CN113755575A - 一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用 Download PDF

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CN113755575A CN202111049057.7A CN202111049057A CN113755575A CN 113755575 A CN113755575 A CN 113755575A CN 202111049057 A CN202111049057 A CN 202111049057A CN 113755575 A CN113755575 A CN 113755575A
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Abstract

本发明公开了一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述胰岛素抵抗风险评估的基因为IRS‑1，试剂盒针对IRS‑1Gly972Arg多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、IRS‑1Gly972Arg测序引物和阳性对照。本发明采用生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，简化了测序流程和时间。本发明以快速DNA制备、恒温PCR扩增和焦磷酸测序技术为组合对胰岛素抵抗风险评估的基因多态性进行检测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。

Description

一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测 方法和应用
技术领域
本发明涉及一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
背景技术
胰岛素是由胰岛β细胞在内源性或外源性物质的刺激下而分泌的一种蛋白质激素，只有当胰岛素与其受体结合才能实现在机体中发挥生理功能，其主要生理功能是调节机体的糖、脂代谢，并促进蛋白质合成。胰岛素受体(insulin receptor)在机体中分布较广，肌肉、脂肪、肝脏乃至肾脏都是胰岛素靶器官或组织。当胰岛素靶器官或组织对内源性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低时就会发生全身或局部的胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)。IRS1(insulin receptor substrate 1)，也称IRS-1，是胰岛素受体激酶的主要底物，是胰岛素信号传递中的关键中枢受体，在胰岛素敏感组织中表达。IRS编码一种蛋白质，该蛋白质会被胰岛素受体酪氨酸激酶磷酸化。该基因的突变尤其是Gly972Arg取代，与T2DM和对IR的敏感性有关。该基因的多态性与胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损有关。因此，对胰岛素抵抗相关的基因进行检测，有助于高血糖精准用药。
目前，基因多态性检测的方法有很多种，主要采用荧光PCR。主要包括高分辨率熔解曲线法、taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法。高分辨率熔解曲线法步骤简单，但特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增操作方法简单，但检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。taqman荧光探针法试验成本较高。
目前对血液DNA的获得方式主要有传统的柱式提取、磁珠法提取，此两种方法均耗时较久，操作较为繁琐。CN201610022581.8提出了一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应。该发明也同样需要对磁珠进行洗涤。综上，急需一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测IRS-1基因多态性的焦磷酸测序方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒的技术方案如下：
所述胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒针对IRS-1(Gly972Arg)的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、IRS-1(Gly972Arg)测序引物、阳性对照。
具体的，所述特异性引物序列如下表1所示：
Figure BDA0003252179420000021
优选的，IRS-1(Gly972Arg)扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。
优选的，IRS-1(Gly972Arg)测序引物如序列表SEQ ID NO:3所示。
优选的，IRS-1(Gly972Arg)测序引物对应的测序区域为IRS-1(Gly972Arg)待检序列，如序列表SEQ ID NO:4所示；优选的，IRS-1(Gly972Arg)分配指令如序列表SEQ ID NO:5所示。
更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
优选的，IRS-1(Gly972Arg)测序引物对应的测序区域为IRS-1(Gly972Arg)待检序列，如序列表SEQ ID NO:4所示；IRS-1(Gly972Arg)分配指令如序列表SEQ ID NO:5所示。
优选的，所述样本处理液，不包含胍盐，通过碱性条件和表面活性剂对样本进行裂解。包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、2-50mg/mL氢氧化钠、5-15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20-80mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝8.5-9.5。
更优选的，所述样本处理液，包括0.3％-0.5％十二烷基硫酸锂、0.2-0.4％曲拉通X-100、10-20mg/mL氢氧化钠、8-12mM甜菜碱、8-12％海藻糖、4～6mM BSA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝9。
优选的，所述的磁珠为羧基磁珠，粒径为600mm，悬浮性较好，磁性能较强，吸附量大。反应液中磁珠浓度为0.2mg/25μL，血液样本中DNA吸附量为30ng～260ng，完全满足扩增所需的DNA量。
优选的，所述的扩增试剂1包括：扩增缓冲液，15mM醋酸镁；
优选的，所述的扩增试剂2包括：IRS-1(Gly972Arg)前引物(0.32uM)，IRS-1(Gly972Arg)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)。
更优选的，所述的扩增试剂2包括：海藻糖(0.2％)，10mM醋酸锰、0.1M山梨糖醇、5ug/mL BSA。海藻糖对生物活性物质具有非特异性保护作用，能提高DNA聚合酶热稳定性、降低DNA模板解链温度，减少G-C丰富区由于自身互补配对所形成的二级结构，因此提高PCR反应的特异性。山梨糖醇和醋酸锰具有PCR预混液稳定效应，同时在冷冻干燥过程中具有稳定作用。牛血清白蛋白能提高PCR反应的扩增效率并减少体系中PCR抑制物对反应的影响。
优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：42℃30min。
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的IRS-1(Gly972Arg)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
a.样本处理液100ul、4ul磁珠和30ulEDTA抗凝全血样本混合，室温静置5min；
b.将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
c.将配制好的PCR反应液加入到步骤b)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
d.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合；
e.变性液处理得到单链产物；
f.加入洗涤缓冲液漂洗；
g.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
h.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、CYP1B1(432C/G)测序引物，将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
i.焦磷酸测序。
本发明还公开了一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒对IRS-1(Gly972Arg)进行检测，以从基因层面反应胰岛素的抵抗风险，进一步为指导胰岛素的剂量给出基因层面的建议。
与现有技术相比，本发明采用样本处理液快速样本释放出DNA，样本量为30ul全血，相比一步裂解法和直接扩增(约2-10ul)，可以得到足量的基因组DNA吸附在磁珠上供后续分析。通过将样本和裂解混合液移除可以去除大部分抑制物。DNA模板通过恒温PCR扩增IRS-1(Gly972Arg)基因位点，产生大量的生物素标记的单链DNA。生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，简化了测序流程和时间。本发明以快速DNA制备、恒温PCR扩增和焦磷酸测序技术为组合对胰岛素抵抗风险评估的基因多态性进行检测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
与现有技术相比，本发明快速扩增方法主要从两方面进行了优化，一方面采用提取扩增同管的方式，免去提取多次移管、核酸丢失风险；另一方面通过加入抗抑制剂进行快速恒温扩增；本发明的目的是以恒温PCR和焦磷酸检测为基础，获得一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用。
附图说明
图1是本发明提供的IRS-1(Gly972Arg)位点CC型焦磷酸检测结果示例图；
图2是本发明提供的IRS-1(Gly972Arg)位点CT型焦磷酸检测结果示例图；
图3是本发明提供的IRS-1(Gly972Arg)位点TT型焦磷酸检测结果示例图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
(一)特异性引物设计
本发明的试剂盒针对IRS-1(Gly972Arg)基因多态性设计了特异性扩增引物和测序引物，用于焦磷酸PCR检测。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准，引物序列如下表1所示。
表1
Figure BDA0003252179420000051
(二)试剂盒组成
检测试剂盒包括如下表2所示的组分：
表2试剂盒组分表
序号 组份 标示装量
1 样本处理液 2000μL×1管
2 磁珠 80μL×1管
3 扩增试剂1 530μL×1管
4 扩增试剂2 干粉
5 IRS-1(Gly972Arg)测序引物 70ul×1管
6 阳性对照 50μL×1管
(三)样本处理液配置体系如下：
样本处理液，包括0.4％十二烷基硫酸锂、0.3％曲拉通X-100、15mg/mL氢氧化钠、10mM甜菜碱、10％海藻糖、5mM BSA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝9。
(四)本实施例的检测试剂盒扩增试剂1单人份配置体系如下：
成分 体积(ul)
扩增缓冲液 24
200mM醋酸镁 1
(五)本实施例的检测试剂盒扩增试剂2单人份配置体系如下：
IRS-1(Gly972Arg)前引物(0.32uM)，IRS-1(Gly972Arg)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)，10mM醋酸锰、0.1M山梨糖醇、5ug/mL BSA。PCR体系如表3所示：
表3 PCR体系表
成分 体积(ul)
结合单链核酸的重组酶(100ng/μL) 1.2
单链DNA结合蛋白(100ng/μL) 0.8
链置换DNA聚合酶(100ng/μL) 0.3
dNTPs(25mM) 0.3
IRS-1(Gly972Arg)前引物(20μM) 0.4
IRS-1(Gly972Arg)后引物(20μM) 0.4
海藻糖(20％) 0.25
1M醋酸锰 0.25
10M山梨糖醇 0.25
5mg/mL BSA 0.25
配置完成后96.8ul/管进行分装、冻干。
实施例2、试剂盒检测步骤
本发明中采用的仪器如下：恒温仪，焦磷酸测序仪(武汉菲思特生物科技有限公司)。
1)取30μL EDTA抗凝全血样品于PCR扩增管中；
2)加入100μL样本处理液和4ul磁珠，静置5min；
3)将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
4)将扩增试剂1加入扩增试剂2干粉中，充分溶解混匀；
5)将配制好的PCR反应液加入25ul到步骤4)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应。
6)采用PCR仪进行扩增，反应体系为25μL，扩增条件：
扩增温度 时间 循环数
42℃ 25min 1
7)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入PCR产物20μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和PCR产物充分结合；
8)7,000×g离心1min，弃上清；
9)加入22uL稀释后的变性液工作液，静置5min，7,000×g离心1min，EP管收集得到单链产物；
10)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7,000×g离心1min。(重复3次)；
11)将EP管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3uL测序酶和3uL测序底物；
12)测序管中分别加入3uL测序酶和3uL测序底物；
13)取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、CYP1B1(432C/G)测序引物、ABCB1(C3435T)测序引物、ddATP；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
14)焦磷酸测序；测序结果如图1～3所示；
15)结果判读。
i.有效性判定
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为IRS-1(Gly972Arg)杂合突变型。
ii.结果判定标准
IRS-1(Gly972Arg)的DNA测序峰值图中，
C的频率≧90％，T的频率≦10％，即为CC型；
40％≦C的频率≦60％，40％≦T的频率≦60％，即为CT型；
T的频率≧90％，C的频率≦10％，即为TT型；
16)基因检测结果与胰岛素抵抗的相关性表
结果 表型
CC型 基因层面导致胰岛素抵抗风险较低
CT型、TT型 胰岛素抵抗风险较大
五、试剂盒的性能测试结果
5.1.特异性
对16份特异性样本(包括非人类DNA模板和人类同一基因不同位点或同源性位点扩增产物稀释物)进行检测，结果为阴性。
5.2.准确性
对试剂盒范围内的不同基因型的12份参考品(包括IRS-1(Gly972Arg)野生、杂合、突变三种基因型)进行检测，应均能检出相应基因型。
5.3.最低检出限
最低检出限应不高于2ng/ul。
5.4.重复性
检测试剂盒范围内的不同基因型的重复性参考品，每个参考品进行10次检测，结果应均为相应突变类型，且相应检测通道的Ct值的变异系数(CV)应≤5.0％。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Figure BDA0003252179420000091
Figure BDA0003252179420000101
Figure BDA0003252179420000111
序列表
<110> 菲思特（上海）生物科技有限公司
<120> 一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 1
catcccagct ccagccagct cccagagagg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 2
gaggtgtcca cgtagctctg acggggacaa 30
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 3
caaatgctag cagcc 15
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(27)
<400> 4
cygggaggtg cagggcccag tctgccc 27
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(8)
<400> 5
gctgagtg 8

Claims (10)

1.一种胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述胰岛素抵抗风险评估的基因为IRS-1，试剂盒针对IRS-1Gly972Arg多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、IRS-1Gly972Arg测序引物和阳性对照。
2.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述IRS-1Gly972Arg扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述IRS-1Gly972Arg测序引物如序列表SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述IRS-1Gly972Arg分配指令如序列表SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、2-50mg/mL氢氧化钠、5-15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20-80mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝8.5-9.5。
6.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述所述的扩增试剂1包括：扩增缓冲液，15mM醋酸镁。
7.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述所述的扩增试剂2包括：IRS-1Gly972Arg前引物0.32uM，IRS-1Gly972Arg后引物0.32uM，dNTPS 0.3mM、链置换DNA聚合酶1.2ng/μL，单链DNA结合蛋白3.2ng/μL，以及结合单链核酸的重组酶4.8ng/μL。
8.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照，包括浓度为20ng/ul的IRS-1Gly972Arg杂合型基因组DNA。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
a.样本处理液100ul、4ul磁珠和30ulEDTA抗凝全血样本混合，室温静置5min；
b.将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
c.将配制好的PCR反应液加入到步骤b)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
d.将含微珠的结合液与扩增产物进行结合；
e.变性液处理得到单链产物；
f.加入洗涤缓冲液漂洗；
g.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
h.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、CYP1B1(432C/G)测序引物；
i.焦磷酸测序。
10.一种根据权利要求1～9任一项所述的胰岛素抵抗风险评估的基因多态性检测试剂盒及其检测方法的应用，其特征在于，所述试剂盒对IRS-1Gly972Arg进行检测，以从基因层面反应胰岛素的抵抗风险。
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