CN111394451A - 胰岛素抵抗基因多态性检测引物、应用及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，本发明公开了一种胰岛素抵抗基因多态性检测引物；本发明还公开了一种胰岛素抵抗基因多态性检测引物在制备胰岛素抵抗基因多态性检测试剂中的应用；本发明还公开了一种高灵敏度、高特异性、低成本、操作简单、检测时间短的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种胰岛素抵抗基因多态性检测引物、应用及其试剂盒。
背景技术
胰岛素是由胰岛β细胞在内源性或外源性物质的刺激下而分泌的一种蛋白质激素，只有当胰岛素与其受体结合才能实现在机体中发挥生理功能，其主要生理功能是调节机体的糖、脂代谢，并促进蛋白质合成。胰岛素受体(insulin receptor)在机体中分布较广，肌肉、脂肪、肝脏乃至肾脏都是胰岛素靶器官或组织。当胰岛素靶器官或组织对内源性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低时就会发生全身或局部的胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)。IRS1(insulin receptor substrate 1)，也称IRS-1，是胰岛素受体激酶的主要底物，在胰岛素信号通路中起重要作用，在胰岛素敏感组织中表达。该基因的多态性与胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损有关。ELOVL6是长链脂肪酸合成和延伸的限速酶，在脂肪组织中表达，受固醇调节元件结合蛋白1调控。ELOVL6基因多态性与IR、2型糖尿病的发生具有相关性。因此，对胰岛素抵抗相关的基因进行检测，有助于精准用药。
目前临床上主要采用sanger测序法、芯片法、Taqman-qPCR法和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法。Sanger测序法灵敏度低，检测时间长，不适合临床推广；芯片法也存在灵敏度低，其特异性差，易出现假阳性。Taqman-qPCR法，检测灵敏度高，但对于突变频率低的位点检测特异性低，且引物修饰成本较高。飞行时间质谱法适合于15-25个基因位点的检测，少于10个基因位点，检测成本高，时间慢，另外仪器昂贵，对操作人员的要求也高。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种胰岛素抵抗基因多态性检测引物；
本发明还有一个目的是提供一种胰岛素抵抗基因多态性检测引物在制备胰岛素抵抗基因多态性检测试剂中的应用；
本发明还有一个目的是提供一种高灵敏度、高特异性、低成本、操作简单、检测时间短的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种胰岛素抵抗基因多态性检测引物，包括：
IRS-1基因rs1801278位点的野生型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.3所示；
IRS-1基因rs1801278位点的突变型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示；
ELOVL6基因rs9997926位点的野生型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.6所示；
ELOVL6基因rs9997926位点的突变型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示。
一种胰岛素抵抗基因多态性检测引物在制备胰岛素抵抗基因多态性检测试剂中的应用。
一种胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，包含权利要求1所述的胰岛素抵抗基因多态性检测引物。
优选的是，所述的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，还包括：
PCR反应液、DNA聚合酶、SYBR Green染料、阳性对照品、阴性对照品、内对照和超纯水，其中，阳性对照品包含IRS-1基因rs1801278位点的野生型质粒、IRS-1基因rs1801278位点的突变型质粒、ELOVL6基因rs9997926位点的野生型质粒和ELOVL6基因rs9997926位点的突变型质粒，内对照为β-珠蛋白质粒，阴性对照为ddH2O。
优选的是，所述的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，胰岛素抵抗基因多态性检测引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM。
优选的是，所述的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，待检测样本DNA在扩增体系中的可检出浓度为0.01-100ng/μL。
优选的是，阳性对照品包含IRS-1基因rs1801278位点的野生型质粒，其中包含如SEQ ID NO.7所示多核苷酸序列；
IRS-1基因rs1801278位点的突变型质粒，其中包含如SEQ ID NO.8所示多核苷酸序列；
ELOVL6基因rs9997926位点的野生型质粒，其中包含如SEQ ID NO.9所示多核苷酸序列；
ELOVL6基因rs9997926位点的突变型质粒，其中包含如SEQ ID NO.10所示多核苷酸序列。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明提供的包含有胰岛素抵抗基因多态性检测引物的试剂盒能同时检测IRS-1和ELOVL6基因的多态性；
本发明提供的包含有胰岛素抵抗基因多态性检测引物的试剂盒具有特异性强，灵敏度高，重复性好，检测时间短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
采用检测IRS-1和ELOVL6基因多态性试剂盒，检测胰岛素抵抗的过程，具体包括以下步骤：
1)采用基因组DNA提取试剂盒提取待检测样本的基因组DNA；待检测样本DNA浓度为1-100ng/μL，用于PCR扩增反应。
2)荧光定量检测：向反应管中加入PCR反应液、DNA聚合酶、SYBR Green染料、扩增引物和待测样本DNA；其中引物设置IRS-1和ELOVL6基因的野生型体系和突变型体系；其中，在置IRS-1和ELOVL6基因的野生型体系中含如上各基因的野生型引物对；在置IRS-1和ELOVL6基因的突变型体系中含如上各基因所述突变型引物对，并设置阳性对照组和阴性对照组。然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM荧光信号；PCR扩增反应的条件为：95℃10min；95℃10s，58℃45s，收集荧光，45个循环；25℃10s。
3)PCR扩增反应结束后，根据Ct值的差值ΔCt值进行结果判定。所述结果判定的原则为(如下表1所示)：
IRS-1基因rs1801278位点按如下确定样本类型：
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)<-7为野生型CC样本；
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)>7为突变型TT样本；
ΔCt＝|Ct(C)-Ct(T)|<2为杂合型CT样本。
ELOVL6基因rs9997926位点按如下确定样本类型：
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)<-6.5为野生型CC样本；
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)>7为突变型TT样本；
ΔCt＝|Ct(C)-Ct(T)|<2为杂合型CT样本。
表1：检测结果判定的原则
实施例1引物设计
本发明的具体原理是：针对不同基因位点分别设计野生型和突变型ARMS引物，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血细胞或口腔拭子中提取的基因组DNA进行检测，可以同时实现对IRS-1和ELOVL6的基因多态性进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的ΔCt值来确定样本DNA的基因型。
分别针对人类IRS-1基因rs1801278位点和ELOVL6基因rs9997926位点设计各基因对应的野生型引物、突变型引物、公用引物，通过多次试验、优化、最后获得的引物核苷酸序列(参见序列表)。
实施例2采用实时荧光PCR检测IRS-1和ELOVL6基因多态性的方法
将实施例1筛选设计各基因的引物进行合成，采用实时荧光PCR检测IRS-1和ELOVL6基因多态性的方法。具体步骤如下：
(1)获得待测样品的DNA；
(2)应用设计的检测引物，对待测样本的DNA中对IRS-1基因rs1801278位点和ELOVL6基因rs9997926位点多态性进行实时荧光PCR扩增检测，采用IRS-1和ELOVL6基因的野生型反应体系和突变型反应体系，均用20μL反应体系，PCR反应体系中组分具体为：
待检测样本DNA 2uL、2×PCR buffer 9.5uL、DNA聚合酶0.5uL、2×SYBR Green染料1.5uL，引物1uL、补ddH2O水至20uL。
并设置阴性和阳性对照，及内对照放入荧光定量PCR仪中，设置好反应程序，开始检测，反应条件：95℃10min；95℃10s，58℃45s，收集荧光，45个循环；25℃10s。
收集荧光信号，选择对应荧光通道的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
反应结束后，根据Ct值的差值ΔCt值进行结果判定。
所述结果判定的原则为：
IRS-1基因rs1801278位点按如下确定样本类型：
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)<-8为野生型CC样本；
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)>8为突变型TT样本；
ΔCt＝|Ct(C)-Ct(T)|<2.5为杂合型CT样本。
ELOVL6基因rs9997926位点按如下确定样本类型：
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)<-7为野生型CC样本；
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)>7为突变型TT样本；
ΔCt＝|Ct(C)-Ct(T)|<2为杂合型CT样本。
实施例3用于检测IRS-1和ELOVL6基因多态性的试剂盒
一种胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒包括：
IRS-1基因rs1801278位点的野生型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.3所示；
IRS-1基因rs1801278位点的突变型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示；
ELOVL6基因rs9997926位点的野生型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.6所示；
ELOVL6基因rs9997926位点的突变型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示；
还包括：PCR反应液、DNA聚合酶、SYBR Green染料、阳性对照品、阴性对照品、内对照和超纯水，其中，
阳性对照品包含IRS-1基因rs1801278位点的野生型质粒，其中包含如SEQ IDNO.7所示多核苷酸序列；
IRS-1基因rs1801278位点的突变型质粒，其中包含如SEQ ID NO.8所示多核苷酸序列；
ELOVL6基因rs9997926位点的野生型质粒，其中包含如SEQ ID NO.9所示多核苷酸序列；
ELOVL6基因rs9997926位点的突变型质粒，其中包含如SEQ ID NO.10所示多核苷酸序列。
内对照为β-珠蛋白质粒；
阴性对照为ddH2O。
实施例4临床样本实验
(1)基因组DNA的提取
取10人临床血液样本(编号X01-10)采用基因组DNA提取试剂盒分别提取待检测样本的基因组DNA；待检测样本DNA浓度为1-100ng/uL，用于PCR扩增反应。
采用IRS-1和ELOVL6基因多态性的试剂盒，设置野生型反应体系和突变型反应体系，均用20μL反应体系，PCR反应体系中组分具体为：待检测样本DNA 2uL、2×PCRbuffer9.5uL、DNA聚合酶0.5uL、2×SYBR Green染料1.5uL，引物1uL、补ddH2O水至20uL。并设置阴性和阳性对照，及内对照放入荧光定量PCR仪中，设置好反应程序，开始检测，反应条件：95℃10min；95℃10s，58℃，45s，收集荧光，45个循环；25℃10s。收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
反应结束后，根据Ct值的差值ΔCt值进行结果判定。
所述结果判定的原则为：
IRS-1基因rs1801278位点按如下确定样本类型：
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)<-8为野生型CC样本；
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)>8为突变型TT样本；
ΔCt＝|Ct(C)-Ct(T)|<2.5为杂合型CT样本。
ELOVL6基因rs9997926位点按如下确定样本类型：
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)<-7为野生型CC样本；
ΔCt＝Ct(C)-Ct(T)>7为突变型TT样本；
ΔCt＝|Ct(C)-Ct(T)|<2为杂合型CT样本。
表2：血液样本(编号X01-10)检测结果如下所示：
用本发明的试剂盒检测的结果和Sanger测序的结果完全一致。说明本发明的试剂盒和检测方法准确度高，适应临床样本检测。
实施例5灵敏度实验
选择已知IRS-1、ELOVL6基因相应位点基因型的样本，每个位点分别选取野生型基因组、突变型基因组和杂合型基因组样本各一例，进行浓度梯度检测，检测结果如下表3和表4所示。分别稀释至10ng/uL、1ng/uL、0.1ng/uL、0.01ng/uL，各梯度重复3次，评估每个梯度的检出情况。
表3 IRS-1灵敏度检测结果如下
| 10ng/uL | 1ng/uL | 0.1ng/uL | 0.01ng/uL | 一致率 | |
| 野生型样本 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 100％ |
| 突变型样本 | 突变型 | 突变型 | 突变型 | 突变型 | 100％ |
| 杂合型样本 | 杂合型 | 杂合型 | 杂合型 | 杂合型 | 100％ |
表4 ELOVL6灵敏度检测结果如下
| 10ng/uL | 1ng/uL | 0.1ng/uL | 0.01ng/uL | 一致率 | |
| 野生型样本 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 100％ |
| 突变型样本 | 突变型 | 突变型 | 突变型 | 突变型 | 100％ |
| 杂合型样本 | 杂合型 | 杂合型 | 杂合型 | 杂合型 | 100％ |
上述结果显示，本发明可准确检出低至0.01ng/uL的DNA样本进行胰岛素抵抗基因多态性检测。
实施例6特异性实验
选择已知IRS-1、ELOVL6基因相应位点基因型的样本，每个位点分别选取野生型基因组、突变型基因组和杂合型基因组样本各一例，进行浓度梯度检测。分别进行3种浓度为100ng/μL、10ng/μL和1ng/μL在荧光定量PCR仪上进行6个反应系统的检测，结果显示，三种不同浓度的基因组DNA作为模板的检测，均能准确检出，故检测结果不会受过高浓度而影响结果的判读。因此，可以减少稀释样本的过程，提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现结果误判。
实施例7准确性实验
选择IRS-1各基因型样本各10例，用本专利试剂盒进行检测，同时将样本进行一代测序，结果本专利试剂盒检测结果与测序结果符合率为100％(如表5所示)。
表5 IRS-1各基因型样本各10例的测序结果
选择ELOVL6各基因型样本各10例，用本专利试剂盒进行检测，同时将样本进行一代测序，结果本专利试剂盒检测结果与测序结果符合率为100％(如表6所示)。
表6 IRS-1各基因型样本各10例的测序结果
实施例8重复性实验
已知基因型的样本6例覆盖全部待检测型别，重复检测3次，计算3次检测样本Ct值间的变异系数。结果见下表7所示，变异系数均在3％以下，说明本发明试剂盒具有良好的重复性。
表7
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
<110>石家庄诺道中科医学检验实验室有限公司
<120>胰岛素抵抗基因多态性检测引物、应用及其试剂盒
<160>10
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>1
ctgggccctg cacctcacg 19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>2
ctgggccctg cacctcaca 19
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>3
gctctgacgg ggacaactca tctg 24
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>4
aattcactga aatgagcgca c 21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>5
aattcactga aatgagcgca t 21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>6
attccacact aactccccct 20
<210>7
<211>107
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>7
ctgggccctg cacctcccgg ggctgctagc atttgcaggc ctacccgggc agtgcccagc 60
agccggggtg actacatgac catgcagatg agttgtcccc gtcagag 107
<210>8
<211>107
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>8
ctgggccctg cacctcccag ggctgctagc atttgcaggc ctacccgggc agtgcccagc 60
agccggggtg actacatgac catgcagatg agttgtcccc gtcagag 107
<210>9
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>9
aattcactga aatgagctca cggttttctg ctgaaacaga aaggtcttct tgctatttat 60
taagagttta gtga 74
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<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>10
aattcactga aatgagctca tggttttctg ctgaaacaga aaggtcttct tgctatttat 60
taagagttta gtga 74
Claims (7)
1.一种胰岛素抵抗基因多态性检测引物，其特征在于，包括：
IRS-1基因rs1801278位点的野生型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.3所示；
IRS-1基因rs1801278位点的突变型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；
ELOVL6基因rs9997926位点的野生型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.6所示；
ELOVL6基因rs9997926位点的突变型引物对如多核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。
2.一种如权利要求1所述的胰岛素抵抗基因多态性检测引物在制备胰岛素抵抗基因多态性检测试剂中的应用。
3.一种胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的胰岛素抵抗基因多态性检测引物。
4.如权利要求3所述的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，其特征在于，还包括：
PCR反应液、DNA聚合酶、SYBR Green染料、阳性对照品、阴性对照品、内对照和超纯水，其中，阳性对照品包含IRS-1基因rs1801278位点的野生型质粒、IRS-1基因rs1801278位点的突变型质粒、ELOVL6基因rs9997926位点的野生型质粒和ELOVL6基因rs9997926位点的突变型质粒，内对照为β-珠蛋白质粒，阴性对照为ddH2O。
5.如权利要求3所述的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，其特征在于，胰岛素抵抗基因多态性检测引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM。
6.如权利要求3所述的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，其特征在于，待检测样本DNA在扩增体系中的可检出浓度为0.01-100ng/μL。
7.如权利要求3所述的胰岛素抵抗基因多态性检测试剂盒，其特征在于，阳性对照品包含IRS-1基因rs1801278位点的野生型质粒，其中包含如SEQ ID NO.7所示多核苷酸序列；
IRS-1基因rs1801278位点的突变型质粒，其中包含如SEQ ID NO.8所示多核苷酸序列；
ELOVL6基因rs9997926位点的野生型质粒，其中包含如SEQ ID NO.9所示多核苷酸序列；
ELOVL6基因rs9997926位点的突变型质粒，其中包含如SEQ ID NO.10所示多核苷酸序列。
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2020
- 2020-04-22 CN CN202010319877.2A patent/CN111394451B/zh not_active Expired - Fee Related
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