JP7196143B2 - 細胞の選択された部分集団中の複数エピトープを識別するための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年12月19日に出願された米国仮出願番号第62/094,917号;2014年12月19日に出願された米国仮出願番号第62/094,919号;および2014年12月19日に出願された米国仮出願番号第62/094,924号の利益を主張しており、これら出願のすべては、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。
ヒトの体内のすべての細胞は、同じ遺伝物質を含むが、それらの全細胞において同じ遺伝子セットが活性であるわけではない。遺伝子発現パターンの変化は、生物学的機能に重大な影響を及ぼし得る。遺伝子産物(タンパク質)の産生および制御のダイナミクスならびにそれらの相互作用の理解は、例えば、遺伝的障害および/または環境によって誘導される健康障害の根底にある機序の理解に不可欠であり、新しい診断標的および治療標的の発見の根拠を提供する可能性がある。ゆえに、遺伝子発現プロファイルをモニタリングするための手法、および個々の細胞において全タンパク質の特定のバリアント(例えば、スプライスバリアント、点変異、翻訳後修飾、および環境によって、または治療によって誘導される改変)を検出するための手法、およびそれらのレベルを経時的に定量するための手法が、新しい診断法および治療手順の開発に役立つ可能性がある。さらに、単一細胞においてただ1つの標的分子ではなく複数の標的分子に対してこれらの解析を同時に行うことはますます重要になってきている。
本開示は、単一細胞における複数の標的核酸配列を検出するための方法、組成物およびキットを記載する。開示される方法は、核酸標的分子全般の検出に適しており、特に、細胞の混合物中に存在する単一細胞におけるmRNA標的分子の検出にふさわしく、その個々の細胞起源情報が保持される。
いくつかの実施形態において、2つまたはそれを超えるアッセイ可能ポリマーサブユニットは、連続したラウンドのスプリットプール合成において標的特異的プローブ複合体に付着される。いくつかの実施形態において、その付着は、オリゴヌクレオチド鋳型分子へのハイブリダイゼーションを含み、ここで、その鋳型分子の一端は、標的特異的プローブ複合体に相補的であり、アッセイ可能ポリマーサブユニットおよび標的特異的プローブ複合体は、リガーゼ反応を用いたハイブリダイゼーションの後に共有結合によって連結される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鋳型分子は、アッセイ可能ポリマーサブユニットがハイブリダイズする鋳型分子配列のセクションの間に位置する停止コード配列を含み、それによって、増幅反応中のオリゴヌクレオチド鋳型分子の増幅が阻害される。いくつかの実施形態において、停止コード配列は、ポリ-dT配列を含む。いくつかの実施形態において、停止コード配列は、ポリ-T配列を含む。いくつかの実施形態において、停止コード配列は、3炭素リンカーを含む。いくつかの実施形態において、第1または第2のオリゴヌクレオチド近接プローブの少なくとも1つは、1つまたはそれを超えるプライマー配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞起源バーコードは、1つまたはそれを超えるプライマー配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、プライマー配列の少なくとも1つは、増幅プライマー配列である。いくつかの実施形態において、開示される方法は、細胞起源バーコード一式の全部または一部およびそれらと会合したエピトープ特異的バーコードを増幅しかつ、配列決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、プライマー配列の少なくとも1つは、配列決定プライマー配列である。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、DNA分子である。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、RNA分子である。いくつかの実施形態において、そのRNA分子は、mRNA分子である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド近接プローブは、DNA分子である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド近接プローブは、10~200ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、標的認識配列は、5~50ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、エピトープ特異的バーコードは、5~50ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、Nは、1~20である。いくつかの実施形態において、Nは、20~40である。いくつかの実施形態において、Nは、40~100である。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、DNA分子である。いくつかの実施形態において、架橋分子のプローブ認識配列は、5~50ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アッセイ可能ポリマーサブユニットは、核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、多重化される。いくつかの実施形態において、上記方法は、細胞起源バーコードの末端へのさらなるプライマーの付着をさらに含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド近接プローブのうちの1つは、架橋オリゴヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、1つまたはそれを超えるアッセイ可能ポリマーサブユニットの付着のための鋳型分子として機能する。いくつかの実施形態において、2つまたはそれを超える鋳型分子は、細胞起源バーコードを構築する(assembly)ために使用される。
いくつかの実施形態において、それらの複数のアッセイ可能ポリマーサブユニットから合成された細胞起源バーコードは、1つまたはそれを超えるプライマーをさらに含む。いくつかの実施形態において、それらのプライマーの少なくとも1つは、増幅プライマーである。いくつかの実施形態において、それらのプライマーの少なくとも1つは、配列決定プライマーである。
いくつかの実施形態において、開示される方法、組成物およびキットは、細胞の混合物を含むサンプル中の個々の細胞に存在する1つまたはそれを超える標的分子の量を定量することをさらに含む。
本明細書中で述べられるすべての刊行物、特許および特許出願は、各々個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により援用されているのと明確かつ個別に示されたのと同一程度に参照により本明細書中に援用される。
本発明の新規の特徴は、添付の請求項に特定して示されている。本発明の特徴および利点のさらなる理解は、本発明の原理を用いた例証的な実施形態を説明している以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られる:
本開示は、参照により本明細書中に援用される公開された特許出願PCT/US2012/023411およびPCT/US2013/054190において以前に説明された方法、組成物およびキットを発展させたものである。特に、本開示は、非特異的なハイブリダイゼーションおよびバックグラウンドシグナルの増幅を最小にするようにデザインされた近接プローブを用いて、単一細胞において複数の標的核酸配列を検出し、より詳細には、単一細胞において複数の標的mRNA配列を検出し、それによって、検出の感度および特異性を改善するための方法、組成物およびキットを記載する。いくつかの実施形態において、開示される方法は、細胞の複合混合物を含む生物学的サンプル中の選択された細胞部分集団内の複数の標的mRNA配列の検出に適用される。特に、本開示は、細胞の複合混合物を含む生物学的サンプル中の選択された細胞部分集団内の単一細胞において複数の標的分子を検出するための方法、組成物およびキットを記載する。
本明細書中で使用されるとき、句「ユニーク結合物質」(UBA)とは、開示される方法において使用するための種々の検出試薬のうちの1つのことを指す。各UBAは、単一種の標的分子に結合すること、またはハイブリダイズすることができる。この結合またはハイブリダイゼーションの特異性こそが、所与の個々の細胞における標的分子の検出を可能にする。
本開示の方法、組成物およびキットは、新規の検出試薬およびバーコード化試薬のセットを用いて、単一細胞(選択された細胞の部分集団を含む)において複数の標的分子を検出するための手段を提供する。開示される方法のいくつかの実施形態において、選択された細胞部分集団からの単一細胞における複数の標的分子の検出が可能になる。一般に、そのアプローチは、目的の標的分子を検出するためのユニーク結合物質(UBA)、UBAによって認識される標的分子の同一性をコードするエピトープ特異的バーコード(ESB)、および個々の細胞を識別するユニーク細胞起源バーコード(COB)を作製するためのアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)の使用を含み、それによって、特定のバイオマーカーのセットに基づいて、細胞の複合混合物を含むサンプル内の選択された細胞部分集団を定義することが可能になり、その後、1つまたはそれを超える標的分子の検出が、選択された細胞部分集団における個々の細胞との相関関係を示す。
A.ユニーク結合物質(UBA)
UBAは、少なくとも1つの標的分子またはその一部に結合するかまたはハイブリダイズするようにデザインされた分子または分子集合体であり、適切な条件下において、UBAおよび標的分子を含む分子複合体を形成することができる。標的分子の例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、DNA、RNA、mRNA、脂質、炭水化物、有機小分子、薬物分子、有機モノマーおよびイオンが挙げられるがこれらに限定されない。便宜上、本明細書中に記載される方法、組成物およびキットの大部分が、標的タンパク質または標的mRNAに結合するUBAの文脈において説明される。しかしながら、これらの方法、組成物およびキットはまた、他の標的分子にも適用することができる。
その共通リンカーは、UBAに直接または間接的に付着され得る。いくつかの実施形態において、その共通リンカーエレメントは、オリゴヌクレオチド分子であり得る。いくつかの実施形態において、共通リンカーエレメントは、UBAに共有結合により付着されるオリゴヌクレオチド配列であり得るが、いくつかの実施形態では、共通リンカーエレメントは、UBAに非共有結合により付着され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体」は、インタクトな抗体分子(免疫グロブリンA、免疫グロブリンGおよび免疫グロブリンMを含むがこれらに限定されない)だけでなく、少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する抗体分子の任意の免疫反応性の構成要素も含むように広い意味で使用される。そのような免疫反応性の構成要素としては、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Fab’2フラグメント、一本鎖抗体フラグメント(scFv)、ミニ抗体、ダイアボディ、架橋抗体フラグメント、Affibody(商標)分子、シクロチド分子などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体工学またはタンパク質工学の手法を用いて得られる免疫反応性の産物も明確に、本明細書中で使用される用語「抗体」の意味の範囲内に含まれる。関連するプロトコルを含む抗体工学および/またはタンパク質工学の詳細な説明は、例えば、J.Maynard and G.Georgiou,Ann.Rev.Biomed.Eng.2:339 76(2000);Antibody Engineering,R.Kontermann and S.Dubel,eds.,Springer Lab Manual,Springer Verlag(2001);米国特許第5,831,012号;およびAntibody Engineering Protocols,S.Paul,Humana Press(1995)に見られる。
リンカーとESBの両方を含むオリゴヌクレオチド配列の1つの非限定的な例は、
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN CGTCAGACAGGGAGC-3’
であり、ここで、NNNNNNNNN配列は、付着される抗体に特異的な9ヌクレオチドコードである。核酸を抗体に付着するための方法は、当該分野で周知であり、任意の好適なアプローチが、ここに開示されている方法、組成物およびキットに包含される。例えば、いくつかの実施形態において、抗体は、Gullbergら(2004),PNAS 101(22):228420-8424およびBoozerら(2004),Analytical Chemistry 76(23):6967-6972(この両方が参照により本明細書中に援用される)に記載されている方法を用いて核酸分子に付着され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、遊離アミンへのランダムなカップリングによって核酸分子に付着され得る。いくつかの実施形態において、それらの抗体は、10対1の比の核酸と抗体を用いる遊離アミンへのランダムなカップリングによって核酸分子に付着され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、参照により本明細書中に援用されるKozlovら(2004),Biopolymers 5:73(5):621-630に記載されている方法を用いて核酸分子に付着され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒドラジン化学を用いて核酸分子に付着され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、参照により本明細書中に援用されるNolan(2005),Nature Methods 2:11-12に記載されているような「タドポール(tadpoles)」を用いて核酸分子に付着され得る。一般に、抗体は、本明細書中に記載される方法を含む、操作された抗体を作製するための当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて核酸分子に付着され得る。
本開示のエピトープ特異的バーコードは、特定の標的分子と会合するユニークなコードを提供する。ESBは、UBAまたはその一部に付着するかまたは結合するようにデザインされた分子または分子集合体であり、適切な条件下において、ESB、UBAおよび標的分子を含む分子複合体を形成することができる。
ここに開示されている方法、組成物およびキットは、細胞起源バーコードを作製するための手段をさらに提供し、ここで、各COBは、特定の起源細胞に関連し得るユニークなコードを提供する。いくつかの実施形態において、1つまたはそれを超える結合したUBA-ESB複合体へのCOBの付着(例えば、共通リンカーオリゴヌクレオチドを用いた付着)によって、UBA/ESB複合体が結合している標的分子に対する起源細胞が識別される。いくつかの実施形態において、本開示のCOBは、(i)UBA-ESB複合体と会合した共通リンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる共通リンカー配列、(ii)特定の起源細胞に関連するユニークなコード、および(iii)1つもしくはそれを超えるプライマー配列、またはそれらの組み合わせを含み得る分子実体(または集合体、複合体または結合体)である。
二連COBの系を用いるとき、そのCOBのうちの1つは、下記に記載されるように標識されてもよいし、未標識であってもよい。いくつかの実施形態において、未標識のCOBは、捕捉領域を含み得る。
開示される方法、組成物およびキットのいくつかの実施形態では、個々の細胞における標的分子の検出および定量のために使用される配列決定反応の費用対効果および処理量を最適化するために、標的特異的プライマー、一般的プライマー、セミランダムプライマーまたはそれらの組み合わせを使用して、目的の標的に対するUBA-ESB-COB複合体が選択的に増幅される。
A.細胞とUBA-ESB複合体とのインキュベーション
開示される方法の多くの実施形態では、細胞懸濁液またはサンプルを、個々の細胞の表面上または個々の細胞内の特定の分子標的との結合またはハイブリダイゼーションに適した条件下において、1つまたはそれを超えるUBA-ESB複合体とともにインキュベートする。いくつかの実施形態において、1つまたはそれを超える目的の標的は、細胞内の標的であり得、それらの細胞は、当該分野で公知の任意の方法を用いて、例えば、冷メタノールを細胞サンプルに加え、短時間インキュベートした後、メタノールを吸引し、すすぎ、UBA-ESBとのインキュベーションの前にウシ血清アルブミンまたはカゼイン溶液でブロッキングすることによって、固定および透過処理され得る。
単一細胞をバーコード化し、会合した細胞起源バーコードを構築するための方法は、参照により本明細書中に援用される公開された特許出願PCT/US2012/023411およびPCT/US2013/054190にすでに記載されている。COBの構築または合成は、本明細書中に簡潔に記載される方法を含む当該分野で公知の任意の好適な方法によって行うことができる。いくつかの実施形態において、COBは、オリゴヌクレオチドを含むアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)の段階的な付加によって構築され得る。いくつかの実施形態において、COBは、共通リンカー(CL)を介してUBA-ESB複合体に付着され、その共通リンカーは、それ自体がオリゴヌクレオチドであり得、APS自体の一部または別個の分子構成要素であり得る。いくつかの実施形態において、ESB、APSおよびCLはすべて、オリゴヌクレオチド配列を含み得る。したがって、ESB、APSおよびCL上の相補的または実質的に相補的なアニーリング領域間のハイブリダイゼーションによる構築の後、構築されたオリゴヌクレオチドは、ライゲートされることにより、ESB-APS単位、隣接APS単位または隣接APS-CL単位の間に共有結合を形成し得る。アニーリング領域は、オリゴヌクレオチドESB、APSまたはCLの片端または両端に提供され得る。
エピトープ特異的バーコードおよび細胞起源バーコードを増幅および検出するための方法は、参照により本明細書中に援用される公開された特許出願PCT/US2012/023411およびPCT/US2013/054190に十分に記載されている。いくつかの実施形態において、構築されたUBA-ESB-COBまたはESB-COB産物を増幅し、必要に応じて、その結果を参照サンプル由来の類似の標的核酸の増幅と比較する。核酸増幅は、当該分野で公知の任意の手段によって行われ得る。いくつかの場合では、ライゲートされた産物をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅する。使用され得るPCRの手法の例としては、定量的PCR、定量的蛍光PCR(QF-PCR)、多重蛍光PCR(MF-PCR)、リアルタイムPCR(RT-PCR)、単一細胞PCR、制限酵素断片長多型PCR(PCR-RFLP)、リアルタイム制限酵素断片長多型PCR(RT-PCR-RFLP)、ホットスタートPCR、ネステッドPCR、インサイチュポロニー(in situ polonony)PCR、インサイチュローリングサークル増幅(RCA)、ブリッジPCR、ピコタイターPCRおよびエマルジョンPCRが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写増幅、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライム(consensus sequence primed)ポリメラーゼ連鎖反応(CP-PCR)、任意プライム(arbitrarily primed)ポリメラーゼ連鎖反応(AP-PCR)、縮重オリゴヌクレオチドプライムPCR(DOP-PCR)および核酸ベース配列増幅(nucleic acid based sequence amplification)(NABSA)が挙げられる。本明細書中で使用され得る他の増幅方法としては、米国特許第5,242,794号;同第5,494,810号;同第4,988,617号;および同第6,582,938号に記載されている方法が挙げられる。いくつかの実施形態において、増幅は、細胞内で行われる。
いくつかの実施形態において、セミランダム配列は、標的RNA配列のcDNAコピーと元のUBAプローブ配列との間の接合点から128~32ヌクレオチドの位置におけるcDNA配列に部分的に相補的であるようにデザインされる。
配列決定は、当該分野で周知の伝統的なSanger配列決定法によって達成され得る。
配列決定は、ハイスループット配列決定システムおよび/または次世代配列決定システムを用いても達成され得、それらの配列決定システムのいくつかは、配列決定されるヌクレオチドが伸長中の鎖に組み込まれた直後または組み込まれるときにそのヌクレオチドの検出を可能にし、すなわち、リアルタイム(red time)または実質的にリアルタイムに配列の検出を可能にする。いくつかの場合において、ハイスループット配列決定は、少なくとも1,000、少なくとも5,000、少なくとも10,000、少なくとも20,000、少なくとも30,000、少なくとも40,000、少なくとも50,000、少なくとも100,000または少なくとも500,000配列リード/時を生成し;各リードは、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも120、少なくとも150、少なくとも200または少なくとも250塩基/リードである。
ある特定の実施形態において、検出方法は、多重アッセイにおいて行われ、ここで、複数の標的分子が、同じアッセイ(すなわち、単一の反応混合物)において検出される。いくつかの実施形態において、そのアッセイは、複数の標的分子が同時に検出される、ハイブリダイゼーションアッセイまたは親和性結合アッセイである。いくつかの実施形態において、そのアッセイは、複数の標的分子が単一細胞において同時に検出される、ハイブリダイゼーションアッセイまたは親和性結合アッセイである。ある特定の実施形態において、同じアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、少なくとも2つの異なる標的分子、少なくとも5個の異なる標的分子、少なくとも10個の異なる標的分子、少なくとも20個の異なる標的分子、少なくとも50個の異なる標的分子、少なくとも75個の異なる標的分子、少なくとも100個の異なる標的分子、少なくとも200個の異なる標的分子、少なくとも500個の異なる標的分子、少なくとも750個の異なる標的分子または少なくとも1,000個の異なる標的分子である。他の実施形態において、同じアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、最大5個の異なる標的分子、最大10個の異なる標的分子、最大20個の異なる標的分子、最大50個の異なる標的分子、最大100個の異なる標的分子、最大150個の異なる標的分子、最大200個の異なる標的分子、最大500個の異なる標的分子、最大750個の異なる標的分子、最大1,000個の異なる標的分子、最大2,000個の標的分子または最大5,000個の標的分子である。なおも他の実施形態では、検出される複数の標的分子は、前述の数の間の任意の範囲の異なる標的分子であり、例えば、20~50個の異なる標的分子、50~200個の異なる標的分子、100~1000個の異なる標的分子、500~5000個の異なる標的分子などであるがこれらに限定されない。
本開示のUBA-ESB-COB複合体およびそれに基づく分析技術によって提供される定性的な分析能力に加えて、いくつかの実施形態において、UBA-ESB-COBは、定量的解析を行うのにユニークに好適であり得る。UBA-ESB-COBとそれらに会合する標的分子との間に1対1の結合化学量論を提供することによって、例えば、UBA-ESB複合体が、各場合の標的分子をユニークにタグ化する短いランダムな配列(図10)を含む実施形態では、サンプル中に存在する標的分子の全部または代表的な一部が、識別され、カウントされ得る。様々な分子種のこの個々のカウントは、生物学的サンプル中の標的分子の絶対濃度または相対濃度を測定するための正確かつ直接的な方法を提供する。さらに、単一分子をアドレス指定およびカウントできると、アッセイの小型化の利点(高感度、最小のサンプル必要量、少量の液相の動態によってもたらされる速い反応速度および最終的には非常に低い試薬コストを含む)を高めることが可能になる。
特定のmRNA標的分子を検出するため、および各存在をユニーク細胞起源バーコードで標識するために使用されるプロセスの非限定的な例が、CD4 mRNAの検出について図9に図示されている。CD4逆方向プライマーを、固定および透過処理された細胞サンプルに加え、アニールさせた後、逆転写(RT)反応を行うことにより、CD4 mRNA分子の一部のcDNAコピーを作製する。mRNA分子を除去した後(例えば、RNase Hで処理することによって)、スプリントアダプターをそのcDNAにアニールさせる。そのスプリントアダプターは、スプリント分子をアニールさせるために使用され、次いでそれを用いて、SC領域を含む2つまたはそれを超えるAPS(コードSC1~SC3を含む3つのAPSが図9に図示されている)をコンビナトリアル様式で構築することにより、ユニークCOBを作製する。いくつかの実施形態において、標的分子とハイブリダイズさせるために使用される逆方向プライマーは、標的核酸分子に特異的な配列認識領域を含む(図18)。いくつかの実施形態において、配列認識領域は、10~20ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの実施形態において、配列認識領域は、ヘキサマーである(図19)。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、ポリ-T配列認識領域を用いることによって、mRNA分子全般と非特異的にハイブリダイズするようにデザインされる(図17)。いくつかの実施形態において、スプリント分子は、1つまたはそれを超える増幅プライマーおよび/または配列決定プライマーを付加するためにも使用される。いくつかの実施形態において、アニールした分子複合体は、ライゲーションに供されることにより、増幅および配列決定され得る共有結合した分子集合体が形成される。
GCTCCCTGTCTGACG XXXXXXXXXXX
を用いてmRNA分子をバーコード化するための方法の非限定的な例を図示している。その配列特異的プライマーを細胞サンプルに加えた後、逆転写反応を行い、その後、「スプリント」オリゴヌクレオチドを、アニールさせ、コード領域SC1~SC3を含むAPSを構築して、Illuminaプライマーを用いて増幅および配列決定され得るユニーク細胞起源バーコードにするために用いた。いくつかの実施形態において、Illuminaプライマーを用いる増幅および配列決定の前に、内部プライマーを用いて、1回またはそれを超えるラウンドのネステッドPCR増幅が行われ得る。いくつかの実施形態において、標的mRNA分子とハイブリダイズするために、ヘキサマープライマー、例えば、
GCTCCCTGTCTGACG NNNNNN
が用いられる。
細胞の複合混合物を含むサンプル中の個々の細胞において複数の標的分子を識別するためのアッセイを行うとき、死細胞、細胞片または細胞塊に対するデータが、その後の解析から排除されることによって、データの質が向上し得るように、全細胞と死細胞、細胞片または細胞塊とを区別することが所望され得る。各細胞が個別にバーコード化されている数百万個の細胞を含むサンプルが関わる研究において、細胞片、細胞対(cell doublets)またはより大きな細胞塊の存在は、有するはずのないマーカーを有する細胞の存在を示唆する誤ったデータの形の「ノイズ」の一因になり得る。したがって、本開示の方法、組成物およびキットは、目的の単一細胞と、サンプル中に存在する死細胞、細胞片または細胞塊とを区別するための手段を提供する。
細胞の複合混合物を含むサンプル中の個々の細胞において複数の標的分子を識別するためのアッセイを行うとき、その複合混合物内の特定の細胞部分集団を識別し、その部分集団についてのその後の解析に焦点を当て、それによって、データの特異性を向上させることが望ましいことが多い。各細胞が個別にバーコード化された数百万個の細胞を含むサンプルが関わる研究において、稀な細胞の存在は、全細胞集団のわずか0.01%しか構成しないことがある。したがって、本開示の方法、組成物およびキットは、目的の細胞のサブセットとサンプル中に存在する細胞の大部分とを区別するための手段を提供する。
細胞の複合混合物を含むサンプル中の個々の細胞において複数の標的分子を識別するためのアッセイを行うとき、その複合混合物内の特定の細胞部分集団を除外し、その後の解析を残りの細胞に集中させることによって、データの特異性を向上させることが望ましいことが多い。例えば、いくつかの用途では、細胞集団内の成熟B細胞を識別し(CD19、CD38、BCMAなどのような細胞表面マーカーに対して向けられた抗体を用いて)、それらをさらなる考慮すべき事柄から排除して、その後の解析が、存在する任意の幹細胞に集中し得ることが望ましいことがある。したがって、本開示の方法、組成物およびキットは、特定の細胞集団をさらなる解析から排除するための手段も提供する。いくつかの実施形態において、これは、複数のUBA(例えば、抗体セット)を同じESBで標識することによって達成され、その結果、アッセイの結合工程の後、特定のUBAセットに対するESB-COB結合体の選択的増幅および配列決定によって、さらなる解析から排除されるべき細胞のリストが提供される。選択的増幅および配列決定は、上に記載されたように行われ得る。
細胞の複合混合物を含むサンプル中の個々の細胞において複数の標的分子を識別するためのアッセイを行うとき、さらなる標的分子がまた、選択された部分集団内に存在するか否かを判定するために、バーコード化された細胞懸濁液をリサンプリングすることが望ましいことが多い。したがって、本開示の方法、組成物およびキットはまた、最初の細胞バーコード化手順を行った時点より後の時点において、1つまたはそれを超える目的の標的分子を検出するためにリサンプリングするための手段も提供する。いくつかの実施形態において、タンパク質に対して非特異的に向けられた1つまたはそれを超えるUBA(例えば、アミン反応性部分(例えば、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、スルホジクロロフェノールエステル、イソチオシアネートまたは塩化スルホニル)を含むがこれらに限定されない)を、最初の細胞バーコード化を行うために使用される元のUBAセットに含めることによって、バーコード化された細胞懸濁液の個々の細胞における1つまたはそれを超える目的の標的分子の検出が可能になる。選択された部分集団の細胞と会合した細胞起源バーコードのリストを得るために上に記載されたように行われた選択的増幅および配列決定の後、バーコード化された細胞懸濁液のアリコートを、溶解し、例えば、さらなる目的の標的分子のうちの1つに対して向けられた固定化された抗体、および所与のビーズ上に固定化された抗体を識別するためのコード配列をプライマー配列の下流に含む繋ぎ止められた二次プライマーを含むビーズ(図25)とともにインキュベートする。複数のビーズを使用してよいが、ここで、その複数のビーズは、例えば、複数の標的分子に対して向けられた固定化された抗体を、それらの対応する二次プライマーとともに含み、任意の単一のビーズは、単一タイプの固定化された抗体を含む。標的分子(例えば、標的タンパク質)の免疫沈殿の後、二次プライマーの伸長反応を、適切なポリメラーゼ、例えば、Taq DNAポリメラーゼ、Klenow DNAポリメラーゼIなどを用いて行った後、抗体コード配列および細胞起源バーコード配列を含む増幅産物を生成する増幅を行う。次いで、細胞起源バーコードと、選択された目的の部分集団について識別されたCOBのリストとを比較することによって、選択された部分集団におけるさらなる目的の標的分子の存在を個々の細胞ベースで識別および定量することが可能になる。
本開示はまた、分子および細胞をバーコード化するためのキットも記載し、ここで、そのキットは、上に記載された1つまたはそれを超える組成物を含む。いくつかの実施形態において、そのキットは、1つもしくはそれを超える標的特異的UBA-ESB複合体、またはユーザーによって供給されるUBAに予め合成されたESBを付着するための試薬を含み得る。いくつかの実施形態において、ここに開示されているキットのUBAは、会合した抗体の同一性をコードする付着されたESBをさらに含み得る1つまたはそれを超える抗体を含む。いくつかの実施形態において、ここに開示されているキットのUBAは、選択された核酸標的にハイブリダイズするようにデザインされ、会合した標的プローブの同一性をコードする付着したESBをさらに含み得る、1つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドプローブを含む。いくつかの実施形態において、開示されるキットは、APSのセットおよび細胞起源バーコードにそれらを構築するために必要とされ得る任意のさらなる酵素または試薬をさらにまたはスタンドアロンの製品として含み得る。いくつかの実施形態において、そのAPSのセットは、解析の配列決定工程においてエラーを検出し、かつ訂正することができるようにデザインされたサブコード領域のセットを含む。いくつかの実施形態において、開示されるキットは、選択された細胞部分集団に対するエピトープ特異的バーコードの選択的増幅のためのプライマーのセットをさらに、またはスタンドアロンの製品として含み得る。
本明細書中に開示される組成物、方法およびキットは、診断、予後診断、治療、患者の層別化、薬物の開発、処置の選択およびスクリーニングの目的のために使用され得る。開示される組成物、方法およびキットは、多くの異なる標的分子が、単一の生物学的サンプルから単一細胞レベルで一度に解析することができるという利点を提供する。このことにより、例えば、いくつかの診断検査を1つのサンプルにおいて行うことが可能になる。
エピトープ特異的バーコード-細胞起源バーコード結合体のセットに対して得られた配列決定データを解読およびグループ化するための解析能力を提供する非一時的コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアパッケージも本明細書中に開示される。そのようなソフトウェアパッケージによって提供される能力の例としては、配列アラインメントツールおよび配列比較ツール、階層クラスタリングツール、増幅および/または配列決定のエラーの検出および訂正のツール、データ可視化ツールなどが挙げられる。
Claims (12)
- 細胞の混合集団内の部分集団中の標的を検出するための方法であって、該方法は、
a)前記細胞の混合集団を、前記細胞の混合集団内の部分集団を同定する少なくとも1の第1のユニーク結合物質(UBA)及び前記部分集団に限られない少なくとも1の第2のUBAと接触させ;ここで前記UBAが、エピトープ特異的バーコード(ESB)オリゴヌクレオチドを含み;
b)結合した各UBA上のESBに、複数のアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)オリゴヌクレオチドを、スプリットプール合成の連続的なラウンドのあいだ順番に、連続的に付加し、ここで、最初のAPSは前記ESBに隣接してアニーリングし、各ラウンドにおいて全ての連続するAPSは、前回のラウンド由来の前記APSにアニーリング領域を介して隣接し、そして最初のAPSをESBに共有結合し、連続して隣接してアニーリングされたAPSを互いに共有結合して、UBAが結合している個々の細胞のアイデンティティを表すユニークな細胞起源バーコード(COB)を作成する、
c)COBを配列決定し、それによって前記部分集団特異的ESBを含むCOBを、部分集団特異的COBとして同定すること;
d)少なくとも1対の増幅プライマーを設計し、ここで、1のプライマーは第2のUBAのESBにハイブリダイズする配列を含み、もう一方のプライマーは、ステップc)で同定された部分集団特異的COB中のAPSにハイブリダイズする配列を含み;そして
e)第2のUBAのESBを含むCOBを増幅し、それによって細胞の部分集団中の標的を検出する、
を含む、前記方法。 - 前記部分集団が、前記細胞の混合集団の1%未満を含む、請求項1に記載の方法。
- 第1のUBAが、CD1、CD3、CD8、CD4およびHIVウイルス配列から選択される部分集団マーカーに特異的である、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのUBAが抗体であり、そして前記ESBが前記抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1のUBAがオリゴヌクレオチドプローブであり、前記ESBがオリゴヌクレオチドプローブ配列の一部である、請求項1に記載の方法。
- ステップd)における増幅プライマーの前記対のうちの1のプライマーが、最も外側のAPSから始まる部分集団特異的COB中の一連のAPSにハイブリダイズする一連のネステッド増幅プライマーを含み;そして、ステップe)における増幅が、一連の連続ラウンドであり、その各々が次のネステッドプライマーで行う、請求項1に記載の方法。
- ステップe)で増幅されたCOBの配列決定をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 1又は複数の追加の標的について、細胞の混合集団内の部分集団をリサンプリングするための方法であって、以下を含む方法:
a)検出される追加の標的に結合する非特異的結合物質(BA)及び前記細胞の混合集団内の部分集団を同定する少なくとも1のユニーク結合物質(UBA)を、前記細胞の混合集団と接触し;ここで、前記BA及びUBAが、エピトープ特異的バーコード(ESB)オリゴヌクレオチドを含み;
b)結合したBA及びUBAのそれぞれのESBに、複数のアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)オリゴヌクレオチドを、スプリットプール合成の連続的なラウンドのあいだ順番に、連続的に付加し、ここで、最初のAPSは前記ESBに隣接してアニーリングし、各ラウンドにおいて全ての連続するAPSは、前回のラウンド由来の前記APSにアニーリング領域を介して隣接し、そして最初のAPSをESBに共有結合し、隣接してアニーリングされたAPSを互いに共有結合して、BA及びUBAが結合している個々の細胞のアイデンティティを表すユニークな細胞起源バーコード(COB)を作成する;
c)COBを配列決定し、それによって部分集団特異的ESBを含むCOBを部分集団特異的COBとして同定する;
d) 前記集合の一定量を接触検出されるべき追加の標的分子に対する特異的結合物質と接触させることによって、前記細胞の混合集団を再サンプリングし;ここで、前記特異的結合物質が、固体支持体に結合し、
そしてここで、該特異的結合物質は固体支持体に結合し、そしてさらに追加の標的分子を同定するコード配列およびステップc)で同定された部分集団特異的COBにハイブリダイズする配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマーにさらに結合すること、および
前記追加の標的分子が、ステップb)においてその上に組み立てられたCOBとともにステップa)の非特異的結合物質(BA)にさらに結合し;
e)前記固体支持体を捕獲することによって追加の標的分子を捕獲すること;および
f)ステップd)の第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、ステップc)で同定された部分集団特異的COBに特異的な第2のプライマーで、前記追加の標的分子に付随するCOBを増幅し、それにより前記細胞の部分集団における追加の標的分子を検出する
を含む、前記方法。 - 結合物質(BA)が、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、スルホジクロロフェノールエステル、イソチオシアネートおよび塩化スルホニルから選択されるタンパク質結合物質である、請求項8に記載の方法。
- 結合物質(BA)がポリ-dTオリゴヌクレオチドである、請求項8に記載の方法。
- ステップe)で増幅されたCOBの配列決定をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- ステップf)における第2の増幅プライマーが、最外側APSから始まる部分集団特異的COBにおける一連のAPSにハイブリダイズする一連のネステッド増幅プライマーを含み、そしてステップf)における増幅が、一連の連続したラウンドの増幅であり、その各々が次のネステッドプライマーを用いる、請求項8に記載の方法。
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