JP7004378B2

JP7004378B2 - アプタマーセットの選択方法

Info

Publication number: JP7004378B2
Application number: JP2017059733A
Authority: JP
Inventors: 穣秋富; 直人金子; 克紀堀井
Original assignee: NEC Solutions Innovators Ltd
Current assignee: NEC Solutions Innovators Ltd
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2022-02-10
Anticipated expiration: 2037-03-24
Also published as: JP2018161078A

Description

本発明は、アプタマーセットの選択方法に関する。

近年、抗体に代わるターゲットへの結合分子として、いわゆるアプタマーと呼ばれる核酸分子の開発が進められている。前記アプタマーは、一般に、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichiment）法により調製されている（特許文献１、非特許文献１）。前記アプタマーを使用してターゲットの検出を行う場合、前記アプタマーとしては、例えば、ターゲットへの特異性が高く、且つ、他の物質への交差反応がないことを求められている。

しかしながら、このようにターゲットへの特異性が高く、且つ、他の物質への交差反応を示さないアプタマーの取得は、非常に困難である。

特許第２７６３９５８号

そこで、本発明は、例えば、他の物質に対して交差反応を示したとしても、ターゲットを特異的に検出することができるアプタマーの提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明のアプタマーセットの選択方法は、
配列が異なる複数のアプタマーについて、複数の物質に対する結合能を評価する評価工程と、
前記複数のアプタマーから、各物質に対する結合能に基づき、組合せによって所定のターゲット物質に対して特異的な結合能となる、アプタマーの組合せを選択する選択工程とを含むことを特徴とする。

本発明によれば、ターゲット以外の物質に結合するアプタマーであっても、組合せることで、ターゲットを特異的に検出できるアプタマーセットを選択することができる。このため、本発明によれば、例えば、これまで単独では使用できなかったアプタマーを有効利用することも可能になる。

図１は、本発明の選択方法の概念を示す概略図である。図２は、本発明の選択方法における選択工程の一例を示すフローチャートである。図３は、本発明の選択方法における選択工程のその他の例を示すフローチャートである。

本発明者は、アプタマーを用いた特異的なターゲットの検出方法を確立するにあたって、鋭意研究を行った。そして、ターゲットの検出において、他の物質と交差反応を示さない特異性の高いアプタマーの単独使用に代えて、複数のアプタマーをアプタマーセットとして使用するとの着想を得た。すなわち、例えば、物質Ｂをターゲットとして検出する場合、単独のアプタマーの場合、物質Ｂのみに結合し、物質ＡおよびＣには結合しない性質が求められる。しかし、例えば、物質Ａと物質Ｂの両方に結合するアプタマーＸまたは物質Ｂと物質Ｃの両方に結合するアプタマーＹであっても、それぞれの物質Ａ、物質Ｂおよび物質Ｃへの結合能から、結果的に、ターゲットである物質Ｂの存在を有意に検出できるとの着想である。

具体的に、図１の概略図を用いて説明する。図１（Ａ）は、物質Ａ、物質Ｂおよび物質Ｃと、アプタマーＸおよびアプタマーＹとの結合能に関する概略を示す模式図であり、（Ｂ）は、概略を示すグラフである。図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、アプタマーＸが、物質Ａおよび物質Ｂに同等の結合能を有し、アプタマーＹが、物質Ｂおよび物質Ｃに同等の結合能を有する場合、図１（Ａ）に示すように、アプタマーＸには、物質Ａと物質Ｂとが当量結合し、アプタマーＹには、物質Ｂと物質Ｃとが当量結合する。このため、アプタマーＸまたはアプタマーＹを単独で使用した場合、アプタマーＸが物質との結合を示しても、それが物質Ａか物質Ｂかは判断できず、また、アプタマーＹが物質との結合を示しても、それが物質Ｂか物質Ｃかは判断できない。しかしながら、アプタマーＸの結合結果とアプタマーＹとの結合結果とを総合すると、以下のようなことがわかる。つまり、アプタマーＸとアプタマーＹは、それぞれが物質Ｂに結合能を示すが、アプタマーＸは、物質Ａにも結合するものの物質Ｃには結合せず、アプタマーＹは、物質Ｃにも結合するものの物質Ａには結合しない。このため、アプタマーＸおよびアプタマーＹの物質に対する結合能を総合すると、物質Ｂに対する結合能が、アプタマーＡに対する結合能およびアプタマーＣに対する結合能に対して、それぞれ約２倍を示すことになる。このため、アプタマーＸとアプタマーＹとが、それぞれ、物質Ｂ以外に結合する場合であっても、総合的にみると、アプタマーＹと結合しており、アプタマーＹが存在していることが明らかと判断することができる。

このような考えに基づき、本発明は、配列が異なる複数のアプタマーから、組合せによって、所定のターゲット物質に対して特異的な結合能となるアプタマーの組合せを選択し、これをアプタマーセットとして選択することを見出した。このようにして選択されたアプタマーセットであれば、例えば、ターゲット以外に結合するアプタマーの組合せであっても、所定のターゲット物質の検出に使用でき、また、これまで単独では使用できないと思われていたアプタマーについても、有効利用が可能になる。また、本発明の選択方法により、例えば、各種ターゲットに対するアプタマーセットを構築し、データを蓄積すれば、後に機械学習のデータとなり、より簡便にターゲットに適したアプタマーセットを構築することも可能になる。

例えば、あるターゲットに対して結合するアプタマーをコンピュータ上でランダムに探索する場合、使用するランダムな塩基配列の長さを３０塩基と仮定すると、４＾３０（４の３０乗）通りの組み合わせから、最も結合力の高い塩基配列の予測を実施する必要がある。しかし、本発明を用いれば、例えば、１０００通りのアプタマーを用いるアプタマーセットであれば、高々１０００通りの結合力を予測し、その組み合わせを計算するだけでよい。機械学習で塩基配列の結合力を予測するためには、様々な種類のターゲットとそれに対応する配列との結合力のデータを、大量に学習させる必要がある。その際、４＾３０通りの塩基配列の結合力のデータを取得するのは極めて困難であるが、前述のように、１０００通りの配列の結合力のデータを取得することは容易である。

本発明において、前記評価工程は、配列が異なる複数のアプタマーについて、複数の物質に対する結合能を評価する工程である。前記複数のアプタマーの種類および数は、何ら制限されない。前記アプタマーの数は、例えば、２配列以上、３０配列以上、１０００配列以上であっても、本発明の選択方法における候補アプタマーとして使用できる。前記アプタマーの数の上限は、特に制限されない。

前記評価工程における前記複数のアプタマーは、例えば、アプタマーセットの候補であることから、候補アプタマーということもできる。前記候補アプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ法によって新たに調製した配列でもよいし、既存の配列でもよいし、論文および特許等の文献に開示された配列であってもよい。また、前述のように、本発明においては、例えば、ターゲット物質の検出用として、アプタマーの組合せとして選択することから、例えば、各アプタマーの物質に対する結合能、特異性等は、特に制限されない。また、従来から、Ｇリッチな配列のアプタマーは、ターゲットに結合しやすいが、他の物質にも結合しやすいことが知られており、結果的に、単独では使用し難いとされている。しかしながら、本発明によれば、例えば、他の物質へ結合する場合でも使用できる可能性があることから、Ｇリッチな配列も候補アプタマーとして使用することができる。

前記評価工程は、例えば、実際に、前記複数のアプタマーについて、前記複数の物質に対する結合能を評価するための、結合能の測定工程を含んでもよい。この場合、例えば、複数のアプタマーを用いて、同時に、前記各物質に対する結合能を測定することができる。前記結合能の測定は、例えば、アレイを用いて評価することができる。この際、例えば、アレイ等によって同時に評価できる候補アプタマーの数は、特に制限されず、下限は、例えば、２配列以上、３０配列以上、１０００配列以上でもよく、上限は、例えば、１，０００，０００配列以下であり、具体例としては、例えば、１２００配列程度である。

他方、本発明の選択方法は、前記評価工程において、実際に結合能の測定工程を実施しなくてもよい。この場合、例えば、すでに収集した結合能の情報を使用して、評価することもできる。

本発明において、前記選択工程は、特に制限されず、例えば、ターゲット物質の種類、候補アプタマーの種類等に応じて、適宜決定できる。前記選択工程において、前記組合せに含める候補アプタマーの数は、特に制限されず、２配列以上である。前記選択工程の具体例としては、例えば、前記所定のターゲット物質に対する結合能を示すアプタマーを選択する第１工程と、前記第１工程で選択されたアプタマーから、結合させたくない物質に結合能を示すアプタマーを除外する第２工程と、前記第２工程で残ったアプタマーのうち、所定のターゲット物質に対する結合能の積算が、他の物質に対する結合能の積算よりも高くなるアプタマーの組合せを選択する第３工程とを含む形態が一例としてあげられる。

前記選択工程の一例は、例えば、図２のフローチャートに表すことができる。本例では、ターゲットを物質Ｂとし、交差反応が望ましくない物質を物質Ｄとする。なお、本発明は、この例示には制限されない。

まず、前記評価工程後、前記第１工程として、複数の候補アプタマーについて、物質Ｂに結合するか否かを判定し、結合する場合（Ｙｅｓ）は、候補アプタマーとして残し、結合しない場合（Ｎｏ）は、候補から外す。つぎに、前記第２工程として、選択された候補アプタマーについて、物質Ｄに結合するか否かを判定し、結合しない場合（Ｎｏ）は、候補アプタマーとして残し、結合する場合（Ｎｏ）は、候補から外す。これによって、不要な交差反応を示すアプタマーを除外できる。つぎに、物質Ｂに結合し物質Ｄに結合しない候補アプタマーを組合せ、各組合せにおいて、物質Ｂへの結合の総和が、他の物質への結合能の各総和より、十分に高いか否かを判定する。十分に高いといえる場合（Ｙｅｓ）には、その組合せのアプタマーセットは、物質Ｂをターゲットとする検出に使用できる。十分に高いといえない場合（Ｎｏ）は、候補から外す。「十分に高い」か否かは、例えば、目的に応じてその程度を設定できる。

前記選択工程のその他の例として、例えば、図３のフローチャートに表すこともできる。本例では、結合して欲しい１個以上のターゲットからなる群を群Ｂ’とし、結合して欲しくない０個以上の物質からなる群を群Ｄ’とする。なお、本発明は、この例示には制限されない。

まず、前記評価工程後、前記第１工程として、複数の候補アプタマーについて、物質群Ｂ’の全てに結合する否かを判定し、結合する場合（Ｙｅｓ）は、Ｂ’群結合候補アプタマーとして残し、結合しない場合（Ｎｏ）は、候補から外す。つぎに、前記第２工程として、選択されたＢ’群結合候補アプタマーについて、物質群Ｄ’に結合するか否かを判定し、結合しない場合（Ｎｏ）は、候補アプタマーとして残し、結合する場合（Ｙｅｓ）は、候補からはずす。これによって、不要な交差反応を示すアプタマーを除外できる。つぎに、物質群Ｂ’に結合し物質群’Ｄに結合しない候補アプタマーを組合せ、各組合せにおいて、物質群Ｂ’に含まれる各物質への結合の総和が、他の物質への結合能の各総和より、十分に高いか否かを判定する。高い場合（Ｙｅｓ）には、その組合せのアプタマーセットは、物質群Ｂ’に含まれる物質をターゲットとする検出に使用できる。十分に高いといえない場合（Ｎｏ）は、候補から外す。

以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。

Claims

配列が異なる複数のアプタマーについて、複数の物質に対する非特異的な結合能を評価する評価工程と、
前記複数のアプタマーから、各物質に対する前記非特異的な結合能に基づき、組合せによって所定のターゲット物質に対して特異的な結合能となるように、アプタマーの組合せを選択する選択工程とを含み、
前記選択工程が、
前記所定のターゲット物質に対する結合能を示すアプタマーを選択する第１工程と、
前記第１工程で選択されたアプタマーから、結合させたくない物質に結合能を示すアプタマーを除外する第２工程と、
前記第２工程で残ったアプタマーから、前記各物質に対する前記非特異的な結合能に基づき、所定のターゲット物質に対する結合能の総和が、他の物質に対する結合能の総和よりも高くなるように、アプタマーの組合せを選択する第３工程とを含むことを特徴とするアプタマーセットの選択方法。
前記評価工程において、複数のアプタマーを用いて、同時に、前記各物質に対する前記非特異的な結合能を測定する、請求項１に記載のアプタマーセットの選択方法。
前記複数のアプタマーが、２配列以上である、請求項１または２に記載のアプタマーセットの選択方法。