより制御され
るデカルトロボット操作装置により、作業面上の１つまたはそれ以上の作業ステ
ーションで行われることを含む、前記方法。
【請求項２】さらに：ｄ）連続する反復各々のリガンド濃縮混合物を用い、工程ａ）からｃ）を必要な
だけ反復し、望ましいレベルの増加したリガンド濃縮を生じる工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】前記標的が固体支持体に結合しており、そして工程（ｂ）
が前記固体支持体を前記候補混合物から分配することにより達成される、請求項
２の方法。
【請求項４】前記固体支持体がマルチウェルマイクロタイタープレート
である、請求項３の方法。
【請求項５】前記プレートがポリスチレンからなる、請求項４の方法。
【請求項６】前記標的が疎水性相互作用により前記プレートに結合して
いる、請求項５の方法。
【請求項７】前記固体支持体が常磁性ビーズであり、そして前記常磁性
ビーズの分配が前記コンピューターにより制御されている磁気ビーズ分離装置に
より行われる、請求項３の方法。
【請求項８】前記候補核酸リガンドが固定配列領域を有し、そして工程
（ｃ）が前記固定配列領域に相補的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
を用いて行われる、請求項１の方法。
【請求項９】前記コンピューターが、増幅産物量の測定を行い、そして
前記測定を用い、標的から溶出される核酸リガンドの最初の濃度に関する値を計
算する、請求項８の方法。
【請求項１０】前記コンピューターが、前記値に反応し、あらかじめ決
定された方式で工程（ａ）−（ｃ）の反応条件を調整する、請求項９の方法。
【請求項１１】増幅産物への取り込みに際し、前記プライマーの蛍光発
光プロフィールが変化するように、前記プライマーが増幅産物に取り込まれた際
、互いに相対的に移動するヌクレオチド位で、前記プライマーがフルオロフォア
および消光基で標識されており、そして前記コンピューターが前記変化を検出す
ることにより、増幅産物量の測定を行う、請求項９の方法。
【請求項１２】前記コンピューターが蛍光検出手段を制御し、そして前
記コンピューターが前記検出手段を操作し、増幅産物量の測定を行う、請求項１
１の方法。
【請求項１３】少なくとも１つの前記プライマーが：（ａ）前記固定配列領域の１つに相補的な一本鎖ＤＮＡ分子；（ｂ）前記一本鎖ＤＮＡ分子の５’端に結合するステム・ループ構造であって、
前記ステムが、前記ステム・ループ構造のステムの向かい合ったヌクレオチド位
に位置するフルオロフォアおよび消光剤を含み、前記フルオロフォアからの蛍光
シグナルが、前記消光剤により実質的に消光されるように、前記ヌクレオチド位
が互いに十分に近くに位置する、前記ステム・ループ構造；ここで前記ポリメラーゼ連鎖反応中に前記プライマーにアニーリングする候補核
酸リガンドの３’端の伸長が前記ステム構造を破壊し、前記蛍光基がもはや前記
消光基により消光されないを含む、請求項１１の方法。
【請求項１４】前記プライマーが：【化１】および【化２】からなる群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】核酸候補混合物から核酸リガンドを同定するための改善
法であって、前記核酸リガンドが既定の標的のリガンドであり：ａ）候補混合物を標的と接触させ、ここで候補混合物に比較し、標的に増加した
親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である；ｂ）増加した親和性の核酸を残りの候補混合物から分配し；そしてｃ）増加した親和性の核酸を増幅し、リガンド濃縮核酸混合物を生じることを含み、改善は：実質的にコンピューターにより制御される自動化機械により工程（ａ）−（ｃ）
を行うことを含む、前記方法。
【請求項１６】核酸候補混合物から核酸リガンドを自動的に同定するた
めの方法であって、前記核酸リガンドが既定の標的のリガンドであり：ａ）候補混合物を標的と接触させ、ここで候補混合物に比較し、標的に増加した
親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である；ｂ）増加した親和性の核酸を残りの候補混合物から分配し；そしてｃ）増加した親和性の核酸を増幅し、リガンド濃縮核酸混合物を生じる、ここで工程（ａ）−（ｃ）は、実質的にコンピューターにより制御される自動化
機械により行われることを含む、前記方法。
【請求項１７】請求項１の方法を行う自動化機械。