JP2007524410A - ポリヌクレオチドライゲーション反応の改良 - Google Patents

Abstract

本発明の方法は、（ｉ）ユニークな分子タグ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｇ）を、サンプル中の実質的に全ての分子に結合させること；（ｉｉ）サンプルの分子を用いて、分析手順を行なうこと；（ｉｉｉ）分子タグに基づいて、分析手順を受けたオリジナルのサンプル（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓａｍｐｌｅ）中に存在する分子の絶対又は相対数を測定することの工程を包含する、サンプルに分析手順を行なった後に、サンプル中に存在するユニークな分子の絶対又は相対数を定量することにおいて有用である。
【選択図】なし

Description

発明の分野
この発明は、分析手順を受ける分子の絶対及び／又は相対数を定量するための方法に関し；さらに、分析手順の間の個々の分子の追跡（ｔｒａｃｋｉｎｇ）を可能にする。本発明は、ポリヌクレオチド及びタンパク質の分析において特に有用である。

発明の背景
分子分析のための方法は、しばしば、その分析自体が行なわれ得る前に、オリジナルの標的分子が増幅や標識のような様々なプロセスを受けなければならないことを要求する。しかしながら、このようなプロセスの効率が変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を受けやすいことが問題である。例えば、増幅プロセスにおいて、サンプル中のある標的分子が別の標的分子よりも高い頻度でコピーされ、それによってオリジナルのサンプル中に存在していた別の標的分子の絶対及び相対量を測定することが困難になるかも知れない。さらに、分析手順自体は、しばしば、各々の個々の分子に関する情報を維持することができないような分子の混合をもたらす。分子をタグ化するための先に開示された方法は、この問題に取り組んでいない。

オリゴヌクレオチドタグを用いた分子のクラス又は亜集団（ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を追跡及び同定する方法の例がＵＳ ５，６０４，０９７及びＵＳ ５，６５４，４１３に開示されている。ＵＳ ５，６０４，０９７及びＵＳ ５，６５４，４１３は、サンプルからの同一ポリヌクレオチドの亜集団を、特別な固相サブストレート上へ選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）するための方法を開示している。これは、実質的に全ての同種分子又は分子の同種亜集団に同じタグを結合させ、且つ、実質的に全ての異種分子又は分子の異種亜集団に異なるオリゴヌクレオチドタグを結合させるように、分子集団における各々の分子にタグのレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）からオリゴヌクレオチドタグを結合させることによって達成される。さらに、レパートリーからの各オリゴヌクレオチドタグは複数のサブユニットを含み、且つ、各サブユニットは３〜６ヌクレオチド又は３〜６塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドからなり；サブユニットは、クロス−ハイブリダイゼーションを防ぐよう選択される。次いで、分子又は分子の亜集団は、オリゴヌクレオチドタグを固体サブストレートの表面上にみられるそれぞれの相補物とハイブリダイズすることによって選別され得る。

この方法は、クラス又は亜集団の追跡及び選別を可能にする。しかしながら、個々の分子が同定され得るように各分子上のタグをシークエンスすることの開示はない。

発明の要旨
本発明は、各々の特定の分子にユニークな分子タグを用いることによって、ユニークな標的分子の絶対及び／又は相対量が測定され、且つ、集団内の個々の分子が分析手順の間追跡され得るという実現に基づく。

本発明の最初の局面に従って、サンプルに分析手順を行なった後に、サンプル中に存在するユニークな分子の絶対又は相対数を定量する方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）ユニークな分子タグ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｇ）を、サンプル中の実質的に全ての分子に結合させる工程；
（ｉｉ）サンプルの分子を用いて、分析手順を行う工程；
（ｉｉｉ）分子タグに基づいて、分析手順を受けたオリジナルのサンプル中に存在するユニークな分子の絶対又は相対数を測定する工程。

増幅後にオリジナルのサンプル中に存在するユニークな分子の量を測定できることは、多くのプロセスにおいて有利である。例えば、それは、異なるｍＲＮＡクラスの量を測定するために、転写分析に使用され得る。

本発明の第二の局面に従って、サンプル中のポリヌクレオチドの配列を決定するための方法は、以下の工程を包含する、
ｉ）ユニークな分子タグをサンプル中の実質的に全てのポリヌクレオチドに結合させる工程；
ｉｉ）増幅されたポリヌクレオチドを断片化する工程；並びに、
ｉｉｉ）分子タグを含有する少なくともこれらの断片化されたポリヌクレオチドをシークエンスする工程（ここで、分子タグに基づいて、各々の個々のポリヌクレオチドに関する配列情報が例えばコンピュータープログラムを用いて照合され得る）。

これは、特にｄｅ ｎｏｖｏシークエンシングにおいて、個々の配列断片からの配列データの再構築を簡素化することにおいて有用である。

本発明の第三の局面に従って、サンプル中のタンパク質の存在を検出するための方法は、各々が標的タンパク質の異なる部分に対して親和性を有する２又はそれ以上のタンパク質結合分子と、サンプルを接触させる工程を包含し（ここで、タンパク質−結合分子は、ポリヌクレオチド分子タグを含有し、且つ、ここで、少なくとも２つのタンパク質−結合分子が標的タンパク質に結合すると、分子タグが続くライゲーション工程においてライゲートされ、且つ、ライゲートされたポリヌクレオチドが検出される）、ライゲートされたポリヌクレオチドが標的タンパク質のクラスと個々のタンパク質を同定する配列を含有することを特徴とする。

本発明の第四の局面に従って、細胞の外表面上に存在する特定のタンパク質の存在を検出するための方法は、
（ｉ）細胞を、異なるタンパク質−結合分子を含有するサンプルと接触させること（各々のタンパク質−結合分子は、定義された配列のポリヌクレオチド分子タグを含有する）；
（ｉｉ）近接するポリヌクレオチドをライゲートするため、ライゲーション反応を行うこと；及び、
（ｉｉｉ）ライゲートされたポリヌクレオチドを検出し、且つ、外表面タンパク質の存在を測定すること；
（ここで、ポリヌクレオチド分子タグは、外表面タンパク質のクラスと個々のタンパク質とを同定するヌクレオチド配列を含有する）
を包含する。

発明の詳細な説明
本発明は、ユニークな分子の分析において使用される。分子は、分析手順を受けるサンプル中に存在するあらゆる分子であり得る。好ましい実施形態において、分子はポリマーである。用語「ポリマー分子」及び「ポリマー」は、本書において使用され、複数のモノマーユニットから構成される生物学的分子を言う。好ましいポリマーとしては、タンパク質（ペプチドを含む）及び核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその合成アナログ（ＰＮＡを含む））が挙げられる。最も好ましいポリマーはポリヌクレオチドである。

用語「分子タグ」は、本書において使用され、それが結合される標的分子に関する情報を与える分子（又は一連の分子）を言う。タグは、結合された個々の標的分子を表すユニークな定義された構造又は活性を有する。タグは、また、標的分子のクラス（又は、亜集団）を表す第二の定義された構造を含有してもよい。サンプルが分子の単一クラスを含有している場合、さらなる構造は必要なく、タグはユニークな部分のみを含有し得る。

標的分子の起源に関する情報を保持するため、サンプル同定部分（ｓａｍｐｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）も使用され得る。このようにして、標的分子を用いる幾つかのアッセイ又は手順の後に、遡る（ｔｒａｃｋｉｎｇ ｂａｃｋ）可能性を保持し、標的分子が取り出されたオリジナルのサンプルを同定することが可能になる。例えば、サンプル同定部分は、生物学的サンプルが採取された個々の患者に特異的であり得る。従って、アッセイは、多数の患者からのサンプルに対して同時に行われ、結果は、各々の標的分子が得られた知見（ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ）を用いて分析され得る。これは、誤ってラベルを付されたサンプル （ｍｉｓｌａｂｅｌｌｅｄ ｓａｍｐｌｅ）の誤った分析を防ぐことにおいても有益である。

分子タグは、サンプル中の「実質的に」全ての分子に結合されるように決められる。タグがサンプル中の分子の８０％以上、より好ましくは９０％、９５％又は９８％以上、そして最も好ましくは分子の少なくとも９９％に結合されることが好ましい。最終的な読み出し工程（ｒｅａｄ−ｏｕｔ ｓｔｅｐ）において、分子上のタグが測定される。最終サンプル中のタグの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％が測定されることが好ましい。オリジナルのサンプル中の各タグが少なくとも１回読まれることを確実にする方法で読み出し工程が行なわれることが望ましい。これは、各タグが少なくとも１回同定されることを確実にする。次いで、統計的分析が行なわれ得る。

分子タグは、標的分子に関する必要な情報を付与し得るあらゆる生物学的分子であり得る。好ましくは、分子タグは、特定の配列を有するよう設計され、それゆえ結合された分子の同定において使用され得るポリマー分子である。最も好ましい実施形態において、分子タグは、ユニークであり且つ分子タグが結合される個々の標的に対して特異的である核酸配列を有するポリヌクレオチドである。このタグは、また、サンプル分子のクラス（又は亜集団）を表すさらなる核酸配列、及び、必要に応じてサンプル同定部分を含有し得る。ポリヌクレオチドは、任意の適当な配列であり得る。任意の適当なサイズのポリヌクレオチドが使用され得る。ユニークな配列は各々の（又は実質的に各々の）標的に要求されるので、サイズは「タグ化（ｔａｇｇｅｄ）」される異なる標的ポリマーの数に一部依存する。

ポリヌクレオチドタグに関連して、これらは、タグが後の読み出し工程において測定され得るように、例えば、ポリメラーゼ反応によって増幅され得る。それゆえ、読み出しの際、タグが標的分子に結合される必要はない。この実施形態において、ポリメラーゼ反応における使用に適するプライマーに結合する配列を、タグに付加する必要があるかもしれない。この配列は、標的への付加よりも前にタグ上に存在してもよいし、いったんタグが標的に結合してから（例えば、ライゲーションを経て）付加されてもよい。

さらなる実施形態において、分子タグは、サンプル分子に対して親和性を有するアプタマーであるか又は該アプタマーを含有する。好ましい実施形態において、分子タグは、標的−特異的アプタマー（これは、標的分子と特異的に結合する）及びユニークなポリヌクレオチドタグを含有する。生体分子を認識することが知られているアプタマー及びその製造方法は、当該分野においてよく知られている（例えば、その内容が参考として援用されるＷＯ−Ａ−００／７１７５５）。

あるいは、タグは、タンパク質であるか又はタンパク質を含有し得る。好ましくは、この場合におけるタグは、サンプル分子に対して親和性を有する抗体であるか又は該抗体を含有する。

タグは、上記のいずれかを単一部分に結合させることによって形成され得ると考えられる（例えば、ポリヌクレオチドに連結される抗体又はポリヌクレオチドに連結されるアプタマー）。

好ましくは、結合が起こるときに実質的に全てのサンプル分子が異なるユニークなタグに結合されることが統計的に起こり得るように、サンプル分子に対して大過剰のユニークなタグが存在する。

サンプルは、全く同一であるか又は実質的に類似している分子を含有してもよいし、異なる集団からの分子を含有してもよい（即ち、サンプル中には、分子の単一なクラスが存在してもよいし、分子の幾つかのクラスが存在してもよい）。同じクラスの分子は、同一であるか又は共通の属性を有する（例えば、ＰＣＲによって増幅される同一ＤＮＡ分子の集団、或いは、（異なる配列を含有するけれども）全てがｍＲＮＡの共通の属性を有し、それゆえ同じクラスに属するｍＲＮＡ転写物の混合集団）。異なるクラスの分子は、構造又は幾つかの他の属性において異なる（例えば、細胞表面（図３に示されるような）は、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、脂質、又は、全てが異なる（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）構造及び属性を有する他の生物学的分子を含有する）。これらは、本発明の方法を用いて決定され得る。分子の異なるクラスを含有するサンプルのさらなる例は、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物、細胞破砕物又はタンパク質の異なるクラスを含有するサンプルであり得る。

サンプルが分子の単一クラスを含有しているか又は分子の複数のクラスを含有しているかは、当業者に明らかである。；
本発明の方法は、標的分子を分析する前にサンプル中の「タグ」標的分子に使用される。

タグ化は、分子タグを標的分子と連結させるための任意の適当な方法（化学法又は酵素法を含む）によって行われ得る。核酸標的ポリマー及びポリヌクレオチドタグに関連して、タグ化プロセスは、適当なリガーゼ酵素によって行なわれ得る。タグは、通常、標的の末端の一方にライゲートされる。例えば、二重鎖ポリヌクレオチドは、単一鎖の突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）（これは、ポリヌクレオチドタグ上の相補的な突出部とハイブリダイズし、適当なリガーゼ酵素を用いてライゲートされ得る）を生成するよう処理され得る。単一鎖の突出部を生成するあらゆる方法が使用され得、好ましい方法は、クラスＩＩＳ制限酵素の使用である。

アプタマー又は抗体に関連して、タグは、特異的な標的−アプタマー／抗体相互作用によってサンプル分子に結合され得る。

分子タグは、また、標的分子に結合させるために使用される異なる分子に結合され得る。例えば、タグは、特定の標的に対する親和性を有するタンパク質−結合分子（例えば、抗体）に結合されたポリヌクレオチドであり得る。

分子タグは、２進法（ｂｉｎａｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）（ここで、各タグは、「０」及び「１」の連続によって表される）を表す形であり得、大量のデータが少数のタグ成分内に含まれることを可能にする。例えば、「０」と「１」の異なる組み合わせが形成され、ユニークなタグとして使用され得る「０」と「１」のユニークな列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が提供され得る。

好ましくは、シグナル「０」及び「１」は、異なるオリゴヌクレオチド配列によって表され、例えば：

分子タグは、例えば、分子タグと結合される標的分子のクラス、個々の標的分子、及び、所望の場合には標的が採取されたサンプルを同定するよう特徴付けられ得るユニークな配列を形成するユニットの組み合わせを伴う、ヌクレオチド配列の繰り返しユニットであるか又はこれを含み得る。

このシステムは、たった２のユニットを用いて多くのユニークなタグが生成され得るので有利である。これは、図１によって示される。

タグがこの２進法に従って「０」と「１」のユニークなシリーズを含む場合、タグのユニークな部分は、本書において「ユニークネスナンバー部分（ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ ｎｕｍｂｅｒ ｐｏｒｔｉｏｎ）」と称される。２進法に従って、好ましいタグは、個々の分子を同定するユニークネスナンバー部分を含有し得、また、サンプルが分子の幾つかのクラスを含有する場合には、第二の定義される２進数列（ｂｉｎａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が「分子クラス部分」を表し、サンプル分子の各々のクラスを定義し得る。それゆえ、サンプル分子の各クラスは、異なる分子クラス部分でタグ化され、且つ、クラス内の各サンプル分子は、異なるユニークネスナンバー部分を有する。これは、図１によって示される。

分子タグのユニークな部分（２進法が使用される場合には、「ユニークネスナンバー部分」）のサンプル分子への結合は、任意の分析手順の前に起こる。サンプル同定部分は、分析手順の前、間又は後の任意の時点でサンプル分子へ結合され得る。

分析手順は、分子を分析するために使用されるあらゆる手順であり得る。

サンプル分子がタンパク質及びポリヌクレオチドのような生物学的分子である場合、個々にタグ化された各々のサンプル分子を有することから利益を受ける当該分野に存在する多数の分析手順が存在する。

分子の物理的、化学的及び機能的特性を特徴付ける方法は、「分析手順」の範囲内である。このような技術は、当業者によく知られている。生物学的ポリマーのシークエンシングが、このような分析手順であり得る。

１つの実施形態において、分子タグはポリヌクレオチドであり、且つ、例えば、それぞれの内容が本書において参考として援用されるＧｕｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ， ２００４； １０１（２２）： ８４２０−８４２４及びＷＯ−Ａ−０１／６１０３７に開示される近接ライゲーション反応（ａ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）において使用され得る。この実施形態において、標的タンパク質は、各々がポリヌクレオチド分子を含有している２又はそれ以上のタンパク質−結合分子と接触される。標的分子への結合に際し、ポリヌクレオチドは接近し、従来のライゲーション手順を用いてライゲートされ得る。次いで、ライゲートされたポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列に基づいて同定される；例えば、ポリヌクレオチドがポリメラーゼ反応において増幅され、ポリヌクレオチドの絶対又は相対数がシークエンシングで決定され得る。ポリヌクレオチドは、標的分子のクラス、個々の分子、及び、必要であれば標的分子が得られたサンプルに関する情報を提供する配列を組み込むよう設計される。それゆえ、ポリヌクレオチドは、本書に開示されるような「二進（ｂｉｎａｒｙ）」形をとり得る。タンパク質−結合分子は、例えば、標的タンパク質上の異なるエピトープに結合する抗体又はアプタマーであり得る。

分析手順は、また、分子の混合物の分離（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、別々の集団への分子の分割（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）又は分子（特に、ポリヌクレオチド）の増幅を包含してもよい。これらの分析手順は多くの技術において適用され得、例えば、本発明の方法を用いるポリヌクレオチドの定量は、転写の数を測定するためにｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの転写分析において使用され得る。微生物フローラ（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｌｏｒａｓ）が類似の方法で分析され得る；異なる微生物種からのゲノムＤＮＡの分析に基づき、本発明の方法によって記載されるようなタグを用いて確認され得る各々の種についてユニークな転写プロフィールを生成することが可能である。ポリヌクレオチドを定量することは、また、ｒＲＮＡタグ化及び検出に基づくリボソーム分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）において使用され得る。

それ自体では増幅され得ない分子を定量化すること（図３において示される）は、タンパク質、炭水化物及び脂質のような膜−結合リガンドの分析に適用され得、また、表面に架橋される生物学的分子の分析においても適用され得る。

好ましい実施形態において、分析手順は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を包含する。分子タグの性質に依存して、タグ自体のみ又はタグ及びサンプル分子が増幅され得る。

例えば、タグがユニークなポリヌクレオチドに結合された抗体を含有する場合（ここで、抗体は、タンパク質を認識及び結合する）、ＰＣＲによる増幅は、ユニークなポリヌクレオチドのみを増幅するであろう。この実施形態において、タグをサンプル分子に接触させた後に、非−結合タグが反応ミックスから除去される。除去の適当な方法は、当業者に明らかである。次いでＰＣＲによる増幅が行なわれる（ここで、ポリヌクレオチドタグのみが増幅される）。増幅後のタグ内に含まれる情報は、オリジナルのサンプル中に存在する異なる分子の数を測定するのに十分である。

あるいは、標的分子及びタグの両方がポリヌクレオチドである場合、ＰＣＲはタグ及び結合するサンプル分子の両方の増幅をもたらす。非−結合タグは、また、増幅の前に除去され得る。この実施形態において、サンプル分子は増幅され、さらに分析又は使用され得、一方、タグ（これもまた増幅されている）は、オリジナルサンプル中に存在する異なる分子の数の情報を含有している。

本発明の方法は、また、細胞上に存在する複数の外表面タンパク質（又は他の分子）を同定するために使用され得る。この実施形態において、分子タグは、細胞と接触し得るタンパク質−結合分子であるか又はこれに結合される。外表面タンパク質に結合されるそれらのタグは、後の同定工程において同定され得る。例えば、タグがポリヌクレオチドである場合、これは、続くポリメラーゼ反応において増幅され得る。

この手順のさらなる展開において、複数の外表面分子は、外表面分子に結合されたポリヌクレオチドタグをライゲートすることによる1回のアッセイにおいて同定され得る。これは、以下のように行なわれる：
（ｉ）細胞又はメンブレンを異なる分子−標的部分を含有するサンプルと接触させること（各部分は、定義された配列のポリヌクレオチド分子タグを含有する）；
（ｉｉ）近接するポリヌクレオチドをライゲートするため、ライゲーション反応を行うこと；及び、
（ｉｉｉ）ライゲートされたポリヌクレオチド（単数又は複数）を検出し、且つ、外表面又はメンブレン分子の存在を測定すること；
（ここで、ポリヌクレオチド分子タグは、外表面分子のクラスと個々の分子を同定するヌクレオチド配列を含有する）。

「近接する（ａｄｊａｃｅｎｔ）」の言及は、外表面分子が互いに直ぐ隣に位置すること示すことを意図しない。むしろ、この用語は、ラーゲーションを起こさせるために、ポリヌクレオチドタグが互いに最も近い位置に配置され得るとき、ライゲーションが起こり得ることを意味することが意図される。この概念は、図４に示される。

さらに好ましい実施形態において、分析手順は、ナノポア検出システムを用いるタグ化分子（ｔａｇｇｅｄ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の検出を包含する。この技術は、各々のタグ化された分子に関する情報が要求されるときに使用される。検出のナノポア法は、当該分野においてよく知られており、その内容が本書において参照として援用されるＴｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００ Ａｐｒ； １８（４）：１４７−５１に記載される。

ポリヌクレオチド検出のための適当なナノポアとしては、脂質二重層内のタンパク質チャンネル又は薄い固体状態のメンブレンにおける「ホール」が挙げられる。好ましくは、ナノポアは、ポリヌクレオチドよりもずっと大きくない直径（例えば、数ナノメートルの範囲）を有する。タグ化されたポリヌクレオチドが、絶縁メンブレン（ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ）におけるナノポアに入るとき、ポアの電気的特性が変化する。これらの変化が測定され、タグ化されたポリヌクレオチドがポアを通過するとき、各ヌクレオチドに対してシグナルが生成される。

本発明の方法は、ポリマーの全サンプルが、各分子の起源に関する情報を失うことなく、ナノポア分析を受けることを可能にし、その一方で、ナノポア分析の後、オリジナルなサンプル中に存在する異なる分子の数を測定することをさらに可能にする。

いったん分析手順が行なわれると、分子タグが測定される。測定方法は、使用されるタグに応じて異なる。タグがポリヌクレオチドである場合、シークエンシングによって特徴付けされ得る。シークエンシングの方法は、当業者によく知られており、適当な技術は明らかであろう。

いったんサンプルがタグ化されれば、必要に応じてこの方法を繰り返すことができ、次いで、得られた産物が分子タグを測定することにより分析される。

この方法は、溶液中又はサンプル分子が表面に結合されるところで行なわれ得る。このような表面としては、生体膜（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、ビーズ又は生きた細胞が挙げられる。例えば、タンパク質の各クラスにユニークなタグを結合し、増幅し、そして異なるユニークなタグの数を検出することによって、細胞表面上の異なるタンパク質の数が検出され得る。サンプル分子が表面に結合される場合、アプタマー及びポリヌクレオチドのような他の分子タグも使用され得るが、分子タグは図３に示されるような抗体を含有し得る。好ましい実施形態において、サンプル分子は、読み出し分析のステージでサブストレート表面に結合されない。それゆえ、サンプル分子は、他の異なるサンプル分子を含む異種集団中に含まれ得る。個々の分子のタグが測定され（読まれ）、情報がコンピューターに収集され、分子及びその特徴が追跡される。

図３は、ビーズ、微生物又は細胞のようなサブストレートに結合された標的分子を定量するための方法を図示する。この方法は、以下のように、細胞膜に結合されたタンパク質のような分子を定量するために使用され得る：
ｉ）細胞は、特定の標的分子、特定の標的分子を表すユニークなポリヌクレオチド及びサンプル同定部分に結合する能力を有する部分（抗体又はアプタマー）を各々が含有する分子タグと、混合される。結合された標的の飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）を達成するために、標的分子に対して大過剰の分子タグが存在する。
ｉｉ）結合反応が飽和に達した後、あらゆる結合していない分子タグが反応ミックスから除去される。
ｉｉｉ）分子タグのポリヌクレオチド部分が増幅され且つ分析される。特異的な標的標識と結合し得るユニークな分子タグの数は、標的分子のオリジナルの数を与える。

サンプル分子が溶液中に存在する場合、例えば、転写の分析において異なるｍＲＮＡクラスの数を測定するとき、抗体のような他の分子タグも使用され得るが、分子タグは、アプタマー及び／又はポリヌクレオチドを含有し得る。

１．標的分子と分子タグが混合される。

標的分子（例えば、タンパク質のようなマクロ分子）を含有する溶液は、特異性を伴って標的分子に結合する能力を有し且つユニークなポリヌクレオチド部分を含有する部分（例えばアプタマー）を含有する大過剰の分子タグと混合される。

２．分子タグは、標的分子に結合され得る。

３．結合していない分子タグが除去される。

これは、例えば、ゲル電気泳動、スピンカラム又は当該分野において知られている他の分離方法を用いて達成され得る。

４．標的分子に結合される分子タグが増幅され、ユニークなタグの数が測定される。

次いで、ユニークなタグは、代表的な数（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ）の増幅された分子タグが更に分析される前に、ＰＣＲによって増幅され得る。

サンプル分子がポリヌクレオチドである場合、タグ化反応の特異性を高めるために、１より多いポリヌクレオチドタグを用いることができる。２つの異なるタグ（各々は、サンプルポリヌクレオチド上の異なるが近接する配列に相補的な配列を含有し、且つ、各々は、ユニークなタグ配列を含有している）は、サンプルポリヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。次いで、これらの２つのタグは互いにラーゲートされ、単一なポリヌクレオチドとしてＰＣＲによって増幅される。２つの特異的なタグがハイブリダイズすることが要求されるので、通常使用される単一タグと比べて、このライゲーション工程は、定量の特異性を高める。正確にハイブリダイズされた近接するタグのみが、ライゲートされ、増幅される。

１．サンプルポリヌクレオチドとポリヌクレオチドタグが混合される：
単一鎖のサンプルポリヌクレオチドは、サンプル配列の特定の近接する部分にハイブリダイズし得る配列をそれぞれ含有する２つのポリヌクレオチドタグと接触される。２つの異なるポリヌクレオチドタグのハイブリダイゼーションの成功は、次いで、互いに接触させ、ライゲーションを起こし得る。

２．ポリヌクレオチドタグは、サンプルポリヌクレオチドにハイブリダイズされ、ライゲートされる：
ハイブリダイズされ且つライゲートされたポリヌクレオチドタグのみが、ＰＣＲによって増幅され得る。ライゲーション工程は、定量手順の特異性を高める。

３．サンプルポリヌクレオチドに結合されたポリヌクレオチドタグが増幅され、ユニークなタグの数が測定される。

図１は、分析手順が増幅である本発明の第一の局面の方法を図示する。最初の前増幅（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）サンプルは、４つの標的ポリマー分子、１つの「Ａ」ＤＮＡ分子と３つの「Ｂ」ＤＮＡ分子を含有する。増幅反応より先に、分子タグは、各標的ポリマー分子上に組み込まれる。分子タグは、２つの部分を含有する。１つの部分は、標的ポリマータイプを同定するサンプル同定部分である。この例において、分子タグは、２進法を使用し、サブユニット「１」はポリマータイプ「Ａ」を表す。分子タグサブユニット「０」は、標的ポリマータイプ「Ｂ」を表す。分子タグの別の部分は（「ユニークネスナンバー部分」）は、個々の標的ポリマーを同定する。図１において見られるように、「Ｂ」標的ＤＮＡ分子の各々は、異なるユニークネスナンバー部分を含有する分子タグを有する。分子タグは、ライゲーションによって標的上に組み込まれる。

いったん各標的ポリマー分子がタグ化されると、そのタグ及び結合された標的は、ポリメラーゼ反応を用いて増幅される。増幅反応はランダムであり、任意の所定のサンプルにおいて、ある標的ポリマー分子は、他の標的ポリマー分子と正確に同じ倍数でコピーされないかもしれない。

増幅後、各ユニークな分子タグが高い統計的確率で少なくとも１回読まれることを確実にして、増幅された分子タグの所定の数を読む場合、どの程度多くのユニークなタグが分子「Ａ」及び「Ｂ」にそれぞれ結合しているかをカウントすることによって、「Ａ」及び「Ｂ」分子の絶対及び／又は相対数を推定することが可能である。

この方法において、情報は、第一の前増幅サンプルの組成について、及び、増幅工程それ自体について得られる。

本発明の更なる実施形態は、個々の分子、並びに／或いは、そのコピー及び／又は断片の存在及び起源（ｏｒｉｇｉｎ）を追跡する方法を包含する。サンプル分子は、先に述べたように、オリゴヌクレオチド標的タグでタグ化されたポリマー核酸であり得る。好ましい分析手順は、タグ及び結合されたサンプル分子の増幅、その後の増幅されたポリマーの断片化である（例えば、「ｄｅ ｎｏｖｏ」シークエンシング法において使用されるような）。この断片化の結果は、同じ標識を含む同じ起源からの全ての分子（親分子）を含む、異なる長さの標識されたポリヌクレオチドの選択であり、各分子の起源が追跡され得る。

増幅された産物は、更なるプロセスにおいて修飾され得、その修飾物は、更なるタグの組み込みによってモニターされる。例えば、各々の増幅された産物の部分は、シークエンスされ得る。

本発明の更なる局面に従って、サンプル中のポリヌクレオチドの配列は、例えば、ｄｅ ｎｏｖｏシークエンシングにおいて測定され得る。この局面は、図２によって示される。

分子タグは、前述したように、サンプル中の実質的に全てのポリヌクレオチドに結合される。次いで、サンプルポリヌクレオチドは、例えば、その内容が本書において参照として援用されるＷＯ−Ａ−００／３９３３３に開示されるような当該分野においてよく知られる方法によって断片化される。次いで、少なくともタグを含有する断片は、当該分野においてよく知られているポリヌクレオチドシークエンシング法によってシークエンスされ得る。ここに、タグ化されたポリヌクレオチド断片（これは、集ってオリジナルのサンプル分子の全配列を表す）のコレクションが存在し、各々の断片の起源がタグに基づいて分かるため、配列データの再アセンブリ（ｒｅ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）が単純化される。

好ましい実施形態において、その内容が参照として援用されるＷＯ−Ａ−００−３９３３３に開示されるような、シークエンシングの拡張タグ法（ｔｈｅ ｍａｇｎｉｆｙｉｎｇ ｔａｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が使用される。これは、標的ポリヌクレオチドの配列を、定義された配列及びそれに含まれる位置情報を有する第二のポリヌクレオチドに変換することによって、ポリヌクレオチドをシークエンスするための方法を記載する。標的の配列情報は、第二ポリヌクレオチドにおいて「拡張されている」と言われ、標的分子上の個々の塩基間を区別することのさらなる簡便化を可能にする。これは、予め決定された核酸配列である「拡張タグ（ｍａｇｎｉｆｙｉｎｇ ｔａｇ）」を用いて達成される。標的分子上の塩基アデニン、シトシン、グアニン及びチミンの各々が、個々の拡張タグによって表され、オリジナルの標的配列が拡張された配列に変換される。次いで、拡張タグの順番を決定するために慣例的な技術が使用され、それによって標的ポリヌクレオチド上の特定の配列が決定される。各拡張タグは、標識（例えば、蛍光標識）（これは、次に同定され、拡張タグを特徴付けるために使用される）を含有し得る。

シークエンシングの別の好ましい方法は、その内容が参考として援用されるＷＯ−Ａ−２００４／０９４６６３に開示される。これは、シークエンシングの「拡張タグ」法に基づき、ここで標的ポリヌクレオチド配列は、第二の「拡張された」ポリヌクレオチドに変換される。標的ポリヌクレオチドの配列の迅速な決定を可能にするため、第二のポリヌクレオチドは、次いで、ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの少なくとも２つと接触される（ここで、少なくとも１つのヌクレオチドは、特有の検出可能な標識を含有する）。

分析手順の様々なステージの追跡は、コンピューター手段を用いて行われ得る。例えば、各反応後、分子タグが同定され、分子タグに結合する標的分子の特徴がコンピューターに格納される。標的分子を用いた続く反応が行われ、更なる結果が決定され、分子タグに関連付けられる。この情報もまた、格納され、特定の標的分子に対する種々の反応結果の照合が得られる。

本発明は、添付の図面を参照して記載される。

図１は、分子のクラスと個々の分子の両方を同定するためにどのように分子タグが使用されるかを示す。 図２は、各分子に関する配列情報を提供するためにどのように分子タグの更なる部分が使用され得るかを示す。 図３は、どのようにビーズ、微生物又は細胞のようなサブストレートに結合された分子が定量され得るかを示す。 図４は、ライゲーション反応を用いて、外表面タンパク質を同定するためにどのように分子タグが使用され得るかを示す。

配列番号１ タグ
配列番号２ タグ

Claims (33)

1. （ｉ）ユニークな分子タグ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｇ）を、サンプル中の実質的に全ての分子に結合させる工程；
   （ｉｉ）サンプルの分子を用いて、分析手順を行なうこと；
   （ｉｉｉ）該分子タグに基づいて、分析手順を受けたオリジナルのサンプル（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓａｍｐｌｅ）中に存在する分子の絶対又は相対数を測定する工程、
   を包含する、サンプルに分析手順を行なった後に、サンプル中に存在する分子の絶対又は相対数を定量する方法。
2. サンプル同定部分を分子タグに組み込む工程を、分析前又は後のいずれかにさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ｉｉｉ）が、読み出し工程（ｒｅａｄ−ｏｕｔ ｓｔｅｐ）においてタグを同定することによって行なわれる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 読み出し工程が、オリジナルのサンプル中の各タグが少なくとも１回読まれることを確実にする方法で行なわれる、請求項３に記載の方法。
5. 分子がポリマー分子である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
6. サンプルが異なる分子を含有している、先の請求項のいずれかに記載の方法。
7. サンプルが、同じタイプの複数の分子を含有している、先の請求項のいずれかに記載の方法。
8. 分子タグが、定義された配列のポリヌクレオチド分子であるか又は定義された配列のポリヌクレオチド分子を含有している、先の請求項のいずれかに記載の方法。
9. ポリヌクレオチドが、定義された配列のＤＮＡ分子である、請求項８に記載の方法。
10. 分子タグが、抗体であるか又は抗体を含有している、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
11. 分子タグが、アプタマーであるか又はアプタマーを含有している、請求項１〜７のいずれか又は請求項１０に記載の方法。
12. 分子タグがポリヌクレオチドであり、且つ、分析手順が増幅反応を包含している、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
13. ポリヌクレオチドタグがポリメラーゼ反応において増幅される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
14. 分子がポリヌクレオチドであり、且つ、分析手順がポリヌクレオチド分子の増幅を包含している、請求項１３に記載の方法。
15. ２又はそれ以上のポリヌクレオチド分子タグが各々の標的ポリヌクレオチドに結合され、次いで該タグが互いにライゲートされ、生じるライゲートされたポリヌクレオチドがポリヌクレオチド増幅反応において増幅される、請求項１４に記載の方法。
16. 分析手順がナノ−ポア検出を包含している、先の請求項のいずれかに記載の方法。
17. 分子タグ又は分子タグの一部が、タグ化分子のサンプル起源（ｓａｍｐｌｅ−ｏｒｉｇｉｎ）を示す、先の請求項のいずれかに記載の方法。
18. 工程（ｉｉｉ）の結果がコンピュータープログラムにおいて照合される、先の請求項のいずれかに記載の方法。
19. 分子がタンパク質である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
20. 分子が抗体である、請求項１８に記載の方法。
21. 各々が標的分子の異なる部分に対して親和性を有する２又はそれ以上の分子−結合部分と、サンプルを接触させる工程を包含し（ここで、該部分は、ポリヌクレオチド分子タグを含有し、且つ、ここで、少なくとも２つの部分が標的分子に結合すると、２又はそれ以上の分子タグが続くライゲーション工程においてライゲートされ、且つ、ライゲートされたポリヌクレオチドが検出される）、
    該ライゲートされたポリヌクレオチドが標的分子のクラスと個々の分子（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を同定する配列を含有することを特徴とする、
    サンプル中の分子の存在を検出するための方法。
22. ライゲートされたポリヌクレオチドがサンプル同定部分をさらに含有している、先の請求項のいずれかに記載の方法。
23. （ｉ）細胞又はメンブレンを、異なる分子−標的部分を含有するサンプルと接触させること（各々の部分は、定義された配列のポリヌクレオチド分子タグを含有する）；
    （ｉｉ）近接するポリヌクレオチドをライゲートするため、ライゲーション反応を行うこと；及び、
    （ｉｉｉ）ライゲートされたポリヌクレオチドを検出し、且つ、外表面又はメンブレン分子の存在を測定すること；
    （ここで、ポリヌクレオチド分子タグは、外表面分子のクラスと必要に応じて個々の分子を同定するヌクレオチド配列を含有する）
    を包含する、メンブレン又は細胞の外表面上に存在する特定の分子の存在を検出する方法。
24. ポリヌクレオチド分子タグが、サンプル同定部分をさらに含有している、請求項２３に記載の方法。
25. 外表面分子がタンパク質であり、且つ、該部分がタンパク質−結合分子である、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
26. ポリヌクレオチド分子タグが、２進コードの別個のユニット（ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｕｎｉｔｓ ｏｆ ｂｉｎａｒｙ ｃｏｄｅ）を表すヌクレオチドの配列を含有する、請求項８、９又は２１〜２５のいずれかに記載の方法。
27. ｉ）サンプル中のポリヌクレオチドにユニークな分子タグを結合させる工程；
    ｉｉ）ポリヌクレオチドを増幅する工程；
    ｉｉｉ）増幅されたポリヌクレオチドを断片化する工程；並びに、
    ｉｖ）分子タグを含有する少なくともこれらの断片化されたポリヌクレオチドをシークエンスし、且つ、分子タグを同定する工程、
    （ここで、分子タグに基づいて、各々の個々のポリヌクレオチドの配列情報が照合される）
    を包含する、サンプル中のポリヌクレオチドの配列を決定するための方法。
28. 分子タグが請求項９〜１２及び１７のいずれかに定義されるとおりである、請求項２７に記載の方法。
29. シークエンシング工程が、配列情報を拡張タグ（ｍａｇｎｉｆｙｉｎｇ ｔａｇｓ）に変換することを包含する（各タグは、ポリヌクレオチドにおける１の塩基を表す）、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
30. 工程（ｉｖ）の結果が、コンピュータープログラムに照合される、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
31. 生物学的分子を、該分子が取り出された又は配置された（ｐｌａｃｅｄ ｉｎｔｏ）サンプルに特異的な分子タグで標識することを包含する（ここで、サンプル起源は、分子タグを同定することによって決定される）、
    生物学的分子のサンプル起源を決定するための方法。
32. 分子タグが請求項９〜１２及び１７のいずれかに定義されるとおりである、請求項３１に記載の方法。
33. 請求項９〜１２及び１７のいずれかに定義される１又はそれ以上の分子タグを含有する独立したコンパートメント（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を備えるキット。

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