JP2011500076A - アプタマーを選択する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つの標的分子に対する１つまたは複数のアプタマーの同定のための方法であって、標的分子に結合する候補アプタマー配列を選択することと、結合された配列に各々の配列のアプタマーの可能性の測定値（適応度関数）を割り当てることと、配列のうちのいくつかまたはすべての進化を可能にして候補配列の新しい混合物を生成することと、候補プールの総計のアプタマーの可能性がプラトーに到達するまで、新しく生成された候補アプタマープールにより方法を繰り返すこととを含み、最終プール中に存在する配列が標的分子に対する最適なアプタマーである方法である。

Description

本発明はアプタマーの分野に関する。特に、本発明は、タンパク質バイオマーカー同定などのプロテオミクスにおいて使用される、アプタマーライブラリーおよびタンパク質特異的アプタマーを生成する方法に関する。

アプタマーは、抗体に概念的に類似する方式での標的分子の結合を可能にする十分に定義された立体的な形状を形成する、短いポリマー（通常は核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ））である。アプタマーは、低分子および抗体の最適な特徴を組み合わせたものであり、それらは高特異性および高親和性、化学的安定性、低免疫原性、ならびに標的のタンパク質−タンパク質相互作用に対する能力を含む。アプタマーは、高特異性に加えて、標的に対する非常に高い親和性を有する。典型的には、タンパク質に対して生成されたアプタマーは、ピコモルから低いナノモルの範囲の親和性を有する。モノクローナル抗体とは対照的に、アプタマーは生物学的に発現されるのではなく化学的に合成され、有意な費用優位性を提供する（８、９）。

アプタマーは、典型的には、米国特許出願第０７／５３６，４２８号、米国特許出願第５，４７５，０９６号、および米国特許出願第５，２７０，１６３号において記述されている、「指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）」（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれるインビトロ進化プロセスを介して産生される。ＳＥＬＥＸプロセスは、同じ一般的な選択スキームを使用する、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、分割および増幅の段階的な反復を含み、結合親和性および結合選択性の任意の所望される基準を事実上達成する。好ましくはランダム化配列のセグメントを含む核酸の混合物から開始して、ＳＥＬＥＸプロセスは、結合に好ましい条件下で標的と混合物を接触させる工程、特異的に標的分子に結合した核酸から未結合の核酸を分割する工程、核酸−標的複合体を解離する工程、核酸標的複合体から解離された核酸を増幅してリガンドが濃縮された核酸の混合物を産出する工程、そして結合、分割、解離および増幅の工程を所望される数のサイクルだけ反復して、標的分子に対して最も高い結合親和性を備えた配列のみを得る工程を含む。候補オリゴヌクレオチドは、配列内の固定モチーフまたは既知のモチーフを含むことができる。もし純粋にランダムな配列が使用されるならば、候補集団内の選択的なアプタマーの発見は完全に偶然に依ることになる。実際は、オリゴヌクレオチド配列がランダムであればあるほど、研究下の標的についてのその配列の選択は偶然に依るに違いない（１１、１２、１３）。

その最も基本的な形態において、ＳＥＬＥＸプロセスは、以下の一連の工程によって定義することができる。
１）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は、一般的に、固定された配列の領域（すなわち、候補混合物の各々のメンバーは同じ位置で同じ配列を含んでいる）およびランダム化配列の領域を含む。固定された配列領域は、（ａ）後述する増幅工程を支援するか、（ｂ）標的に結合することが既知である配列を模倣するか、または（ｃ）候補混合物中の核酸の所与の構造配列の濃度を増強するように選択される。ランダム化配列は、完全にランダム化（すなわち、任意の位置である塩基を見出す確率は４分の１である）、または部分的にのみランダム化（例えば、任意の場所である塩基を見出す確率は０〜１００パーセントの間の任意のレベルで選択できる）することができる。
２）候補混合物は、標的と候補混合物のメンバーとの間の結合に好ましい条件下で、選択された標的と接触させられる。これらの状況下で、標的と候補混合物の核酸との間の相互作用は、標的と標的に対する最も強い親和性を有する核酸との間の核酸標的ペアの形成として判断することができる。
３）標的に対する最も高い親和性を備えた核酸は、標的に対してより低い親和性を備えたそれらの核酸から分割される。非常に少ない数の最も親和性が高い核酸に対応する配列のみ（および恐らく１分子の核酸のみ）が候補混合物中に存在するので、候補混合物中の有意な量の核酸（およそ５〜５０％）が、分割の間に保持されるように、分割基準を設定することが一般的に望ましい。
４）次に、標的に対して比較的より高い親和性を有するとして分割の間に選択された核酸を増幅して、標的に対する比較的より高い親和性を有する核酸が濃縮された新しい候補混合物を生成する。
５）分割を繰り返し上記の工程を増幅することによって、新しく形成された候補混合物が含む弱い結合配列はますます少なくなり、標的に対する核酸の親和性の平均程度は一般的に増加することになる。極端な場合は、ＳＥＬＥＸプロセスは、標的分子に対する最も高い親和性を有するもとの候補混合物から、それらの核酸を表す１つのまたは少数のユニークな核酸を含む候補混合物をもたらすことになる（１１、１３）。

アプタマーライブラリーを生成する場合の主要な問題の１つは、可能な探索空間の全体の大きさである。例えば、単一のタンパク質について選択的および特異的であり得る何百または何千もの可能なオリゴヌクレオチド配列があり得るが、どこで開始して最も正しい配列を見つけるか？

用語「探索空間」は、所与の長さのアプタマー分子で生じることができるポリマー単位（ヌクレオチドなどの）の可能なまたは許容されたバリエーションをすべて包含する。一度に限定的な数の配列のみしか問い合わせることができないので、候補ライブラリーは、所与の長さの可能なヌクレオチド配列の可能な探索空間の画分のみしかサンプリングすることができない。例えば、４つの基本単位（ＤＮＡ／ＲＮＡについてはヌクレオチド）を含む可能な４０ｍｅｒは１０^２４ある。したがって、生物学的サンプル（これが何万もの異なるタンパク質を含むと仮定して）からの典型的なタンパク質空間に対するアプタマー探索空間（４０ｍｅｒ核酸について）は、〜１０^２０：１（±１０倍の幅で）のアプタマー候補ポリマー対タンパク質の比率で存在する。６０ｍｅｒでは、１０^３２：１である。たとえ１０^１０の配列のうち１つのみが強く「アプタマー性」であっても、これは１つの強いアプタマーの配列を見つけるために問い合わせられる１０^２２：１のアプタマー対タンパク質をなお残している。

しかしながら、任意のタンパク質について様々な質の多数のアプタマーが存在する可能性がある。したがって、ＳＥＬＥＸは、適切な配列がテスト下の初期候補混合物中に偶然に存在するということに依存する。次に、この方法は、選択された混合物において利用可能な最も正しい解に指数関数的に収束する。可能性のある適切な配列（例えば配列に対して特定の二次構造または三次構造を付与する配列）のいくつかの予備的知識は、プロセスが完全に偶然によって決定されるとは限らないように保証するために、候補ライブラリーのデザインの間に利用することができる。たとえそうであっても、ＳＥＬＥＸによって提供される解は、その問題について最も正しい解（すなわち特定のタンパク質について最も正しいアプタマー）を提供する可能性は極めて低い。

したがって、ＳＥＬＥＸプロセスは、結合選択に対して適用可能な単一発現され単離されたタンパク質標的の使用を好み、小規模なアプタマーセットまたは単一アプタマーへの収束に向けた増幅のラウンドを介して無作為に進行する。そのプロセスは、指数関数的および反復的な選択によって、所与の配列のセットから単離されたタンパク質に対する「最も正しい」アプタマーを見つける。最近発表されたスキームにおいて、しばしば、可能な配列探索空間のうちの１×１０^{−２０ｔｈ}のみが利用される（８）が、特定の基本的な配列モチーフが他のものよりもアプタマーとしてはるかにより多くの可能性を有することが理解される。それにもかかわらず、現在のアプタマー探索は、全体的に最も適合するアプタマーをプールから見つける見込みがない。また、探索の結果は初期プールの多様性に非常に依存的である。大部分の現在のＳＥＬＥＸスキームにおいて、アプタマーは、候補アプタマーの初期探索プール中に存在しなければならない。各々のタンパク質は、現在までに行われた小規模な探索を考慮すると、完全なアプタマー空間内に広いスペクトルの可能なアプタマーを有する可能性もまた非常に高い。ＳＥＬＥＸスキームが指数関数的であるので、そして一般的に推定上のアプタマーが初期ライブラリー中に存在しなければならないので、複数のタンパク質標的に対するアプタマーを同時に選択すること、または他のもののバックグラウンド中でマスクされた１つのタンパク質標的に対するアプタマーを選択することは、ＳＥＬＥＸでは困難を伴うことになる。ＳＥＬＥＸは、文献において典型的であると最近主張される１０^１５の候補アプタマー配列を完全にスクリーニングすることもまたできない。これは、ライブラリー多様性を実証するのに必要なレベルへと、典型的には市販ののＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上でのライブラリーの合成の質を制御することができないからである。また、ライブラリー中のアプタマーのうちのいくつかは、非常に他のものにアニール（粘着する）する可能性が非常に高く、あるものは、合成プロセスにおけるバイアスのために集団中で化学量論的に少なく表現されることになる。多くのアプタマーが三次構造の分布へと折り畳まれることになる（あるものは活性があり、他のものは活性がない）。多くは、単純にそれらの相対的な希釈のために標的タンパク質に結合する機会を有さないことになる。従って、１０^１５の候補アプタマーはタンパク質に対して実際にスクリーニングされる可能性は低く、そのため探索は考えられるよりもさらに限定され、ランダム配列を生成する手段に依存するプログラミングである。進化するアプタマーの中へランダムな変動を導入することによってこれらの限定を回避しようとするＳＥＬＥＸスキームについてのいくつかのバリエーションが記述されている（７）。

別の観点では、ＳＥＬＥＸは、本質的にはコンピュータによるヒューリスティックの物理的なインビトロの実施形態である。ヒューリスティックとは、「適度に良い」正解で間に合う問題の解決を支援するための近似手法である。本事例において、問題は、大きすぎるため全体として探索することができない有限の探索空間から最も正しい解を見つけるということである。ヒューリスティックは、コンピュータでの解決が難しい問題についての解を近似する試行錯誤法を使用する、コンピュータによる方法である。言い換えれば、ヒューリスティックな方法または手順は、いくつかの目標のコンテキスト内で問題を解決する近似手法のみで始めて、次にそれ自体のパフォーマンスを改善し、したがって、より良い解に向かって移動させるために解の影響からのフィードバックを使用するものである。ＳＥＬＥＸは、標的プログラムに対してランダムに生成された候補アプタマー配列の基本的な探索を実行し、分析におけるその残存率によって各候補配列の結果の成功を査定し、次にさらなる再選択のラウンドの前に残存物を増幅する。最終的に、初期ライブラリーからの最も強い候補配列（すなわち標的タンパク質に最も高い親和性で結合するもの）が、手順の後続するラウンドにおいて漸進的により濃縮されるようになる。ＳＥＬＥＸ手順は、したがって研究下のタンパク質に対して最も高い結合親和性を備えたポリマー（または核酸）を見つけるコンピュータによる手順の実験室における実行である。もしアプタマーおよびタンパク質の物理化学的特性ならびにそれらの挙動の原因がすべて既知であるならならば、完全に決定論的にコンピュータ内でＳＥＬＥＸ手順をモデル化することができるだろう。このプロセスはあまり完全でない情報を用いて近似することができる（１７）。コンピュータによる問題をより明瞭に解決する生体分子の使用のさらなる例が公表されている（１、２、３、４、５）。

米国特許出願第０７／５３６，４２８号 米国特許出願第５，４７５，０９６号 米国特許出願第５，２７０，１６３号

本発明者は、本問題を解決し、ＳＥＬＥＸによって提示される探索能力および解を改良するために、アプタマー探索空間を探索し、プロテオームにおいて存在する多数のタンパク質および各タンパク質に対する非常に多数の可能な候補アプタマーによって提示される問題のスケールに対処する最適解を見出す、知的方法が必要であることを認識した。

多数の可能な解に関する非常に複雑な問題に対する正解を探すための手段としての候補解の集団の進化的成長は、コンピュータにより十分に記述されており（１４、１５、１６）、いわゆる遺伝的アルゴリズム（進化論的な探索ヒューリスティックの特定のクラス）において最も良く具体化される。遺伝的アルゴリズムは、自然選択および自然遺伝学の機構（増殖、突然変異、組換え、自然選択および適者生存）に基づいた探索アルゴリズムである。それらは、構造化されるがなおランダム化された情報交換と、候補解（例えばストリング構造）のコード化表現の中で適者生存を組み合わせる。これは、ヒトによる探索の革新的な直感のうちのいくつかにより探索アルゴリズムを形成することを可能にする。研究下の最適化問題に対する候補解は、集団中で人工創造物（個体）の役割を果たす。次に、集団の進化は、上記の演算子（突然変異、交差、増殖および選択）の繰り返し適用後に起こる。すべての世代において、人工創造物の新しいセット（ストリングコード化または二進法コード化）は、古い集団または以前の集団の適者を断片的に使用して生成される。時には新たな一部分は正しい測定値のために試みられる。遺伝的アルゴリズムは、効率的に過去の情報を利用して、予想される改善されたパフォーマンスを備えた新しい探索ポイントについて推測する（１４）。

これらのスキームにおいて、探索問題は、数または文字の鎖、配列またはストリングとして表現されている各々の可能な解ｓによりコード化される。このコード化はヒューリスティックの実行の便宜のみのためのものである。数または文字のこれらの鎖、配列またはストリングは、アナロジーによって、「ゲノム」として、しばしば記載される。各々の人工的な個別の解は、したがってそれ自体のゲノムを有する。候補解（ゲノム）の多くの初期集団が生成されるが、集団は完全にコード化することができる可能な候補解の総数の非常に小さな部分のみを表す。近似正解が大きすぎて網羅的探索で扱うことができない探索空間から捜し求められる場合、典型的にはこれらのヒューリスティックは展開される。「適応度関数」または「目的関数」ｆは、各々の可能な解ｓまたは候補集団のメンバーに適用される。この関数は、個別の解の最適解の特徴に対する近接性の評価である。高いｆ（ｓ）は、ｓが正しい解であることを示唆する。

通常、ランダムに生成された候補解ｓの初期集団は第一世代を含む。適応度関数ｆは候補解および任意の後続する子孫に適用される。選択において、次世代のための親はより高い適応度に向けたバイアスにより選択される。適応度関数ｆおよびカットオフ（例えば上位四分位点）の適用によって測定されるような、「適応」個体のみが選択されて、突然変異の第２のラウンド（それらのゲノムに対するランダム変化）を介して進行し、他の高いスコアの個体とそれらの「ゲノム」の一部分を交差する（組換えまたは増殖）。これを行うために用いられる方法は、１つの可能性から別の可能性までそれらの「ゲノム」の単位のアルゴリズムの変化と、任意の２つの適応ゲノム間のランダムなポイントでのゲノムの前置および後置の組合せの産生とを必要とする。したがって、子の第二世代はもとの親の解に加えて生成される。これをより詳細に表現すると、親は組換えおよび／または突然変異によるコピーによって増殖する。増殖は、個別の候補またはストリングが適応度関数ｆに従ってコピーされるプロセスである。これは、より高い適応度値を備えた候補が次世代に対して１つまたは複数の子孫を与える確率がより高く、内部にコード化された特徴のうちのいくつかが子孫に伝達されることになることを意味する。この演算子（ｆ）は、自然選択の人工バージョン（候補の中のダーウィン的な適者生存）である。一旦候補が増殖のために選択されたならば、候補の正確なレプリカが作製される。次に、この候補はさらに一般的な演算子動作のために交配プール（一時的な新しい集団）へと入力される。

組換えは２つの選択された親（候補）に作動し、１つまたは２つの子（新しい候補）をもたらす。増殖の後に、単純な交差を２つの工程で進行することができる。第一に、交配プールにおける、新しい候補または子のメンバーは、任意に交配される。第二に、各ペアの新しい候補は交差を行って、さらに２つの新しい候補を生成する。

突然変異は１つの候補に作動し、新しい候補をもたらす。たとえ増殖および交差が残存する物を効果的に探索し組み換えても、偶発的にそれらが過剰になり、いくつかの有用な可能性のある遺伝物質を失わせうるので、突然変異は必要である。人工システムにおいて、突然変異演算子は、かかる取消不能な減少に対して防御する。したがって、突然変異は重要な物の早期損失に対する保険である。

要約すると、これらの演算子は子孫（１セットの新しい候補）を生成し、いくつかの任意の集団サイズの多様であるが類似した個別の候補解（またはゲノム）の新しいセットをもたらす。この新しいセットは、その適応度について査定され、最も正しい解が生き残って増殖および変異する。これらの新しい候補は、次世代でそれらの地位を古い候補と競合する（適者生存）。集団の総計の適応度が安定したプラトーに到達するまでこれを進行させる。しばしば、これは、探索に対して妥当な解である数個の個体があることを意味し、しばしば、それらはいくつかの特徴を共通に有する。したがって、候補解（それらはそのままの状態でコード化される）の集団は、与えられた「適応度」の基準を満たす１セットの解に向かって収束することができる。結果として生じる個体の集団は、初期集団との組成的な共通性をほとんど有していない可能性がある。かかる反復の数、および安定し高度に適応する候補解集団を達成するのに必要な考慮する可能性の数は、比較的少なく、網羅的探索よりもはるかに少ない。

したがって、遺伝的アルゴリズムは、大きすぎるため一度にすべてを探索することができない空間における問題に対して、解または解のセットについて反復的に探索することを可能にする。解決される問題は１セットの候補解において最初にコード化され、適応度関数が各々の可能な解に適用される。次に、最も正しい解を同定することができる。次に、ヒューリスティックは、それらの親の特徴を保有する「子」の多様であるが類似した集団を生成する。次に、適応度の質問を再度適用し、プロセスを繰り返す。したがって、探索に対する解のランダム近似を用いて開始し、アルゴリズムは、最も正しい解が適応度関数のロバスト性に依存的であることに留意しつつ、解の最適セット側に集団の移動を許容にする。所与の問題に対する複数の同等に正しい解がある一方で、遺伝的アルゴリズムの強度は、適正な条件下で、これらのアルゴリズムはこれらの同等に正しい解のうちのいくつかまたはすべてを見つける傾向があるということである。

これに留意して、本発明は、ＳＥＬＥＸの改善を包含する。別の表現をすれば、本発明はＳＥＬＥＸを改善するコンピュータによるヒューリスティックの適用に関する。この目的のために、本発明は遺伝的アルゴリズムの物理的な実施形態である。実際は、１つの態様において、本発明は、候補アプタマー配列のデザインにおけるポリマー配列進化を方向付ける遺伝的アルゴリズムパラダイムの使用である。

別の見方では、本発明は、少なくとも１つの標的分子に対する１つまたは複数のアプタマーの同定のための方法であり、ＳＥＬＥＸを含む方法であり、各標的分子についての最も適合した配列に向けたその配列の進化を方向付ける候補アプタマー配列の適応度の使用をさらに含むという点を特徴とする方法である。

具体的には、本発明は、少なくとも１つの標的分子に対する１つまたは複数のアプタマーの同定のための方法であって、
ａ）標的分子に結合する候補アプタマー配列を選択することと；
ｂ）結合された配列に各配列のアプタマーの可能性の測定値（適応度関数）を割り当てることと；
ｃ）配列のうちのいくつかまたはすべてに対するランダム変化または指向性変化によって、進化を可能にして新しい候補配列の混合物を生成することと；
ｄ）候補プールの総計のアプタマーの可能性がプラトーに到達するまで、新しく生成された候補アプタマープールにより工程ａ）〜ｃ）を繰り返すこととを含み、
最終プール中に存在する配列が標的分子に対する最適アプタマーである方法である。

より具体的には、
ａ）少なくとも１つの標的分子と候補ポリマー配列のプールを接触させることと；
ｂ）特異的に標的分子に結合した配列から未結合の配列を分割することと；
ｃ）配列標的複合体を解離して、配列のリガンドが濃縮された混合物を得ることと；
ｄ）工程ｃ）において得られた各配列に配列のアプタマーの可能性の測定値（適応度関数）を割り当てることと；
ｅ）工程ｄ）の測定値を使用して、リガンドが濃縮された混合物のアプタマーの可能性を決定することと；
ｆ）工程ｅ）において得られた情報を使用して、工程ｃ）において得られた配列のうちのいくつかまたはすべての進化を可能にして、新しい配列の混合物を生成することと；
ｇ）候補プールの総計のアプタマーの可能性がプラトーに到達するまで、新しく生成された候補アプタマープールにより工程ａ）〜ｆ）を繰り返すこととを含み、
最終プール中に存在する配列が少なくとも１つの標的分子に対する最適アプタマーである方法である。

したがって、本発明の方法は、標的について選択的なアプタマー（実質的に最も正しいアプタマー）の同定を可能にする。アプタマー自体の候補ポリヌクレオチド配列は、探索空間（探索空間はすべての可能なアプタマー（および暗黙的にそれらの配列）である）内の可能な解を表す。配列進化の使用は、可能な解の集団が最適解に向かって移動することを可能にする。したがって、最終プール中の配列は、もとの探索プール中に存在する必要はなく、実際にはもとの探索プール中に恐らくほとんど存在しなかった。さらに、ＳＥＬＥＸは可能な解の固定された集団を問い合わせるので、プール中の候補配列の進化を可能にすることにより最も正しい解（アプタマー）の獲得を成功する機会は、ＳＥＬＥＸに比べてより可能性が高い。

進化という用語は、選択プロセスの反復の間の配列の増殖、組換え、交差および突然変異を包含する。進化は、ランダムであるか、デザインされているか、またはその組み合わせであり得る。

１つのポリヌクレオチドアプタマーを別のポリヌクレオチドアプタマーから区別する唯一の物がその配列であるので、そのアプタマーの特性はしたがってその配列にコード化されていなけらばならないということに注目するべきである。

アプタマーの可能性の割り当ては、各配列に特異的な１つまたは複数の測定された特性または計算した特性を使って行われる。例えば、アプタマーの可能性は、リガンドが濃縮された混合物における配列の存在量（相対的な存在量は以前の反復または対照に比較される）に基づくことができる。定量化はアプタマーの可能性の他の測定値と組み合わせることができる。かかる測定値は、典型的には配列それ自体、および二次または三次の構造予測、疎水性、既知のアプタマーへの類似性などのような配列によって与えられた特性に由来する。数学的にこれらの測定値を組み合わせるかまたは総計する、混成測定値もまた適切であり得る。特定の一般的な配列モチーフの可能性を使用して、配列のアプタマーの可能性を推定することもできる。その測定された統計特徴または配列特徴（または他のもの）から候補配列の相対的または絶対的なアプタマーの可能性を決定する方法は、「適応度関数」と呼ばれる。これは、進化的探索ヒューリスティックの当業者のための標準的な用語に従う（１４）。他の用語は、「目的関数」などの同じ概念についてもまた存在する。非技術的に表現すれば、これは候補アプタマーの可能性の客観的な測定値（通常数のスコア）である。

本発明の特色は、高度にアプタマーである個体が、配列の単一の変更などの小さなランダムな組成的変化および配列の交差組換えを受けることを可能にしており、これによって、より強い候補アプタマー配列の新しいプールを生成する。配列の進化を可能にすることの有意な利点は、それが初期候補プール中に存在しえない配列およびモチーフの生成を可能にするということであり、したがって標的タンパク質について最適アプタマーを同定する可能性を促進する。本方法の他の有意な利点は、互いと組み換えて突然変異を行うことが可能にされるのは「適者」候補配列のみであり、したがって推定上より適応した新規のアプタマー配列の子集団を生成するということである。

本発明のスキームとＳＥＬＥＸとの間の基本的な差は、ＳＥＬＥＸが研究下の配列中に突然変異または変化の導入を容易には可能にしないということである。実際は、突然変異を生じることができる唯一の方法は、結合された配列がＰＣＲによって増幅される場合の増幅工程の間の偶然によるものである。しかしながら、かかる突然変異は非常にまれであるので、プロセス（すなわち研究下の配列の集団の全体的な組成）に影響できない可能性がある。また、ＳＥＬＥＸは、アプタマー種の間の配列の組換えまたは交差（他の場合には「組換えまたは増殖」と呼ばれる）も、アプタマー配列を変化させる合理的な介入も作動させないかまたは可能にしない。さらに、ＳＥＬＥＸスキームは、例えば配列がアプタマーとしてそれらの「適応度」について査定され、選択のラウンド間で合理的に操作されることを可能にしない。

合理的な介入の例としては、任意の反復でのすべてのアプタマー配列が特定の配列モチーフを含むことを保証することであってもよい。これは突然変異および組換えの後は行われないかもしれない。従って、合理的な介入はランダム性についてのフィルターまたは制約として作動する。重要なことには、予備的知識（例えば既知のタンパク質結合性モチーフ）を、例えば、研究下の配列の集団へと組み入れて維持することが可能であるので、選択プロセスの効率を改善することができる。これは、その結果を完全には決定しないが、人間が進化を方向付けて制約することを可能にする。

さらなる例において、各々の反復で配列プールの多様性をモニタリングすることによって、集団で、複数のタンパク質に対する複数の解（アプタマー）が並列して見出だされるように助長することができる。これは集団全体内の別個の配列の複数の亜集団の進化を同定し、モニタリングし、方向付けることによって遂行することができる。提案された発明とは異なり、ＳＥＬＥＸが、プロセスの各々の反復で結合されたアプタマーの定量化を可能にしないので、および全般的な結果にポジティブに影響を及ぼす方式でアプタマープールの各々の反復の間の各々の配列についての推論および決定を下すためにこの情報を使用しないので、これはＳＥＬＥＸでは可能ではない。

いわゆる「次世代」のポリヌクレオチド配列決定技術は、ビーズまたはチップなどの表面にＤＮＡもしくはＲＮＡまたは他のポリヌクレオチド配列の個別の分子を分離し、それによって配列の単一分子アレイを生成することを必要とする。アレイは、各々の分子が例えば光学顕微鏡法によって個別に分解されることを可能にする表面密度を有する。アレイ上のポリヌクレオチド分子の配列決定は、配列の「デジタルな」（すなわち、絶対的な）カウント、およびしたがってアレイに存在する配列の直接定量を可能にする。いくつかの技術において、配列をいったんアレイ化しクローン的に増幅して、各々の配列からのシグナルを増強および／または明確にすることができる。それにもかかわらず、定量化は、各々のアンプリコンから産生されたシグナルではなく、アレイ上の配列の出現のカウントによって得られる。適切な配列決定技術および定量化技術の例は、ＷＯ００／００６７７０およびブラントン（Branton）ら（２１）などの出版物において見出すことができる。

提案された発明において、候補アプタマー配列の操作は、「第二世代」、「次世代」または「第三世代」のＤＮＡシークエンサーにおいて具体化された技術などの超並列ＤＮＡ塩基配列決定の使用によって達成される。超並列配列決定の使用は、リガンドが濃縮された候補アプタマーが並列して定量および配列決定されることを可能にし、それによってそれらの存在量に由来する適応度測定値、および同時にそれらの配列に由来する他の適応度測定値に対する情報を提供する。なお、超並列シークエンサーのパフォーマンスを考慮すると、かかるスキームが、提案されたスキーム下でアプタマーを見出す実験の時間およびコストを有意に減少させることになる。

したがって、合理的な介入（または人間による方向付け）の別の例は、研究下のアプタマー配列を検討およびカウントすることであり、特定の配列の表示を損なうシークエンサーそれ自体の効率の欠点が指摘される。これは後続する集団の組成にバイアスをかけることによって補償することができる。

したがって、好ましい実施形態において、アプタマーの可能性は、工程ｃ）において得られた各々の配列の定量によって測定される。理想的には、定量化は、配列の単一分子アレイ、または超並列様式で個別の分子を配列決定しカウントすることができる類似した装置を使用して実行される。特に、アレイ上の各々の配列を同定するのに十分な配列決定または部分的な配列決定は、各々の配列のカウントと組み合わせて実行して、定量化を達成する。あるいは、表面上にアレイ化された後に各々の配列を増幅し、クローンのアレイ上で配列を定量することができる。このような方法で、一次適応度測定値は、研究下の集団における所与の候補アプタマー配列の頻度を表現するアレイ上のカウントであり得る。いったん一次適応度が得られたならば、各々の候補アプタマーのヌクレオチド配列または分子組成に由来し、定量化の間に得られたバイオインフォマティクスデータ（類似したモチーフまたは二次構造などの）は、リガンドが濃縮された配列へのドリルダウンに加えて使用され、さらなる適応度基準を得ることができる。計算されているが組成依存的な特性は、それらを組み入れること、それらにバイアスをかけること、または消失させることのいずれかによって、次のラウンドのための候補アプタマーライブラリーの進化的生成において続いて利用することができる。

本発明は、現在のところ利用可能な、超並列様式で、単一分子感度まで個別の配列を分離し定量する技術の能力を利用する。それは、複雑かつ多様な配列の集団の研究もまた可能にする。単一タンパク質に対してスクリーニングした場合、結合された画分においてより多量にあることが見出される候補アプタマー配列は、本方法が研究下のタンパク質に粘着する（結合する）候補アプタマー配列を探索する事実から、１コピーのみが結合される配列よりも高い適応度を有することになる。これはアプタマーを定義する一次特性である。タンパク質の複雑な混合物に対してスクリーニングした場合、定量化手順に由来する他の統計的特性がアプタマーを同定するために必要となる。超並列配列決定の利点は、各々およびすべての配列がカウントされ、従って定量化されることを可能にするということである。これは、例えば、分解能が同程度には高くなりえない抗体分析とは対照的である。

したがって、アプタマーのカウント、およびそれらの配列から生成された他の測定された統計、計算された統計、または過去の統計は、「適応度関数」へと使用され、組み合わせることができる。これは、ＳＥＬＥＸで具体化されたものよりも分子レベルで洗練されてより成功した進化的探索ヒューリスティックスの物理的な実行を可能にする。計算領域におけるかかる洗練されたヒューリスティックスのように、それは、所与の「適応度」の測定値自体の詳細よりもむしろ、かかる「適応度関数」自体を導出し、それを適用して重要な研究下の分子の集団の後続する反復を改良する能力である。なお、本発明は、多くのかかる調査を可能にし、これによってアプタマーの最適な一般的な「適応度」特性の学習を可能にすること、または例えば特定のクラスのタンパク質にコンテキスト特異的「適応度」測定値を導出することになる。

候補配列およびモチーフについての情報が構築されるので、関連タンパク質または類似タンパク質に対するアプタマーの同定のための後の候補プールまたは新しいプールへ、特定の特色の知識を組み入れることができる。同様に、効果的でないことが見出された配列およびモチーフは、候補プールから積極的に除外することができる。

また、異なるタンパク質についての選択性を備えたアプタマーが必要とされるならば、既知のタンパク質に対する既知のアプタマーの配列は、積極的に候補プールから除外することができる。これは、見出されたアプタマーがこのタンパク質に対する特異的な可能性が高いこと（有用なアプタマーのための主要な必要条件）を保証することを支援する。あるいは、特定のタンパク質ファミリーに対する選択性および特異性を提供する配列および／またはモチーフが選ばれるならば、これらの配列および／またはモチーフは、次にこれらのタンパク質のサブタイプについて選択的なアプタマーの同定に使用される候補アプタマープールへと組み入れることができる。

これらの利点のすべては、アプタマー配列の知識、それらの相対的な「適応度」に加えて、それらの配列または選択的なスキーム下でのそれらの定量的挙動に由来する他の計算可能な特徴を有することによって推進される。

遺伝的アルゴリズムによって使用されるアルゴリズムのコード化スキームは、本発明の実際の組成的本質を反映する。これらのアルゴリズムは、コンピュータのメモリ内ではあるが、交差組換えおよび選択／増幅などの反復的な変化が行われる性質または数（またはビット）のアナロジーによって、探索問題を「ゲノム」へとコード化する。本発明に従って、これらのプロセスは研究下の実際の分子を使用して実施される。分子（この事例においてはポリヌクレオチド配列）自体は、探索に対する可能な解をコード化し、タンパク質に対するそれらの粘着性（定量化によって表されるように）などのそれらの特性（それらの配列中にもコード化される）の評価であり、それは本方法を推進する（１５）。したがって、本発明は遺伝的アルゴリズムの物理的な実施形態である。これは、超並列ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定の使用、およびさらにアプタマーはアプタマー特性が配列中にコード化される個々のポリマー分子であるという事実によって可能になる。

より明確には、超並列配列決定の使用は、タンパク質標的または複数のタンパク質標的に対する特異的なアプタマーの同定のための最適化された半合理的な／セミランダムな進化的検索戦略の実行を可能にする。例えば、研究下のものに類似するタンパク質に対して効果的であると以前に示されている既知の配列モチーフは、初期ライブラリー生成の一部としておよび適応度選択の一部として、両方で優先的に選択することができる。このような方法で、これらのモチーフ（これらのモチーフはまた任意の解についての前提条件である）を含む、高品質の解または「適合する」解に向かって、本質的におよび都合好く、プロセスにバイアスをかける。しかしながら、ライブラリー生成における十分なランダム性およびモチーフの後続する突然変異変更を使用して、研究下のタンパク質を結合する新しいが類似した配列を見つけることを保証することができる。以前のタンパク質に対して既に見つけられていたものに類似するが十分に異なる配列が選択されるように、適応度関数はデザインすることができ、適切なアプタマーの選択における成功および特異性の両方を保証する。これは、多くのタンパク質に対して感受性があり特異的なアプタマーのカタログの経時的蓄積もまた促進する。１つのタンパク質に対して作動し、他のものには作動しない別個のアプタマーのかかる「非重複」亜集団を、続いて同時に使用して、複数のタンパク質を並列してプロービングし測定することができる。

超並列配列決定は多重化を可能にするので、１を超えるのタンパク質に対するアプタマーライブラリーを、同時に生成およびスクリーニングすることができる。同様に、本発明は、高品質であるが（配列レベルで）異なる多くのアプタマーが、単一または複数のタンパク質標的に対して並列して選択されることを可能にする。

さらに、超並列配列決定が各々の配列種の定量化を可能にし、各々の種が単一タンパク質を表現することができるので、提案された方法はゲノミクスを使用してプロテオミクスのパワーおよびダイナミックレンジを拡張する。

本発明の特異的な実施形態において、デザインされた配列、ランダムな配列、または半デザインされた配列の多様なライブラリーは、生物学的材料（例えば血清、血漿）に由来する折り畳まれたタンパク質のインビトロのセットに対してスクリーニングおよび選択される。なお、配列のライブラリーは任意の方法によって生成されてもよい。

タンパク質を結合しない配列は、除去または溶出される。これを達成するために、様々な既知の選択肢が利用可能である。例えば、単一タンパク質または複雑なタンパク質サンプルは、固体支持体上で固定化することができる。ストリンジェントな洗浄を実行して、未結合の配列および弱い結合の配列を除去することができる。別の選択肢は、タンパク質標的上の配列の可逆的な架橋（フォトアプタマー）の使用である。

残存する結合配列はそれらのタンパク質ホストから除去し、それらを配列決定およびカウントする場合は超並列シークエンサーを通す。

超並列配列決定の具体的な例として、結合配列は、ビーズまたはチップなどの表面上でランダムにアレイ化される。配列は任意でサイクル的に増幅され、表面上のまたは個別のビーズ上の個々のｘ座標およびｙ座標でクローンの一本鎖分子のグループをもたらす。次に、適切なＤＮＡシークエンサーは、１サイクルあたり各々の相補的な配列上の１塩基の決定を可能にする試薬からなる段階的なケミストリーを実施して、リアルタイムで塩基の取り込みをモニタリングする。照射および画像化のシステムは、もとの候補の配列を得ることができるようにこのプロセスが撮影されることを可能にする。配列決定技術の詳細に関係なく、各々の結合された候補配列を反映する相補的な配列が構築される。典型的には、かかる技術は、４０００万〜３億のＤＮＡ断片を越えて最大長さ７５塩基対で配列決定することができ、技術が改良されるにつれてこれらの数は急速に増加している。このプロセスは、現在のところサンプル調製から配列決定アウトプットまで１〜３日未満しかかからず、これらの時間スケールは短縮している。

なお、「次世代ポリヌクレオチド配列決定」のカテゴリーへと分類される他の超並列方法が使用でき、かつ本発明は記載された特定の例に限定されない。「次世代ポリヌクレオチド配列決定」は、一般的には、２００４年に出現したＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定プラットフォームについて記述するために作られた用語である。２００８年以来、改善された特徴を備えた配列決定プラットフォームの別の世代は、現在「第三世代」として表現される。それらの共通の特徴は、「サンガー」の配列決定に基づいた旧技術とは異なる配列決定ケミストリーを使用するということである。新しいプラットフォームは新しいケミストリーを使用し、一般的に非常に高いスループットおよびはるかに低いコストのものである。これは、非常に高い程度まで配列決定反応を並列化する能力を介して達成された。新しいプラットフォームは塩基を切り取る（分解する）ことによって機能するサンガー法とは異なり、合成または鎖の伸長（構築）によって、典型的には進行するが、これのみに限定されない。さらに、新しいプラットフォームは、非常に大きな塩基に対する分子の測定比率のＤＮＡシークエンサーを有するサンガー法とは異なり、少数の単一分子またはクローン性分子で作動する。

なお、ＤＮＡ塩基配列決定が言及されているが、ＲＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）の配列に対してもまたＤＮＡ塩基配列決定技術を使用できる。したがって、次世代のシークエンサーまたは配列決定に対する言及は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡと同様に、本発明の方法における使用に適した核酸ベースのポリマーの他のすべての化学的バリアントおよびそれらの類似体を包含する。すべての新しい配列決定技術は、「次世代」または「第三世代」かどうかに関わらず、超並列かつ高度に効率的な方式で個別の分子またはそれらのクローン性のコピーを配列決定することができる。

「配列カウント」（すなわち複雑な生物学的サンプル（ｍｉＲＮＡなどの）中の配列の絶対的存在量または相対的存在量を定量する）の使用は、既に十分確立されており、かかる次世代プラットフォームまたは超並列プラットフォームについて記述される（１８）。効果的な超並列配列決定プラットフォーム上で、もとの候補配列に対して相補的な由来配列は高度に正確であり、強い構造要素であるホモポリマーおよびパリンドローム配列または他のモチーフを解消することができないような有意なシステマティック配列コンテキストバイアスを、たとえあったとしても、ほとんど有さないはずである。いくつかのプラットフォーム上で、これは、大きい複雑なゲノム（それはかかるモチーフを含んでいる）の再配列決定によって既に確立されている。

本発明の方法は、単一の単離されたタンパク質に対して実行することができる。あるいは、本方法は、タンパク質の混合物内に存在することが既知の単一タンパク質に対して実行することができる。

しかしながら、遺伝的アルゴリズムの長所のうちの１つは、亜集団がより広範囲の集団から進化できるということである。これは異なる基準に対して副選択することによって達成される。したがって、さらなる代替において、本方法は、混合物内の多くのタンパク質の問い合わせもまた同時に可能にする。本技術は多重化を可能にするので、これは次世代ＤＮＡ塩基配列決定技術の使用によって可能になる。

複数のタンパク質に対して候補アプタマーを探索する場合、候補配列の別個の集団の出現をモニタリングすることができる。次に、配列集団は、本発明における一般的なスキーム下で並列して分類および発達させることができる。例えば、単一タンパク質の異なる領域のための別個のアプタマーを同定することができる。なお、どの時点においても問い合わせられた集団の数は、配列決定アレイに加えて標的分子のダイナミックレンジによって限定される。

本発明の方法を使用して単一の標的またはタンパク質（例えばゲルから切除されたタンパク質）を問い合わせることができるが、複雑なタンパク質混合物を含む標的の混合物の分析に特に適している。用語「タンパク質の混合物」または「タンパク質混合物」は、２つまたは複数の異なるタンパク質（例えば上記２つ以上の異なるタンパク質またはそれらのアイソフォームを含む組成物）の混合物を一般的に指す。

好ましい実施形態において、本明細書で分析されるタンパク質の混合物は、約１０を越える、好ましくは約５０を越える、さらにより好ましくは約１００を越える、さらにより好ましくは約５００を越える異なるタンパク質、例えば約１０００を越えるまたは約５０００を越える異なるタンパク質などを含むことができる。例示的な複雑なタンパク質混合物は、生物学的サンプルまたはその一部分において存在するタンパク質のすべてまたは画分を含むが、これらに限定されない。

用語「生物学的サンプル」または「サンプル」は、一般的に本明細書において使用される時、生物学的ソースから得られて、非精製形態または精製形態の材料を指す。限定ではなく例として、サンプルは、ウイルス（例えば、原核生物ホストまたは真核生物ホストのウイルス）；原核生物細胞（例えば、細菌または古細菌（例えば、自由生活性原核生物もしくはプランクトン性原核生物、または原核生物を含むコロニーもしくはバイオフィルム））；インビボでもしくはインシトゥーで得られるか、またはインビトロで培養された真核生物細胞を含む真核生物細胞またはそのオルガネラ；真核生物の組織または生物（例えば、真核生物の組織または生物からの細胞含有サンプルまたは無細胞サンプル）から得ることができ；真核生物は、原生生物（例えば、原虫類または藻類）、真菌（例えば、酵母またはカビ）、植物および動物（例えば、哺乳類、ヒトまたは非ヒト哺乳類）を含むことができる。生体サンプルは、したがって、例えば、細胞、組織、生物、またはその抽出物を包含することができる。生物学的サンプルは、尿、唾液、喀痰、精液、乳汁、粘液、汗、糞便などの回収または採取、血液、脳脊髄液、間質液、眼内液（ガラス体液）または関節液の採取などのこれらに限定されない適切な方法によって、または組織生検、切除などによって、その生物学的ソースから（例えば、哺乳類、ヒトまたは非ヒト哺乳類などの動物から）好ましくは取り出すことができる。生物学的サンプルをさらに細分して、本発明における分析のためのタンパク質を得るために使用されるその一部分を単離または濃縮することができる。限定ではなく例として、多様な組織タイプは互いから分離することができ；特異的な細胞タイプまたは細胞表現型を、例えばＦＡＣＳ選別、抗体パニングならびにレーザー捕捉解剖などを使用して、サンプルから単離することができ；細胞は間質液から分離することができ、例えば、血球は血漿または血清から分離することができ；または同様なことができる。サンプルは、本発明の方法に直接適用することができるか、または使用前にさまざまな程度まで加工、抽出もしくは精製することができる。

サンプルは、健康な被験者、または病態、障害、疾患もしくは感染を患う被験者に由来しうる。例えば、被験者は、健康な動物（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類）、または癌、炎症性疾患、自己免疫性疾患、代謝疾患、中枢神経系疾患、眼疾患、心臓疾患、肺疾患、肝臓疾患、胃腸疾患、神経変性疾患、遺伝性疾患、感染症もしくはウイルス感染、または他の病気（複数可）を有する動物（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類）であり得るが、これらに限定されない。

好ましくは、プロテオーム解析の感度およびパフォーマンスを増加させるために、生物学的サンプルに由来するタンパク質混合物を処理して、高度に多量にあるタンパク質をそれから枯渇させることができる。例として、ヒトの血清サンプルまたは血漿サンプルなどの哺乳類サンプルは、多量にあるタンパク質、とりわけアルブミン、ＩｇＧ、アンチトリプシン、ＩｇＡ、トランスフェリン、ハプトグロビンおよびフィブリノーゲンを含み、これらは好ましくはサンプルからそのように枯渇されていてもよい。多量にあるタンパク質の除去のための方法およびシステムは、例えば、免疫親和性枯渇などが既知であり、例えば、マルチプル・アフィニティ・リムーバル・システム（Multiple Affinity Removal System）（ＭＡＲＳ−７、ＭＡＲＳ−１４）が、アジレント・テクノロジー（Agilent Technologies）社（サンタクララ、カリフォルニア）からしばしば市販で入手可能である。

本発明はタンパク質のための特異的なアプタマーの同定に対する特定の適用を有するが、本発明は代謝物質および可能な低分子および生物学的治療剤などの他の分子の問い合わせのための適用もまた有することが認識されるべきである。

上述された方法は、配列決定を介するアプタマー配列の定量に着目する。単一のタンパク質のための特異的なアプタマーのライブラリーを生成する目的のために、ライブラリーが完成するまでアプタマーの配列を具体的に調べる必要はない。したがって、本方法はアプタマー配列の最終プールのみの配列を得ることをさらに含むことができる。

本方法の有意な利点は、必要とされる材料の量は少ない（ピコモル、さらにはフェントモル）ということである。４つの塩基（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）を使用して、４０ｍｅｒのＤＮＡアプタマー配列が調製されるならば、可能性として１．２×１０^２４の組合せが利用可能である。したがって、１モル（６．２×１０^２３）は、最もよい場合ですべての可能な配列の５％のみを含み得、かかる調製物は重さ１ｋｇを超えることになる。１ピコモルはおよそ１×１０^１１分子を含み、したがって１ｍｌのピコモーラーのユニークなアプタマーは１×１０^８分子を含むことになる。２３の可変塩基対および／またはランダム塩基対を残して、４０ｍｅｒ中の１７塩基対がすなわち「モチーフ」として固定されるならば、１ピコモルは最大約７０コピーの各々の可能な配列を含むので、１〜１０ｍｌのピコモーラー溶液は１〜およそ１０コピーの間の各々の配列を含むはずである。したがって、定量化装置（すなわち超並列シークエンサー）は、感度において、タンパク質についてのアプタマーの親和性および未修飾生物学的サンプルにおける大部分のタンパク質の生来の濃度の両方を上回ることができ、かつ上回るはずである。

イルミナ（Illumina）社（登録商標）によって販売されるものなどの次世代配列決定装置は、典型的には、画像化領域あたり２５０００配列程度をきれいに抽出することができる表面上に３３０×８画像化領域を有している。したがって、現在のところ、１稼動および１チップあたり約１×１０^８の４０ｍｅｒ配列を問い合わせることが可能であるはずである。したがって、本技術は、溶液中のピコモーラーアプタマーの１：１観察を可能にするはずである。したがって、本技術は、生来のサンプル中のタンパク質のダイナミックレンジにわたるダイナミックレンジを有する。かかる配列決定技術のパフォーマンスは経時的に改良されている。

いったん特定のタンパク質のための特異的なアプタマーのライブラリーまたは集団が開発されたならば、アプタマーの配列を使用して、特異的なタンパク質のためのアプタマー集団の構造、機能および結合の特徴の合理的な知識を構築することができ、またはその逆も成立する。今度は、これを使用して、タンパク質をさらに調べ、アプタマーライブラリーの他のパラメーターおよび／または特色を改良することができる。これらの改良は、初期ライブラリー生成の間、および／または提案されたスキーム下で反復的な選択のラウンドの間のいずれかで、適用することができる。実際は、経時的に、同定されたアプタマーとタンパク質との間の配列／構造的関係が構築され、初期アプタマーライブラリーのデザインへのインプットとして使用して、異なるモチーフによりアプタマー空間の異なる一部分および他の一部分を調査することができる。

かかる情報を使用して、対象となる初期タンパク質に類似した構造を有するタンパク質の評価をすることもできる。このような方法で、特定のクラスのタンパク質に対するアプタマーを見つけて、類似するタンパク質は、同じクラスにおけるタンパク質の予備的知識に基づいて合理的に選択された出発アプタマーライブラリーの利用によって、調査および問い合わせることができる。１つのタンパク質、すなわち特定のドメイン、のためのライブラリー配列の知識はまた、関連するタンパク質および仮想上のタンパク質ファミリーの他のメンバーのためのアプタマープールのデザインの支援に使用することができるか、または類似するアプタマー配列が類似するタンパク質の表面に結合する特徴を実証および測定することができる。

廃棄されたアプタマー配列も、情報のために掘り起こすことができる。例えば、これらの配列の統計的特性および計算上の特性（例えば構造）を使用して、弱いアプタマーの一般的な特性を特徴づけることができる。初期アプタマーライブラリーをデザインする場合、かかる情報は有用な知識を提供し、配列レベルとしての初期ライブラリーのランダム性の限定への近道を可能にする。

代替の実施形態において、中間の工程は、アプタマータグ（配列）をバイオインフォマティクス的に調べて、それらを合理的に改良することであり、したがって多様であるが高度に特異的なタグに向けた集団の進化的進行を保証することができる。バイオインフォマティクスデータは、特定の二次構造および三次構造をもたらす配列、および候補配列とタンパク質との間の配列相補性を含む。

以前に略述されたように、特徴は、所与のアプタマー配列、およびタンパク質ファミリー、折り畳みドメインなどのような他の生物学的データのために、計算、集計、関連づけ、および保存することができる。これらのバイオインフォマティクス特徴を使用して、初期ライブラリー生成を改良することができる。また、それらは、各々のステージで集団の特徴を形作りかつ改善するために、候補アプタマー配列の選択ラウンド間の「適応度関数」の一部として使用することができる。

血液中のタンパク質は、疾患状態のマーカーの同定および薬物治療についての特定の標的である。血液中のタンパク質の量および／またはコンフォーメーションが、内因性の天然の変動を上回る方式で、かかる状態に統計的に関連するはずであることが広く想定されている。血液および他の体液は、影響を受けた組織を浸しており、生命に必要なタンパク質を輸送し、医学相談の間に比較的安価で簡単な手順を使用して検査のために得ることができるので、血液および他の体液は特定の標的である。

しかしながら、血液中のタンパク質は非常に広い範囲の濃度を有し、少数のタンパク質がすべてのタンパク質のうちの９９．９％以上を占め、残りが１ミリリットルあたりピコグラム〜ミリグラムの分布を占める（１９）。したがって、高存在量のタンパク質の小集団は、タンパク質混合物中に同様に存在する生命に必要であるがまれなタンパク質を隠してしまう。

本発明の方法は、低い存在量または非常に低い存在量で生物学的サンプル中に存在するタンパク質へのアプタマーの同定を可能にする。したがって、さらなる実施形態において、本方法は、反復の初期（第１および／または第２）ラウンドおよび／または他のラウンドにおいて見出される非常に高度に多量にある候補配列を除去することをさらに含む。配列決定アレイに「スロット」の有限数があるとすれば、高度に多量にある候補配列は全部ではないが大部分のスロットを占め、それによって任意のそれほど多量にない候補配列を隠し、潜在するタンパク質のダイナミックレンジの歪んだ概観図を提供することになる。配列プールから、非常に高度に多量にある候補配列を、絶対的または相対的な意味のいずれかにおいて、取り除くことによって、次に、高度に多量にあるタンパク質のための特異的な候補配列はもはや問い合わせることができず、たとえタンパク質が混合物中になお存在しても、複雑な混合物内のタンパク質のこの特定の集団は効果的に無視される。

１つの高度に多量にあるタンパク質へ適応する配列の除去は、別の高度に多量にある候補配列を示すか、またはより少量の標的に対する候補配列を示すことになる。

これは、より少量のタンパク質に向けたアプタマー配列を見出すことにバイアスをかける合理的な介入の別の例である。他の平衡選択（同じ反復の複製間の推定上の低存在量のアプタマーについての低い分散、および／または特定の既知の配列モチーフの優先性など）もまた適応度関数において必要とされることになる。これは、非特異的配列またはランダム配列のバックグラウンドノイズから低存在量だが「適応する」配列が選択されることの保証を支援することになる。

この追加の工程の利点は、非常に高度に多量にあり共通のタンパク質を除去するタンパク質混合物操作が回避されるということである。このような方法で、タンパク質混合物はより忠実に天然サンプルに基づき、推論によって、混合物に由来するタンパク質についての任意の情報は各々のタンパク質の天然の状況をより正確に反映する可能性がより高い。タンパク質の天然状態のこの使用は、それが化学的修飾または天然で一般的な他の翻訳後修飾を有するタンパク質に向けた特異的なアプタマーの選択を可能にするという追加の長所もまた有する。

高度に多量にある候補アプタマーは単純に無視することができるか、またはプールからその集団を引くことができるかまたは除去することができる。除去は、例えば、多量にある配列に対して相補的なプローブを含む固体支持体上でのハイブリダイゼーションによって達成することができる。また除去は、高度に多量にあるタンパク質と結合する配列を例外として、「適応度」を暗示する望ましい特徴のすべてを備えた新しい配列のプールを生成するようにＤＮＡシンセサイザーを適切にプログラミングことによって、後続する反復から特定の候補配列を除外するという点で、合理的な介入の例である可能性がある。次にこの新しいプールは、本発明を含む一般的なスキーム下で、後続する選択のラウンドへと進められる。

次に、第１の工程から最も量が少ない候補配列のパネルのみが注目され、続いて使用することができる。したがって、シークエンサーの定量的パワーは非常に少量の候補配列、および、代わりに、タンパク質混合物中に低存在量で存在するタンパク質に注目することができる。これは、従来のＭＳ（質量分析）に基づいた技術またはＳＥＬＥＸのいずれでも現在のところ可能ではない。

高度に多量にある候補配列の反復的なサブトラクションは、より低存在量の候補配列の問い合わせを可能にするはずである。任意の結合が選択的であることおよび単に偶然に起こらないことを保証するために、候補配列に既知の量の既知のアプタマー配列を添加し、既知のアプタマーが既知の量で存在して結合するタンパク質を含むタンパク質の混合物に対して、配列を作動させる。あるいはまたはさらに、多数の複製にわたって低分散であることは、問い合わせ下の候補配列がタンパク質に高度に結合（粘着）する可能性が高いことを意味するはずである。

したがって、本発明の方法は、プロテオミクスの主要な問題のうちの１つ（すなわち、どのように高度に多量にあるタンパク質に対処し取り組む）を検討する。これはこれらのタンパク質に結合する候補配列を合理的に除外することによって達成される。これらのタンパク質は、後続する測定および選択のラウンドにおいて無視される。突然変異／交差のプロセスは、高い存在量のタンパク質に結合するいくつかの候補配列の再出現を引き起こすことができるが、これらの配列もまた以前に記述されるようなプロセスの各々の反復で合理的に消失させることができる。少量の候補配列（反復間のそれらの測定上で強い配列特性および少ない分散を備えた）の注意深い選択は、少量のタンパク質に特異的に感度よく結合する可能性のあるアプタマーの集団（またはサブセット）上への収束を可能にするはずである。

さらなる実施形態において、候補配列をカウントしそれらを対照集団に比べることによって、各々の反復における候補配列の存在量範囲もモニタリングすることができる。これをさらに使用して、適応度ベースの選択を改良することができる。例としては、選択の第一ラウンドの間で、選択された配列の集団は初期のスクリーニングされていないライブラリー中に存在するものと比較される。特定の配列の配列組成および統計的な普及率の有意な変化（恐らくいくつかのモデルに合致して）は、相対的な成功を示しうる。初めのいくつかの選択のラウンドが、初期集団とは組成が有意に異なる候補配列プールを産生しないならば、プールおよび実験は失敗と判断されうる。

なお、いったん１つの候補アプタマー配列、または候補アプタマー配列のライブラリーが本発明の方法によって同定されたならば、配列がアプタマーとして検証されなくてはならない。これは、同じ元のサンプルの複数のコピーに対して、または複数の異なるサンプルにわたって、候補配列の結合および定量化を複製することによって達成することができる。サンプル間での複製が不十分であるかまたは変動が高いならば、恐らく候補配列は１つの標的について特異的ではない。かかる妥当性検証に適切な方法は同時係属中の欧州特許出願第０７０２００４９．８号中に記述されている。

本発明を、ここで、非限定例によりさらに記述する。

（実施例１）
この実施例において、ＳＥＬＥＸとの比較のために、１セットのアプタマーを、溶液中に存在するかまたは固定化された単一のタンパク質に対して捜索する。

ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチド配列の集団は、モチーフまたはパターンとして表現される。例えば、配列ＧＧＣＴおよびＣＣＧＡは１つのパターンＧＧＣ（Ａ／Ｔ）によって表現することができ、ここで「／」は「または」を意味する。ＩＵＰＡＣ一文字コードの高度なセットは、共通性が強調された配列の多重表示を可能にする配列パターンを表現するように存在する（２０）。

この実施例において、ＤＮＡアプタマーモチーフが選択され、セミランダムライブラリーが既知の技術を使用して合成される（１１）。これは「候補ライブラリー」と呼ばれる。ライブラリーの多様性は合成の可能な任意の範囲中であり得る。この実施例において、合理的な予備的知識を使用して、自己類似性およびアニーリングによって特定の二次構造を有するＤＮＡ配列を支援する。対照ライブラリーも同じ長さの純粋にランダムな配列から構築される。これは「ランダムライブラリー」と呼ばれる。

次に、従来のＳＥＬＥＸスキームにおいて具体化されるように、非結合アプタマー配列が廃棄されるように両方のライブラリーは選択された条件下で単一タンパク質に対してスクリーニングされる。

生き残ったアプタマーＤＮＡ配列（すなわちタンパク質に結合した配列）は、タンパク質からアプタマーの結合をはずした後に、適切な分解能およびダイナミックレンジの次世代ＤＮＡシークエンサーでアレイ化される。この手順は、結果として生じる測定の統計的有意性の改良のために複製される。

生き残ったライブラリー中に存在するアプタマーが同定されカウントされるように、アレイ上のすべての分子を配列決定およびカウントする。アレイ上に存在する配列の数は、通常の統計的サンプリング手順に従って、起源とする集団中の分子の比率を表すはずである。測定の正確性および任意の統計的サンプリング問題（特に、よりまれなアプタマーとの）は、各々のライブラリーの複製からの分散の測定によって確認することができる。

初期の選択されていないライブラリーに対して選択されたアプタマーの第１の反復の差異的な比較が行われる。これは、ライブラリー合成の成功および効率／多様性の評価もまた可能にする。同様に、アプタマーの純粋にランダムなライブラリーのその選択されていない相当物に対する差異的解析が実行される。選択／暴露されたセミランダムライブラリーが、暴露されない／ランダムなライブラリーとは有意に異ならなければ、それは、アプタマー選択が適切でなく、ライブラリーが見込みがないと結論することができる。この時点で、このライブラリーのトライアルを停止することができ、配列レベルで異なる特徴を有する別のライブラリーを合成することができる。

候補ライブラリーが、第１の反復の後に、暴露されない候補ライブラリーおよび／またはランダムライブラリーと十分に相違するならば、当該ライブラリーは使用され、さらに発達されることになる。

任意のサイズの初期アプタマープールから、１０^７〜１０^９のアプタマーの範囲のサンプルがアレイ上で配列決定されることになる。シークエンサーの未来の世代はより高いダイナミックレンジを可能にすることになる。初期候補ライブラリー多様性ならびに以前の工程における配列決定およびカウント（および対照）の結果を考慮すると、アプタマーモチーフの品質は第１の反復の後に査定することができる。記述されるように、このアプタマー集団がもし有望であると判断されるならば進行させることができるか、または、あるいは、新しい初期候補モチーフライブラリーを生成することができる。例えば、生き残ったアプタマーの分布および分散が、対照から測定されるような初期ライブラリーとは非常に異なるならば、かかるライブラリーは進行のために好ましい。

第１の反復は、実験条件および対照からのデータを提供する。

表１において、各々のアプタマー配列、その量および分散、二次構造などの配列に由来するバイオインフォマティクス特性、ならびに前述の「適応度関数」を介する配列適応度の全般的な測定値を計算することができる。使用において、表は何千または何万ものエントリーを有し、１つの行は各々のユニークなアプタマー配列のためのものである。列は、そのアプタマー配列についての総計された測定値を含む。示された表は、説明の目的のみのためである。

複数のスコアからの適応度計算は、遺伝的アルゴリズムについての文献において十分記述されており（１４、１５）、単なる例示としては、複数の確率のベイズの組合せを含むことができる。任意の適切に計算可能な適応度の測定値は、配列の測定された存在量または配列それ自体（および任意の推論可能な特性）のいずれかに基づいて使用することができる。表１において提供される単純化された例において、モチーフＧＣＴは明らかに好まれ、特にＧＣＴＧは対照に対するその量によって非常に重きを置かれていることが示される。このような方法で、各々の候補アプタマー配列は、適応度測定値の適用によって集計され、アプタマーとしてその可能性について査定することができる。適応度の測定値として得られるスコアは、所与の候補配列が次の反復に生き残るかどうかを査定するのに使用され、配列が増殖（交差）を可能にするか、またはその配列組成を変化させる突然変異プロセスを行うかどうかの決定にも使用することができる。これらのプロセスを適用した後に、他の新しいアプタマー配列は、もとのものに加えて導かれうる。

複製間の分散が低いことは、所与のモチーフまたは配列のタンパク質に対する特異性を実証する統計値の例でもあり得る。したがって実験的測定の複製を使用して、表１において例示された導き出された統計的測定値を改良することができる。本発明の重要な態様は、実験および学習によって適切な統計を導き出すことができるということである。

このステージで集められた情報を基盤として、第一世代の結果からの測定された統計、バイオインフォマティクスおよび合理的分析に基づいた新しい合成アプタマー集団を生成することができる。この実施例において、純粋に図示のためであるが、ライブラリーは、ＳＥＬＥＸにおいて使用されるような従来の増幅よりもむしろ、ＤＮＡシンセサイザー上で再合成される。この再合成は、表１において示されるような、適応配列の集計に由来するモチーフの交差組合せのプログラミング、および他の位置ではなく特定の位置である程度の新しい配列のランダム突然変異を含むことができる。このような方法で、アプタマー集団中の配列多様性は、初期反復において適切に多様なレベルで維持される。従来の遺伝的プロセスに従って、以前の集団の最も適応する個体に由来する後続する新しい集団（表１）も「適応する」または「より適応する」はずである。集団の世代の適応度が収束するにつれて、集団多様性における介入は減少することになる。合理的なデザイン、突然変異および交差手順の使用によって、候補アプタマーの多様性は初期集団においても維持することができる。これは、最終的な解が、時期尚早の「極小」、またはかかるアルゴリズムの他の立証された実施形態において記述されているような他の探索停止条件（１５）に遭遇しないことを保証することになる。

新しい候補ライブラリー（ｎ番目）はここで、研究下のタンパク質に対して暴露される。生き残り結合したアプタマーは溶出され、シークエンサー上に再アレイ化され、上記の一般的な評価手順が繰り返される。

候補ライブラリーの以前の配列決定反復（ｎ−１）は、新しい集団が配列決定およびカウントされるにつれて、先に進められる対照になりえ、表１中の値と置き換わる現在の反復（ｎ）について生成された表を結果として生じる。特定の配列が急速に優位になることが見られ、現在の反復の複製との間と同様に、直前の反復（ｎ−１）に比べた存在量および分散に反映される。同様に、この傾向が見られなくてもよい。後者のシナリオにおいて、「突然変異」（合成の間のアプタマーに対するランダムな変化）の数を増加させて研究下の配列の集団の進化および多様性を促進することができる。どちらにしても、解（すなわちアプタマー）の安定したセットに向けた集団の漸近収束は、必要であるならば、そして必要に応じて、追跡および最適化することができる。かかる原理は、集団が、適応度および組成の安定したプラトーに向かう上昇速度を最大限にできることも保証する。

候補解（アプタマー）の安定した集団が達成されるまで、候補アプタマーの集団の反復が実行される。後の反復において、いったん特定の配列モチーフの優位性が明瞭になれば、配列を再合成するというよりはむしろ、反復間の配列を増幅することが必要となるまたは望ましい可能性がある。あるいは、合成および増幅ラウンドを交互に使用することができる。

結果として生じる配列は研究下のタンパク質のための強いアプタマーであり、複数の同様に存続可能なアプタマーを見出せることが期待される。各々の存続可能なアプタマーは、配列レベルで構造的に異なってもよいし、異なっていなくてもよい。

いったん１つまたは複数の適切なアプタマーが同定されたならば、次に、例えばヌクレオチドアナログを使用してアプタマーを化学的に修飾し、安定性および他の望ましい特性を増加させることができる。次に、同じ手順または他の手順を使用して集団を再スクリーニングし、各々のアプタマーの特異性および他の特性を確認することができる。

したがって、所与のタンパク質について、そのタンパク質のためのアプタマーとして作用することが示された配列のライブラリーを構築することができる。最も重要なことには、配列の組成に対する変化が、ランダムおよび合理的の両方で導かれた反復の間に可能にされたので、初期候補アプタマーライブラリー中に必ずしも存在しなかった強い解の集団を見出すことができる。

（実施例２）
上記の実施例は単一の既知のタンパク質に対するアプタマーライブラリーの生成に関するが、上記プロセスはインビトロの既知のタンパク質の混合物に対してもまた使用することができる。これは可能なアプタマーに対するタンパク質の比率が非常に高いからである。この事例において、配列（暗黙的には構造）レベルでモチーフの多様性は重要である。多様だが機能的な配列の初期集団はしたがって本発明の重要な特徴である。

この実施例において、複数の既知のタンパク質は、アプタマー選択のために単離される。複数の候補アプタマーライブラリーを並列して選択および管理する目的以外は、方法は実施例１のように進行する。これは、１つの候補ライブラリー中のアプタマーライブラリーをグループ化すること、または１つの十分に多様な候補ライブラリーにより出発して研究下のすべてのタンパク質に対するアプタマーを包含することによって遂行される。実施例１において記述された方法に従い、追加で、初期反復の後に、アプタマーは遺伝的アルゴリズムにおいて既に記述された方式（１６）でグループ化またはクラスター化され、表１において示されるような複数の概念的な表を生成する。実施例１において、グルーピングは、表１において具体化された測定された特徴を使用する「クラスタリング」または他の方法に基づくことができる。この事例において、選択間の介入は、研究下のタンパク質の混合物を抽象的に表現する概念的に別個の表（アプタマーの亜集団を表す）を維持するように機能する。その最も単純な実施形態において、これは多重化の形態である。

選択プロセスの終了時に、研究下の混合物中のタンパク質に対して特異的なアプタマーが得られることになる。この事例において、どのアプタマーサブセットがどのタンパク質に結合するかは分からない可能性がある。これは他の実験技術を使用して後に解決できるか、または必要ではない可能性がある。後者の場合は、もしアプタマーおよびタンパク質が配置されともに使用されることになっていれば、既知のタンパク質に対する「無名の」アプタマーを生成および使用することが可能である。

あるいは、特定のタンパク質構造に対する特定のアプタマー配列モチーフの特異性の予備的知識を使用して、どのアプタマーがどのタンパク質にマッチしているかを示唆することができる。

実施例１および２の両方において、所与のタンパク質に対して同定されたアプタマーの、それらが選択されたものに対する特異性は、追加の工程として実証されるべきである。この追加の工程は、アプタマーが選択されたタンパク質の既知量を含む複雑な生物学的サンプルに対してアプタマーを暴露することによって、次世代配列決定を使用してもまた遂行することができる。アプタマーの測定は、それらが選択されたものではないサンプル中に存在するタンパク質に対する非特異的結合によって混乱させられるべきではない。これは、アレイ化によって生成されたカウンティングの統計、および暴露されたアプタマーの配列決定を使用して検査することができる。

（実施例３）
理想的には、それぞれのタンパク質に対するアプタマーの特異性は、選択プロセス／生成プロセスへと組み入れられる。これは、ＳＥＬＥＸスキーム、および単一のタンパク質または小規模なサブセットに対するスキームでは可能ではない。

この実施例において、方法は実施例１において記述されているように進行する。しかしながら、この実施例において、アプタマーライブラリーは生来の複雑な生物学的サンプルに対して暴露される。この実験は多数複製される。

第１に、アレイ上で非常に多く表されるアプタマーが見られることになる。多く表されたアプタマーのうちのいくつかまたはすべては、複製間で高い分散度もまた有することができる。前者の事例において、アプタマーが高度に多量のタンパク質を結合していることは論理的に結論することができる。それらの分散が高いならば、アプタマーが特異性を欠くと結論することは妥当である。

合成の次のラウンドにおいて、これらの多量にあるアプタマーまたは分散のかかるアプタマーは除外される。次に、配列決定アレイが、複製間で相対的表示（恐らくいくつかの対照に対して）が低く、分散が非常に低い配列の多様なセットを含むようになるまで、実施例１において略述されるように、本発明の方法を実行する。この事例において、サンプル中に高度に多量にあるタンパク質を結合するアプタマーおよび／または低特異性を備えたアプタマーは、効果的に除外されている。

後続するアプタマーを個別にまたはグループで使用して、実施例２において設定されるような方法を既知のタンパク質の混合物を使用して繰り返すことができる。同定されたアプタマー配列は、より単純な例において必要とされるセミランダムライブラリーの生成に使用される「モチーフ」を提供することができる。このような方法で、ライブラリーは、感度および特異性（抗体ベースの方法が失敗する共通の原因）についてあらかじめフィルタリングされることになる。

さらなる工程において、集団はまとめて、実施例２の一般的なスキームを使用して、未知の低存在量のタンパク質に対する多数のアプタマーの同定を続行することができる。この事例において、アプタマーが結合しているタンパク質は未知である。タンパク質の同定は他の技術を使用するさらなる工程において解明されることになる。しかしながら、未知の低存在量タンパク質に対する「無名の」アプタマープローブのセットを開発することは概念的に可能である。

それらを次に配置して多くのサンプル中のこれらのタンパク質を測定することができるので、これはそれらの有用性を限定しない。アプタマーはここでこれらのタンパク質の代理であり、統計的に有意に変化するアプタマー（すなわちタンパク質）はしたがってサンプル間で測定することができる（すなわちバイオマーカーを見出す）。これを達成し、適切なアプタマーを掌中にして、続いてアプタマーは抽出され、代理であるタンパク質の同定に使用することができる。このような方法で、無名の低存在量タンパク質の複雑な混合物に対するアプタマーを見出すこと、バイオマーカー発見においてそれらを配置すること、有意なアプタマーを見出すこと、および現在の最先端技術のように最初ではなく、最終的な工程としてタンパク質を同定することが可能である。

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Claims (30)

1. 少なくとも１つの標的分子に対する１つまたは複数のアプタマーの同定のための方法であって、
   ａ）少なくとも１つの標的分子と候補ポリマー配列のプールを接触させることと；
   ｂ）特異的に標的分子に結合した配列から未結合の配列を分割することと；
   ｃ）配列標的複合体を解離して、配列のリガンドが濃縮された混合物を得ることと；
   ｄ）工程ｃ）において得られた各配列に配列のアプタマーの可能性の測定値（適応度関数）を割り当てることと；
   ｅ）工程ｄ）の測定値を使用して、リガンドが濃縮された混合物のアプタマーの可能性を決定することと；
   ｆ）工程ｅ）において得られた情報を使用して、工程ｃ）において得られた配列のうちのいくつかまたはすべての進化を可能にして、新しい配列の混合物を生成することと；
   ｇ）候補プールの総計のアプタマーの可能性がプラトーに到達するまで、新しく生成された候補アプタマープールにより工程ａ）〜ｆ）を繰り返すこととを含み、
   前記最終プール中に存在する配列が少なくとも１つの標的分子に対する至適アプタマーである方法。
2. 前記少なくとも１つの標的分子が、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つの標的分子が、単一で単離されたタンパク質である、請求項２に記載の方法。
4. １つまたは各々の標的分子が何であるかが既知である、請求項１、２または３に記載の方法。
5. 複数のタンパク質が、タンパク質の混合物において問い合わせられる、請求項２または４に記載の方法。
6. 前記少なくとも１つのタンパク質が、タンパク質の混合物中に存在する既知のタンパク質である、請求項５に記載の方法。
7. 前記タンパク質の混合物が、生物学的サンプルに由来する、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記生物学的サンプルが体液である、請求項７に記載の方法。
9. 前記体液が、血液であるかまたは血液に由来する、請求項８に記載の方法。
10. 前記体液が、血清または血漿である、請求項９に記載の方法。
11. 前記ポリマー配列が、ポリヌクレオチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ポリヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、またはそのバリアントもしくは組合せである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ポリマーが、３０ｍｅｒ〜６０ｍｅｒの間である、請求項１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
14. 前記ポリマーが４０ｍｅｒである、請求項１３に記載の方法。
15. アプタマーの可能性が、リガンドが濃縮された混合物中の候補配列の定量によって測定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 定量化が、各々の候補配列の少なくとも一部の配列決定によって実行される、請求項１５に記載の方法。
17. 配列決定が、単一分子アレイまたはクローン性の単一分子アレイに対して実行される、請求項１６に記載の方法。
18. 工程ｄ）の前にリガンドが濃縮された混合物中の配列を表面上へアレイ化することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. アレイ化された配列を増幅することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記アプタマーの可能性の測定値が、１つまたは複数の測定された特性、計算された特性、またはバイオインフォマティクス特性をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記バイオインフォマティクス特性が、二次構造予測、三次構造予測、自己類似性、情報の複雑度、既知のアプタマー配列への類似性、配列モチーフ、またはその組合せを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 研究下の候補配列集団と比較した場合に、統計的に有意なアプタマーの可能性を有する、前記リガンドが濃縮された配列が、工程ｄ）およびｅ）から工程ｆ）へ進行させられる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 平均または上位パーセンタイル範囲中に分類されるアプタマーの可能性を有する、前記リガンドが濃縮された配列が、工程ｄ）およびｅ）から工程ｆ）へ進行させられる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
24. 統計的に有意でないアプタマーの可能性を有する、前記リガンドが濃縮された配列が、候補プールから取り除かれる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 非結合候補配列が、候補プールから溶出され廃棄される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 候補プールから数的に優位な配列を取り除くことをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 最終的なプール中に存在する候補アプタマーの完全な配列を得ることをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. アプタマーの高い可能性を有する配列またはかかる配列に由来するモチーフを使用して新しい候補アプタマープールをデザインする、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. アプタマーの高い可能性を有する配列および／またはモチーフを使用して、アプタマーの高い可能性を示す配列に対するランダムな変化および／またはその配列の組換えに影響を及ぼす、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 候補配列を修飾して安定性および／または結合能を増加させることをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。